Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng loratadin và psseudophedrin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1

 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI







NGUYỄN THỊ KIM OANH




NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN
TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO






LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

2
MỤC LỤC




ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………… 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………… 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN……… 3
1.1.1. Loratadin
1.1.2. Pseudoephedrin
 loratadin và pseudoephedrin
1.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC



1.3. HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ………………………… 17

1.3.2. C
1.3 20
20
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƢỢNG - NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………22
2.1. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ………………………………………… 22

2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU……………………………………… 23
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU………………………………………… 23


HÀ NỘI 2013

3
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………….23
2.4.1.Chun b mu cho nghiên cu23
.25
2.4.3. Th27
2.4.4. ng dng Loratadin và Pseudoephedrin trên mu thc.30
2.4.5. X lý và biu th các kt qu nghiên cu 30
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 31
3.1 . KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG……… 31

31
  35
.39
3.2.THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG…………………….41
  41
.43
 (LLOQ)45
 46
 51
.53
          
trên  57
3.3. BÀN LUẬN…………………………………………………………….60
             SE

 MS





4
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………… 64
64

LỜI CẢM ƠN

          
Nguyễn Thị Kiều Anh  
ThS.NCS. Đinh Thị Hải Bình  


Tôi xin chân th   
 
  tác và

              
               
              

Tôi xin chân t





Nguy


5
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT



µg
Microgam
µl
Microlit
AUC

C
max




HESI
 
HPLC

Chromatography)
HQC

Sample)

IS

LC  MS

Mass Spectrometry)
LC-MS/MS

LLOQ

LOD

LOR
Loratadin
LQC

Sample)
MeCN
Acetonitril
MeOH
Methanol
MQC

Control Sample)
m/z
 tích

6
ng
Nanogam
PA


PSE
Pseudoephedrin
QC
 (Quality Control Sample)
RSD
e Standard Deviation)
SKD
 (Bioavailability)
TB
Trung bình


T
max

 (Maximum Time)
v/v




7
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng
Trang

8

HPLC

9
Bng 2.1. Cách chun b mu chun LOR, PSE và IS trong MeOH
24
Bng 2.2. Cách chun b mu huy to cha chun LOR
và PSE.
24
Bng 2.3. Cách chun b mng chun.
25
Bng 2.4. Cách chun b mu QC.
25

34
Bng 3.2: Kt qu  chn lc  c hiu c
42

43

45
Bng 3.5. Kt qu th ú chính xác trong ngày ca
i LOR
46
Bng 3.6. Kt qu th  chính xác trong ngày ca
i PSE
46
B  chính xác khác ngày vi LOR
48
B  chính xác khác ngày vi PSE
49

50

Bng 3.10. T l thu hi ca LOR
51
Bng 3.11. T l thu hi ca PSE
51

8
B nh trong thi gian ngn  nhi phòng.
52

53


54


55

57

58


9
DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN
Tên hình
Trang
Hình 1.1.Các b phn ca máy phân tích khi ph.
17

(m/z 383.17)

31
Hình 3.2. T n th Cone cho mnh ion m
pseudoephedrin (m/z=166)
31


32
Hình 3.4

32
Hình 3.5
(m/z=426)
33
Hình 3.6. t phân mnh cho Domperidom
34
Hình 3.7. S mu huy- ct Thermo
hypersil
35
Hinh 3.8- 
36
Hinh 3.9 
36
Hình 3.10. S mu chun LOR, PSE và IS vu kin
sng.
38
Hình 3.11: S mu huyng khi chit lng  lng
bng hn hp dung môi Diethyl ether: Chloroforrm (8:2).
39
Hình 3.12: Quy trình x lý mu bng chit lng  lng vi h
dung môi Diethyl ether: Chloroform (8: 2).

40

10
Hình 3.13. S 
41
Hình 3.14. S 

41
Hình 3.15 
 PSE/IS
43
Hình 3.16

44
Hình 3.17
57
Hình 3.18

57

Clarinase
58

11
ĐẶT VẤN ĐỀ

nh
-
 ,
,
 [3].

kháng histamin (Chlopheniramin, Diphenhydramin (Benadryl), Promethazin,
Alimemazin (Theralene),Fexofenadin, Cetirizin, Loratadin  
corticoid (Fluticason, Budesonid, Triamcinolon, Beclomethason),  
Ephedrin, Pseudoephedrin, Phenylephrin) 
hai thành ph seudoephedrin . 
 k 

 voratadin  
Pseudoephedrin 
[5], [8] tron
 
g lên. Theo C


 tro
Loratadin và Pseudoephedrin khi vào tr 
   
P
 có tính  
ph 

12
 
tích hai .
Nhgóp          trang
tNghiên cứu xây dựng phương
pháp định lượng Loratadin và Pseudoephedrin trong huyết tương bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao”.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
1.       Loratadin và Pseudoephedrin trong

2. 
viên        
Pseudoephedrin 120 mg).

13
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN.
1.1.1. Loratadin
Công thức cấu tạo [22]


22

H
23
ClN
2
O
2.


Ethyl4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-
ylidene)piperidine-1-carboxylat.
Tính chất lý hóa [22]
Dng bt hoc tinh th màu trng hay trng ngà
Nhi nóng chy 132- 137ºC
 tan: Thc t khônc, tan trong các dung môi aceton,
chloroform, methanol, toluen  bt k t l nào .
Dược động học [1], [3],[10], [22].
 Hấp thu
 




14
          
trong vòng 1 - - 


 
 mg).
 Phân bố

- 97%- 99% loratadin và 73-
.
- - 120 lít/kg.
- 
 Chuyển hóa
           
microso        
.
- 142 ml/phút/kg.
 Thải trừ

nhau, d.
         h -   
Descarboetho- -


Tác dụng [1], [3],[10], [22].


1



15

1






           

Chỉ định, liều dùng [1], [3], [10], [22].



 Liu dùng
Người lớn, người cao tuổi và trẻ em từ 12 tuổi trở lên:
          mg/ml) siro Loratadin,
- 
Pseudoephedrin sulfat 240 mg).
1.1.2 Pseudoephedrin.
Công thức cấu tạo [22]


C
10
H
15
NO
165,2
 (+)-(1S,2S)-2-Methylamino-1-phenylpropan-1-ol.

16
Tính chất lý hóa [22]
 Hóa tính : i quang ca Ephedrin, nó d b
kh thành Methamphetamin và b oxy hóa thành Methcathion.
 Lý tính :
Dng bt hoc tinh th màu trng

Nhi nóng chy: 117ºC  118 ºC ( dng mui sulfat 174- 179 ºC)
 tan : 7 mg/L, dng mui tan t c và Ethanol.
Dược động học [10], [22], [25]
 Hấp thu
 -
120 mg P-300 
397 ng/ml  422  2h
 1,


 Phân bố
  60 mg
 

 Chuyển hóa


 Thải trừ
-

- 6h,  pH 8
là 9- 16h.

17
Tác dụng [10], [16], [25]
Pseudoephedr


phóng Norephedrin.
  



ephedrin

2
adrenergic.
Chỉ định, liều dùng [10], [22], [25]
 Ch nh

 

 Liu dùng

-.

 
1.1.3. Một số nghiên cứu định lƣợng loratadin và pseudoephedrin
- Trên thế giới:
 Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PSE trong dịch sinh học:
Nghiên cng thi Loratadin và Pseudoephedrine sulfat
trong huyi bc ký lng khi ph - k thut
n tc thui hc Trung Quc tin hành

18
 dng ca Loratadin và Pseudoephedrin t viên gii phóng
có kim soát.
ng LC-MS/MS 
- Chit hot cht t huyi bng ethyl ether
- Ct sc ký: ODS Shimazu (5µm ; 2,1 x 150mm)
- ng: acetnitril- c (80:20) ch

- T dòng: 0,2ml/phút
- Th u: 5µl
- Chun ni: diazepam cho LOR và phenylpropanolamin cho PSE
- Kiu khi ph: MS/MS, ngun ion hóa HESI(+)
- Kt qu: Khong n tuyn tính: 5- 1000 ng/ml vi PSE và 0,05 
10 ng/ml vi LOR. Gii hng: 10 pg/ml vi LOR và 50 pg/ml
vi PSE [14].
Các nghiên cứu định lượng Loratadin trong dịch sinh học:
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng Loratadin bằng HPLC
Tài
liệu
Mẫu
thử
Cột sắc
ký
Detector
Điều kiện sắc ký
[28]



Zorbax
SB-C18,
(100
mm x
3,0 mm,
3,5 µm)
MS/MS
- IS: Metoclopramid
- Dung môi kAcetonitril

-   acetonitril -   acid
formic 0,4% (8:92).
- ion  m/z=383  
337 LOR
m/z= m/z=(259 + 294 + 282) DSL
(descarboethoxyloratadin)
m/z= m/z =226,8 IS
- LLOQ = 0,52ng/ml
- :0,52-
LOR và DSL
[17]



C8 (250
×4,6mm,
5 µm)

quang
(FLD)
- IS: diazepam
-    n-butyl alcol/n-hexan
(2:98)
- natri dihydro phosphat 20 mM:
acetonitril - triethylamin (43:57:0.02), pH
2,4.

19
- v = 1,0 ml / phút
- t

0
= 25
0
C
- -20 ng/ml
- r

> 0,999
[18]



YMC-
Pack Pro
C18(15
cm x 4,6
mm)

MS/MS
- acetonitril - natri acetat 5 mM -
natri dodecyl sulfat 10 mM, pH 5.5.
- -10ng/ml.
- r > 0,999
- LLOQ = 0,1ng/ml.
- -109,5%

Các nghiên cứu định lượng Pseudoephedrin trong dịch sinh học:
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng Pseudoephedrin bằng HPLC
Tài
liệu

Mẫu
thử
Cột sắc
ký
Detector
Điều kiện sắc ký
[11]



Nova-pak
C18 (150
× 3.9mm,
4m)
UV-VIS
= 210nm
- IS: Phenylpropanolamin hydroclorid
-     -butyl
ether
-      
0,5% - CH
3
OH (5 : 95), pH = 3,0.
- - 1140ng/ml
- LLOQ = 9,5ng/ml
- 
- RSD < 2,18%
[16]




Hypurity
C18 (2,1
mm× 150
mm,5µm,

HPLC-
ESI

- IS: Tramadol
-    -   
0,1% acid formic, 10 mM amoni format
(65:35)
- v = 0,2 ml / phút
- t
0
= 40
0
- m/z=m/z148(pseudoephedrin)
- m/z= m/z= 201,1 (cetirizin)
- m/z= m/z= 246 (IS).
- LLOQ = 5ng/ml




[20]




Zorbax
SB-C18
(150 mm
x4,6 mm,
5 µm)
Waters
ZQ 2000
HPLC-MS
- IS: glipizid
- 
-   ethanol - amoni acetat
5mM (90: 10)
- v = 1ml/phút
- m/z = 148,4 (pseudoephedrin)
- m/z = 468,1 (IS)
- - 1002 mg/l

20




- LLOQ = 5mg/l
-   -7,1%,
khác ngày: 89,6% -95,1%
[21]




Diamosil
C18






UV-VIS
= 205nm






- IS: phenylpropanolamin HCl
- -hexan-
dicloromethan-isopropyl alcol (10 : 05:
0,5)
- 
0,2% - acetonitril (9:1)
- v = 1ml/phút
-  1000 mg/l
- r = 0,999
- LLOQ = 1mg/l
- 
khác ngày: RSD < 8%

- 
[26]



C18 (250
mm x 46
mm)
UV-VIS
= 200nm
- IS :dextromethorphan
- -butyl ether
-    -  -
trieth    
mM natri dodecyl sulfat (SDS) và 60
mM NaH
2
PO
4
, pH 2,6.
- 
1,5 - 0,01 mg/l (pseudoephedrin)
75 - 0,5 µg/l (Clorpheniramin)
-       
12,4%, khác ngày: RSD < 12,4%
-     ình: 97,3% -
109,4%
- Ở Việt Nam:
Hin nay  Ving thi LOR
và PSE trong dch sinh ht s nghiên cng hai

hot cht trên trong ch phm:
Tác gi 
    

0- 50 µg/ml SE là 120- 1800

21
µg/ml (r = 0E 
].

 Loratadin và Pseudoephedrin sulfat trong ch phm viên
nén b     t ngo o hàm. Kt qu cho khong
tuyn tính 0,015  0,035 mg/ml vi LOR và 0,025  0,84 mg/ml vi PSE
  ng cho hai cht l t là 99,46% (RSD =
0,72%) và 100,6% (RSD = 0,58%) [8].
Tác gi Tru,  Hi Bình, Lê Th Ngp, Nguyn
Thanh Hi       ng thi Loratadin và
Pseudoephedrin b o hàm bc nht. Kt qu cho
th    t yêu cu, tin hành
nhanh và tit kim thi gian có th s dng PSE
và LOR trong các ch phm bào ch kt hp b
dng [7].
Nhận xét: T
pseudoep        -detector
UV  -MS/MS. Tuy nhiên,
trong máu 

-
so 
           các

  và .
1.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC


 

22
 
  
 
nên không




             
 


1.2.1. Kỹ thuật xử lý mẫu


c 

-
1.2.1.1. Kỹ thuật tủa protein
 
 
là:
- A     


+2
.
- Dacetonitril
-3 -
             

23

ký.
n
          

     i khi



 

 

1.2.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
Ng 

 :
- 
.
- ích.
- .
- .

- )  

-n.
Nh
 
 

24
-

- 
 hòa tan 
 
dicloromethan, diethyl ether, tertbutyl 
 tùy

1.2.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE- solid phase extraction)



 




à



         

 


1.2.2. Kỹ thuật phân tích định lƣợng



25

-
hu

- 
-  

(ng/ml) 
-

1.2.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học




          1), EMEA (2011),
ASEAN (2003) [6], [12], [23], [24

1.2.3.1. Độ chọn lọc – đặc hiệu.
- 
   Theo
        

 

. Ngoài ra còn

