Nghiên cứu phát hiện dexamethason trong một số chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUYÊN
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ DUYÊN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS .TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

Nơi thực hiện:
Phòng phân tích , kiểm nghiệm và tương
đương sinh học

HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo
tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, anh
chị công tác tại Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học -
Viện công nghệ Dược phẩm quốc gia trong quá trình em làm thực nghiệm tại
phòng.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất.
Bộ môn Dược cổ truyền.
Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này.
Và cuối cùng em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình và
bạn bè những người đã luôn động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập và
hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Nguyễn Thị Duyên


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1. Vài nét về Glucocorticoid 3
1.1.1. Tác dung và tác dụng không mong muốn của Glucocorticoid 3
Tác dụng 3
Tác dụng không mong muốn 3
1.1.2. Đại cương về dexamethason và dexamethason acetat 4
1.1.2.1. Dexamethason 4
1.1.2.2. Dexamethason acetat 6
1.2. Một số nghiên cứu xác định dexamethason và dexamethason
acetat 7
1.3. Thực trạng thuốc đông dược và thực phẩm chức năng bị trộn
tân dược 9
1.4. Phương pháp xử lý mẫu 10
1.4.1. Phương pháp chiết trực tiếp 11
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng 11
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn 11
1.5. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng 12
1.5.1. Nguyên tắc 12
1.5.2. Pha tĩnh 13

1.5.3. Pha động 13
1.5.4. Dụng cụ 14
1.5.5. Ứng dụng của SKLM 15
1.5.6. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lớp mỏng 17
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NÔI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 18
2.1.1. Máy móc, thiết bị 18
2.1.2. Hóa chất, dung môi, chất chuẩn 18
2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: 19
2.2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu. 21
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích. 23
3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc: 23
3.1.2. Xử lý mẫu 23
3.1.2.1. Mẫu rắn 23
3.1.2.2. Mẫu lỏng 24
3.1.3. Khảo sát, chọn hệ dung môi sắc ký 24
3.1.4. Khảo sát điều kiện phát hiện 27
3.2. Đánh giá phương pháp 29
3.2.1. Tính chọn lọc
29
3.2.2. Giới hạn phát hiện 30
3.2.3. Độ lặp lại và độ tìm lại 33
3.3. Áp dụng trên một số mẫu thử 36
3.4. Bàn luận 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN
DAD
DM
DMKT
GC
HPLC
LC-MS
MeOH

R
f
SKĐ
SKLM
S/N
SPE
STT
TLC
TLTK
TPCN
t
R
UV
VIS



: Acetonitril
: Detector diod array
: Dung môi
: Dung môi khai triển
: Glucocorticoid
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
: Sắc ký lỏng khối phổ
: Methanol
: Hệ số lưu giữ
: Sắc ký đồ
: Sắc ký lớp mỏng
: Signal/noise
: Solid phase extration

: Số thứ tự
: Sắc ký lớp mỏng
: Tài liệu tham khảo
: Thực phẩm chức năng
: Thời gian lưu
: Tử ngoại
: Khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu chiết dexamethason và dexamethason acetat 7
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu phát hiện dexamethason và dexamethason acetat 8
Bảng 1.3 : Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM 13
Bảng 2.1: Các mẫu thuốc được phân tích 20
Bảng 3.1. Kết quả xác định LOD 33
Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra bằng SKLM trên 5 chế phẩm đông dược 38
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra bằng HPLC trên 5 chế phẩm đông dược 41


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 3.1. SKĐ sắc ký với hệ DM1 25
Hình 3.2. SKĐ sắc ký với hệ DM2 25
Hình 3.3. SKĐ khảo sát DM trên nền mẫu rắn 27
Hình 3.4. SKĐ khảo sát DM trên nền mẫu lỏng 27
Hình 3.5. SKĐ khảo sát tìm điều kiện phát hiện (UV-254 nm) 28
Hình 3.6. SKĐ khảo sát tìm điều kiện phát hiện vết (phun dung dịch acid
sulfuric trong ethanol) 28
Hình 3.7. SKĐ đánh giá tính chọn lọc (mẫu rắn) 29
Hình 3.8. SKĐ đánh giá tính chọn lọc (mẫu lỏng) 29

Hình 3.9. SKĐ giới hạn phát hiện của Dexamethason và Dexamethason
acetat 31
Hình 3.10. SKĐ analog xác định LOD 32
Hình 3.11. SKĐ đánh giá độ lặp lại của phương pháp chiết 34
Hình 3.12. SKĐ chụp ảnh và analog của dịch chiết mẫu tự tạo R 34
Hình 3.13. SKĐ chụp ảnh và analog của dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,5
mg/ml 35
Hình 3.14. SKĐ của mẫu thử 37
Hình 3.15: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dexamethason và dexamethason
acetat 38
Hình 3.16. Phổ hấp thụ tại pic chất chuẩn 39
Hình 3.17. SKĐ mẫu thuốc trị Viêm mũi 39
Hình 3.18. Phổ hấp thụ của mẫu thuốc trị viêm mũi tương ứng với t
R
=
8,539 39
Hình 3.19.SKĐ mẫu bột thuốc của cơ sở Đặng Đình Toàn 40
Hình 3.20. Phổ hấp thụ tương ứng với t
R
= 8,535 của mẫu bột thuốc của cơ
sở Đặng Đình Toàn 40
Hình 3.21. SKĐ mẫu phong tê nhức khớp thủy 40
Hình 3.22. SKĐ mẫu phong tê cốt thống thủy 41
Hình 3.23. Phổ hấp thụ tương ứng với t
R
= 8,546 của mẫu phong tê cốt
thống thủy 41


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thế kỷ trước, Y học phương Tây, mà người ta quen gọi là “Y học hiện
đại”, đã trở thành hệ thống y học chính thống ở hầu hết các quốc gia trên Thế
giới, kể cả các nước Đông Nam Á. Thế nhưng, trong những năm gần đây, các
loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên của Y học truyền thống ở phương Đông
(Đông dược) ngày càng được nhiều người, ở cả phương Đông và phương Tây
chú ý, ưa chuộng và sử dụng ngày càng nhiều bởi tính an toàn và hiệu quả
đáng tin cậy, lâu dài của nó. Tuy nhiên, nhằm tạo ra những hiệu quả tức thời
cho người bệnh, giảm đau, ăn ngon, ngủ yên, tăng cân, sinh lực dồi dào ,
nhiều cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền và cơ sở chữa bệnh tư nhân đã trộn
trái phép vào thuốc đông dược, thực phẩm chức năng một số loại tân dược.
Hậu quả của việc dùng thuốc đông y trộn tân dược sẽ rất trầm trọng và khó
lường trước được những mối nguy hiểm, vì người bệnh cứ tin chắc rằng đang
uống thuốc có nguồn gốc dược liệu nên an toàn và uống kéo dài.
Nhóm glucocorticoid là nhóm thuốc chống dị ứng, chống viêm mạnh với
nhiều tác dụng phụ, khoảng điều trị hẹp, cần được bác sỹ kê đơn và phải theo
dõi khi dùng. Các chất này rất hay được trộn một cách khéo léo và tinh vi vào
thuốc đông dược có chỉ định điều trị thấp khớp, hen phế quản, gout…hay
thuốc bổ do có tác dụng nhanh, mạnh và tác dụng không mong muốn gây tích
nước, béo phì giả tạo.
Đã có rất nhiều chế phẩm phát hiện có chứa corticoid như: Tân hòa truy
phong tê thấp thủy, Hạnh đức khu phong tê thấp thủy (trộn betamethason)
[25], mẫu thuốc bột định xuyễn của Trung Quốc có prednisolon acetat, Tăng
phì đoàn của Đài Loan, Nam liên truy phong thấu cốt hoàng của Trung Quốc
có dexamethason acetat [10]. Dexamethason là một glucocorticoid bán tổng
hợp, có tác dụng (chống viêm, chống dị ứng) mạnh, kéo dài, không giữ muối,

2
nước. Do đó nó được dùng rộng rãi và cũng dễ bị trộn trái phép vào thuốc

đông dược.
Nghiên cứu định tính, định lượng các glucocorticoid trộn trái phép vào thuốc
đông dược đã và đang thu hút được nhiều nhóm nghiên cứu, đã có một số
công bố về xác định dexamethason, dexamethason acetat bằng các phương
pháp khác nhau như: HPLC-MS, HPLC-DAD… Tuy nhiên các phương pháp
này yêu cầu máy móc khá đắt tiền. Để đóng góp một phương pháp phân tích
nhanh, đơn giản và kinh tế hơn trong xác định chất cấm dexamethason,
dexamethason acetat trong thuốc đông dược, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài:
“Nghiên cứu phát hiện Dexamethason trong một số chế phẩm đông dược
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng”
Với mục tiêu cụ thể sau đây:
1. Xây dựng được phương pháp phát hiện dexamethason, dexamethason
acetat trong chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng bằng sắc ký lớp
mỏng
2. Áp dụng phương pháp xây dựng được để phát hiện dexamethason,
dexamethason acetat trong một số chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng
(dạng thuốc nước và thuốc rắn) có nghi ngờ trên thị trường.


3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Vài nét về Glucocorticoid
1.1.1. Tác dung và tác dụng không mong muốn của Glucocorticoid
Tác dụng:
GC tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2 chất là
hydrocortison (cortisol) và cortison. GC tổng hợp gồm nhiều chất khác
nhau.Ở nồng độ sinh lý, các chất này cho cân bằng nội môi, tăng sức chống
đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác nhau của cơ thể. GC có

tác dụng trên chuyển hóa, trên các cơ quan và tuyến [12]. Trong đó, tác dụng
chống viêm, chống dị ứng hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn
tính như: thấp khớp, hen phế quản, viêm xoang [12].
Tác dụng không mong muốn: [5], [12].
- Tác dụng trên sự tăng trưởng của trẻ em: Mức liều từ 5 mg/m
2
/ngày trở lên
gây chậm lớn ở trẻ em.
- Gây xốp xương khi dùng corticoid ở liều cao kéo dài.
- Loét dạ dày tá tràng tỷ lệ không cao (khoảng 1,8%) nhưng nếu gặp thường
rất nặng, thậm chí có thể gây thủng dạ dày hoặc tử vong.
- Tác dụng phụ do dùng tại chỗ: teo da, xơ cứng bì, viêm da ửng đỏ, mụn
trứng cá hoặc bội nhiễm nấm, vi khuẩn và virus, chậm liền sẹo, đục thủy tinh
thể hoặc tăng nhãn áp, đặc biệt khi dùng liên tục và kéo dài.
- Hiện tượng ức chế trục dưới đồi – tuyến yên – tuyến thượng thận (HPA) [5].
Dùng GC không đúng cách dài ngày khi ngừng thuốc dễ gặp hiện tượng suy
thượng thận đột ngột. Teo thượng thận có thể kéo dài nhiều năm sau khi điều
trị dài ngày bằng GC [12].



4
1.1.2. Đại cương về dexamethason và dexamethason acetat
1.1.2.1. Dexamethason
 Công thức cấu tạo: [4], [7], [20], [21].

C
22
H
29

FO
5
P.t.l: 392,5
Tên khoa học: 9-fluoro-11β,17,21-trihydroxy-16α-methylpregna-1,4-dien
3,20-dion.
 Tính chất vật lý: [4], [7], [20], [21].
Bột kết tinh trắng hoặc tinh thể không màu, không mùi. Chảy ở 253 – 255
0
C
(kèm phân hủy). Thực tế không tan trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan
trong methylen clorid, tan trong aceton.
 Định tính: [4], [20].
- Đo phổ hấp thụ của dẫn chất hydrazon: cho phản ứng với phenylhydrazin
trong môi trường acid cho dẫn chất phenihydrazon có màu vàng (hấp thụ cực
đại ở 419nm).
- Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
dexamethason chuẩn.
- Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng Silicagel GF
254
hệ
dung môi triển khai là butanol bão hòa nước – toluen – ether (5: 10: 85).
- Phản ứng màu: Oxy hóa với tác nhân H
2
SO4 đặc, có màu đỏ nhạt (thường
kèm huỳnh quang). Pha loãng với nước, màu biến mất.
 Định lượng: [4], [20]
- Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS): Hòa tan chế phẩm trong

5
ethanol; đo ở khoảng 238,5nm, mẫu trắng là ethanol. Lấy E (1% 1cm) của

dexamethason ở 238,5nm là 394 để tính kết quả.
- Phương pháp HPLC bằng đo diện tích píc so với chất chuẩn.
 Tác dụng dược lý: [6], [12]
Dexamethason tác dụng bằng cách gắn kết vào thụ thể ở tế bào, chuyển vị vào
nhân tế bào và ở đó đã tác động đến một số gen được dịch mã. Dexamethason
có các tác dụng chính của glucocorticoid là chống viêm, chống dị ứng và ức
chế miễn dịch, còn tác dụng đến cân bằng điện giải thì rất ít. Về hoạt lực
chống viêm, dexamethason mạnh hơn hydrocortison 30 lần, mạnh hơn
prednisolon 7 lần, thời gian tác dụng kéo dài
 Chỉ định [6]
- Liệu pháp không đặc hiệu bằng steroid, khi cần điều trị tích cực, như điều trị
trạng thái hen, bệnh dị ứng nặng, phản ứng sau truyền máu, viêm thanh quản
rít.
- Dùng phối hợp với các cách điều trị khác trong phù não, trong sốc do nhiều
nguyên nhân khác nhau.
- Phòng ngừa bằng steroid trong phẫu thuật khi dự trữ glucocorticoid được coi
là không đủ, trừ suy vỏ tuyến thượng thận tiên phát (bệnh Addison).
- Dùng dexamethason trước khi sinh trong chuyển dạ trước kỳ hạn (giữa 24
và 34 tuần) để thúc đẩy quá trình trưởng thành thai (ví dụ phổi, mạch máu
não).
- Liệu pháp bổ trợ bằng dexamethason trong điều trị viêm màng não phế cầu.
- Ðiều trị tại chỗ: Tiêm trong và quanh khớp ở người bệnh viêm khớp dạng
thấp, thoái hóa xương khớp, viêm quanh khớp, viêm mỏm lồi cầu. Còn được
dùng tại chỗ trong một số trường hợp bệnh lý tai mũi họng, nhãn khoa, ngoài
da.
 Liều dùng : 0,5-10 mg/ngày [6], [10].

6
1.1.2.2. Dexamethason acetat
 Công thức cấu tạo: [4], [7], [20], [21].

C
24
H
31
FO
6
P.t.l: 434,5
Tên khoa học: 9-fluoro-11β,17-dihydroxy-16α-methyl-3,20-dioxopregna-1,4-
dien-21-yl acetat
 Tính chất vật lý: [4], [7], [20], [21].
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình. Dễ tan trong ethanol 96% và
aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước.
 Định tính:[4], [20].
- Đo phổ hấp thụ của dẫn chất hydrazon: cho phản ứng với phenylhydrazin
trong môi trường acid cho dẫn chất phenihydrazon có màu vàng (hấp thụ cực
đại ở 419 nm).
- Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
dexamethason acetat chuẩn (ĐC). Nếu các phổ thu được của chế phẩm và của
chất chuẩn ở dạng rắn khác nhau, đo thêm phổ ở dạng lỏng: dùng dung dịch
bão hòa (nồng độ khoảng 3%) của chế phẩm và của chất chuẩn trong
cloroform (TT) với tế bào đo dày 0,2 mm.
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: Silica gel GF
254
.
Dung môi khai triển: Nước - methanol - ether - methylen clorid (1,2 : 8 : 15 :
77).

7
Phát hiện: Soi ở bước sóng 254 và hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric
- Phản ứng màu: Oxy hóa với tác nhân H
2
SO4 đặc, có màu đỏ nhạt (thường
kèm huỳnh quang). Pha loãng với nước, màu biến mất trong ethanol.
- Khoảng 10 mg chế phẩm cho phản ứng của nhóm acetyl.
 Liều dùng trung bình: 0,5-10 mg/ngày [6], [10].
1.2. Một số nghiên cứu xác định dexamethason và dexamethason acetat
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu chiết dexamethason và dexamethason acetat
TLTK
Nền mẫu
PP chiết
Dung môi/cột
[10]
Thuốc nước
Chiết pha rắn
Cột 250SPE (500mg C18
và HLB; 8ml
[11]
Kem
Trực tiếp
Methanol
[9]
Chế phẩm đông
dược (thuốc bột)
Trực tiếp
Aceton
[22]
Viên nén

Trực tiếp
Cloroform
Thuốc nước
Pha loãng,
lỏng lỏng
Methanol-nước (1:1)
Ethyl acetat
[20]
Bột
Trực tiếp
Ethanol
Thuốc nước
Pha loãng
Methanol-nước
[16]
Huyết tương
người
Chiết lỏng lỏng
Ethyl acetat
[17]
Thực phẩm
Chiết pha rắn
C18 catridge
[19]
Viên nén
Chiết trực tiếp
Methanol
Máu
Chiết lỏng lỏng
Aceton-Methanol (1:1)

8
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu phát hiện dexamethason và dexamethason acetat
STT
Phương pháp
Điều kiện phân tích
TLTK
1
HPLC
- Cột Inertsil C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
- Detector DAD: bước sóng 240 nm
- Pha động: ACN-nước (35:65)
- Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút
[10]
2
TLC









- DMKT:
Hệ 1: Dicloromethan-ether-methanol-nước

(77:15:8:1,2)
Hệ 2: Dicloromethan-methanol-nước
(95:5:0,2)
Hệ 3: dicloromethan-methyl acetat-nước
(100:50:50) (lấy lớp dưới)
- V chấm = 2 µl
- Phát hiện: soi UV (254 nm), phun dung dị
ch
acid H
2
SO
4
20% trong ethanol rồi soi ở 366

nm, phun dung dịch xanh tetrazolium kiềm.
[11]
3
HPLC

- Pha động: ACN-nước (44-56)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Detector (240 nm)

4
TLC
- DMKT: Dicloromethan-ether-methanol-
nước (77:15:8:1,2)
- V chấm = 5 µl
- Phát hiện: soi UV (254 nm), phun dung dị
ch

acid H
2
SO
4
20% trong ethanol.
[9]
5
HPLC
- Cột C18
- Pha động: ACN - H
2
O (28 : 72)
- Phát hiện ở bước sóng 254 nm
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Chất chuẩn nội: Triamcinolon acetonide
[16]
6
HPLC
- Cột Metasil octadecyl silane, 5 µm (25 cm x
4,6 mm)
- Pha động: MeOH-Nước (65:35)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Detector UV (254 nm)
[15]
7
HPLC
- Cột Diol với hạt có kích cỡ 5 µm
- Pha động: hexan – propan-2-ol (90:10)
-Detector DAD
[17]

8
HPLC
- Cột C18
- Detector UV (239 nm)
[13]

9
1.3. Thực trạng thuốc đông dược và thực phẩm chức năng bị trộn tân
dược
Hiện nay, tình hình thuốc đông dược, thực phẩm chức năng bị trộn trái
phép tân dược đang xảy ra rất phổ biến và được cơ quan quản lý phát hiện
nhiều ở các vùng miền, từ các thành phố lớn đến các vùng tỉnh thành khác
trong toàn quốc. Các chế phẩm bị trộn tân dược cũng rất đa dạng và phong
phú, thủ đoạn của người sản xuất làm giả ngày một khéo léo và tinh vi (trộn
Tân dược vào vỏ nang mềm, lượng trộn được tính theo liều dùng của
thuốc, ). Trong đó nhóm thuốc đông dược bị trộn glucocorticoid hay gặp
nhất (vì thuốc có tác dụng nhanh và mạnh) và cũng gây ra nhiều tác hại cho
người tiêu dùng [26], [27], [28].
Một số thuốc đã bị phát hiện như:
- Nang mềm Tăng phì hoàn (Ceng Fui Yen) Malaysia sản xuất,trộn
Dexamethason, Cyproheptadin [24].
- Thuốc Dân tộc cứu nhân vật, sản xuất tại Campuchia, trộn 4 loại Tân dược
Dexamethason, Diazepam, Paracetamol và Cyproheptadin [24].
- Khu phong tê thấp thủy, và Truy phong tê thấp thủy của cơ sở sản xuất
thuốc YHCT Hinh hòa, TP Hồ Chí Minh bị trộn betamethason [25].
-Thuốc Bổ tỳ tâm của Phước Lợi Đường-Đà Nẵng có trộn cyproheptadin và
dexamethason [23].
- Một số đông dược và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu trộn
hoạt chất tăng cường khả năng sinh lý: Viên nang Supai 99 Tongkat Ali
plusdo Malaysia sản xuất có chứa Noracetildenafil; Viên nang Mãnh Nam do

Công ty TNHH Dược phẩm Ngọc Khánh có chứa Acetyldenafil; Viên nang
Bổ Thận Hà Thành do Công ty TNHH Hà Thành sản xuất có chứa
Sildenafil, [24].
Việc trộn thêm tân dược vào đông dược không chỉ là vấn đề của riêng nước ta

10
mà là vấn đề của nhiều nước khác: Trung Quốc, Singapore, Malaysia, Nhật
Bản, Campuchia, Theo báo cáo tại hội nghị hòa hợp thuốc đông dược khu
vực châu Á Thái Bình Dương, nhiều mẫu thuốc đông dược điều trị ho, hen,
thấp khớp bị phát hiện có trộn prednisolon hoặc dexamethason [10].
Vấn đề thực phẩm chức năng hiện nay:
- Sản xuất: Một số cơ sở sản xuất thuốc chữa bệnh không đạt GMP không
được phép sản xuất dược phẩm chuyển sang sản xuất TPCN do yêu cầu của
sản xuất chế phẩm này không khắt khe như thuốc, chỉ cần công bố tiêu chuẩn
và chịu trách nhiệm trước sản phẩm của mình, các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu
là tính chất, kim loại độc, độ nhiễm khuẩn.
- Bên cạnh đó các cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền nhỏ lẻ, gia truyền
đang dần sang sản xuất kinh doanh TPCN. Đây là nguồn gốc dẫn đến hàng
loạt TPCN có nguồn gốc YHCT như: Độc hoạt thang ký sinh, dầu gấc
Nhiều loại TPCN đóng gói giống hệt như thuốc chữa bệnh làm người dùng
khó phân biệt TPCN và thuốc điều trị. Đây cũng chính là các loại thực phẩm
chức năng có khả năng bị trộn trái phép thuốc tân dược nhằm quảng cáo,
chứng minh tác dụng tức thời của sản phẩm để thúc đẩy người mua, bán với
giá cao.
- Trộn tân dược trái phép vào thuốc đông dược và thực phẩm chức năng ngày
nhiều, do đó việc kiểm soát chất lượng càng mang tính chất thời sự và cấp
bách. Đặc biệt sự bùng nổ của thị trường TPCN trong mấy năm gần đây đã
gây nhiều khó khăn cho các cơ quan quản lý. Vì vậy, việc xây dựng các
phương pháp phát hiện chất cấm trong đông dược và TPCN là rất cần thiết.
1.4. Phương pháp xử lý mẫu [2]

Các thuốc đông dược thường là những thuốc có thành phần phức tạp, do
đó để phân tích các thuốc tân dược lẫn trong các thuốc đông dược thì việc xử
lý mẫu, tách chiết các chất cần quan tâm ra khỏi mẫu để định tính và định

11
lượng là rất quan trọng.
1.4.1. Phương pháp chiết trực tiếp
Chiết trực tiếp với dung môi hữu cơ là phương pháp chiết phổ biến nhất
trong kiểm nghiệm thuốc nhằm hòa tan dược chất. Tùy vào độ tan của dược
chất và tính chất của dung môi mà người ta lựa chọn cách hòa tan như ngâm,
khuấy, lắc cơ học, lắc siêu âm Khi chiết trực tiếp, còn có thể thay đổi thời
gian chiết, nhiệt độ để tăng hiệu suất chiết.
Phương pháp chiết trực tiếp thường được áp dụng cho các dạng mẫu rắn:
thuốc bột, thuốc viên, dược liệu hoặc dạng bán rắn như thuốc kem, thuốc mỡ.
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng
Là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang
dung môi thứ hai không đồng tan với dung môi thứ nhất, cất thu hồi dung môi
thu được chất phân tích. Tùy vào bản chất chất phân tích và mục đích nghiên
cứu có thể chiết dạng phân tử hay chiết cặp ion, chiết nội phức.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: độ tan của chất phân tích
trong dung môi, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hòa tan khác trong dung dịch.
Ứng dụng: Chiết lỏng lỏng được áp dụng khá phổ biến trong kiểm
nghiệm các thuốc dạng dung dịch như: thuốc nước, siro, rượu thuốc hay các
mẫu dịch sinh học như máu, nước tiểu Ngoài ra đối với mẫu phân tích dạng
rắn, người ta thường chuyển vào pha nước rồi chiết lỏng lỏng tách các nhóm
chất, tinh chế dịch chiết.
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn
Là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các
chất có ảnh hưởng tới chất cần phân tích, làm giàu chất trước khi phân tích
chúng. Các tài liệu tiếng Anh gọi là SPE (Solid phase extraction). Kỹ thuật

này được sử dụng từ lâu để tinh chế dịch chiết trong chiết xuất lỏng – lỏng.
Phương pháp này làm giảm đáng kể lượng dung môi được sử dụng, chiết có

12
chọn lọc chất cần quan tâm, thời gian chiết nhanh, hiệu quả chiết tốt và độ lặp
lại cao.
Ngày nay SPE được áp dụng rộng rãi để chiết tách, tinh chế, làm giàu
mẫu, đặc biệt hiệu quả cho các mẫu dịch sinh học, phân tích vi lượng, môi
trường
1.5. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng
1.5.1. Nguyên tắc
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin Layer Chromatography) là một kỹ thuật
phân tích dùng để tách các chất trong hỗn hợp.
Phương pháp SKLM bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ được
phủ trên một mặt phẳng trơ, pha động là chất lỏng gồm một hay nhiều dung
môi phối hợp với nhau, pha động chuyển động qua pha tĩnh dưới tác dụng của
lực mao dẫn [1].
Các chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc theo bản
chất của chúng, được tách riêng và ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng. Sự
tách các chất khác nhau dựa trên tính chất phân cực của các thành phần trong
dung dịch phân tích. Cơ chế tách có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử…hoặc phối hợp nhiều cơ chế [1].
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ R
f
. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của các
chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động [1]:
R
f
= d

R


/ d
M

Trong đó:
d
R
: Khoảng cách từ điểm xuất phát từ tâm đến vết phân tích (cm),
d
M
: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm)
R
f
: Có giá trị dao động giữa 0 và 1.


13
1.5.2. Pha tĩnh
Pha tĩnh của SKLM là các hạt có kích thước 10 – 30 µm được rải đều và
kết dính thành một lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ thủy
tinh, nhôm hoặc nhựa. Người ta thường đưa thêm chất phát huỳnh quang
không tan vào pha tĩnh để phát hiện chất phân tích. Một số chất thường dùng
làm pha tĩnh cho SKLM được trình bày trong bảng sau:
Bảng 1.3 : Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM
Pha tĩnh
Cơ chế sắc ký
Ứng dụng phân tích
Silica

Hấp thụ
Acid amin, hydrocarbon, alkaloid,
vitamin
Dẫn chất siloxan
Phân bố
Các chất ít phân cực
Cellulose
Phân bố
Acid amin, carbohydrat, nucleotid
Alumina
Hấp thụ
Hydrocarbon, alkaloid, chất màu thực
phẩm, lipid
Cát biển
Phân bố
Đường, acid béo
Cellulose trao đổi
ion
Trao đổi ion
Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,
halogenid
Gel sephadex
Loại cỡ
Polymer, protein, phức kim loại

Trong những chất làm pha tĩnh kể trên, phổ biến nhất là Silica (SiO
2
) và
Alumina (Al
2

O
3
) [1],[8].
1.5.3. Pha động
Pha động thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký, có thể sử dụng một hoặc
hỗn hợp nhiều dung môi với tỷ lệ thích hợp. Trong SKLM việc chọn dung
môi có ý nghĩa rất quan trọng. Tùy thuộc vào tính chất phân cực và ái lực với
pha tĩnh, ta lựa chọn dung môi phù hợp làm pha động khai triển. Muốn tách
các chất không hoặc ít phân cực phải dùng chất hấp phụ hoạt năng cao và

14
dung môi khai triển yếu (ít phân cực) và ngược lại [1].
Tuy vậy lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm. Sau
đây là một số gợi ý chung nhất cho pha động SKLM [1]:
- Dung môi cần có độ tinh khiết cao.
- Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số R
f
nằm trong khoảng 0,2
– 0,8 đạt độ phân giải cực trị.
- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân
cực như hỗn hợp n-BuOH : H
2
O. Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào
nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng.
- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của
pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số R
f
của
chúng. Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi
không phân cực như methylbenzen thì sẽ làm tăng đáng kể trị số R

f
.
1.5.4. Dụng cụ
• Dụng cụ chấm sắc ký
Có nhiều dụng cụ chấm sắc ký như: mao quản thủy tinh, pipet nhọn,
micropipet với nhiều cỡ khác nhau, máy chấm sắc ký với bơm tiêm mẫu…
Hiện nay có rất nhiều loại máy chấm sắc ký với phần mềm điều khiển cho
phép thay đổi được thể tích chấm, số lượng mẫu chấm trên một bản mỏng, vị
trí chấm một cách chính xác. Người dùng có thể chấm tròn hoặc vạch theo
yêu cầu.[14]
Các loại máy thường dùng là Nanomat (CAMAG, Muttenz, Switzerland),
Linomat 4, 5 (CAMAG, Muttenz, Switzerland), TLS100 (Baron, Reuchenau,
Germany); AS30, TLC Spotter PS 01 (Desaga, Heidelberg, Germany),
Automatic TLC Sampler 3, 4 (ATS 3; ATS 4 CAMAG). Trong đó, hay sử dụng
nhất là máy chấm sắc ký Linomax 5.0 kết hợp với một máy tính chạy phần mềm
winCATS. Cũng có thể sử dụng riêng các thiết bị tùy theo nhu cầu [14]

15
• Bình chạy sắc ký
Bình chạy sắc ký có thể là hình hộp hoặc hình trụ chữ nhật bằng thủy
tinh trong suốt. Thường dùng loại bình cổ điển đáy phẳng hoặc bình đáy hai
ngăn (twin trough chambers – TTC) với các kích thước khác nhau, bình hai
ngăn dùng tiết kiệm dung môi hơn. Bình có nắp đậy bằng thủy tinh hoặc thép
không gỉ để đảm bảo tạo buồng khai triển kín. Ngoài ra còn có thể sử dụng
các cốc thủy tinh hình trụ có nắp đậy kín để triển khai bản mỏng với kích
thước nhỏ [1], [14], [18].
• Thiết bị phát hiện sắc ký đồ [1], [14], [18].
- Bình phun thuốc thử hiện màu: TLC Sprayer, Reagent Spray, TLC spray
cabinet (CAMAG), Sprayer SG1, Autosprayer ChromaJet DS 20 (DESAGA).
- Đèn tử ngoại phát các bức xạ có bước sóng 254nm và 366nm như UV Lamp

(CAMAG).
- Densitometer: Thiết bị đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi
dưới đèn UV-VIS.
1.5.5. Ứng dụng của SKLM
SKLM là một kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực hóa học, dược
phẩm, hóa sinh, lâm sàng vào 3 mục đích sau:
• Định tính
Thường dựa vào trị số R
f
của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong
cùng điều kiện. Mỗi chất trong một hệ sắc ký có một giá trị R
f
đặc trưng. Giá
trị R
f
phụ thuộc nhiều yếu tố như chất hấp phụ (loại chất hấp phụ, hoạt tính,
bề dày chất hấp phụ…), pha động (thành phần, độ tinh khiết, tốc độ di chuyển
của pha động ), độ bão hòa dung môi trong bình chạy sắc ký, chiều dài khai
triển, nhiệt độ, lượng mẫu, cách xác định tâm, độ chính xác của phép đo độ
dài… Để việc định tính được chính xác, không được thay đổi điều kiện thực
nghiệm và nên tiến hành một loạt phép đo để xác định giá trị trung bình.

16
Đôi khi do sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động,
người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối R
r
để đặc trưng cho chất phân tích [1]:
R
r
= d

R,x
/ d
R,c

Trong đó: d
R,x
: là đường đi của chất phân tích (cm)
d
R,c
: là đường đi của chất chuẩn (cm)
(giá trị R
r
càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)
Ngoài trị số R
f
, người ta còn dựa vào màu sắc vết hoặc quét phổ vết để định
tính các chất.
• Thử tinh khiết
Đây là ứng dụng rất phổ biến của SKLM để kiểm tra sự tinh khiết của
chất chiết xuất từ dược liệu, là biện pháp đơn giản để kiểm tra các tạp chất đi
kèm với dược chất khi điều chế [1]. Khi khai triển dung dịch mẫu với các hệ
dung môi khác nhau không phát hiện vết lạ ngoài vết chính ta có thể kết luận
chất chiết xuất tinh khiết. Hiện nay ứng dụng thử tinh khiết khi chiết phân
đoạn và thường dùng nhất để xác định chất tinh khiết khi chạy sắc ký cột.
• Định lượng và bán định lượng [1]
Bằng các biện pháp chính xác hóa lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể
áp dụng SKLM để định lượng. Tùy theo phương tiện sử dụng mà độ chính
xác của phép định lượng ở cấp độ khác nhau.
Có hai cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:
 Định lượng sau khi tách các chất ra khỏi bản mỏng.

Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi
làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp
(phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ…). Phương pháp này hiện nay ít dùng vì
có nhiều trở ngại, lại mất thời gian.
 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:
Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:

17
- Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc
huỳnh quang.
- Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số:
Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có
độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng
máy tính.
1.5.6. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lớp mỏng
• Ưu điểm [1]
- Chi phí thiết bị đơn giản, không đòi hỏi nhiều thao tác quá khó như nhiều
phương pháp khác mà vẫn cho một độ chính xác có thể chấp nhận được.
- Phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động
(nằm ở điểm xuất phát).
- Thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần: Có thể thực hiện sắc
ký đồng thời 10 – 20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn.
- SKLM cung cấp thêm thông tin bán định lượng về các thành phần chính của
thuốc và các tiền chất làm thuốc, do đó nó cho phép đánh giá chất lượng
thuốc.
• Nhược điểm [1]
- Trong một số trường hợp độ lặp lại của trị số R
f
thấp do thành phần pha
động thay đổi trong quá trình triển khai sắc ký.

- Tăng giãn rộng pic sắc ký do khuếch tán vì tốc độ dòng của pha động thấp.