Nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 183 216 tổng hợp nên

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ THỦY


NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO
STREPTOMYCES 183.216 TỔNG HỢP NÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ








HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ THỦY


NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH
DO STREPTOMYCES 183.216 TỔNG HỢP NÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
DS. Tạ Thu Lan
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội




HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo DS.Tạ
Thu Lan – Bộ môn Vi sinh – Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những
bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy,
công tác tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại
học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Trung tâm phổ ứng dụng – Viện
hóa học đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy
cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Thủy
MỤC LỤC


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa 2
1.1.2. Phân loại 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh 3
1.1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp kháng sinh 3
1.1.6. Khái niệm về tính kháng kháng sinh 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn 4
1.2.1. Đặc điểm chung về xạ khuẩn 4
1.2.2. Đặc điểm chi Streptomyces 4
1.2.3. Phân loại Streptomyces 6
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo vệ giống xạ khuẩn 7
1.3.1. Mục đích 7
1.3.2. Chọn lọc tự nhiên 7
1.3.3. Đột biến nhân tạo 7
1.3.4. Bảo quản chủng giống xạ khuẩn 8

1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8
1.4.1. Đại cương 8
1.4.2. Các phương pháp lên men 8
1.4.3. Các phương pháp chiết tách kháng sinh 9
1.4.4. Tách và tinh chế các thành phần kháng sinh 10
1.5. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 11
1.5.1. Phổ hồng ngoại 11
1.5.2. Phổ tử ngoại-khả kiến 11
1.5.3. Phân tích khối phổ 12
1.6. Điều chế sinh tổng hợp Daunorubicin từ Streptomyces peucetius-phản hồi và dự
tính kiểm soát phiên mã 12
1.7.Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của Actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển
13
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 14
2.1.1. Nguyên vật liệu 14
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 14
2.1.3. Các hóa chất sử dụng 15
2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu 19
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19
2.3.2. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 19
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán 20
2.3.4. Sàng lọc ngẫu nhiên 21
2.3.5. Đột biến bằng ánh sáng UV 22
2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 23
2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.8. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 23
2.3.9. Tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24
2.3.10. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25

2.3.11. Tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột 25
2.3.12. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 25
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 26
3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.216 theo ISP 26
3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy, bảo quản 27
3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27
3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28
3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 29
3.6. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30
3.6.1. Chọn môi trường lên men 30
3.6.2. Kết quả chọn chủng lên men 30
3.7. Kết quả thử độ bền kháng sinh với nhiệt độ và pH 31
3.8. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 32
3.9. Kết quả sắc ký lớp mỏng 33
3.10. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh 34
3.10.1. Kết quả sắc ký cột lần 1 34
3.10.2. Kết quả sắc ký cột lần 2 36
3.10.3. Kết quả sắc ký cột lần 3 38
3.11. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và đo phổ kháng sinh tinh khiết 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
1. Kết luận 40
2. Đề xuất 41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
(Chương trình Streptomyces quốc tế)
ATCC American type culture collection

(Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ)
B. cereus Bacillus cereus ATCC 9946

B. pumilis Bacillus pumilus ATCC 6633

B. subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633

E. coli Escherichia coli ATCC 25922

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VM 201

P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108

S. aureus Staphylococcus aureus ATCC 1288

S. flexneri Shighella flexneri DT 112
DM Dung môi
ĐB1 Đột biến lần 1
ĐB2 Đột biến lần 2
HTKS Hoạt tính kháng sinh
ISP International Streptomyces Project
KS Kháng sinh
MC Mẫu chứng
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định 14

Bảng 2.2: Các dung môi sử dụng trong khóa luận 15

Bảng 2.3: thành phần các MT nuôi cấy xạ khuẩn 16

Bảng 2.4: thành phần các MT nuôi cấy VSV kiểm định 17

Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.216 và S. orientalis 26

Bảng 3.2: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy 27

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 28

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến cải tạo giống lần 1 28

Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS sau đột biến cải tạo giống lần 2 29

Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men 30

Bảng 3.7: Kết quả chọn chủng lên men 31

Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền kháng sinh với nhiệt độ 31

Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền kháng sinh với pH 32

Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết trên Bacillus subtilis 32

Bảng 3.11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết trên Shighella flexneri 33

Bảng 3.12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 34

Bảng 3.13: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau sắc ký cột lần 1 35

Bảng 3.14: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau sắc ký cột lần 1 36

Bảng 3.15. Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2 36

Bảng 3.16: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau sắc ký cột lần 2 37

Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau sắc ký cột lần 2 37

Bảng 3.18: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau sắc ký cột lần 3 38

Bảng 3.19: Kết quả đo phổ IR 39




DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình P1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm 1940 – 2000
Hình P2: Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Hình P3: Phân loại bộ Actinomycetales
Hình P4 : Sơ đồ tổng quát quy trình sinh kháng sinh
Hình P5: Hình ảnh bề mặt bào tử chụp bằng kính hiển vi điện tử (sau 10 ngày nuôi
cấy trên môi trường ISP3)
Hình P6: Hình ảnh chuỗi bào tử chụp bằng kính hiển vi điện tử (sau 10 ngày nuôi

cấy trên môi trường ISP3)
Hình P7: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch (VSV kiểm định B. subtilis)
Hình P8: Thử HTKS bằng phương háp giếng thạch (VSV kiểm định B. subtilis)
Hình P9:Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy (VSV kiểm định B.subtilis)
Hình P10:Hình ảnh lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 183.216
Hình P11: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau khi chay sắc ký cột lần 1
Hình P12: Kết quả hiện hình VSV (VSV kiểpm định B. subtilis)
Hình P13: Phổ UV-VIS của kháng sinh do Streptomyces 183.216 sinh tổng hợp.
Hình P14: Phổ MS của kháng sinh do Streptomyces 183.216 sinh tổng hợp.
Hình P15: Phổ IR của kháng sinh do Streptomyces 183.216 sinh tổng hợp.


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1928, Alexander Fleming (1881-1955) đã phát hiện ra tác dụng của kháng
sinh mở ra thời đại mới: thời đại kháng sinh. Việc phát hiện và phát triển kháng sinh
của thế kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn. Song từ những
năm 1980, những kháng sinh mới được phát hiện và đưa vào điều trị giảm hẳn do
chi phí quá lớn. Đồng thời, vi sinh vật nhanh kháng thuốc và tốc độ đó lại nhanh
hơn tốc độ tìm ra thuốc mới của con người. Vì vậy, việc tìm ra các chủng có HTKS
cao và phát hiện các loại kháng sinh mới là rất cần thiết.
Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, phương pháp phân lập kháng sinh
từ xạ khuẩn vẫn là con đường quan trọng để tìm được các chủng có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới. Trong khoảng 16.000 chất
kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 60% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và
tới khoảng 55% trong số đó là từ Streptomyces [8]. Đó là cơ sở để các nhà khoa học
nước ta tập trung nghiên cứu vào nhóm xạ khuẩn này.
Nằm trong xu hướng này, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu kháng sinh do
Streptomyces 183.216 tổng hợp nên” làm đề tài khóa luận tốt nghiệp với chủng
Streptomyces 183.216 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội

cung cấp. Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau:
1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.216 theo ISP.
2. Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
3. Xác định điều kiện chiết tách, tinh chế kháng sinh.
4. Xác định sơ bộ các tính chất của kháng sinh thu được.


2
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa
Kháng sinh là những chất có nguồn gốc từ vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc
tổng hợp hóa học có hoạt tính sinh học cao có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt chọn
lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa,…) hay tế bào ung thư
ở nồng độ thấp [1], [2].
1.1.2. Phân loại
Có nhiều cách để phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo phổ tác dụng,
theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc
hóa học,… Phân loại theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp viêc nghiên
cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện
khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các
đặc điểm khác [1], [2].
Phân loại theo cấu trúc hóa học được trình bày ở bảng 1.1 [1], [2], [4].
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
STT Nhóm kháng sinh Ví dụ điển hình
1 β-lactam Penicillin, Cephalexin
2 Aminosid Streptomycin, Gentamicin
3 Macrolid Erythromycin, Clarithromycin
4 Lincosamid Lincomycin, Clindamycin
5 Phenicol Chloramphenicol, Thiamphenicol

6 Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin
7 Peptid Vacomycin, Polymyxin
8 Quinolon Ciprofloxacin, Levofloxacin
9 Co-trimoxazol Co-trimoxazol

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Một kháng sinh có thể có một hoặc nhiều đích tác dụng trong tế bào mẫn cảm,
có thể khái quát thành 5 nhóm kháng sinh theo đích tác dụng chính:
 Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: β-lactam, Vancomycin,…
 Thay đổi tính thấm màng tế bào: Polymyxin, Amphotericin B,…


3
 Ức chế tổng hợp acid nucleic: Quinolon, Rifampicin,…
 Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: Tetracyclin,
Macrolid,…
 Ức chế chuyển hóa: Co-trimoxazol [1].
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh
- Trong lĩnh vực y học: kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn, nấm
gây ra, một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị bệnh ung thư.
- Ngoài lĩnh vực y học:
+ Trong chăn nuôi: điều trị một số bệnh do VSV gây ra cho gia súc, gia cầm. Ví
dụ griseoviridin trị viêm phổi cấp, viêm vú ở trâu, bò.
Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia
cầm, giảm chi phí thức ăn, kích thích tăng sản lượng trứng ở gà, vịt như chế phẩm
Biovit (Biomycin, Vitamin E), Terravit (Tetracyclin, Vitamin B12).
+ Trong trồng trọt: xử lý hạt, đất trồng; điều trị một số bệnh của cây trồng:
nhiễm khuẩn, nấm (Blasticidin, Kasugamycin, Validamycin).
+ Trong công nghiệp thực phẩm: đối với thực phẩm đóng hộp, cho thêm kháng
sinh vào để làm giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử trùng (Nisin,

Subtilin) [4].
1.1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp kháng sinh
Sơ đồ được trình bày ở hình P4, phần Phụ lục [4], [12], [16].
1.1.6. Khái niệm về tính kháng kháng sinh
Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó
trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu.
Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng
thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng loài sinh vật nhất định đối với một số kháng
sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế
bào, do các enzym vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa
các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng [5].



4
1.2. Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1. Đặc điểm chung về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eurobacteria), là các vi
khuẩn Gram (+) có tỷ lệ G+C > 55%, đại đa số là các VSV hiếu khí, hoại sinh có
cấu tạo dạng sợi phân nhánh [5], [16].
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, bùn,… Trong 1g đất có
khoảng 29.000-2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số VSV [7].
Các đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
- Xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi, hệ sợi gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn
ty khí sinh. Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ
khuẩn [5].
- Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt không trơn ướt mà thường thô ráp, dạng
phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [5].
- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0μm đến 2-3μm.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn với màu sắc hết sức phong phú: da

cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám,…
Xạ khuẩn sinh sản nhờ bào tử: chuỗi bào tử (họ Streptomycetaceae), bào tử di
động (họ Actinoplanaceae), bào tử hình cầu do phân cắt hệ sợi đã già (họ
Actinomycetaceae) [5].
Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như kháng sinh, enzym, vitamin,…có
thể được tích lũy trong sinh khối hoặc tiết ra ngoài môi trường.
Phân loại bộ Actinomycetales được thể hiện trong hình P3, phần Phụ lục [28].
1.2.2. Đặc điểm chi Streptomyces
Xạ khuẩn Streptomyces là 1 chi thuộc bộ Actyinomycetales, Streptomyces có mặt
trong đất, bùn, nước, bào tử của chúng còn được tìm thấy trong không khí [28].
Các xạ khuẩn thuộc chi này có khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp
có hoạt tính sinh học như: chống nấm, chống virus, chống tăng huyết áp, ức chế
miễn dịch và đặc biệt là kháng sinh [27]. Có khoảng 55% kháng sinh được sản xuất


5
từ Streptomyces [26]. Một số kháng sinh do Streptomyces tổng hợp (Bảng P1, phần
Phụ lục)
- Đặc điểm hình thái:
Hệ sợi gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt
quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại
sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố tan trong dung môi hữu cơ.
Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
Chuỗi bào tử: là cơ quan sinh sản chủ yếu của Streptomyces .
- Đặc điểm cấu tạo:
Cấu tạo của Streptomyces chia làm ba phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế
bào chất. Trong đó thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I, có chứa
L-diaminopimelic acid (L–ADP) và glycin, không chứa acid mycolic [5], [18].
- Đặc điểm sinh lý:

Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Có khả năng phân giải
các hydratcarbon, thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat
thành nitrit [18].
Streptomyces là xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, phát triển tối thích ở nhiệt độ 25-
30˚C, pH 6,8-7,5. Khả năng tạo sắc tố: sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia
làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh,
sắc tố melanoid [17], [19], [28].
- Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp của xạ khuẩn:
+ Nhiệt độ: nhiệt độ tối thích cho sự sinh tổng hợp là 22-32˚C.
+ pH: xạ khuẩn thường phát triển tốt ở pH trung tính, môi trường quá acid hay
quá base đều ức chế quá trình sinh tổng hợp của Streptomyces [5].
+ Thông khí: xạ khuẩn là VSV hiếu khí nên yêu cầu có độ thông khí cao [4].
+ Thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men:
 Nguồn carbon: thích hợp nhất là tinh bột, ngoài ra còn có thể thay thế bằng
các đường như glucose, fructose, maltose, …tùy chủng xạ khuẩn.


6
 Nguồn nitơ: có thể là nitơ hữu cơ hoặc nitơ vô cơ (muối amoni).
 Nguồn phosphat: có ý nghĩa quan trọng đối với quá trình sinh trưởng của xạ
khuẩn cũng như hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. Nếu thiếu phosphat xạ khuẩn
sinh trưởng kém, hiệu suất lên men thấp. Nếu thừa phosphat sẽ kéo dài pha sinh
trưởng, rút ngắn pha tổng hợp kháng sinh [27].
 Nguyên tố vi lượng: là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của khuẩn. Tuy
nhiên nếu thừa các nguyên tố vi lượng có thể tạo phức với một số kháng sinh [4].
1.2.3. Phân loại Streptomyces
Chi Streptomyces gồm một số lượng lớn các sạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Tại hội nghị “ Vi
sinh vật thế giới lần thứ X” (tại Mexico, 1970) chọn đề xuất của E.B.Shirling và
D.Gottlieb làm khóa phân loại chính để phân loại chi Streptomyces và đặt tên quốc

tế là International Streptomyces Project (ISP) [5], [23].
Trong khóa phân loại này các đặc trưng phân loại được sử dụng bao gồm:
- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
+ Màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh,
+ Hình dạng chuỗi bào tử,
+ Bề mặt bào tử,
- Đặc điểm sinh lý:
+ Khả năng tạo sắc tố hòa tan,
+ Khả năng tạo sắc tố melanoid,
+ Khả năng sử dụng các nguồn đường.
Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phân loại xạ
khuẩn cũng đã và đang được áp dụng, nhất là ở các phòng thí nghiệm tiên tiến. Ưu
điểm là cho kết quả chính xác, đáng tin cậy [5].


7
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo vệ giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích
VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính
kháng sinh thấp (ví dụ các chủng Penicillium phân lập từ đất chỉ có khả năng tổng
hợp từ 30-50 đv/mL). Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao, ổn định để
đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo giống bằng các phương pháp khác nhau [4].
1.3.2. Chọn lọc tự nhiên
Các VSV có sự biến dị tự phát theo tần số khác nhau trong chủng giống thuần
khiết, có cá thể có HTKS cao gấp 10-30 lần những cá thể khác. Cần phải chọn lấy
các cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp theo [17].
1.3.3. Đột biến nhân tạo
Trong quần thể VSV luôn xảy ra quá trình đột biến ngẫu nhiên với tần số khoảng
10
-10

-10
-5
[5]. Trong cải tạo giống để tăng tần số đột biến, người ta sử dụng các nhân
tố: vật lý, hóa học, sinh học hoặc phối hợp các yếu tố trên. Tác nhân vật lý: tia
phóng xạ, tia X, ánh sáng tử ngoại; tác nhân hóa học: acid nitrơ, đồng đẳng của các
base nitơ, các chất alkyl hóa mạch,… Đối với VSV các tác nhân gây đột biến chủ
yếu là tia tử ngoại và một số hóa chất [5], [17].
Đột biến bằng ánh sáng tử ngoại:
Ánh sáng tử ngoại có tác dụng gây chết mạnh và gây đột biến. Ánh sáng UV
(λ=253-280nm) tác dụng lên acid nucleic dẫn đến dimer hóa thymin (TT), thymin-
cystosin (TC) hoặc cystosin (CC) tại vị trí C4 và C5. Hậu quả là sao chép bị sai lệch
vì ADN-polymerase dễ lắp một nucleotid không chính xác vào vị trí trên. Ánh sáng
tử ngoại thường gây ra các đột biến đổi dịch GC thành AT, trượt khung thậm chí
mất đoạn [5], [17].
Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng gây chết và tần số đột biến:
- Liều lượng chiếu: đặc trưng bởi các yếu tố: thời gian chiếu, khoảng cách
chiếu, nồng độ pha loãng bào tử.
- Ánh sáng: sau khi chiếu sáng UV lên tế bào, nếu có ánh sáng thường sẽ gây
ra hiện tượng quang phục hồi làm cho quá trình đột biến không còn ý nghĩa.


8
- Một số các yếu khác như nhiệt độ, pH, môi trường, …cũng ảnh hưởng tới
hiệu quả đột biến.
1.3.4. Bảo quản chủng giống xạ khuẩn
- Mục đích: để giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, ổn định được những đặc
điểm và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
- Có nhiều phương pháp để giữ giống như: giữ giống trên môi trường thạch
nghiêng trong tủ lạnh, kỹ thuật dùng parafin, làm đông khô, ổn định trong đất.
Tùy theo trang thiết bị và VSV cần lưu giữ để chọn phương pháp phù hợp. Đối

với giữ giống trong phòng thí nghiệm, đơn giản nhất có thể sử dụng phương pháp
giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong nhiệt độ thấp (2-4˚C) [4], [17].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Đại cương
Lên men sinh tổng hợp kháng sinh là quá trình nuôi cấy VSV trong môi trường
dinh dưỡng với các điều kiện ngoại cảnh tốt nhất để VSV sinh trưởng và phát triển
tạo được lượng kháng sinh là nhiều nhất.
1.4.2. Các phương pháp lên men
Có 2 phương pháp lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm [4], [16],
[17], [22].
- Phương pháp lên men bề mặt:
Theo phương pháp này, VSV được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn, đặc,
lỏng. VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng O
2
trong
không khí để hô hấp. Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là bề mặt lên men phải
rộng, lớp dinh dưỡng không quá sâu.
Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, chi phí ban đầu thấp.
Nhược điểm: đòi hỏi diện tích bề mặt lớn, hiệu suất sử dụng môi trường thấp,
khó cơ giới hóa, tự động hóa, nên hiện nay phương pháp này chỉ sử dụng trong
phòng thí nghiệm để nghiên cứu.
- Phương pháp lên men chìm:


9
Trong phương pháp này, VSV được nuôi cấy phát triển đa chiều trong môi
trường lỏng thích hợp. VSV dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh
dưỡng đang trong giai đoạn phát triển mạnh và đồng hóa vật chất cao. Vì vậy trong
công nghiệp, giống được nhân giống ở các cấp khác nhau.
Giống cấp 1: nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100mL/500mL).

Giống cấp 2: nuôi trong bình nhân giống 5L.
Giống cấp 3: nuôi trong bình nhân giống 1-5m
3
.
Tỷ lệ giống trong môi trường lên men thường từ 1-10%.
Ưu điểm: sử dụng tối đa môi trường dinh dưỡng, hiệu suất lên men cao, thiết bị
dễ tự động hóa, cơ giới hóa nên tiết kiệm mặt bằng và nhân công.
Nhược điểm: đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật cao (chịu được áp lực cao, vô trùng
tuyệt đối), chi phí đầu tư lớn.
Có các kiểu lên men chìm sau:
- Lên men mẻ
- Lên men có bổ sung
- Lên men liên tục
- Lên men bán liên tục
1.4.3. Các phương pháp chiết tách kháng sinh
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp. Sau quá trình lên men, dịch lên men
ngoài kháng sinh còn có các tạp cơ học, hữu cơ là sản phẩm trao đổi chất hay là
thành phần của môi trường. Do đó việc chiết tách, tinh chế rất quan trọng [4].
- Các phương pháp tách sinh khối từ dịch lên men [3], [4], [12]:
Để tách sinh khối từ dịch lên men chủ yếu dùng 2 phương pháp là lọc và ly tâm.
+ Lọc: là quá trình phân tách riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc
(hoặc bông), bã được giữ lại, lớp dịch qua giấy lọc do sự chênh lệch áp suất trên và
dưới lớp lọc. Có thể bổ sung thêm chất trợ lọc, thực hiện ở áp suất thường, áp suất
giảm hoặc áp suất cao [3].
+ Ly tâm: là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau bằng
lực ly tâm. Thường sử dụng khi phương pháp lọc không có hiệu quả.


10
- Chiết kháng sinh từ dịch lọc:

Người ta dùng các phương pháp như tách chiết bằng dung môi hữu cơ, bằng
nhựa trao đổi ion, bằng phương pháp tạo phức chất kết tủa với chất kháng sinh [4],
[10].
- Tách chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ:
Nguyên tắc chung: dựa vào sự phân bố khác nhau của chất kháng sinh giữa 2
pha (dịch chiết và dịch lọc) không đồng tan với nhau để tách lấy kháng sinh.
Để chiết kháng sinh từ dịch lọc, người ta có thể dùng phương pháp chiết sau:
chiết đơn, chiết lặp, chiết ngược dòng [3], [10].
1.4.4. Tách và tinh chế các thành phần kháng sinh
Sắc ký là phương pháp thường được sử dụng.
a. Nguyên lý
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của
hỗn hợp dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào 2 pha không
hòa lẫn vào nhau là pha động và pha tĩnh [3], [14].
Trong tinh chế kháng sinh người ta sử dụng các phương pháp sắc ký khác nhau
như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao.
b. Sắc ký lớp mỏng
- Nguyên tắc: Là sắc ký trong đó chất hấp phụ (pha tĩnh) được rải thành lớp
mỏng trên tấm kính hoặc tấm kim loại. Trong đó quá trình chuyển động của pha
động qua lớp hấp phụ nhờ lực mao quản. Quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được
lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau các thành phần được dịch chuyển trên
lớp mỏng theo hướng pha động với tốc độ khác nhau. Kết quả thu được sắc ký đồ
trên bản mỏng [3].
- Cơ chế trong sắc ký lớp mỏng: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử
nhưng cơ chế hấp phụ chiếm ưu thế nhất.
- Ưu điểm: có thể tách hỗn hợp phức tạp nhiều thành phần, các hợp chất vô cơ,
hữu cơ khác nhau, độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh,
kỹ thuật tiến hành đơn giản, thiết bị tương đối rẻ [3].

11

c. Sắc ký cột
- Là sắc ký trong đó chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha tĩnh được nhồi
trong cột, nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi
khác nhau từ phân cực yếu tới phân cực mạnh.
- Cột nhồi trong phòng thí nghiệm là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài từ
25-70cm, đường kính từ 1-5cm, đầu dưới có vòi và có một khóa điều chỉnh tốc độ.
- Hóa chất nhồi cột có thể là cellulose, gel của acid silic không hoạt hóa, oxit
nhôm, silicagel, … Các chất dùng trong sắc ký cột phải được tiêu chuẩn hóa để việc
sử dụng dễ dàng, thuận tiện.
- Pha động: nói chung hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy
đều có thể sử dụng cho sắc ký cột [3], [21].
1.5. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.5.1. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại chỉ đủ lớn để làm thay đổi trạng thái dao
động của phân tử. Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong
phân tử. Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho mỗi nhóm
chức. Do vậy, phổ IR góp phần vào nghiên cứu cấu trúc phân tử [3].
1.5.2. Phổ tử ngoại-khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn, có khả năng làm thay đổi mức năng
lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa cấu trúc
hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ
chặt chẽ. Các phân tử có đặc điểm: có nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, O, S có
khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS [3], [20].
Tuy nhiên, phổ UV-VIS thường kém chính xác nên hiện nay phương pháp này
phải phối hợp với nhiều phương pháp khác như quang phổ hồng ngoại, phổ cộng
hưởng từ hạt nhân để cho kết quả chính xác [3].

12
1.5.3. Phân tích khối phổ
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion được tạo
thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện tử có năng
lượng yếu hoặc trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao
(10
-8
mmHg). Trong đó chất hữu cơ bị ion hóa hoặc bị phá vỡ thành mảnh. Các tín
hiệu thu nhận được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ [20]. Dựa vào khối phổ có thể
định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất), xác định cấu trúc và định tính
các chất [3].
1.6. Điều chế sinh tổng hợp Daunorubicin từ Streptomyces peucetius - phản
hồi và dự tính kiểm soát phiên mã
Daunorubicin là tác nhân chữa một số bệnh ung thư, chất chuyển hóa thứ cấp từ
S. peucetius.
Sinh tổng hợp của daunorubicin ở S. peucetius được thực hiện với chức năng
của 30 gen mã hóa enzym theo một kiểu phối hợp chuỗi. Ngoài enzym trên, 3 chất
điều chỉnh quá trình phiên mã: DnrO, DnrN, DnrJ bằng cách tạo ra một mạch điều
chỉnh đoán trước thông suốt, có thể kiểm soát các gen mã hóa enzym. Daunorubicin
có khả năng xen giữa ADN, việc duy trì nồng độ thuốc tối ưu trong nội bào là việc
then chốt để ngăn ngừa việc tự gây độc. Khi bắt đầu quá trình sinh tổng hợp
daunorubicin cũng là lúc bắt đầu hoạt hóa có cơ chế hoàn ngược được thực hiện bởi
chất chuyển hóa. Khi nồng độ trong nội bào quá mức, daunorubicin xen giữa vào
các chuỗi ADN và ngăn cản sự gắn của các nhân tố phiên mã. Sự kiềm soát của cơ
chế hoàn ngược này được giảm bớt bởi một nhóm các gen tự kháng, đồng thời làm
giảm nồng độ daunorubicin cao trong nội bào. Bài báo này thảo luận chức năng, cơ
chế của mỗi nhân tố phiên mã và sự tác động lẫn nhau của chúng trong việc bắt đầu
và duy trì sinh tổng hợp daunorubicin ở S. peucetius [30].

13
1.7. Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của Actinomycete phân lập từ chất
lắng ở biển
Trong nghiên cứu này, ADN được phân lập và vùng ITS của 16S-rRNA được
khuếch đại bởi PCR, sử dụng 2 primer quốc tế: 1492R(5
’
GGTTACCTTGTTAC3
’
),
Eubac27F(5
’
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3
’
). Sản phẩm khuếch đại được tinh
chế bởi bộ kit mini ITANgel, gắn với vector đơn MP18-T, được biến nạp vào các tế
bào khả biến của E.coli DH5α. Mảnh gen 16S-rRNA được tạo thành chuỗi nhờ
primer xuôi M13F(-47) và primer đảo ngược M13R(-48). Kết quả là các chuỗi
tương đồng được tìm thấy không khớp với cơ sở dữ liệu chuỗi nucleotid đang tồn
tại, nên được đặt tên là Streptomyces sp SU, S. rubrulavandulae SU1, S. cacaoi
SU2, S. cavourensis SU3, S. avidinii SU4, S. globisporus SU5, S. variabilis SU6, S.
coelicolor SU7. S. avidinii dòng SU4 được chọn để nghiên cứu sâu hơn.
Dịch chiết thô Actinomycete phân lập

ức chế dòng Hep-2 và VERO với giá trị
IC
50
lần lượt là 64,5 và 250μg. Phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) cho thấy
chất có hoạt tính có thể là 1,2-benzendicarboxylic acid (30,15%), bis(2-
methylpropyl) ester (12,17%), isooctyl phthalat (15,29%) [29].

Kết luận: Nghiên cứu chứng minh rõ rằng chất lắng từ biển có Actinomycete với
chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học có thể cung cấp chất liệu sinh học chất lượng
cao cho chương trình sinh hóa chống ung thư.


14
Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
- Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 183.216 do Bộ môn Vi sinh - Sinh học
cung cấp được phân lập từ mẫu đất tại quận 9, thành phố Hồ Chí Minh.
- Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học
Dược Hà Nội cung cấp được trình bày ở bảng 2.1 sau:
Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201
Bacillus subtilis ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108
Staphylococcus aureus ATCC 1288 Shighella flexneri DT 112
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ ấm Memmert, Binder
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48
- Tủ lạnh Sanyo
- Tủ sấy SL shellab
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030
- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121S
- Máy cất quay Buchi Waterbath B480
- Đĩa Petri đường kính 9cm

- Bản mỏng sắc ký silicagel 60F
254
(Merck)
-Tác nhân đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W-220V.
- Thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm
- Buret thủy tinh, ống nghiệm, pipet các loại, bình nón các loại, ống đong, nút
bông, đũa thủy tinh, que trang, đèn cồn, phễu lọc, bình gạn,…


15
2.1.3. Các hóa chất sử dụng
- Các dung môi (trình bày ở bảng 2.2)
- Dung dịch NaOH 1M, dung dịch HCl 1M, dung dịch amoniac 25%
Bảng 2.2: Các dung môi sử dụng trong khóa luận
Dung môi
Khối lượng riêng (g/mL)
ở 20
o
C
Nhiệt độ sôi (
o
C)
Aceton 0,79 56
Butylacetat 0,878-0,883 117-118
Chloroform 1,470-1,480 60-62
Dichloromethan 1,32 40
Dimethylformamid 0,95 153
Ethanol tuyệt đối 0,789-0,791 78,3
Ethylacetat 0,889-0,901 70,4
Methanol 0,791-0,793 64,5

n-Butanol 0,81 116-118
n-Hexan 0,6548 69
Triethylamin 0,726-0,728 90

2.1.4. Môi trường nuôi cấy VSV
Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần MT được trình bày ở bảng 2.3.
Các môi trường lên men (MTdt): thành phần tương ứng với MT nuôi cấy xạ
khuẩn nhưng loại bỏ thạch.
Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần MT trình bày ở bảng 2.4.


16
Bảng 2.3: thành phần các MT nuôi cấy xạ khuẩn (đơn vị:g)
Thành phần MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7
Tinh bột 2 2 2,4 2
Lactose 3
Glucose 2 1
Cao ngô 0,5 0,5
Saccarose 3
Bột đậu tương 1,5
Cao thịt 0,3 0,3
Pepton 0,3 0,5
KNO
3
0,1
KCl 0,05
NaNO
3
0,2
NH

4
NO
3
0,2 0,2
CaCO
3
0,3 0,4 0,4 0,2
(NH
4
)SO
4
0,2
FeSO
4
.7H
2
O 0,001
KH
2
PO
4
0,05 0,1 0,1 0,05
MgSO
4
.7H
2
O 0,05 0,05 0,25 0,15
NaCl 0.05
Cao nấm men 0,5
Thạch 1,8 2 2 2 2 2 1,8

Nước (mL) 100 100 100 100 100 100 100
pH 6,8-7,2