Nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 183 211 tổng hợp được

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN HỮU CHIẾN



NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO
STREPTOMYCES 183.211 TỔNG HỢP
ĐƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
:
ThS. Nguyễn Liên Hương

Nơi thực hiện
:
Bộ môn Vi sinh - Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội




HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Liên Hương
đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên
đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp
Dược, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện hóa học – Viện hàn lâm khoa
học và công nghệ Việt Nam, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội. Nhân dịp
này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy
giáo, cô giáo, cán bộ nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền
đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động
viên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.
Do còn hạn chế về thời gian, phương tiện, kinh phí và trình độ của bản
thân, chắc chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận
được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để khóa luận này được
hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, Ngày 12tháng 5 năm 2014

Sinh viên

NGUYỄN HỮU CHIẾN

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh 3
1.1.5. Giới thiệu về tính kháng kháng sinh 3
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 4
1.2. Đại cương về xạ khuẩn. 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces 5
1.2.3. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn 5
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 6
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 6
1.3.1. Mục đích 6
1.3.2. Chọn giống có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 6
1.3.3. Đột biến cải tạo giống 7
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 8
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8
1.4.1. Khái niệm lên men 8
1.4.2. Các phương pháp lên men 9
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 10
1.5.2. Chiết xuất 11
1.5.3. Tinh chế 11

1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12
1.6.1. Phổ tử ngoại – khả kiến 12
1.6.2. Phổ hồng ngoại 12
1.6.3. Phổ khối MS 12
1.7. Geosmin và các chất bay hơi liên quan trong phản ứng sinh học – nuôi
cấyStreptomyces citreus CBS109.60 13
1.8. Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một streptomycete có sắc tố khuếch
tán màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam 13
1.9. Phân lập một polyene mới có phổ kháng nấm rộng từ Streptomyces sp.
MTCC 5680 14
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Máy móc, thiết bị 19
2.2.Nội dung nghiên cứu 19
2.2.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.211 19
2.2.2. Chọn lọc, cải tạo giống 19
2.2.3. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 20
2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được
20
2.3. Phương pháp thực nghiệm 20
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20
2.3.2. Phân loại Streptomyces 183.211 theo ISP 20
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21
2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 22
2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 23
2.3.6. Đột biến 23
2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 24

2.3.8. Xác định độ bền nhiệt, pH của kháng sinh trong dịch lên men 25


2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25
2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 26
2.3.11. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 26
2.3.12. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 26
2.3.13. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 27
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 28
3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.211 28
3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 29
3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 30
3.4. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 31
3.5. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 32
3.6. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 33
3.7. Kết quả chọn chủng lên men 33
3.8. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt 34
3.9. Kết quả chọn dung môi và pH chiết xuất kháng sinh 35
3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 36
3.11. Kết quả sắc ký cột lần 1 37
3.12. Kết quả sắc ký cột lần 2 38
3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và đo phổ của kháng sinh 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
 Kết luận 40
 Kiến nghị 41

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
DM Dung môi
dd Dung dịch
ĐB Đột biến
Gr Gram
Gr(+) Gram dương
Gr(-) Gram âm
ISP InternationalStreptomyces project
(Chương trình Streptomyces quốc tế)
IR Hồng ngoại – Infrared
HTKS Hoạt tính kháng sinh
MC Mẫu chứng
MS Phố khối – Mass spectrometry
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
UV Tử ngoại – Ultraviolet
VSV Vi sinh vật
B. subtilis Bacillus subtilis
S. flexneri Shighella flexneri



Đường kính trung bình
s Sai số chuẩn có hiệu chỉnh

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1:Các chủng VSV kiểm định
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.4: Các dung môi sử dụng
Bảng 3.1: Các đặc điểm của Streptomyces 183.211 và Streptomyces citreus
Bảng 3.2: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên
Bảng 3.4:Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2
Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men chìm
Bảng 3.7: Kết quả chọn chủng lên men
Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền với pH
Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền với nhiệt
Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết
Bảng 3.11: Kết quả sắc ký chọn hệ DM
Bảng 3.12: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng của các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng P1: Một số kháng sinh do các chủng Streptomyces tạo ra



DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình P1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Hình P2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
Hình P3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
Hình P4: Hình ảnh hiển vi chuỗi bào tử của Streptomyces 183.211
Hình P5: Hình ảnh hiển vibề mặt bào tử của Streptomyces 183.211
Hình P6: Nuôi cấy xạ khuẩn bề mặt

Hình P7: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch
Hình P8: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc
Hình P9: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch
Hình P10: Bình chứa dịch lên men chọn môi trường
Hình P11: Phổ UV-VIS
Hình P12: Phổ IR
Hình P13: Phổ MS
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ khi kháng sinh được tìm ra và ứng dụng rộng rãi thì đã có rất nhiều
căn bệnh do vi khuẩngây ra từng được coi là nan y đã được chữa trị thành
công. Nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy ngày càng có nhiều chủng vi
khuẩn gây bệnh kháng lại các kháng sinh có sẵn, nhiều kháng sinh trước đây
đã không còn tác dụng trên một số chủng gây bệnh nữa. Vì vậy, việc nghiên
cứu tìm ra kháng sinh mới luôn là vấn đề cần thiết và luôn được cả thế giới
quan tâm.
Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ, khoa học kỹ thuật, kháng
sinh mới thường được tổng hợp theo 3 hướng chính: tổng hợp hóa học, bán
tổng hợp và sinh tổng hợp.
Vi sinh vật có khả năng tổng hợp kháng sinh rất đa dạng và phong phú
có thể là vi khuẩn, xạ khuẩn hay vi nấm. Trong đó, chi xạ khuẩn Streptomyces
có nhiều loài xạ khuẩn có khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc
và khả năng kháng khuẩn hơn cả. Ngoài ra một số loài trong chi này còn tổng
hợp được các chất chữa ung thư.
Do đó, chúng tôi lựa chọn đề tài
“Nghiên cứu kháng sinh do Streptomyces 183.211 tổng hợp được ”với mục
tiêu sau:
- Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.211.
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Xác định các điều kiện tối thích để lên men, chiết tách, tinh chế kháng
sinh
- Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được.


2

CHƯƠNG I:TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các
nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một
cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên
sinh, ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp. [7], [13]
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm
của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học…
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho
người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng
sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời
gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác
.
[5,7,14]

Sau đây là một số nhóm kháng sinh phân loại theo cấu trúc hóa học :[5,7,14]
Bảng 1.1 :Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể

- lactam
Penicillin, Cephalexin

Phenicol Chloramphenicol
Aminosid Streptomycin, Tobramycin
Macrolid Erythromycin, Clarithromycin
Lincosamid Lincomycin, Lindamycin
Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin
Peptid Vancomycin, Polymycin
Quinolon Floxacin, Levofloxacin
Cotrimoxazol Cotrimoxazol

3

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trị chính xác
hay các phân tử đích của tế bào VSV, làm biến đổi các phản ứng đó.[14]
Có 6 cơ chế tác dụng chủ yếu:[5,13,14]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh
Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực khác như:
- Trong chăn nuôi: dùng kháng sinh trong thú y để chữa bệnh cho động vật:
griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò…. Kháng sinh còn
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi
phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà vịt.[7]
- Trong trồng trọt: kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus gây

bệnh cho cây trồng: validamycin dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây
bệnh khô vằn hại lúa.[7]
- Trong công nghiệp thực phẩm: bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt
VSV trong thực phẩm : subtilin(do B.subtilis tạo ra).[7]
1.1.5. Giới thiệu về tính kháng kháng sinh
Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó
trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị
liệu.[13,14]
4

Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận.
Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi VSV nhất định đối với một số
kháng sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính
thấm tế bào, do các enzym vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc
do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác
dụng.[13][14]
1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh được giới thiệu ở hình P1 phần
phụ lục. [8,12]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn.
Xạ khuẩn(Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C trên
55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa
số các xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân
nhánh. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng
nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất
nhiều.[4,10,13]
Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì
khoảng 55-60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản
xuất nhiều loại enzym (amylase, cellulose, protease…), cũng như các hợp

chất khác.[13]. Xạ khuẩn được phân loại theo sơ đồ hình P2 phần phụ lục. [4]
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.
Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt mà thường có dạng thô ráp,
dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[4,13]
5

Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3 – 1,0μm đến 2-
3μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ
khuẩn hết sức phong phú : da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám [4,13]
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
- Đặc điểm hình thái:[4,13,16]
Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh:
+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào MT nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá
trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra MT một số loại sắc tố,
có loại tan trong nước, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử): khuẩn ty khí sinh sau một thời gian phát triển
trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có rất nhiều hình dạng
khác nhau: thẳng, uốn cong, móc câu, xoắn; phân cắt tạo thành các bào tử
trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng
trơn nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc.
- Đặc điểm sinh lý:[4,13,16]
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao.Để phát triển,
chúng phân giải các hydrocacbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng,
đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat
thành nitrit.Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích
của chúng là 22-32
o
C, pH tối thích thường là 6,8 – 7,5.

- Khả năng tạo sắc tố:[4,13,16]
Sắc tố tạo thành từ Streptomycesđược chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc
tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.
1.2.3. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn
Có khá nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên
cứu và phát triển, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, khóa
6

phân loại của Krassilnhikov (Nga), khóa phân loại của Gauze,… Khóa phân
loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (International
Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất(1970) đã được sử dụng
rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chiStreptomyces trong họ
Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được
sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid,
sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử và khả năng tiêu thụ các
nguồn hydratcarbon.[4,13,16]
Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kỹ thuật xác định trình tự gen 16s
ADNđể phân loại xạ khuẩn đã và đang được áp dụng. Ưu điểm là cho kết quả
khá chính xác, đáng tin cậy.[13]
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều
kháng sinh nhất và có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã tìm
thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% được tổng hợp từ Streptomyces.
Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn được trình bày ở bảng P1phần
phụ luc.[4,13]
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên(bùn, đất,
nước, mô thực vật ) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp
thấp. Do đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi

phải cải tạo , chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều
kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[8,12]
1.3.2. Chọn giống có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có HTKS tăng lên 20-30% so với những cá thể khác.
7

Cần phải chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu
tiếp.[8,11,12]
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để
nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được
những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các
phương pháp đột biến nhân tạo.[8,12,13]
1.3.3. Đột biến cải tạo giống.[8,11,12,13]
Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:
- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ(HNO
2
), dimethylsulfat,
hydroxylamin,…
- Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β.
- Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon,
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ
giết chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến
gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đếnlàm mất hoặc làm giảm khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh lên mạnh mẽ(đột biến dương).
Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả
năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách đột biến, thời gian và cường độ
bức xạ. Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với các tế bào VSV
có kích thước nhỏ thì tia UV có thể đâm tới vùng nhân. Tia UV có thể làm

cho các base pyrimidin trên cùng 1 mạch của ADN hình thành các cấu trúc
dimer T-T, C-C, T-C. Các dimer ảnh hưởng tới sự ghép đôi bổ sung trong sao
chép để lại một vết khuyết trên mạch bổ sung gây ĐB gen.



8

1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV rất cần thiết với mục đích cụ thể là: giữ giống
VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không
bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.[8,10,11,12]
Thông thường có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
- Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang
ống(hoặc lọ) MT mới.
- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng).
- Đông khô(phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh).
- Đông lạnh(huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp).
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là
nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng
trong tủ lạnh 2
o
C và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần.[8,10,11,12]
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động
của VSV nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng
và các hợp chất trung gian cho chúng.[4 , 7, 11]

Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh học trong bình lên men trong môi
trường dịch thể(lên men chìm) là các hệ thống đảm bảo sinh trưởng, phát triển
của VSV theo 4 pha đặc thù là pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa),
pha cân bằng và pha suy tàn. Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo ra lúc gần kết
thúc quá trình sinh trưởng, vào pha cân bằng. Đường cong sinh trưởng phát
triển của xạ khuẩn được trình bày ở hình P3 phần phụ lục. [4,7,11].

9

1.4.2. Các phương pháp lên men
-Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể
rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng
oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là
thao tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại
có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó cơ
giới hóa tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề
mặt trong chọn giống và giữ giống trong phòng thí nghiệm.[3,7,11]
-Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển
trong không gian 3 chiều của môi trường.Phương pháp này dùng cho cả VSV
hiếu khí và kị khí. Đối với VSV kị khí trong quá trình lên men không cần sục
khí, còn VSV hiếu khí thì phải vừa khuấy trộn vừa sục khí liên tục. Phương
pháp này có ưu điểm là hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng
triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa. Tuy nhiên
vẫn có nhược điểm là phải có thiết bị chuyên dụng, chi phí đầu tư lớn, đòi hỏi
phải làm trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.[7,8,11]
 Có 4 kiểu lên men chìm như sau:[7, 8, 12]
+ Lên men mẻ(lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên
men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản
phẩm. Kết thúc qua trình, người ta thu lấy sản phẩm.
+ Lên men bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm MT dinh

dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng cao hiệu
quả sử dụng bình lên men.
+ Lên mên bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT
dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ
sau những khoảng thời gian nhất định.
10

+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã
phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men
và đồng thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình.
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men[7,8,11,12]
-pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng
trực tiếp của các ion H
+
hay OH
-
đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của
enzym hoặc là tác dụng gián tiếp.
-Nhiệt độ: Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng mà
còn ảnh hưởng đến kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất và nhu cầu dinh
dưỡng của VSV. Ở nhiệt độ thấp, VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao
VSV bị chết do biến tính protein và kể cả ARN. Thiết bị lên men cần có bộ
phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối thích cho
VSV.
-Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi
chất trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tương
thích với tốc độ sử dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ
làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm tàng.
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố
tới quá trình lên men để tìm các điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi

nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn.
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau
quá trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên
men thường thấp. Tùy vào đặc tính của loài vi sinh vật mà kháng sinh có thể
nằm trong sinh khối hoăc trong dịch lọc. Vì vậy, để thu được sản phẩm mong
muốn phải lựa chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp.[1,9]
11


1.5.2. Chiết xuất
Chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác, thường
dùng dung môi hữu cơ (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm
chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào
nhau
Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dịch lên men người ta ứng dụng
phương pháp chiết lỏng – lỏng với các phép chiết: chiết đơn, chiết lặp, chiết
ngược dòng.
Với kháng sinh nội bào: Tiến hành chiết rắn – lỏng. Nguyên tắc của
phương pháp này là dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh vào dung môi
chiết.[9,10]
1.5.3. Tinh chế
Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một
hỗn hợp phức tạp đến một hỗn hợp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách
riêng từng chất. Đối với hỗn hợp đồng nhất, dùng phương pháp chuyển pha,
dùng dung môi thích hợp để chuyển một chất từ pha này sang pha khác.
Phương pháp bao gồm: chiết, thẩm thấu, sắc ký.[9,10]
Quá trình tách sắc ký dùng để tách từng phần ra khỏi hỗn hợp. Dựa trên

sự phân chia khác nhau của các thành phần khác nhau vào hai pha luôn tiếp
xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động. Quá trình sắc
ký trải qua ba giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha
tĩnh và phát hiện chất cần tách.[1,6,9,10]
Một số phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp
kháng sinh: [1,6,9]
12

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp
phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn hấp phụ. Chất
hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ.Đại lượng đặc
trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số R
f
.
+ Sắc ký cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác
nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành màng
phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ)
được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ tử ngoại – khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay
đổi mức năng lượng của các điện tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích
thích. Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ
hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ(ví dụ: những phân tử càng có nhiều liên kết
đôi thì sự hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên
hợp). Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N,S,O, …
có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS.[1,2,6,10,15]
1.6.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng
thái năng lượng của các electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động

của phân tử.
Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử.
Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm
chức.[1,6,10,15]
1.6.3. Phổ khối MS
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỉ số khối lượng và điện tích của
ion(m/z) được tạo thành trong pha phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các ion
13

tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân
tích khối. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng các pic có
cường độ khác nhau tập hợp thành phổ khối.Phổ khối cung cấp thông tin định
tính về khối lượng phân tử , nhận dạng các chất, xác định cấu trúc và định
lượng các chất.[1,6,10,15]
1.7.Geosmin và các chất bay hơi liên quan trong phản ứng sinh học –
nuôi cấyStreptomyces citreus CBS109.60
Streptomyces citreus CBS 109,60 sản xuất geosmin và một hỗn hợp
phức tạp các hợp chất dễ bay hơi khác trong phản ứng sinh học khi nuôi cấy
2,5 lít trong phòng thí nghiệm. Chất dễ bay hơi được phân lập từ tế bào bị phá
vỡ, từ môi trường nuôi cấy, và từ khí thoát ra của các phản ứng sinh học bằng
cách hấp phụ trên Lewatit OC 1064MD. Phân tích định lượng và định tính
được thực hiện bằng cách sử dụng sắc ký khí và sắc ký khí – khối phổ.S.
citreus sản xuất 56 hợp chất dễ bay hơi, trong đó chủ yếu là terpenoid nhưng
cũng bao gồm ceton béo, rượu, este, pyrazines, furan, và các loại hương thơm
trong giai đoạn sinh trưởng. Các thành phần chính là geosmin và
germacradienol.[17]
1.8. Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một streptomycetecó sắc tố khuếch
tán màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam
Một xạ khuẩn được định tên là GIMV4.0001, được phân lập từ mẫu đất
rừng ở Việt Nam . Chủng tạo ra các sợi khí sinh màu trắng và xanh tím, sắc tố

khuếch tán trên môi trường thạch tổng hợpcủa Gause . Màu sợi nấm bề mặt
không nhạy cảm với pH. Quan sát chuỗi bào tử của chủng GIMV4.0001dưới
kính hiển vithấychuỗi bào tử thẳng, dài, hình trụ, và thông tinvề hóa định
dạng khẳng định rằng chủng này thuộc về các chi Streptomyces. Chủng có
sinh sắc tố Melamin, nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn đối với
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida
14

albicans hoặc Penicillium citrinum. Phân tích trình tự gen 16S rRNA của
chủng GIMV4.0001 cho thấy chủng có sự tương đồng cao nhất (99,4%)
là Streptomyces bikiniensis ATCC 11062. Tuy nhiên, sự liên quan DNA-DNA
giữa chủng GIMV4.0001và S. bikiniensis ATCC 11062 được tìm thấy là
50,3%. Chủng GIMV4.0001 cũng có thể được phân biệt với S. bikiniensis
ATCC 11062 (T) và các loài Streptomyces có trình tự gen 16S rRNA giống
nhau cao (98-99%) dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa. Trên cơ
sở tính chất sinh lý và phân tử của nó, rõ ràng là chủng GIMV4.0001 đại diện
cho một loài mới thuộc chi Streptomyces , mà tên Streptomyces vietnamensis
sp. Nov được đề xuất. Loại chủng là GIMV 4.0001 (= CCTCC M 205.143 =
IAM 15.340).[18]
1.9. Phân lập một polyene mới có phổ kháng nấm rộng từ Streptomyces
sp. MTCC 5680
Một kháng sinh polyene macrolid mới PN00053được phân lập từ dịch
lên men của Streptomyces sp.chủng MTCC - 5680. Chủng này được phân lập
từ vùng đất núi màu mỡ ở Naldehra, Himachal Pradesh, Ấn Độ. Hợp chất
PN00053 đã được tinh khiết hóa thông qua các bước khác nhau của kỹ thuật
sắc ký và sinh học, các đặc điểm của kháng sinhnày được xác định bằng cách
sử dụng các thuộc tính hóa lý , dữ liệu quang phổ (1H- NMR, 13C - NMR,
HMBC, HSQC, và COSY) và phân tích MS. PN00053 có phổ rộng trong hoạt
động kháng nấm invitro đối với chủng Aspergillus fumigatus (HMR ), A.
fumigatus ATCC 16.424, Candida albicans (IV), C. albicans ATCC 14.503, C.

krusei GO6, C. glabrata HO4, Cryptococcus neoformans, Trichophyton sp
.cũng như chủng kháng fluconazole C. krusei GO3 và C. glabrata HO5. Nó
không ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gram dương và gram âm, tác dụng
đặc trưng của nó chống lại nấm. [19]
15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.211 được phân lập
từ mẫu đất ở Quận 9, Thành phố Hồ Chí Minh.
 Giống VSV kiểm định: các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh-
Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. (bảng 2.1)
Bảng 2.1: Các chủng VSV kiểm định
Vi khuẩn Gr(+) Vi khuẩn Gr(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 10241 Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112
Salmonella typhi DT 220

 Môi trường
 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định. (bảng 2.2).
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
MT
NaCl
(g)
Cao thịt

(g)
Pepton
(g)
Thạch
(g)
Nước
(ml)
pH
Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100(vđ)

7,0-7,4
Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8 100(vđ)


 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn. (bảng 2.3)



16

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
MT
Thành phần
MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7
Tinh bột(g) 2 2 2,4 2
Lactose(g) 3
Glucose(g) 2 1
Cao ngô(g) 0,5 0,5
Saccarose(g) 3
Bột đậu tương(g) 1,5

Cao thịt(g) 0,3 0,3
Pepton(g) 0,5 0,5
KNO
3
(g) 0,1
KCl(g) 0,05
NaNO
3
(g) 0,2
NH
4
NO
3
(g) 0,2 0,2
CaCO
3
(g) 0,3 0,4 0,4 0,2
(NH
4
)
2
SO
4
(g) 0,2
K
2
HPO
4
(g) 0,05 0,1 0,1 0,05
MgSO

4
.7H
2
O(g) 0,05 0,05 0,25 0,15
NaCl(g) 0,05 0,1 0,5
Cao nấm men (g) 0,5
Thạch(g) 1,8 2 2 2 2 2 1,8
Nước máy(ml) 100 100 100 100 100 100 100
pH 6,8 – 7,2

 Các môi trường dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như MT nuôi
cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
17

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm
định được tiệt trùng ở 118-120
o
C trong 30 phút.
 Các môi trường phân loại theo ISP:
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl
2
.4H
2
O : 0,1g; FeSO
4
.7H
2
O : 0,1g;
ZnSO
4

.7H
2
O : 0,1g; nước cất vđ 100ml; pH = 7,0 – 7,2.
Dung dịch A: pepton : 20,0g; acid nitric: 0,384g; FeSO
4
.7H
2
O: 0,556g;
NH
4
OH 25%: 0,264g; Na
2
S
2
O
3
: 10ml; K
2
HPO
4
: 1,0g; nước cất vđ 1000ml.
ISP1: tripton: 5,0g; cao nấm men: 3,0g; nước cất vđ 1000ml; pH=7,0-7,2.
ISP2: cao nấm men: 4,0g; chiết xuất malt 10,0g; glucose: 4,0g; thạch: 20,0g;
nước cất vđ 1000ml; pH=7,3.
ISP3: yến mạch: 20,0g; dd muối vi lượng: 1,0ml; thạch: 18,0g; nước cất ; vđ
1000ml; pH = 7,2.
ISP4: tinh bột: 10,0g; K
2
HPO
4

: 1,0g; MgSO
4
.7H
2
O: 1,0g; (NH
4
)
2
SO
4
: 2,0g;
NaCl: 1,0g; CaCO
3
: 2,0g; dd muối vi lượng 1,0ml; thạch: 20,0g; nước cất vđ
1000ml; pH= 7,0-7,4.
ISP5: L-asparagine: 1,0g; glycerin: 10,0g; K
2
HPO
4
: 1,0g; dd muối vi lượng:
1,0ml; thạch: 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP6: ddA: 36,0g; cao nấm men: 1,0g; thạch: 15g; nước cất vđ 1000ml;
pH=7,0-7,2.
ISP7: glycerin: 15,0g; L-tyrosine: 0,5g; L-asparagine: 1,0g; K
2
HPO
4
: 0,5g;
MgSO
4

.7H
2
O: 0,5g; NaCl: 0,5g; FeSO
4
.7H
2
O: 0,01g; dd muối vi lượng
1,0ml; thạch: 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH = 7,2-7,4.
ISP9: (NH
4
)
2
SO
4
: 2,64g; KH
2
PO
4
: 2,38g; K
2
HPO
4
.3H
2
O: 5,65g;
MgSO
4
.7H
2
O: 1,0g; dd B: 1,0ml; thạch: 15,0g; nước cất vđ 1000ml; pH=6,8-

7,0.
Dung dịch Pridham và Gottlieb (dd B): CuSO
4
.5H
2
O: 0,64g; FeSO
4
.7H
2
O:
0,11g; MnCl
2
.4H
2
O: 0,79g; ZnSO
4
.7H
2
O: 0,15g; nước cất vđ 1000ml.