Nghiên cứu định lượng đồng thời xylomethazolin và dexamethason trong thuốc nhỏ mũi bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN BÌNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL
TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ






HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN BÌNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL

TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :

ThS Trần Thị Lan Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Ths TRẦN THỊ LAN
HƯƠNG – người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa
luận này.
Tôixin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật
viên bộ môn Hóa Dược, Dược lý đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm việ
c tại bộ môn.
Tôi xin gửi tới các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội lời
cảm ơn chân thành về sự dạy bảo, dìu dắt tận tình trong suốt năm năm tôi học tập tại
đây.
Và cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới cha mẹ
kính yêu và những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn giành cho tôi tình yêu
thương, sự quan tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và làm khóa luậ
n tốt
nghiệp.

Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Sinh Viên

Nguyễn Bình Nguyên
MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương I : TỔNG QUAN 2
1.1 Đại cương về Captopril 2
1.1.1 Công thức, tính chất 2
1.1.2 Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định 2
1.2 Một số phương pháp định lượng captopril 3
1.2.1 Đinh lượng Captopril bằng phép đo Iod 3
1.2.2 Định lượng Captopril bằng phương pháp đo quang 4
1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 5
1.3.1 Định nghĩa 5
1.3.2
Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký 5
1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 7
1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn sắc ký 7
1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 11
1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 12
1.4.1 Yêu cầu chung 12
1.4.2 Nội dung thẩm định phương pháp 12
Chương II: ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1 Đố
i tượng nghiên cứu 14
2.2 Dụng cụ, hóa chất 14
2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 14

2.2.2 Hóa chất 14
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 14
2.3.2 Nội dung nghiên cứu 15
2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 16

Chương III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ,BÀN LUẬN 17
3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 17
3.1.1 Khảo sát chọn bước sóng thích hợp 17
3.1.2 Chọn pha tĩnh 18
3.1.3 Khảo sát chọn thành phần pha động và tốc độ dòng 19
3.1.4 Khảo sát chọn dung môi hòa tan Captopril 24
3.1.5 Điều kiện sắc ký đã chọn 25
3.2 Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong
trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC 25
3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 25
3.2.2 Xây d
ựng phương pháp định lượng 27
3.3 Đánh giá phương pháp định lượng 28
3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 28
3.3.2 Đánh giá tính chính xác của phương pháp 30
3.3.3 Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp 33
3.4 Bàn luận 35
3.5 Áp dụng phương pháp xây dựng 36
Chương IV: KẾT LUẬN, ĐÁNH GIÁ 37
4.1 Kết luận 37
4.2 Đề xuất 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AcCN : Acetonitril
AF : Hệ số bất đối xứng(Asymmetric)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography).
MeOH: Methanol
RSD : Độ lệch chuẩn tương đối(Relative Standard Deviation)
R
s
: Hệ số phân giải (Resolution)
TB : Trung bình

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Nội dung Trang
1.1 Cấu trúc cột LC-DB 9
1.2
Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
9
3.1
Phổ hấp thụ UV của Captopril trong MeOH:Đệm phosphat 0,01M
pH=2,40 (65:35)

17
3.2
Sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở các hệ đệm khác nhau và các
pha động khác nhau.
19
3.3 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,50 20
3.4 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,40 20
3.5 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,30 21
3.6

Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ
MeOH:Đệm pH 2,4 (60/40)
22
3.7
Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ
MeOH:Đệm pH 2,4 (65/35)
22
3.8
Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ
MeOH:Đệm pH 2,4 (70/30)
23
3.9
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch
và diện tích pic của Captopil
29
3.10 Sự tương quan giữa lượng Captopril ban đầu và lượng tìm lại 32
3.11
Sắc ký đồ của mẫu trắng
33
3.12
Sắc ký đồ của Captpril chuẩn đối chiếu (100µg/ml)
34
3.13
Sắc ký đồ của Captopril thử (100µg/ml)
34
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Nội dung Trang
3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC 26
3.2

Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính
28
3.3
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Captopril
29
3.4
Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp
30
3.5 Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp 31
3.6
Kết quả định lượng Captopril trong Captopril nguyên liệu của công
ty dược phẩm Traphaco

36
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, tăng huyết áp là một bệnh mang tính chất phổ biến. Điều đáng ngại
chính là có tới 50% người bị tăng huyết áp không biết mình bị tăng huyết áp,
khoảng 30% của những người đã biết mình tăng huyết áp nhưng vẫn không có một
biện pháp điều trị nào.Tăng huyết áp nếu không được điều trị đúng và đầy đủ dẫn
đến nhiều biến chứng nặng nề như suy thận, suy tim, tai biến mạch não… thậm chí
có thể gây tử vong hoặc để lại các di chứng nặng nề ảnh hưởng đến sức khỏe, sức
lao động của người bệnh. Một trong những thuốc đầu tay bác sỹ hay dùng để điều
trị tăng huyết áp trên bệnh nhân đó chính là nhóm ức chế men chuyển trong đó
Captopril là một thuốc kinh điển.
Muốn kiểm soáttốt các chế phẩm chứa Captopril thì đi từ việc nhỏ nhất đó là
đánh giá được nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc Captopril. Hiện nay, ở Việt
Nam, phương pháp chính để định lượng Captopril trong nguyên liệu là phương

pháp oxy hóa khử bằng phép đo Iod. Trên thực tế nếu như trong nguyên liệu có các
chất khử và các chất oxy hóa thì khi áp dụng phương pháp này dễ dẫn đến các sai
số. HPLC là một phương pháp phân tích có tính ổn định,có độ chính xác và độ chọn
lọc cao, được sử dụng rộng rãi trong phân tích và dược phẩm.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Captopril trong
nguyên liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”.
Với 3 mục tiêu sau:
 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng captopril trong nguyên liệu bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
 Thẩm định phương pháp xây dựng theo các tiêu chí của một phương pháp
định lượng, từ đó đề ra quy trình định lượng thường quy để định lượng Captopril
trong nguyên liệu
 Áp dụng phương pháp mới xây dựng để định lượng Captopril trong nguyên
liệu.

2


CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL
1.1.1. Công thức, tính chất
 Công thức hóa học :



 Tên khoa học :
Acid 1-(3-mercapto-2-methylpropanoyl)pyrolidin-2-carboxylic
 Công thức phân tử : C
9

H
15
NO
3
S ; M=217,28;
 Tính chất:
Bột kết tinh màu trắng ngà,ở 25
o
C: tan tốt trong nước (160 mg/ml),
ethanol,methanol,methylclorid, tan trong glyceryltriacetat (20 mg/ml),trong dung
dịch NaOH loãng, rất ít tantrong dầu ngô, ethyl acetat (< 1mg/ml).Nhiệt độ nóng
chảy: 105
o
C – 108
o
C.Góc quay cực riêng trong ethanol tuyệt đối là α
D
25
= -
127,8
o
,hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch nhau +5
o
. Hằng số phân ly
trong nước pKa lần lượt là 3,7 (-COOH) và 9,8 (-SH). Hệ số phân bố
logP(octhanol/nước) =0,34, logP(CH
2
Cl
2
/nước(pH=2))=1,39, logP(octhanol/HCl

0,1M)=1,9.[12]
1.1.2. Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định:
1.1.2.1. Dược động học :
Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có F
tuyệt đối
là 60% - 75%, C
max

trong huyết tương đạt được khoảng 1 giờ sau khi uống. Captopril liên kết với
protein khoảng 30%. Chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu, khoảng 40%-50% đào
thải qua thận ở dạng còn nguyên hoạt tính, còn lại chuyển hóa qua gan thành dạng
captopril disulfide và captopril-cystein.Captopril có t
1/2
= 2–3h, Cl
s
=13,33
ml/min/kg.[14]
3



1.1.2.2. Dược lực học
Captopril có tác dụng ức chế enzym chuyển Angiotensin I
→Angiotensin II
,
giảm tái hấp thu muối nước ở ống thận nên hạ huyết áp, giảm tiết các yếu tố gây phì
đại cơ tim và phì đại mạch máu. Captopril được chỉ định trong điều trị tăng huyết
áp, điều trị suy tim, đau thắt ngực, bệnh thận do tiểu đường phụ thuộc Insulin có
protein niệu > 300mg/24h.[14]
1.1.2.3. Chỉ định và tác dụng không mong muốn

Liều dùng:Điều trị tăng huyết áp : liều đầu 12,5mg /lần x 2 lần /ngày, sự
tăng giảm phụthuộc vào huyết áp của bệnh nhân, nếu sử dụng thêm thuốc lợi tiểu
thì liều đầu là 6,25 mg/lần x 2 lần /ngày.Điều trị bệnh thận do tiểu đường : 75-100
mg/ngày,với bệnh nhân suy thận cần được hiệu chỉ
nh liều cho phù hợp với từng đối
tượng. Một số chế phẩm Captopril đang có trên thị trường đươc trình bày ở bảng1.1
Bảng 1.1 : Một số chế phẩm có chứa Captopril
Biệt dược Nồng độ/Hàm lượng Dạng thuốc Hãng sản xuất
Lopril Captopril 25 mg
Captopril 50 mg
Viên nén
Bristol-myers
Ssquibb
Ecazide Captopril 50 mg +
Hydroclothiazid
25mg
Bristrol-myers
Ssquibb
Captopril
STADA®25
Captopril 25 mg Stadapharm GmnH
DH-CaptoHasan Captopril 25 mg Hasan
1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL
1.2.1. Định lượng Captopril bằng phép đo Iod
Nguyên tắc : Oxy hóa Captopril bằng dung dịch I
2
. Hòa tan 0,15g chế phẩm
trong 30,0 ml nước cất. Chuẩn độ bằng dung dịch Iod 0,05 M. Xác định điểm kết
thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (dùng điện cực Platin).[1]
4

Phương trình phản ứng :
RSH2
RS
SR
-2e
+
H
+
2

Nhận xét :
 Phương pháp có trong dược điển Việt Nam (IV), dược điển anh (BP2009) và
nhiều tiêu chuẩn cơ sở khác .
 Phương pháp định lượng thực hiện đơn giản. Tuy vậy, nếutrong nguyên liệu
có các tạp khử hoặc oxy hóa khác có thể dẫn đến sai số.Đồng thời, Captopril có
nhiều mứcoxy hóa nênbước nhảy thế có thể diễn ra ở nhiều mức khác nhau, điều
này cũng sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
1.2.2. Định lượng Captopril bằng phương pháp đo quang
Nguyên tắc:Bratton-Marshall đưa ra ph
ương pháp định lượng Captopril bằng
phương pháp đo quang sau khi tạo dẫn chất.Captopril tác dụng với một lượng dư
acid nitoro(HNO
2
) tạo sản phẩm S-nitroso tương đối bền vững phá hủy HNO
2
dư
được phá hủy bằng acid sulfamic. Thủy phân S-nitroso giải phóng acid HNO
2

. Tạo
muối diazoni bằng cách cho thêm sulfanilamine. Sau đó thêm N-(1-
napthyl)ethylenediamine tạo phẩm màu azo có màu đỏ.Tiến hành đo mật độ quang
của dung dịch.[10]
Phương trình phản ứng:
RSH
HNO
2
RS
NO
HNO
2
HNO
2
Hg
++
H
2
O
+
S
NH
2
OO
NH
2
H
2
NSO
3

H
S
NH
2
OO
N
+
N
S
NH
2
OO
N
+
N
+
NH
NH
2
NH
NH
2
S
NH
2
O
O
N
N

Nhận xét :
5


 Cách tiến hành định lượng phức tạp vì nhiều giai đoan khó thực hiện, sản
phẩm đo quang là chất trung gian dễ bị phân hủy,làm giảm sự chính xác của phép
định lượng.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích có tính
ổn định, độ chính xác và độ chọn lọc cao được sử dụng rộng rãi trong phân tích và
dược phẩm.Vì vậy trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng phương pháp
định lượng Captopril trong nguyên liệu bằ
ng HPLC.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Định nghĩa
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã
được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,
loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt.[5]
1.3.2. Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký
 Thời gian lưu t
R
:
Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồtính từ lúc tiêm đến lúc
xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó
là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không
đổi. Ngoài ra trong một phép phân tích còn th

ời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng
công thức sau: t
R
’ = t
R
– t
M.
Với: t
M
là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.
Nếu t
R
quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu t
R
quá lớn thì pic bị loãng, thời gian
phân tích kéo dài.[2]
 Hệ số phân bố k : là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung
bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột
6


k =




Trong đó : C
S
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh
C

M
là nồng độ mol của chất tan trong pha động
 Hệ số dung lượng k’ : cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai
pha và được tính theo sức chứa của cột:
k’ = k
x




=




=




=







k’ : tối ưu trong khoảng : 1≤ k ’≤8 [5]
 Hệ số chọn lọc α :

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ
số chọn lọc α :
α
=




=




=









Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α>1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [5]
 Hệ số đối xứng của pic F :
F =


Trong đó :W : chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

a : là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic
đếnmép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N :
Hiệu lực cột được đo bằng thống số : Số đĩa lý thuyết N của cột
N = 5,54 x



/
[5]hoặc16 x



[5]
Trong đó : W
1/2h
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic.
 Độ phân giải R
s
của cột :
R
s
=
.















[5]hoặc
,.











/

/
[5]
Trong đó :
t
(R)A
; t

(R)B
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
7


W
B
; W
A
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W
1/2A
; W
1/2B
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Yêu cầu : R
S
> 1 ; giá trị tối ưu R
s
= 1,5.[5]

1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
các bộ phận chính sau :
 Bơm cao áp :
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(thường 0– 400 bar)để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù
hợp với quá trình sắc ký.
 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi :
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ.

Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm)
và đã đuổi khí hòa tan.
 Hệ tiêm mẫu :
Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng
hệ thống tiêm tự động .
 Cột sắc ký:
Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ
với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột được nhồi pha tĩnh.
Cột sắc ký có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính
sắc ký. Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính
2 – 5 mm .
 Detector :
Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV –
VIS, Detector phổ phát xạ nguyên tử, Detector huỳnh quang.[5]
1.3.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
8


1.3.4.1. Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách
của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký
được chia thành 2 loại :
 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân
tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.
 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích
thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực .
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al

2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon.Trong sắc ký hấp phụ
pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:
 R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH
2
-
NH
2
, alkyl nitril – CH
2
– CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận
để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.[15]
 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế
bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của
mạch carbon (C
2
;C
8
;C
18
) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm OH thân
nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica
đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân
cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.[5]
9

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những
nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH
phân tích .
Trong môi trường quá acid pH< 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi
nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác
với cột .
Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với
chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm
–Si-C
18
, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau
hay là hiện tượng kéo đuôi. Kết quả giảmđi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như
trimethylclorosilan ClSi(CH
3
)
3
hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác
với nhóm –OH này. Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH
3
)
2
-C
18

bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽche chắn đi những nhóm –OH,
được trình bày ở hình 1.2.
10



Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C
18
một số nhóm phân
cực để tăng thêm độ phân cực của dây C
18
làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn
đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)[15]
1.3.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như : nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của
chúng.Các dung môi này có thể
hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký
như : độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R
s
, độ rộng của đáy pic.Nên việc
phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng .
Yêu cầu của 1 pha động :
 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

 Hòa tan chất cần phân tích .
 Có độ tinh khiết cao.
 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký .
 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Có các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả :
 Bản chất của dung môi để pha pha động .
 Thành phần các chất trong pha động .
 pH của pha động .
 Tốc độ dòng của pha động. [7]
11


Chọn đệm – pH :
Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử
dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ
làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.[7]
Tốc độ dòng của pha động :
Sau khi có pha tĩnh, pha động,pH thích hợp,để tăng hiệu lực tách của quá
trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp,
đảm bảo việc tách các chất phân tích được
tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế.[7]
1.3.4.3. Lựa chọn Detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi Detector chuyển
thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UV-
VIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác
nhau.[15]
1.3.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC
1.3.5.1. Cách đánh giá pic
 Đánh giá diện tích pic : để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc
dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.

 Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều
cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thủ từ thấp đến trung bình .
1.3.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Phương pháp định lượng chất phân tích trong HPLC dựa trên nguyên tắc
nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của chất
phân tích. Cácph
ương pháp tính kết quả thường dùng
 Phương pháp chuẩn nội.
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
 Phương pháp chuẩn ngoại.
12


Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được phân
tích trong cũng một điều kiện. Nồng độ (hàm lượng)của chất chưa biết được tính
toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn.
Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn hóa
một điểm:chuẩ
n bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất thử. Tiến hành song song
với nhau.Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn, chất thử và nồng độ chất chuẩn,
tìm được nồng độ của chất thử.
Điều kiện áp dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm: trong khoảng nồng độ
khảo sát, chứng minh luôn có tương quan hồi quy tuyến tính giữa nồng độ
chất phân
tích với diện tích pic của chất phân tích.[7]
1.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.4.1. Yêu cầu chung
Thẩm định một phương pháp phân tích trong nguyên liệu là một quá trình
xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc trưng cơ bản của
phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích

thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp đó là đáng tin cậ
y và có khả năng thực
hiện phân tích những mẫu được khảo sát .
1.4.2. Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp
1.4.2.1. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ đáp ứng của pic (diện tích pic) với nồng
độ chất phân tích trong dung dịch.
Tính tuyến tính của phương pháp phân tích là khả năng suy ra các kết quả
thử một cách trực tiếp hoặc thông qua phép biến đổi toán học, nó tỷ
lệ thuận với
nồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu thử trong một giới hạn nồng độ đã
cho.
Khoảng tuyến tính: là khoảng nồng độ từ nồng độ thấp nhất đến nồng độ cao
nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Thông thường đối với nguyên
liệu thì khảo sát tínhtuyến tính trong khoảng từ 80% đến 120% nồng độ so vớ
i nồng
13


độ định lượng. Đường chuẩn phải có ít nhất là 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong
dung dịch và ít nhất 4/5 điểm trong dãy chuẩn có độ đúng và độc chính xác đạt yêu
cầu .
1.4.2.2. Tính chính xác : bao gồm các tiêu chí về độ lặp lại và độ đúng
 Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ phù hợp với nhau giữa các
kết quả riêng rẽ khi áp dụng phương pháp để định lượng lặp đi lặp lại nhiều lần lấy
mẫu từ một mẫu đã trộn đồng nhất.
Phương pháp là lặp lại nếu độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2,0%.
 Tính đúng
Tính đúng của phương pháp là sự gần sát của kết quả định lượng so với giá

trị thực. Do hàm lượng mẫu thử chưa được xác định chắc chắn ở thời điểm nào, vì
vậy tính đúng phải được xác định trong toàn bộ vùng cần xác định. Đối với nguyên
liệu, tính đúng được xác định trong khoảng 80% đến 120% nồng độ phân tích.
Phương pháp là đúng nếu :
 Trung bình tìm lại được từ 98% đến 102%.
 Khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1 (không có sai số hệ thống tỷ lệ).
Khoảng tin cậy của b (y=ax + b) chứa gốc tọa độ (không có sai số hằng
định).
1.4.2.3. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định chất cần phân tíchmà
không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác như tạp chất, sản phẩm phân
hủy và các thành ph
ần khác.





14










CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Captopril nguyên liệu của công ty dược phẩm Traphaco
2.2. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : DIONEX – detector UV diode aray
- Máy lắc siêu âm – SONOREX
- Máy đo pH : METTLER TOLEDO MP 220
- Máy lọc chân không : SATORIOUS
- Cân phân tích :SATORIOUS
- Máy khuấy từ: HEIDOLPH MR 1000
- Bình định mức 10,25,50,100 ml
- Ống đong 100ml, cốc có mỏ 100, 500, 1000 ml
- Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45µm
2.2.2. Hóa chất
- Captopril nguyên liệu của công ty Traphaco (ngày hết hạn 11/2015)
- Captopril chuẩn đối chiếu của Viện kiểm nghiệm – Bộ Y Tế (hàm ẩm 3%,
hàm lượng 95,3%, ngày hết hạn 11/2015).
- Muối KH
2
PO
4
, H
3
PO
4
(85%) loại tinh khiết dùng phân tích
- MeOH dùng cho HPLC (hãng Honeywell)
15

- Nước cất 2 lần dùng cho HPLC
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
- Tham khảo các phương pháp định lượng Captopril đã công bố
- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hóa học của Captopril cũng như điều
kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, xây dựng quy trình định
lượngCaptopril trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC có tính chính xác, đặc
hiệu cao.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1.Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp
 Khảo sát điều kiện sắc ký
Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp
để có pic captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý.
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột Gemini C18 (250mm x 4,6mm, 5µm)
và cột Luna C8 ( 250 mm x 4,6 mm, 5µm ) là những cột thường dùng trong các cơ
sở kiểm nghiệm hiện nay. Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương
trình sắc ký phù hợp.
 Lựa chọn dung môi để hòa tan Captopril hoàn toàn từ nguyên liệu
Dựa vào tính chất của Captopril và qua tham khảo tài liệu, bằng thực nghiệm
chọn ra dung môi thích hợp để hòa tan captopril và đảm bảo Captopril không bị
thủy phân.
2.3.2.2. Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong Captopril
nguyên liệu .
 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
 Xây dựng phương pháp định lượng
 Đánh giá phương pháp xây dựng bằng các tiêu chí
 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Captopril và diện tích
pic trên sắc ký đồ

 Tính chính xác của phương pháp:
16


- Độ lặp lại của phương pháp
- Tính đúng của phương pháp
 Tính đặc hiệu của phương pháp
2.3.2.3. Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng Captopril trongnguyên liệu.
Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Captopril trong
nguyên liệu của Công ty dược phẩm Traphaco
Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn trên các mẫu thử, song song với
mẫu chuẩn.
Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ thuận với diện tích pic
trên sắc ký đồ. So sánh diện tích mẫu chuẩn và mẫu th
ử để định lượng chất thử
trong dung dịch phân tích, từ đó tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định
lượng.
2.3.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
2.3.3.1. Đánh giá dung môi hòa tan
Dùng phương pháp HPLC đã xây dựng để đánh giá sự phù hợp, tính dặc hiệu
của dung môi sử dụng để hòa tan hoàn toàn Captopril trong nguyên liệu dựa trên
kết quả đánh gia tính chính xác, tính đúng của phương pháp.
2.3.3.2.Định tính
Thời gian lư
u và hình dạng pic của captopril trên sắc ký đồ của mẫu thử và
mẫu chuẩn (đối chiếu) phải như nhau trong cùng điều kiện sắc ký đã chọn.
2.3.3.3 Định lượng
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê, sử
dụng một số công thức sau :
 Giá trị trung bình: x

tb
=


x
∑




(2.1)
 Độ lệch chuẩn : S =

∑











(2.2)
 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%)=




(2.3)

3.
1
hà
n
p
h
á
Ca
p
3.
1
có
th
ờ
bư
ớ
bư
ớ
kh
o

S
a

S
a


K


CHƯƠ
N
1
. KHẢ
O
Qua t
h
n
h khảo sá
t
á
t hiện Ca
p
p
topril chu
ẩ
1
.1 Khảo
s
Trong
c
nhóm –C
O
ờ
i có nhóm
ớ
c sóng(λ)

ớ
c sóng (λ)
Tiến h
à
o
ảng 4 µg/
m
a
i số chuẩn
a
i số tương
K
hoảng tin
c
N
G 3. TH
Ự
O
SÁT ĐI
Ề
h
am khảo c
t
lựa chọn
p
topril,
p
h
a
ẩ

n.
s
át chọn b
ư
c
ông thức
c
O
OH, nitơ
ở
carbonyl
ở
dài, Capto
p
ngắn.
à
nh quét p
h
m
l. Kết qu
ả
:
đối :
c
ậy :
Ự
C NGHI
Ệ
LUẬ
N

Ề
U KIỆ
N
ác tài liệu
dung môi
h
a
tĩnh,
p
ha
đ
ư
ớc són
g
t
h
c
ấu tạo củ
a
ở
vị trí số
1
ở
vị trí th
ứ
p
ril không
c
h
ổ đối với

ả
phổ hấ
p
t
h
17

Ệ
M, KẾT
N

N
SẮC KÝ
và phân tí
c
h
òa tan và
đ
ộng, tốc
đ
h
ích hợp
a
captopril
t
1
của vòng
ứ
nhất của
m

c
ho phổ đặ
Captopril
h
ụ của Capt



=

√

ɛ(%) =






± 


QUẢ, B
À
c
h cấu trú
c
các điều k
i
đ

ộ dòng tr
o
t
hì ở Carb
o
pyrolidin
c
m
ạch nhán
h
c trưng, tu
y
trong dun
g
opril được
t






x 100
%


x 



À
N
c
Captopril
,
i
ện sắc ký
o
ng dung
d
o
n số 2 của
c
ó cặp điệ
n
h
, nên về
m
y
nhiên vẫ
n
g
môi hòa
t
t
rình bày h
ì

(2.
4

%
(2.
5
(2.
6
,
chúng tôi
như bước
s
ị
ch tự tạo
c
vòng pyro
n
tử tự do,
đ
m
ặt lý thu
y
n
cho đáp
ứ
t
an có nồn
g
ì
nh 3.1.
4
)
5

)
6
)
tiến
s
óng
c
hứa
lidin
đ
ồng
y
ết ở
ứ
ng ở
g
độ