Khảo sát sự biến động hàm lượng GS4 trong cây dây thìa canh theo thời gian (gymnemasylvestre (retz) r br ex schult )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TẠ KHẮC CÔNG

KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG
HÀM LƯỢNG GS4 TRONG CÂY
DÂY THÌA CANH THEO THỜI GIAN
(Gymnema sylvestre (Retz) R.Br.ex Schult.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI-2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TẠ KHẮC CÔNG

KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG

HÀM LƯỢNG GS4 TRONG CÂY
DÂY THÌA CANH THEO THỜI GIAN
(Gymnema sylvestre (Retz) R.Br.ex Schult.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Trần Văn Ơn
Nơi thực hiện :
Bộ môn Thực Vật
Trường Đại Học Dược Hà Nội


HÀ NỘI – 2013



LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự ủng hộ, tạo
điều kiện của Ban Giám Hiệu, phòng Đào Tạo Trường ĐH Dược Hà Nội, sự
hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo ở Bộ môn Thực vật, gia đình
và bạn bè.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo Trần Văn Ơn,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi tận tình trong quá trình làm nghiên cứu
khoa học và làm đề tài tại Bộ môn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới chị Chu Thị Thoa
cùng các thầy cô, các chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật đã luôn giúp đỡ tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn Nguyễn Thị An (lớp A4 K63), anh
Trần Viết Văn (Yên Ninh –Phú Lương –Thái Nguyên), chị Lê Thị Vân (Công

ty TNHH MTV Dược Khoa - Trường ĐH Dược Hà Nội) đã hỗ trợ thu hái
dược liệu trong quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên


Tạ Khắc Công




MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br.ex Schult.) 3
1.1.1. Vị trí phân loại 3
1.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố 4
1.1.3.Thành phần hóa học 6
1.1.4. Tác dụng sinh học 13
1.2. Thu hoạch (thu hái) dược liệu theo GACP [37] 15
1.3. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 16
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 16
1.3.2. Ứng dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 16
CHƯƠNG 2 17
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 17
2.1.1. Nguyên liệu 17
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất 18
2.2. Nội dung nghiên cứu 19

2.2.1 . Khảo sát sự biến đổi hàm lượng GS4 theo giai đoạn phát triển của
cây Dây thìa canh sau thu hái 19
2.2.2. Khảo sát sự biến động hàm lượng GS4 theo các tháng của cây Dây
thìa canh 19


2.3. Phương pháp nghiên cứu 20
2.3.1. Theo dõi sự phát triển của cây Dây thìa canh sau thu hái 20
2.3.2. Khảo sát sự thay đổi hàm lượng GS4 theo thời gian và theo các giai
đoạn phát triển của cây Dây thìa canh sau thu hái 20
2.3.2. Khảo sát sơ bộ sự thay đổi các thành phần hoá học trong dịch chiết
Dây thìa canh qua các tháng và giai đoạn phát triển sau thu hái. 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lượng GS4 theo giai đoạn phát triển của cây
Dây thìa canh sau thu hái 24
3.1.1. Sự phát triển của cây Dây thìa canh sau thu hái 24
3.1.2. Sự biến đổi hàm lượng GS4 theo giai đoạn phát triển của cây Dây
thìa canh sau thu hái 25
3.2. Khảo sát sự biến động hàm lượng GS4 theo các tháng của cây Dây thìa
canh 26
3.3. Khảo sát sơ bộ sự thay đổi các thành phần hoá học trong dịch chiết Dây
thìa canh qua các tháng và giai đoạn phát triển sau thu hái 27
3.4. Bàn luận 30
3.4.1. Các giai đoạn phát triển Dây thìa canh sau thu hái và sự biến đổi
hàm lượng GS4 30
3.4.2.Sự biến đổi hàm lượng GS4 theo thời gian 31
3.4.3. Sự biến đổi thành phần hoá học theo các tháng của dịch chiết cây
Dây thìa canh 33
KẾT LUẬN 34
ĐỀ XUẤT 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DTC Dây thìa canh
GS Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
GS4 Tủa saponin toàn phần thu được từ dịch chiết Ethanol của cây
Dây thìa canh
ĐTĐ Đái tháo đường
TLC Sắc ký lớp mỏng
HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
GACP Thực hành tốt Trồng trọt và Thu hái dược liệu
NBC Niacin-bound chromium
HCA-SX Acid Hydroxycitric
BMI Chỉ số cơ thể
LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp
HDL Lipoprotein tỉ trọng cao
GS3 Tủa GS ở giai đoạn 3
NXB Nhà xuất bản
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
DW Khối lượng khô




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1

Danh mục các loài trong chi Gymnema có ở Việt Nam
3
Bảng 1.2
Hàm lượng acid Gymnemic trong các bộ phận của cây
10
Bảng 3.1
Hàm lượng GS4 của cành và lá Dây thìa canh theo giai
đoạn phát triển sau thu hái
26
Bảng 3.2
Sự biến đổi hàm lượng GS4 theo thời gian của các mẫu
dược liệu Dây thìa canh
26
Bảng 3.3
Các vết chính của sắc ký đồ HPTLC của mẫu dịch chiết
tổng theo các tháng
29
Bảng 3.4
Các vết chính của sắc ký đồ HPTLC của mẫu dịch chiết
tổng phần non và phần bánh tẻ
30
Bảng 3.5
Các vết chính của sắc ký đồ của mẫu GS4 các tháng
30
Bảng 3.6
Hàm lượng acid Gymnemic quac các giai đoạn phát triển
của lá
31
Bảng 3.7
Hàm lượng acid Gymnemic trong các giai đoạn phát triển

của cành
31



DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1
Đặc điểm hình thái cây Dây thìa canh
5
Hình 1.2
Quy trình chiết GS4
7
Hình 1.3
Gymnemagenin
9
Hình 1.4
Gymnestrogenin
9
Hình 1.5
Acid Gymnestroic
9
Hình 1.6
Cấu trúc của Gurmarin
11
Hình 1.7
Các acid Gymnemic
12
Hình 2.1
Nguyên liệu Dây thìa canh
17

Hình 2.2
Phần non của cây Dây thìa canh
18
Hình 2.3
Phần bánh tẻ của cây Dây thìa canh
18
Hình 2.4
Nguyên liệu Dây thìa canh
21
Hình 3.1
Sự phát triển của cây Dây thìa canh sau thu hái
25
Hình 3.2
Sự biến đổi hàm lượng GS4 theo thời gian của các mẫu
dược liệu Dây thìa canh
27
Hình 3.3
Hình dạng và màu sắc của GS4
27
Hình 3.4
Sắc ký đồ HPTLC của dịch chiết tổng các mẫu DTC từ
tháng 10/2012 đến tháng 3/2013
28
Hình 3.5
Sắc ký đồ HPTLC của mẫu GS4 từ tháng 10/2012 đến
tháng 2/2013
28
Hình 3.6
Sắc ký đồ HPTLC của dịch chiết tổng các mẫu non, bánh
tẻ

29
1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam có hệ động thực vật phong phú và đa dạng, trong đó có nhiều
cây có tiềm năng chữa bệnh với khoảng 4.000 loài cây thuốc trong tổng số
khoảng 12.000 loài thực vật đã biết cùng với nền Y học cổ truyền phát triển
lâu đời [7]. Nền tảng này và xu hướng sử dụng các sản phẩm thiên nhiên thực
sự đã mở ra tiềm năng phát triển cho ngành Công nghiệp Dược Việt Nam
trong khi nghiên cứu sản xuất thuốc mới có nguồn gốc từ hoá học và công
nghệ sinh học vẫn còn hạn chế.
Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. Ex Schult.) đã được sử
dụng trong nền Y học Ấn Độ từ hơn 2.000 năm nay để điều trị đái tháo đường
(ĐTĐ). Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt nghiên cứu đã được thực hiện ở
nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc,…tạo cơ sở cho sự ra
đời của nhiều chế phẩm điều trị ĐTĐ như GlucosCare Tea, Gymnema
Sylvestre Extract, Gymnema Sylvestre leaf, v.v…[4], [5], [6]. Ở Việt Nam,
cây Dây thìa canh đã được trồng ở quy mô lớn theo các khuyến cáo về Thực
hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc (GACP) của WHO tại huyện Phú
Lương –Thái Nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất. Mặc dù vậy, việc
xác định thời gian thu hái tối ưu cây Dây thìa canh để đảm bảo dược liệu chất
lượng tốt vẫn chưa được sáng tỏ.
Nhằm hoàn thiện quy trình thu hái dược liệu Dây thìa canh định hướng
theo các khuyến cáo về Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc (GACP)
của WHO, đề tài “Khảo sát sự biến động hàm lượng GS4 theo thời gian trong
cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Schult.” được thực hiện
với những mục tiêu sau:
2

1. Khảo sát sự biến đổi hàm lượng GS4 theo giai đoạn phát triển của cây
Dây thìa canh sau thu hái.
2. Khảo sát sự biến động hàm lượng GS4 theo các tháng của cây Dây
thìa canh.
3. Khảo sát sơ bộ sự thay đổi các thành phần hoá học trong dịch chiết
Dây thìa canh qua các tháng và giai đoạn phát triển sau thu hái.


















3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br.ex Schult.)
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 1987 [2] cây Dây thìa canh
là một loài trong chi Gymnema, thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae), bộ Long
đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan
(Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta).
Theo các tài liệu [4], [6], [11], [12], ở Việt Nam hiện đã xác định có 7
loài thuộc chi Gymnema, được tóm tắt và trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Danh mục các loài trong chi Gymnema đã xác định ở Việt Nam
STT
Tên khoa học
Tên thường dùng
1
Gymnema acuminatum(Roxb.) Wall.
Lõa ty nhọn
2
Gymnema albiflorum Cost.
Lõa ty hoa trắng
3
Gymnema inodorum (Lour.) Decne.
Lõa ty không mùi, Rau
mỏ
4
Gymnema latifolium Wall. Ex Wight.
Lõa ty lá rộng, Dây thìa
canh lá to
5
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex
Schult.
Dây thìa canh, Dây muôi,

lõa ty rừng
6
Gymnema reticulatum (Moon) Alston
Cost.
Dây thìa canh gân mạng
7
Gymnema tingens (Roxb) Spreng.
Rau mỏ, Dây thìa canh lá
to, Lõa ty nhuộm
4


1.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố
Dây leo, cao từ 3-5 m. Thân non màu xanh, phủ lông mịn; thân già màu
nâu, có lỗ vỏ, đường kính lỗ vỏ từ 0,5-1 mm. Toàn cây có nhựa mủ màu trắng
hay hơi vàng. Lá mọc đối. Cuống dài 3-5 mm; đường kính 2-3mm; phiến hình
bầu dục, trứng hay trứng ngược, dài 6-7cm, rộng 2,5-5cm, gốc thuôn, mép
nguyên, ngọn nhọn; có 4-6 cặp gân phụ, rõ ở mặt dưới. Hoa nhỏ màu trắng
hơi vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, dài 8mm, rộng 12-15mm. Đài
chia 5, các thuỳ dài 1mm, có lông mịn và rìa lông. Tràng 5, dính nhau thành
ống, dài 1,8-2 mm, mặt ngoài nhẵn; tràng phụ gắn với tràng, có 5 răng, dính
với họng tràng. Cột nhị nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5mm, rộng 0,8-1mm. Bộ
nhị có bao phấn ngắn; khối phấn gồm hai thùy, dài khoảng 0,2mm, liên kết
với nhau nhờ trung đới màu vàng nâu. Bộ nhụy có vòi với đầu rộng hình nón,
vượt quá bao phấn. Quả đại dài 5-6cm, rộng ở dưới, đường kính chỗ lớn nhất
khoảng 1,5cm. Hạt dẹp, dài 3mm, có mào lông màu trắng, dài khoảng 3-
3,5cm, thường có khoảng 40 hạt trong một quả
Cây ra hoa vào tháng 7, có quả vào tháng 8 [3], [4], [5].
Cây gặp ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, v.v…[3], [4], [5],
[19], [22], [24].

Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh Hải Dương, Hưng Yên, Hải
Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Thanh Hóa [3],[4],[5], Nghệ An, Hà Tĩnh,
Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế đến Khánh Hoà, Bình Thuận [11].
Cây thường mọc ở các bờ bụi, hàng rào.




5


Hình 1.1 . Đặc điểm hình thái cây Dây thìa canh [11].
A: Ảnh toàn cây; B: Cụm hoa; C: Cành mang quả; D: Quả chín và hạt

Ở Việt Nam, cây Dây thìa canh được nghiên cứu nhân giống và trồng
lần đầu tiên vào năm 2007 tại Vườn Thực vật - Trường ĐH Dược Hà Nội.
Vào năm 2008, việc khảo nghiệm vùng trồng được tiến hành tại Nam Định
(Hải Hậu), đại diện cho vùng đồng bằng sông Hồng, và Thái Nguyên (Phú
Lương), đại diện cho vùng núi thấp Đông Bắc. Kết quả cho thấy, cây phát
6

triển tốt cả ở hai vùng nghiên cứu. Tuy nhiên, vùng trồng ở Phú Lương – Thái
Nguyên cho hàm lượng GS4 cao hơn [9].
Các nghiên cứu phân loại dưới loài đã xác định Dây thìa canh có 3
giống phân biệt bởi màu hoa, gồm giống hoa màu vàng kem, màu trắng và
màu hồng. Tuy nhiên, sự khác biệt về hàm lượng GS4 của các giống là không
lớn [9], [11].

1.1.3.Thành phần hóa học
Có nhiều thành phần khác nhau đã được phân lập từ các phần khác nhau

của cây Dây thìa canh.
Lá cây Dây thìa canh có chứa saponin triterpenoid thuộc hai nhóm là
Olean và Dammaran là thành phần chính. Bên cạnh đó lá cây Dây thìa canh
cũng có chứa Albumin, Carbonhydrat, Inositol, các hợp chất Anthraquinolic,
acid Tartaric, acid Formic, acid hữu cơ, đường khử, acid amin, nhựa,
v.v [10], [17], [32].
Có 11 hợp chất đã được xác định có ở dịch chiết Chloroform phần phía
trên của cây và 24 hợp chất đối với phần rễ. Trong đó có các thành phần đáng
chú ý như Eicosane (20,81% với thân lá và 23,50% đối với rễ), acid Oleic
(15,71% trong rễ), Stigmasterol (9,31% với thân lá và 12,66% với rễ ) [15].
1.1.3.1. GS4
GS4 là saponin toàn phần được tạo thành bằng cách tủa dịch chiết Dây
thìa canh bằng H
2
SO
4
do saponin trong cây Dây thìa canh không tan trong
môi trường acid. Phần lớn những nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của
Dây thìa canh đều tiến hành bằng GS4. Quy trình chiết xuất GS4 được trình
bày trong Hình 1.2. [14], [23], [28].
Thành phần của GS4 bao gồm Saponin của hai nhóm là nhóm Olean và
nhóm Dammaran. Nhóm oleanan có acid Gymnemic và Gymnema Saponin,
7

trong khi đó nhóm Dammaran có Gymnemosides [15], trong đó acid
Gymnemic là thành phần chính được xác định là có tác dụng hạ đường huyết
[17], [20].


Bã dược liệu

Lá sấy khô, xay
Dịch chiết
Cao lỏng
GS3
Dịch lỏng có tủa
Chiết
Ethanol 70
0
H
2
SO
4
5%
pH acid
Bốc hơi dung môi
Lọc lấy tủa
pH base
KOH 0,1M
Dịch hòa tan
pH acid
H
2
SO
4
5%
Dịch lọc (D1)
Dịch lỏng có tủa
Lọc lấy tủa, sấy ở 60
o

Dịch lọc (D2)
GS4
Hình 1.2. Quy trình chiết GS4

8

1.1.3.2 Saponin nhóm Olean
(1) Acid Gymnemic
Acid Gymnemic là một acid hữu cơ thuộc nhóm Saponin triterpenoid,
là thành phần chính của GS4 có tác dụng hạ đường huyết. Năm 1886, Hopper
đã phân lập được chất này ở dạng acid đơn vô định hình, có cấu trúc glycosid
và đặt tên là acid Gymnemic. Năm 1892, Shore đã phân lập được acid
Gymnemic ở dạng tinh thể trắng bằng phương pháp cải tiến và nhận định đó
là một dẫn xuất của acid Anthranilic. Năm 1959, Warren và Pfaffmann đã
tách được acid Gymnemic dạng tinh thể có nhiệt độ nóng chảy 199
0
C và
Pfaffmann đã công bố các thành phần của dịch thủy phân acid Gymnemic
gồm đường Glucose, Arabinose, và Glucuronolacton. Yackzan cũng đã xác
định được trọng lượng phân tử của acid Gymnemic là khoảng 600 dựa vào kỹ
thuật siêu ly tâm [29].
Năm 1967 Stocklin và cộng sự đã tách riêng được 4 thành phần từ A1
đến A4 của acid Gymnemic. Các thành phần này chưa xác định được đầy đủ
cấu trúc mặc dù đã xác định được chúng là loại D-glucoronid của
Hexahydroxyolean-12-en cs tên là Gymnemagenin, acyl hóa với thành phần
khác nhau như acid Formic, acid Acetic, n-Butyric và Isovaleric [29], [30].
Năm 1989, Yoshikawa và các cộng sự đã phân lập được 12 acid
Gymnemic từ cây Dây thìa canh, đặt tên là acid Gymnemic(I-XII) (Hình 1.7)
[29]. Các acid Gymnemic này đều có phần aglycon là Gymnemagenin, riêng
acid Gymnemic VII có phần aglycon là Gymnestrogenin. Do vậy, Liu và

cộng sự đã đổi tên acid Gynmemic VII (9) thành acid Gymnestroic VII (9)
(Hình 1.5) [29].
Năm 1990, Kiuchi và cộng sự công bố phân lập được 2 acid
Gymnemic được xác định là acid Gymnemic VIII và acid Gymnemic IX. Để
tránh nhầm lẫn với acid Gymnemic VIII và acid Gymnemic IX do
9

Yoshikawa phân lập, 2 chất trên được đặt tên là acid Gymnemic XIII (13) và
acid Gymnemic XIV (14) (Hình 1.7).

H
HO
CH
2
OH
OH
OH
H
OH
H



Hình 1.3 Gymnemagenin (1) Hình 1.4 Gymnestrogenin (2)

Hình 1.5 Acid Gymnestroic (9)

Về sự thay đổi hàm lượng acid Gymnemic theo các bộ phận trong cây,
năm 2009 S.H.Manohar [22] đã sử dụng phương pháp HPLC với chất chuẩn
là acid Gymnemic cho thấy hàm lượng acid Gymnemic trong các bộ phận của
cây Dây thìa canh có sự khác nhau rõ ràng Bảng 2.1.
26
H
OH
CH
2
OH
OH
HO
H
H
OH
OH
24
30
O
O
HO
HO
OH
H

OH
H
H
OH
CH
2
OH
COOH
OH
10

Bảng 1.2. Hàm lượng acid Gymnemic trong các bộ phận của cây
Bộ phận
Hàm lượng acid Gymnemic mg/g DW
Chồi
54,39
Hoa
31,66
Lá
27,67
Dóng (thân)
25,39
Rễ
20,56
Hạt
1,31
Mấu
28,82

(2) Gymnemasaponin

Năm 1991, Yashikawa công bố phân lập được 5 saponin mà trong cấu
trúc không có gốc acyl, đó là các Gymnema saponin I-V.
Ngoài ra năm 1996, 4 saponin nữa thuộc nhóm olean được phân lập
bởi Mahato và cộng sự, Gymnemasin A-D là: 3-O-[β-D-
glucopyranosyl(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-22-O-tigloyl Gymnemanol; 3-O-
[β-D-glucopyranosyl(1→3)-β-D-glucuropyranosyl]- Gymnemanol; 3-O-β-D-
glucuronopyranosyl-22-O-tigloyl- Gymnemanol; 3-O-β-D-
glucuronopyranosyl - Gymnemanol phần aglycon của chúng là
Gymnemanol [31].
1.1.3.3. Saponin nhóm Dammaran
Ngoài những saponin có thành phần aglycon là thuộc nhóm Olean ,
Yoshikawa còn công bố những saponin khác thuộc nhóm Dammaran là
Gymnemaside I-VII [35] cùng với những saponin nhóm Dammaran đã được
phân lập trước đó là Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII và LXIII [26].
Năm 2008, Xu-Min Zhu và cộng sự đã phân lập được thêm 2 saponin mới, đó
là Gymnemoside-W1 và Gymnemoside-W2 [29].
11

1.1.3.4. Một số thành phần khác
Gurmarin là một chuỗi polypeptid gồm 35 acid amin và 3 cầu nối
disulfid nội phân tử. Cấu trúc và vị trí của các cầu nối disulfid đã được xác
định như Hình 1.6 [33], [34]. Gurmarin được phân lập từ cây Dây thìa canh
đã được chứng minh là một chất làm mất vị ngọt.

Hình 1.6. Cấu trúc của Gurmarin
Năm 2004, X. Liu và cộng sự đã xác định được trong lá GS có Kaempferol
(3 - O - β - D – glucopyranosyl - (1→4) – α – L – rhamnopyranosyl - (1→6) –
β – D - galactopyranoid) và Quercetin (3 – O - 6’’ - (3 – hydroxyl – 3 -
methylglutaryl) - β – D -glucopyranoside) [30].

12


O
O
HO
R
3
O
OH
H
OH
H
H
OR
1
OR
4
CH
2
OR
2
COOH
OH

R
1
R
2
R
3
R
4
(3)
Acid Gymnemic I
Tig
Ac
H
H
(4)
Acid Gymnemic II
Mba
Ac
H
H
(5)
Acid Gymnemic III
Mba
H
H
H
(6)
Acid Gymnemic IV
Tig
H

H
H
(7)
Acid Gymnemic V
Tig
H
H
Tig
(8)
Acid Gymnemic VI
Tig
H
β-glc
H
(10)
Acid Gymnemic VIII
H
mba
H
H
(11)
Acid Gymnemic IX
H
tig
H
H
(12)
Acid Gymnemic X
H
Ac

H
H
(13)
Acid Gymnemic XI
Tig
tig
H
H
(14)
Acid Gymnemic XII
Tig
Ac
β-glc
H
(15)
Acid Gymnemic XIII
Mba
H
OG
H
(16)
Acid Gymnemic XIV
Tig
H
OG
H
H
3
C
C

H
C
CH
3
O
tig:

Tigloyl
mba: CH
3
CH
2
C
H
CO
CH
3

(S)-2-Methylbutyryl

OG: β-Arabino-2 –Hexulopyranosyl
β-glc: β-Glucopyranosyl

Hình 1.7. Các acid Gymnemic
13

1.1.4. Tác dụng sinh học
1.1.4.1. Tác dụng làm mất cảm giác ngọt
(1) Tác dụng của hỗn hợp acid Gymnemic
Hỗn hợp acid Gymnemic có tác dụng ức chế rất mạnh cảm giác ngọt ở

người và tinh tinh nhưng lại không có tác dụng ức chế đối với các loài động
vật thí nghiệm bao gồm cả động vật gặm nhấm [18], [19], [33], [34].
(2) Tác dụng của Gurmarin
Gurmarin đã được chứng minh là một chất làm mất vị ngọt mà không
ảnh hưởng đến các vị chua, mặn và đắng ở chuột và không ảnh hưởng đến
dây thần kinh vị giác và các tế bào vị giác của chuột [12]. Tác dụng làm mất
cảm giác này của Gurmarin kéo dài khá lâu trên 2 - 3 giờ, nhưng nhanh chóng
mất tác dụng khi rửa lưỡi với thành phần Anti - Gurmarin trong huyết thanh
của chuột [33], [34]. Kết quả này cho thấy rằng Gurmarin đóng vai trò quan
trọng như một chất ức chế đặc trưng cho các đáp ứng của hệ thống vị giác
ngoại biên của các loài gặm nhấm [18]. Không giống như acid Gymnemic,
Gurmarin không có tác dụng đối với cảm giác ngọt ở người [18],[19],[33].
Về mặt sinh học, hai chất ức chế cảm giác ngọt này đóng vai trò như
một chức năng bảo vệ, giúp cây chống lại các loài sâu bọ gây hại và nhiều
loại động vật có vú do làm mất cảm giác ngon ở các loài này [18].
1.1.4.2. Tác dụng hạ đường huyết
Cây Dây thìa canh đã được nền Y học cổ truyền Ayurveda của Ấn Độ
sử dụng từ hơn 2.000 năm nay để điều trị đái tháo đường [14], [17], [18],
[19], [23], [24], [25], [29].
Hai dịch chiết nước thu được từ lá Dây thìa canh gồm GS3 và GS4 đã
được thử nghiệm tác dụng đối với nồng độ glucose nội sinh và các mô tụy nội
tiết trên chuột gây ĐTĐ bằng Streptozocin. Ở chuột ĐTĐ, nồng độ Glucose
lúc đói đã trở về bình thường sau 60 ngày uống GS3 và 20 ngày uống GS4.
14

Máu trong các thí nghiệm dung nạp Glucose đường uống được thu thập lại để
khảo nghiệm Insulin huyết thanh. Kết quả là việc điều trị với GS3 và GS4 đã
làm cho mức Insulin huyết thanh tăng lên gần với mức Insulin bình thường
lúc chuột đói. Trong tụy của chuột ĐTĐ, cả GS3 và GS4 đều có khả năng
nhân lên số tiểu đảo và số lượng tế bào β đảo tụy. Liệu pháp điều trị thảo

dược này mang đến sự cân bằng nồng độ glucose nội mô thông qua việc tăng
nồng độ Insulin huyết thanh do sự phục hồi của tuyến tụy nội tiết [14], [28].
Hiệu quả tác dụng kiểm soát tăng đường huyết của GS4 từ cây Dây thìa
canh đã được thí nghiệm trên 22 bệnh nhân ĐTĐ typ 2. GS4 được dùng với
liều 400mg/ ngày qua đường uống trong thời gian 18-20 tháng đồng thời với
các thuốc thông thường khác. Kết quả cho thấy đường máu, Hemoglobin
Glucosylat và Glycosylat protein huyết tương đều giảm ở mức có ý nghĩa và
có thể giảm liều các thuốc khác. 5 trong số 22 bệnh nhân có thể ngừng sử
dụng các thuốc khác mà mức đường huyết vẫn được kiểm soát. Điều này cho
thấy các tế bào β có thể được phục hồi khi sử dụng GS4 [23].
1.1.4.3. Tác dụng hạ lipid máu, chống béo phì
Sự kết hợp dịch chiết của Gymnema sylvestre với Niacin-bound
chromium (NBC) và Acid hydroxycitric (HCA-SX) đã được tiến hành để
kiểm tra tác dụng chống béo phì bằng cách theo dõi các chỉ số trọng lượng cơ
thể, chỉ số BMI (chỉ số khối cơ thể ), sự ngon miệng, thành phần Lipid, Leptin
trong huyết thanh và sự bài tiết chất béo chuyển hóa qua thận. Nghiên cứu
được tiến hành ngẫu nhiên trên 60 người béo phì ở Elluru (Ấn Độ), độ tuổi từ
21-50, chỉ số khối cơ thể BMI > 26kg/ m
2
. Các đối tượng được cung cấp chế
độ ăn cho thấy trọng lượng cơ thể và BMI giảm từ 5-6%; tổng lượng
Cholesterol, LDL (Lipoprotein tỉ trọng thấp) và các Triglycerid trong huyết
thanh đều giảm trong khi lượng HDL (Lipoprotein tỉ trọng cao) trong máu và
sự bài tiết chất béo tăng lên. Nghiên cứu này cho thấy việc kết hợp dịch chiết
15

Dây thìa canh với HCA-SX và NBC là một công thức an toàn và hiệu quả
trong việc làm giảm trọng lượng cơ thể, giảm chỉ số khối cơ thể (BMI) trong
khi làm tăng nồng độ các HDL trong máu [17].
1.1.4.4. Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết cồn của cây Dây thìa canh đã được công bố là có tác dụng
ức chế trên các chủng vi khuẩn: Bacillus pumilis, Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae và Staphylococus aureus;
nhưng không có tác dụng đối với Escherichia coli và Proteus vulgaris [25],
[2].
1.2. Thu hoạch (thu hái) dược liệu theo GACP [37]
Theo GACP, thu hái cây thuốc trong mùa hay khoảng thời gian tối ưu
để đảm bảo dược liệu chất lượng tốt nhất. Thời điểm thu hái phụ thuộc vào bộ
phận dùng của cây nghiên cứu. Có thể tìm được các thông tin chi tiết về việc
ấn định thời điểm thích hợp cho thu hái, trong các Dược điển quốc gia, các
tiêu chuẩn đã xuất bản, những chuyên khảo chính thức và những loại sách
tham khảo chủ yếu. Thời điểm tốt nhất cho thu hoạch (mùa vụ/thời điểm đạt
chất lượng cao nhất) cần được xác định theo chất lượng và số lượng các hợp
phần có tính sinh học hơn là tổng sản lượng thực vật của các bộ phận cây
thuốc được nhắm đến. Nên thu hái cây thuốc trong những điều kiện tốt nhất
có thể, tránh sương mưa hoặc ẩm quá cao.
Các thiết bị thu hoạch và các loại máy khác cần được giữ sạch và điều
chỉnh để giảm sự thiệt hại và ô nhiễm do đất và các loại vật liệu khác.
Càng tránh cho dược liệu chạm đất để giảm tối thiểu lượng vi khuẩn
trong các dược liệu đã thu hái. Nếu có dùng các bộ phận dưới mặt đất (như
rễ), thì phải loại bỏ mọi đất cát bám vào dược liệu ngay khi thu hoạch. Dược
liệu đã thu hái phải được vận chuyển ngay trong điều kiện sạch và khô đến cơ
sở chế biến.
16

Mọi đồ đựng dùng trong thu hoạch phải được giữ sạch, không bị ô
nhiễm bởi các cây thuốc khác đã thu hoạch trước và những tạp chất.
Nên tránh mọi sự hư hại cơ học hoặc nén chặt dược liệu, ví dụ như chất
đống dược liệu hoặc dồn quá đầy vào các túi hay bao. Dược liệu bị phân hủy
cần phải được đánh dấu và loại bỏ trong khi thu hoạch, kiểm tra sau thi hoạch

và chế biến, để tránh ô nhiễm vi khuẩn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
1.3. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là dạng nâng cao và tự động
hóa của TLC cho phép chấm mẫu lên bản mỏng chính xác hơn và đánh giá
định lượng các vết được tách. Sự cải tiến về kĩ thuật này làm tăng hiệu lực
tách và giảm thời gian phân tích. Sự khác nhau giữa TLC và HPTLC ở chỗ
kích thước và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ. TLC thường có phạm vi
kích thước hạt từ 10-50µm, trung bình khoảng 20µm. Nhưng với HPTLC,
phạm vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5µm.
Phương pháp đưa mẫu lên bản mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ
chấm mẫu chính xác, làm giảm đường kính vết chấm ban đầu. Những cải tiến
này làm giảm đáng kể thời gian và tăng hiệu lực tách của peak [1], [16].
1.3.2. Ứng dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Phương pháp HPTLC được dùng để định tính, bán định lượng, thử tinh
khiết, định lượng, kiểm nghiệm Dược liệu [1].

17


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là cành và lá của cây Dây thìa canh (Gymnema
sylvestre (Retz) R Br .ex Schult.), tại vùng trồng Thái Nguyên, trên lô trồng 3
năm tuổi, thuộc giống hoa màu vàng kem.
Mẫu định lượng theo các giai đoạn phát triển của cây được thu hái theo
phần non và phần bánh tẻ:

- Phần non: Là phần đầu ngọn, lá và cành màu xanh nhạt, kích thước
chưa phát triển đầy đủ (Hình 2.1).
- Phần bánh tẻ: Là phần tiếp theo sau phần non, lá và thân thường màu
xanh đậm, đã phát triển đầy đủ về kích thước (Hình 2.2).

Hình 2.1. Nguyên liệu Dây thìa canh