Nghiên cứu bán định lượng một số vitamin trong hỗn hợp bằng phương pháp HPTLC

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



PHẠM KIM ANH

NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


PHẠM KIM ANH

NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. Nguyễn Thị Thuận

Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược


HÀ NỘI - 2014


LỜI CẢM ƠN
Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, xin cho phép tôi gửi lời cảm ơn
tới những ngƣời đã hƣớng dẫn, giúp đỡ và luôn ở bên tôi trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đầu tiên tới TS.
Nguyễn Thị Thuận, giảng viên bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng Đại học Dƣợc
Hà Nội, ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn cho tôi thực hiện đề tài này. Cùng
với tri thức và tâm huyết của mình, cô đã truyền đạt cho tôi vốn kiến thức quý
báu, lòng say mê công việc, tác phong làm việc nghiêm túc, khoa học Em
xin cảm ơn cô!
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô và anh chị kỹ thuật
viên trong bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các anh chị trong
khoa Vật lý đo lƣờng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đƣợc khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè là những nguồn cổ vũ tinh thần
lớn lao, đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, 5/2014
Sinh viên

Phạm Kim Anh

MỤC LỤC
CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ Trang
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu. 2
1.1.1. Vài nét về các vitamin B
1
, B
6
, B
12
2
1.1.1.1. Vitamin B
1
(Thiamin) 2
1.1.1.2. Vitamin B
6
(Pyridoxin) 2
1.1.1.3. Vitamin B
12
(Cobalamin) 3
1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B
1
, B

6
, B
12
trên thị trƣờng 4
1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử
dụng hiện nay 5
1.2. Cơ sở lý thuyết chung của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 6
1.2.1. Nguyên lý chung của TLC 6
1.2.2. Pha tĩnh trong TLC 7
1.2.3. Pha động trong TLC. 7
1.2.4. Các bƣớc tiến hành định lƣợng bằng TLC 8
1.2.4.1. Chuẩn bị bản mỏng 8
1.2.4.2. Đƣa mẫu phân tích lên bản mỏng 8
1.2.4.3. Khai triển sắc ký với pha động phù hợp 8
1.2.4.4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ 9
1.2.5. Ứng dụng của TLC 10
1.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 10
1.4. Vài nét về bán định lƣợng (Semiquantitative) 12


1.4.1. Khái niệm bán định lƣợng 12
1.4.2. Bán định lƣợng bằng HPTLC với phần mềm VideoScan 12
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, dung môi hóa chất và dụng cụ. 14
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. 14
2.1.2. Dung môi, hóa chất, thuốc thử. 15
2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị. 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện phát hiện 16
2.2.2. Đánh giá phƣơng pháp 17

2.2.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu 17
2.2.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính 17
2.2.2.3. Độ lặp lại 18
2.2.2.4. Độ đúng 18
2.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp trên một số chế phẩm thuốc lƣu hành trên thị
trƣờng 19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 19
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 21
3.1. Chuẩn bị mẫu trắng, dung dịch chuẩn và thử. 21
3.1.1. Pha mẫu trắng và dung dịch chuẩn gốc 21
3.1.2. Pha dung dịch chuẩn 21
3.1.3. Pha dung dịch thử 22
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 22
3.2.1. Khảo sát thành phần pha động 22
3.2.2. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 24
3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch mẫu đƣa lên bản mỏng và các điều kiện
sắc ký khác. 24


3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 26
3.3.1. Bán định lƣợng B
1
và B
6
26
3.3.1.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc 26
3.3.1.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính. 27
3.3.1.3. Độ lặp lại và độ đúng. 29
3.3.2. Bán định lƣợng B
12

32
3.3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc 32
3.3.2.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính 33
3.3.2.3. Độ lặp lại và độ đúng 35
3.4. Ứng dụng bán định lƣợng vitamin trong một số chế phẩm thuốc 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO


CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
AOAC
: Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association
of Official Analytical Chemists)
CT CPDP
: Công ty cổ phần dƣợc phẩm
CT TNHH
: : Công ty trách nhiệm hữu hạn
EtOH
: Ethanol
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HPTLC
: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin
Layer Chromatography)
Pyridoxin .HCl
: Pyridoxin hydroclorid
r
: Hệ số tƣơng quan
R

f

: Hệ số lƣu giữ
RSD
: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation).
Thiamin .HCl
: Thiamin hydroclorid
TLC
: Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography).
USP
: Dƣợc điển Mỹ (United States Pharmacopoea).
UV
: Tử ngoại (Ultra Violet).
VIS
: Khả kiến (Visible).








DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 1.1: Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B thƣờng
dùng và ƣu nhƣợc điểm

5
Bảng 1.2: So sánh một số tham số của TLC và HPTLC

11
Bảng 2.1: Các chế phẩm đƣợc nghiên cứu trong khóa luận
14
Bảng 2.2: Các chế phẩm đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích
15
Bảng 3.1: Kết quả phân tích vitamin B
1
, B
6
trên dãy dung dịch chuẩn
28
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B
1
, B
6

30
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đúng – B
1
, B
6

31
Bảng 3.4: Kết quả phân tích vitamin B
12
trên dãy dung dịch chuẩn
34
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B
12

36
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng – B
12

37
Bảng 3.7: Phần trăm hàm lƣợng các vitamin trong các chế phẩm so với
nhãn

38











DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Trang
Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC
11
Hình 3.1: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 1
23
Hình 3.2: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 2
23
Hình 3.3: Vị trí chấm mẫu trên bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254
kích thƣớc 20 x 10 cm

25
Hình 3.4: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B
1
, B
6
khi soi dƣới đèn UV ở
bƣớc sóng 366 nm

26
Hình 3.5: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B
1
và B
6
thu đƣợc với
phần mềm VideoScan

27
Hình 3.6: Đƣờng chuẩn vitamin B
1

28
Hình 3.7: Đƣờng chuẩn vitamin B
6

29
Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B
1
và B
6

ở bƣớc
sóng 366 nm

30
Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B
12
khi quan sát dƣới ánh sáng
khả kiến

32
Hình 3.10: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B
12
thu đƣợc với phần
mềm VideoScan

33
Hình 3.11: Đƣờng chuẩn vitamin B
12

34
Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B
12
ở ánh sáng
khả kiến

35
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, trên thị trƣờng có rất nhiều loại thuốc chứa hỗn hợp các

vitamin, hay gặp là dạng kết hợp các vitamin nhóm B. Theo thống kê từ danh
mục thuốc đã đƣợc cấp số đăng ký của Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam, từ tháng
7/2009 đến tháng 1/2014 có gần 500 chế phẩm thuốc multivitamin đã đƣợc
cấp số đăng ký lƣu hành trên thị trƣờng, trong đó khoảng 150 thuốc có thành
phần kết hợp 3 loại vitamin: B
1
, B
6
, B
12
[2]. Vitamin là nhóm chất rất dễ bị
phân hủy bởi nhiều tác nhân lý hóa (nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, các ion kim
loại ) làm giảm hàm lƣợng trong thuốc theo thời gian và điều kiện bảo quản.
Vì vậy, công tác kiểm tra chất lƣợng của các thuốc chứa vitamin nói riêng và
các thuốc nói chung rất cần đƣợc quan tâm.
Các phƣơng pháp hay đƣợc dùng để định lƣợng hỗn hợp vitamin hiện nay
là HPLC [3], quang phổ UV – VIS [4], [13]. Phƣơng pháp TLC mới chỉ đƣợc
sử dụng chủ yếu với mục đích định tính, thử tinh khiết. Tuy nhiên, từ khi xuất
hiện HPTLC, một kỹ thuật cải tiến của TLC thì việc sử dụng HPTLC để định
lƣợng/bán định lƣợng hoạt chất đã trở nên phổ biến hơn. Áp dụng kỹ thuật
HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng các vitamin trong hỗn hợp có một số
ƣu điểm nhƣ: tính đặc hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, định lƣợng đƣợc đồng
thời nhiều vitamin trong hỗn hợp, tiết kiệm thời gian, hóa chất. Vì vậy, để
đóng góp thêm một phƣơng pháp kiểm tra sơ bộ chất lƣợng thuốc hỗn hợp
vitamin cho các nhà sản xuất, kinh doanh thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu bán định lƣợng một số vitamin trong hỗn hợp bằng phƣơng pháp
HPTLC” với các mục tiêu:
1. Xây dựng phƣơng pháp bán định lƣợng các vitamin B
1
, B

6
, B
12
trong
hỗn hợp bằng HPTLC.
2. Đánh giá phƣơng pháp vừa xây dựng.
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu.
Mặc dù trên thị trƣờng có rất nhiều các chế phẩm multivitamin mà thành
phần là hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí có chế phẩm chứa tới 9 – 10 loại
vitamin khác nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi
chỉ nghiên cứu bán định lƣợng các vitamin B
1
, B
6
, B
12
trong các chế phẩm
thuốc chứa 3 loại vitamin này.
1.1.1. Vài nét về các vitamin B
1
, B
6
, B
12
[6], [13].
1.1.1.1. Vitamin B
1

(Thiamin)
- Trên thị trƣờng hiện nay, thiamin thƣờng đƣợc dùng dƣới dạng muối
hydroclorid và nitrat, 2 dạng muối này có tính chất tƣơng tự nhau. Công thức:
N
NH
3
C
NH
2
N
S
CH
2
CH
2
OH
CH
3
.Cl
-
.HCl (NO
3
-
)

- Tính chất: Thiamin hydroclorid là tinh thể không màu hoặc bột kết tinh
trắng, vị đắng, dễ tan trong nƣớc (1g/1ml), khó tan trong EtOH (1g/315ml cồn
tuyệt đối), không tan trong ether, benzen và chloroform. Độ ổn định: thiamin
hydroclorid ổn định trong dung dịch nƣớc (có pH từ 2 – 3,5). Do chứa dị vòng
thơm nên thiamin hấp thụ mạnh bức xạ UV.

- Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri – beri, phối hợp với B
6
, B
12
điều
trị các trƣờng hợp đau nhức dây thần kinh lƣng, hông, dây thần kinh sinh ba,
dùng trong trƣờng hợp mệt mỏi, kém ăn, suy dinh dƣỡng.
1.1.1.2. Vitamin B
6
(Pyridoxin)
- Vitamin B
6
là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở vị trí
nhóm chức số 4 là: pyridoxol, piridoxal, pyridoxamin (1). Chế phẩm dƣợc
3

dụng là dạng muối pyridoxol hydroclorid, thƣờng gọi là pyridoxin
hydroclorid (2).
N CH
3
OH
R
HOH
2
C
R= CH
2
OH: Pyridoxol
R=CH
2

NH
2
: Pyridoxamin
R= CHO: Pyridoxal

N CH
3
OH
CH
2
OH
HOH
2
C
. HCl

(1) (2)
- Tính chất: Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột
kết tinh trắng, dễ tan trong nƣớc (1g/4,5ml), tan trong EtOH (1g/90ml), không
tan trong chloroform, ether. Pyridoxin hydroclorid hấp thụ mạnh bức xạ UV,
ổn định trong môi trƣờng nƣớc với pH từ 2 – 4,5.
- Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh thiếu vitamin B
6
, biểu hiện: tổn thƣơng
ở mắt, mũi, miệng, gây co giật, sƣng đỏ khớp cổ tay, thiếu máu, phòng chống
viêm dây thần kinh ngoại vi do dùng isoniazid, điều trị quá liều isoniazid.
1.1.1.3. Vitamin B
12
(Cobalamin)
- Dạng dƣợc dụng thƣờng đƣợc dùng hiện nay ở Việt Nam của vitamin

B
12
là cyanocobalamin, công thức:

- Tính chất: Cyanocobalamin là những tinh thể màu đỏ tối hoặc bột vô
định hình, tan đƣợc trong nƣớc (1g/1,3ml), EtOH (1g/1,3ml), không tan trong
chloroform và ether. Cyanocobalamin hấp thụ mạnh cả bức xạ vùng tử ngoại
4

và khả kiến, dễ bị phân hủy bởi các tác nhân nhƣ oxi, ánh sáng mặt trời, độ
ẩm, các ion kim loại, khi ở trong dung dịch nƣớc có mặt các chất khác nhƣ
vitamin B
1
, C, PP
- Tác dụng: Điều trị các bệnh thiếu máu ƣu sắc hồng cầu to do thiếu
vitamin B
12
, phòng thiếu máu khi phẫu thuật cắt dạ dày hoặc hồi tràng, viêm
đau dây thần kinh
1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B
1
, B
6
, B
12
trên thị trƣờng [2].
Trên thị trƣờng hiện nay có rất nhiều loại chế phẩm chứa B
1
, B
6

, B
12
với
công dụng chung là: Điều trị các bệnh liên quan đến thiếu vitamin nhóm B,
suy nhƣợc cơ thể, chán ăn, thiếu máu, ngƣời mới ốm dậy, đau nhức do
nguyên nhân thấp khớp hay thần kinh, rối loạn thần kinh do nghiện rƣợu mạn
tính. Các dạng thuốc thƣờng gặp là:
- Dạng phối hợp B
1
– B
6
– B
12
với tỉ lệ các thành phần rất khác nhau:
Viên nén, thƣờng có hàm lƣợng B
1
– B
6
– B
12
là 125 mg – 125 mg –
125 µg (Caditrivit – US Pharma, Vitamin 3B – CT CPDP Quảng Bình, ),
hoặc 100 mg – 200 mg – 200 µg (Scanneuron – CT TNHH STADA Việt
Nam, Betex – CT TNHH The United Drug Thái Lan )
Dung dịch tiêm (Neurobion H5000 – Merck, Enpovit 3B – CTCP
SPM ).
Ngoài ra còn có dạng viên nang mềm, dạng cốm.
- Dạng kết hợp B
1
, B

6
, B
12
ở liều nhỏ hơn dạng thuốc 3B nói trên hàng
chục lần với các loại vitamin và acid amin khác: viên nang (Moriamin Forte –
CT Roussel Việt Nam, Vitacap – CT TNHH Mega Lifesciences Thái Lan ),
viên sủi (Sunlife Multivitamin của Đức, Haas Multivitamin của Hungari ),
dạng siro uống (Pediakids – Pháp, TGB Kidbaomin Plus – Việt Nam )
5

1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử
dụng hiện nay (bảng 1.1).


Phƣơng pháp định
lƣợng
Ƣu điểm chính
Nhƣợc điểm chính
Quang phổ UV-VIS
[3].
- Tiến hành nhanh.
- Cho kết quả có độ
chính xác cao.

- Chỉ định lƣợng đƣợc hỗn hợp
chứa 2-3 thành phần, không
định lƣợng đƣợc đồng thời
nhiều hoạt chất.
- Không đặc hiệu.

Sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) [4],
[13].
- Đặc hiệu.
- Độ lặp lại và độ
chính xác cao.
- Định lƣợng đƣợc
hỗn hợp nhiều
thành phần.
- Dung môi, hóa chất đắt tiền
(dung môi yêu cầu lọc loại khí
hoặc dùng loại chuyên dụng,
tốn nhiều dung môi).
- Thời gian phân tích lâu.
- Dễ tắc cột, khó bảo dƣỡng
thiết bị.
Định lƣợng riêng
từng vitamin sử dụng
kết hợp nhiều phƣơng
pháp: quang phổ hấp
thụ UV, phƣơng pháp
hóa học [12].
- Có thể áp dụng cho
hỗn hợp chứa cả
vitamin tan trong
dầu và vitamin tan
trong nƣớc.
- Cần thực hiện nhiều thao tác,
tốn công sức và thời gian.

Bảng 1.1: Các phương pháp định lượng hỗn hợp vitamin 3B thường
dùng và ưu nhược điểm.

6

Ngoài ra, hiện nay phƣơng pháp điện di mao quản cũng đã đƣợc nghiên
cứu để định lƣợng hỗn hợp các vitamin tan trong nƣớc [5].
Kỹ thuật HPTLC đã khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của các phƣơng
pháp định lƣợng trên, đó là thao tác phức tạp, thời gian tiến hành lâu (HPLC,
phƣơng pháp định lƣợng riêng từng thành phần) hoặc không định lƣợng đƣợc
mẫu có thành phần phức tạp (UV – VIS). Lý do là HPTLC có thao tác đơn
giản, cho phép phân tích đƣợc đồng thời một số lƣợng lớn mẫu thử chứa
nhiều hoạt chất nên tiết kiệm thời gian. Ngoài ra nó còn một số ƣu điểm khác
nhƣ có độ chọn lọc cao, sử dụng lƣợng nhỏ dung môi cho pha động nên tiết
kiệm chi phí, tránh ô nhiễm môi trƣờng [14], [15].
1.2. Cơ sở lý thuyết chung của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [1],
[14], [19].
1.2.1. Nguyên lý chung của TLC
- Sắc ký lớp mỏng là một trong các kỹ thuật tách sắc ký, trong đó dung
dịch chất phân tích đƣợc di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn.
Trong quá trình di chuyển, các thành phần trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc
chuyển dịch trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác
nhau tùy vào bản chất của chúng. Kết quả thu đƣợc là một sắc ký đồ trên lớp
mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất
của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
- Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
lƣu giữ R
f
đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và

khoảng dịch chuyển của dung môi:

b
a
f
R
7

Trong đó:
a là khoảng dịch chuyển của chất phân tích;
b là khoảng dịch chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu.
R
f
: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
- Trị số R
f
nằm trong khoảng 0,2 – 0,8 sẽ đạt độ phân giải cực trị.
1.2.2. Pha tĩnh trong TLC
- Pha tĩnh là một lớp mỏng các chất ở dạng hạt nhỏ có kích thƣớc đồng
nhất, đƣợc trải thành lớp mỏng và đƣợc cố định trên một mặt phẳng (thủy
tinh, nhôm hoặc chất dẻo). Các pha tĩnh đƣợc sử dụng dựa trên nhiều cơ chế
phân tách khác nhau: phân bố, hấp thu, rây phân tử, trao đổi ion, điện di, ái
lực Một số chất thƣờng dùng làm pha tĩnh cho TLC: phổ biến nhất là silica
(SiO
2
) và alumina (Al
2
O
3
), ngoài ra còn có dẫn chất siloxan, cellulose,

cellulose trao đổi ion, cát biển, gel sephadex… Nhiều khi ngƣời ta còn đƣa
thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
cần phân tích.
- Khi phân tích vitamin thƣờng dùng pha tĩnh silica, khi đó quá trình sắc
ký sẽ dựa trên cơ chế hấp phụ.
1.2.3. Pha động trong TLC
- Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với
nhau theo tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Tiêu chuẩn quan trọng
nhất để chọn hệ dung môi pha động là độ phân cực và pH của nó. Cách tốt
nhất là lựa chọn pha động bằng thực nghiệm dựa trên cơ sở:
- Về độ phân cực: nếu chất phân tích có độ phân cực kém, chọn chất hấp
phụ phân cực mạnh (silica gel, Al
2
O
3
), hệ dung môi khai triển có độ phân cực
8

kém (hexan, toluen, benzen ). Ngƣợc lại chất phân tích dạng ion hay phân
cực sẽ đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân cực (methanol, nƣớc ).
- Về độ pH của pha động: Nếu thêm một lƣợng nhỏ acid acetic hoặc
amoniac vào dung môi chứa nƣớc sẽ làm tăng đáng kể độ tan của base hoặc
acid tƣơng ứng, chất phân tích sẽ di chuyển nhanh hơn và vết gọn hơn.
1.2.4. Các bƣớc tiến hành định lƣợng bằng TLC
1.2.4.1. Chuẩn bị bản mỏng
Đối với bản mỏng silica gel, khi bảo quản trong điều kiện thƣờng, các đơn
vị silanol chứa nhóm hydroxyl của silica gel dễ dàng hấp phụ nƣớc trong
không khí, làm giảm khả năng hấp phụ chất phân tích của nó. Do vậy, bản
mỏng silicagel thƣờng đƣợc sấy ở 100 – 120
o

C trong 1 – 2h để loại nƣớc hấp
phụ, mà không làm mất đi nhóm hydroxyl của đơn vị silica gel. Khả năng hấp
phụ của silica gel cao nhất khi đƣợc hoạt hóa ở 105
o
C trong 2h.
Ngoài ra, bản mỏng nên đƣợc rửa sạch trƣớc khi khai triển để loại bỏ bụi
bẩn trên bề mặt nếu bảo quản không tốt. Dung môi rửa có thể là methanol,
methanol – dicloromethan (1:1) hoặc isopropanol. Cho dung môi chạy hết bản
mỏng, sau đó hoạt hóa lại bản mỏng đã rửa trong tủ sấy [10].
1.2.4.2. Đƣa mẫu phân tích lên bản mỏng
Lƣợng mẫu đƣa lên bản mỏng ảnh hƣởng lớn tới trị số R
f
và hiệu quả tách
sắc ký. Nếu lƣợng chất quá lớn, vết sắc ký sẽ lớn và bị kéo dài, khi đó các vết
có trị số R
f
gần nhau sẽ chồng lên nhau. Nếu lƣợng chất quá nhỏ sẽ không
phát hiện đƣợc vết. Vị trí đƣa mẫu lên bản mỏng cần đảm bảo không quá gần
bề mặt pha động, các vết cách rìa bản mỏng và cách nhau đủ xa để không bị
ảnh hƣởng bởi hiệu ứng bờ và các vết khác khi khai triển.
1.2.4.3. Khai triển sắc ký với pha động phù hợp
9

Khai triển sắc ký trong bình thủy tinh có nắp đậy kín. Để tăng độ bão hòa
dung môi trƣớc khi khai triển, thƣờng đặt một tờ giấy lọc áp sát thành bình.
Sau khi chấm mẫu, để bay hơi hết dung môi pha mẫu trên bản mỏng rồi
đặt vào bình sắc ký đã bão hòa pha động. Mép dƣới bản mỏng đƣợc nhúng
vào và cách bề mặt pha động khoảng 1 cm.
1.2.4.4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ
Dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn cách

phát hiện thích hợp. Một số kỹ thuật thƣờng gặp:
- Phun thuốc thử hiện màu. Thuốc thử chung để nhận biết nhiều chất hữu
cơ là acid phosphomolypdic, acid sulfuric đặc, hơi iod. Ngoài ra còn các
thuốc thử đặc hiệu với từng chất nhƣ ninhydrin để nhận biết acid amin và các
nhóm chức amin, rhodamin B để nhận biết các chất lipid
- Soi dƣới đèn UV: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ sẽ tối đi hoặc
phát quang khi soi dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 hoặc 366 nm.
- Dùng densitometer: Thiết bị này sẽ đo cƣờng độ tia phản xạ từ bề mặt
bản mỏng khi soi dƣới đèn UV – VIS. Chất phân tích hấp thụ bức xạ đƣợc ghi
lại thành pic sắc ký.
1.2.4.5. Định lƣợng các chất trong vết sắc ký
Có hai phƣơng pháp định lƣợng các chất trong vết sắc ký:
- Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm
sạch dịch chiết rồi định lƣợng chất phân tích bằng phƣơng pháp thích hợp.
- Định lƣợng trực tiếp trên bản mỏng bằng cách đo diện tích hay cƣờng độ
màu của vết sắc ký, sử dụng 2 kỹ thuật:
10

Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cƣờng độ hấp thụ
hoặc huỳnh quang.
Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: quét bản mỏng với hệ thống phân
tích hình ảnh, ví dụ camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình
ảnh của vết sắc ký, sau đó xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính.
1.2.5. Ứng dụng của TLC
TLC đƣợc ứng dụng trong định tính, thử tinh khiết, định lƣợng, bán định
lƣợng các chất trong hỗn hợp nhiều thành phần.
1.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không khác nhiều so với sắc ký lớp mỏng
thông thƣờng. Điểm khác là kỹ thuật này sử dụng bản mỏng hiệu năng cao có
lớp pha tĩnh mỏng hơn, với bột mịn có kích thƣớc hạt nhỏ hơn, độ đồng đều

cao hơn [1].
Hiện nay, quá trình chấm sắc ký đƣợc điều khiển và thực hiện bằng máy,
số vết, lƣợng dịch chiết sẽ chấm trên bản mỏng đƣợc xác lập trên máy vi tính.
Quá trình chấm dịch chiết thực hiện với sự hỗ trợ của máy nén khí hoặc bình
khí nén. Sau khi triển khai trong bình triển khai sắc ký tự động, sắc ký đồ
đƣợc chụp ảnh qua buồng chụp và kết quả đƣợc đánh giá bằng phần mềm
chuyên dụng (Hình 1.1).
11



Bảng 1.2 sau đây sẽ giúp so sánh một số tham số của TLC và HPTLC:
Bảng 1.2. So sánh một số tham số của TLC và HPTLC

Tham số
HPTLC
TLC
Công nghệ
Bán tự động
Thủ công.
Kích thƣớc hạt
5 – 6 µm
10 – 12 µm
Độ dày lớp pha tĩnh
100 µm
250 µm
Chiều cao đĩa lý thuyết
12 µm
30 µm
Hiệu lực tách

Cao
Thấp hơn.
Giới hạn phát hiện (sử dụng máy đo
độ hấp thụ UV – VIS).
100 – 500 pg
1 – 5 ng
Giới hạn phát hiện (sử dụng máy
quét huỳnh quang).
5 – 10 pg
50 – 100 ng

Máy tính có
phần mềm
VideoScan
Máy chấm
mẫu tự động
Bình triển
khai sắc ký
Buồng
chụp
Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC.

12

So với TLC, HPTLC đã kế thừa đƣợc những lợi thế vốn có và mang một
số ƣu điểm trội hơn: cho vết sắc ký gọn hơn, khả năng tách tốt hơn. Đồng
thời, các bƣớc của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển sắc ký,
nhận diện vết đƣợc tiến hành bán tự động, các thông số đƣợc kiểm soát một
cách chặt chẽ giúp giảm thiểu tối đa các sai số ngẫu nhiên gặp phải, nhất là ở
khâu đƣa mẫu lên bản mỏng, cho kết quả có độ lặp lại và độ đúng cao hơn

TLC [14].
1.4. Vài nét về bán định lƣợng (Semiquantitative)
1.4.1. Khái niệm bán định lƣợng
- Bán định lƣợng là xác định một cách gần đúng hàm lƣợng của một chất,
kết quả bán định lƣợng rơi vào khoảng giữa của một kết quả định lƣợng và
một kết quả định tính [8].
- Phân tích bán định lƣợng tƣơng tự nhƣ phân tích định tính trong việc
phát hiện sự có mặt hay vắng mặt của một chất phân tích, nhƣng sau đó đi vào
để cung cấp một con số đại diện của hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu vật
có liên quan đến các ngƣỡng bình thƣờng/không bình thƣờng.
- WHO thƣờng không đƣa ra các tài liệu tham khảo đối với kết quả phân
tích bán định lƣợng, và phạm vi ứng dụng của bán định lƣợng có thể khác
nhau đáng kể giữa các phòng thí nghiệm [20].
1.4.2. Bán định lƣợng bằng HPTLC với phần mềm VideoScan
- Khi định lƣợng các chất bằng HPTLC, độ chính xác của kết quả phụ
thuộc nhiều vào kỹ thuật xác định và lƣợng giá vết trên sắc ký đồ. Nếu sử
dụng kỹ thuật xử lý ảnh sắc ký với camera kỹ thuật số, thì độ chính xác của
kết quả phần lớn phụ thuộc vào phần mềm xử lý dữ liệu ảnh.
13

- Phần mềm xử lý ảnh VideoScan là một phần mềm có hạn chế về độ
chính xác khi đọc kết quả dữ liệu ảnh. Vì vậy, khi sử dụng phần mềm này để
xử lý ảnh sắc ký đồ thì chỉ có thể xác định đƣợc sơ bộ hàm lƣợng các chất
trong mẫu phân tích (bán định lƣợng).
14

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, dung môi hóa chất và dụng cụ.
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.
Mẫu thử là một chế phẩm chứa vitamin B

1
, B
6
, B
12
trên thị trƣờng và một
chế phẩm không chứa các vitamin này đƣợc dùng làm mẫu trắng (bảng 2.1):

Tên
biệt
dƣợc
Dạng
bào chế
Thành phần, hàm lƣợng
hoạt chất
Nhà sản xuất
Số lô, ngày sản
xuất, hạn dùng
Betex
Viên
nén bao
phim
Thiamin .HCl: 100 mg
Pyridoxin .HCl: 200 mg
Cyanocobalamin: 200 µg

Công ty
TNHH The
United Drug
(1996), Thái

Lan.
Số lô: 413028
NSX:
29/03/2013
HSD:
28/03/2016
Ko –
ginszhi
(Mẫu
trắng)
Viên
nang
mềm
Cao Linh Chi: 13 mg
Cao sâm: 13 mg
Magnesium sulphate:
5mg
Vitamin A: 5 mg
Vitamin B2: 3 mg
Ferrous Fumarate: 5 mg
Công ty
TNHH TC
PHARMA,
Việt Nam
Số lô: 151114
NSX:
12/10/2013
HSD:
12/10/2016
Áp dụng phƣơng pháp để phân tích một số chế phẩm khác trên thị trƣờng

(bảng 2.2):
Bảng 2.1: Các chế phẩm được nghiên cứu trong khóa luận.

15

Bảng 2.2. Các chế phẩm đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích
Tên biệt
dƣợc
Dạng
bào chế
Thành phần, hàm lƣợng
hoạt chất
Nhà sản xuất
Số lô, ngày
sản xuất, hạn
dùng
Nebamin
Viên
nén bao
đƣờng
Thiamin .HCl: 50 mg
Pyridoxin .HCl: 250 mg
Cyanocobalamin: 250
µg
Công Ty
CPDP Trung
Ƣơng 25
(UPHACE),
Việt Nam.
Số lô: 312561

NSX:
07/06/2013
HSD:
27/06/2015
Tervit H
Viên
nén bao
phim
Thiamin .HCl: 250 mg
Pyridoxin .HCl: 250 mg
Cyanocobalamin: 250
µg
Công Ty
CPDP
AMPHARCO
Việt Nam.
Số lô: L2007
NSX:
29/11/2011
HSD:
20/12/2014
Neurobion
Thuốc
tiêm
(ống
3ml)
Thiamin .HCl: 100 mg
Pyridoxin .HCl: 100 mg
Cyanocobalamin: 5 mg
MERCK,

Indonesia

Số lô:
T 1177904
HSD:
10/09/2015
2.1.2. Dung môi, hóa chất, thuốc thử.
- Nƣớc cất, ethanol, chloroform, acid acetic, amoniac đạt tinh khiết phân
tích.
- Chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, đạt tiêu chuẩn
Dƣợc Điển Việt Nam IV: thiamin hydroclorid hàm lƣợng 99,87%, pyridoxin
hydroclorid hàm lƣợng 99,97%, cyanocobalamin 99,67%.
16

2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị.
- Máy siêu âm Bandelin Sonorex Super RK 106
- Máy ly tâm KUBOTA 6500
- Máy quang phổ UV-VIS Cary 60
- Hệ thống máy HPTLC CAMAG gồm:
Máy sấy bản mỏng
Máy chấm sắc ký LINOMAT 5
Máy khai triển sắc ký ADC2
Buồng chụp ảnh sắc ký TLC VISUALIZED
Phần mềm xử lý kết quả: VideoScan
- Cân phân tích AUW 220
- Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (MERCK, Đức)
- Các dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, cốc có mỏ, đũa thủy tinh,
bình chiết, bình nón, ống nghiệm, phễu lọc, giấy lọc.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện phát hiện

- Bản mỏng: bản mỏng silica gel có thêm chất phát huỳnh quang ở bƣớc
sóng 254 nm của MERCK.
- Chọn pha động: sau khi khảo sát một số tài liệu tham khảo [16], [17] với
bản chất bản mỏng lựa chọn, chúng tôi tiến hành khảo sát hai pha động (1) và
(2) để lựa chọn điều kiện tối ƣu:
(1). EtOH – chloroform – aceton – amoniac, 2:2:2:1.
(2). EtOH – chloroform – acid acetic – amoniac – nƣớc, 6:5:5:1:1.
- Khảo sát điều kiện phát hiện: hiện vết sắc ký dƣới đèn UV – VIS, chọn
bƣớc sóng thích hợp để phân tích các thành phần trong hỗn hợp vitamin.