Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong một số chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



HOÀNG THỊ QUỲNH
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN
SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ
PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ
LỚP MỎNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN
SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ
PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ
LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :
TS . Phạm Thị Thanh Hà
ThS . Ngô Quang Trung
Nơi thực hiện:
Phòng phân tích, kiểm nghiệm & TĐSH-
Viện công nghệ dược phẩm Quốc Gia.


HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến:
TS. Phạm Thị Thanh Hà
ThS. Ngô Quang Trung
Là người thầy, người cô đã luôn tận tình hướng dẫn tôi, và giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh,
và các anh chị tại Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học -
Viện công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn
thành được khóa luận.
Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô tại các bộ môn của
Trường Đại Học Dược Hà Nội, đã truyền dạy kiến thức và niềm tự hào là
sinh viên trường Dược cho tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người đã
luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa
luận này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về sildenafil 3
1.1.1. Công thức 3
1.1.2. Tính chất 3
1.1.3. Tác dụng của Sildenafil 4
1.1.3.1. Cơ chế tác dụng của Sildenafil 4
1.1.3.2. Dược động học 4
1.1.3.3. Chỉ định 5
1.1.3.4. Liều dùng 5
1.1.3.5. Tác dụng không mong muốn của Sildenafil 5
1.1.3.6. Tương tác thuốc 6
1.1.4. Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế
phẩm đông dược 7
1.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 7
1.2.1. Nguyên tắc 7
1.2.2. Pha tĩnh 8
1.2.3. Pha động 9
1.2.4. Kỹ thuật 10
1.2.4.1. Đưa chất phân tích lên bản mỏng 10
1.2.4.2. Khai triển sắc ký 11
1.2.4.3. Phát hiện vết trên sắc ký đồ 12
1.2.5. Ứng dụng của SKLM 13
1.2.5.1. Định tính 13

1.2.5.2. Thử tinh khiết 14
1.2.5.3. Định lượng 14
1.2.6. Ưu nhược điểm 14
1.2.6.1. Ưu điểm 14
1.2.6.2. Nhược điểm 15
1.3. Phương pháp xử lý mẫu 15
1.3.1. Chiết hệ dị thể rắn-lỏng 15
1.3.2. Chiết Soxhlet 16
1.3.3. Chiết pha rắn (SPE) 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Phương tiện nghiên cứu 17
2.1.1. Máy móc, thiết bị 17
2.1.2. Hóa chất thuốc thử 17
2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 18
2.2.2. Nội dung nghiên cứu 19
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích 20
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 20
3.1.2. Khảo sát điều kiện phát hiện 21
3.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 23
3.2.Đánh giá phương pháp 25
3.2.1. Độ chọn lọc 25
3.2.2. Độ lặp lại 26

3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) 29
3.3. Áp dụng phương pháp kiểm tra một số mẫu 32
3.3.1. Quy trình xử lý mẫu thử và điều kiện khai triển sắc ký 32
3.3.2. Xích Thố Vương 1 33

3.3.3. Xích Thố Vương 2 33
3.3.4. Xích Thố Vương 3 34
3.3.5. YANGCHUNSAMNOK. 34
3.3.6. ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours. 35
3.3.7. YANGCHUNSAMROK. 35
3.4. Bàn luận 36
KẾT LUẬN 37
ĐỀ XUẤT 38
TLTK

DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
PDE-5 Phosphodiesterase-5
MeOH Methanol
NO Nitơ (II) oxid
cGMP cyclic Guanosine Monophosphate
PAH Pulmonary Arterial Hypertension (tăng áp động mạch phổi)
CYP Cytochrome P450
ED Erectile Dysfunction (rối loạn cương dương)
SKLM Sắc Ký Lớp Mỏng
IR Infrared (Hồng ngoại)
HPLC
High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu
năng cao)
TLC Thin- Layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
MS Mass spectra( khối phổ)
HPTLC
High-performance Thin- Layer chromatography( Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao)
TLTK Tài liệu tham khảo
SKĐ Sắc ký đồ

UV Ultraviolet (Tử ngoại)
SPE Solid Phase extraction (Chiết pha rắn)
SC Sildenafil citrate
SD Sildenafil
S/N Signal/Noise
LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1
Một số phương pháp phát hiện sildenafil. 7
Bảng 1.2
Một số chất thường làm pha tĩnh cho sắc ký lớp mỏng 9
Bảng 1.3
Một số thuốc thử tạo màu trong sắc ký lớp mỏng 12
Bảng 2.1
Một số sản phẩm đông dược ứng dụng kiểm tra. 18
Bảng 3.1
Kết quả tính độ lặp lại. 29

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1
Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi khai triển 20
Hình 3.2
Sắc ký đồ khảo sát điều kiện phát hiện vết 22
Hình 3.3
Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết 24
Hình 3.4

Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc 26
Hình 3.5
Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại 27
Hình 3.6
Sắc ký đồ analog xác định độ lặp lại 28
Hình 3.7
Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện 30
Hình 3.8
Sắc ký đồ analog của mẫu xác định giới hạn phát hiện 31
Hình 3.9
Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 1 33
Hình 3.10
Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 2 33
Hình 3.11
Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 3 34
Hình 3.12
Sắc ký đồ mẫu YANGCHUNSAMNOK 34
Hình 3.13
Sắc ký đồ mẫu ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours

35
Hình 3.14

Sắc ký đồ mẫu YANGCHUNSAMROK 35

1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, khi kinh tế ngày càng phát triển, con người có điều kiện

quan tâm đến sức khỏe nhiều hơn. Cùng xu hướng ưa chuộng sử dụng các
sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên với niềm tin chúng an toàn, hiệu quả hơn.
Nắm bắt xu thế đó, các cơ sở sản xuất chế phẩm đông dược đã đưa ra thị
trường rất nhiều mặt hàng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Tuy
nhiên, nhà sản xuất vì nhiều mục đích như lợi nhuận, giảm nhanh các triệu
chứng hay tạo cảm giác đánh lừa người tiêu dùng (tăng cân nhanh do tác
dụng giữ nước) , mà đã cố tình trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế
phẩm đông dược. Điều này không được thông báo khiến người tiêu dùng vì
không biết đã sử dụng thuốc với một liều lớn trong thời gian kéo dài, đây có
thể là nguyên nhân gây ra các tác dụng không mong muốn về sau cho người
dùng thậm chí là nguy hiểm đến tính mạng. Các nhóm thuốc thường được sử
dụng là: glucocorticoid, nhóm giảm đau chống viêm không steroid, nhóm ức
chế PDE-5…đây là những thuốc cho tác dụng nhanh và mạnh vì vậy mà
chúng bị lạm dụng nhiều. Chính vì vậy mà hiện nay nước ta đã có quy định
cụ thể nghiêm cấm trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông
dược, tuy nhiên việc kiểm soát còn gặp nhiều khó khăn.
Sildenafil là một chất thuộc nhóm ức chế PDE-5. Năm 1998, sildenafil
với tên biệt dược là Viagra đã được FDA công nhận làm thuốc và cũng là
thuốc đầu tiên điều trị rối loạn cương dương trên thế giới. Chính nhờ tác dụng
của nó mà việc lạm dụng thuốc và tình hình trộn trái phép sildenafil vào các
chế phẩm đông dược ngày càng gia tăng. Trong báo cáo thường niên của hội
đồng dược điển Mỹ (USP) năm 2007 đã nêu rõ rằng: “trộn sildenafil và dẫn
chất” trở thành vấn đề mang tính toàn cầu [17].
2


Nhằm mục đích góp phần trong công tác nghiên cứu phát hiện thuốc
tân dược trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược chúng tôi tiến hành đề
tài:
“Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong một số chế phẩm đông dược

bằng sắc ký lớp mỏng”.
Với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Xây dựng quy trình phát hiện sildenafil có thể có trong các chế phẩm
đông dược bằng sắc ký lớp mỏng
2. Áp dụng quy trình để kiểm tra một số chế phẩm đông dược thu thập
được.













3


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về sildenafil
1.1.1 Công thức [14]
- Tên khoa học: 5-[2-ethoxy-5-(4-methylpiperazinnylsulfonyl)phenyl]-1-
methyl-3-n-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one.
- Tên khác: 1-[[3-(4,7-Dihydro-1-methyl-7-oxo-3-propyl-1H-pyrazolo[4,3-
d]pyrimidin-5-yl)-4-ethoxyphenyl]sulfonyl]-4-methylpiperazine.
- Công thức hóa học:

-Công thức phân tử: C
22
H
30
N
6
O
4
S.
-Phân tử lượng: 474,59.
1.1.2 Tính chất [10], [14]
+ Màu trắng hoặc màu trắng ngà.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 187
o
-189
o
C.
+ Độ tan: Sildenafil citrate ít tan trong methanol (3,5mg/ml), độ tan của
SC phụ thuộc vào pH và giảm dần theo sự tăng pH. pH trong phạm vi
3,7-3,8, pKa 8,2-9,6.
+ Tồn tại ở dạng muối liên kết với acid citric (C

22
H
30
N
6
O
4
S.C
6
H
8
O
7
).
4


Tên biệt dược:
Revatio 20mg.
Viagra 25mg, 50mg, 100mg.
1.1.3 Tác dụng của sildenafil
1.1.3.1 Cơ chế tác dụng của sildenafil [3], [10], [21].
- Điều trị rối loạn chức năng cương dương.
Không có một nguyên nhân chính xác về cương dương vật nhưng được
đáp ứng từ nhu cầu tình dục. Cơ chế của cương dương vật liên quan đến giải
phóng nitơ (II) oxid (NO) thể hang dương vật trong quá trình ham muốn tình
dục. NO sau đó sẽ kích hoạt enzyme guanylate cyclase và làm tăng nồng độ
cyclic guanosine monophosphate (cGMP) và kết quả là làm giãn cơ trơn và
tăng lượng máu đến thể hang dương vật. Sildenafil làm tăng tác dụng của NO
bởi ức chế enzyme phosphodiesterase-5 (PDE-5) một enzyme thoái hóa

cGMP trong thể hang dương vật.
- Điều trị tăng áp động mạch phổi (PAH): ức chế PDE-5 ở cơ trơn
động mạch phổi. Kết quả của tăng nồng độ cGMP là gây giãn cơ trơn động
mạch phổi.
1.1.3.2 Dược động học [10], [21]
+ Hấp thu: nhanh, chậm hơn khi ăn bữa ăn giàu chất béo.
+ Phân bố: thể tích phân bố V
d
=105L.
+ Liên kết với protein: 96%.
+ Sinh khả dụng: 40%.
+ Thời gian bán thải: t
1/2
=4h.
+ Thời gian đạt nồng độ tối đa: 30 phút đến 120 phút, chậm 60 phút khi
sử dụng thức ăn giàu chất béo.
+ Chuyển hóa: qua gan, chủ yếu là qua hệ enzyme CYP3A4.
+ Thải trừ: chủ yếu qua phân (80%), qua nước tiểu (13%).
5


1.1.3.3 Chỉ định [10], [21]
- Rối loạn cương dương (ED).
- Tăng áp động mạch phổi (PAH).
1.1.3.4 Liều dùng [10], [21]
- Người lớn:
Rối loạn chức năng cương dương: 50mg × 1 lần/1 ngày (đường uống),
uống trước 1 giờ (dao động từ 30 phút đến 4 giờ) khi có nhu cầu tình dục.
Liều dao động từ 25-100mg × 1 lần/1 ngày.
Tăng áp động mạch phổi: 20mg ×3 lần/1 ngày.

1.1.3.5 Tác dụng không mong muốn của sildenafil
Các tác dụng không mong muốn như đỏ mặt, rối loạn tiêu hóa, đau cơ,
rối loạn về thị giác tăng lên khi dùng liều >100mg/24h.
Ảnh hưởng lên hệ tim mạch [18]
Ảnh hưởng của nhóm ức chế enzyme PDE-5 (sildenafil, vardenafil,
tadalafil) lên hệ tim mạch đã được ghi nhận. Có những báo cáo không rõ ràng
về nguy cơ tiềm tàng khi điều trị bằng sildenafil. Tác dụng giãn mạch như
đau đầu, đỏ mặt xảy ra thường xuyên.
Tháng 12/1998, có 130 bệnh nhân chết khi sử dụng sildenafil được báo
cáo tại FDA, 7 trường hợp bị đột quỵ và 77 trường hợp bị mắc các bệnh có
liên quan đến tim mạch. Liên quan các trường hợp trên với sử dụng thuốc là
chưa rõ ràng, song có một số bệnh nhân khi sử dụng thuốc kết hợp với nitrat
gây “hạ huyết áp quá mức”.
Tại Úc, Trung tâm theo dõi phản ứng có hại của thuốc vào tháng
6/2002 đã ghi nhận 773 trường hợp có liên quan sử dụng sildenafil. Trong đó
có 20 trường hợp bị nhồi máu cơ tim bao gồm 4 trường hợp tử vong, 9 trong
20 trường hợp có tiền sử bệnh tim mạch hoặc đái tháo đường hoặc được xác
6


nhận có nguy cơ cao các bệnh tim mạch, 1 trường hợp sử dụng kết hợp với
nitrat.
Các trường hợp liên quan đến tim mạch gồm 26 trường hợp đau thắt
ngực, 10 trường hợp tử vong (6 trường hợp không rõ nguyên nhân, 2 trường
hợp bị đột quỵ và 2 trường hợp bị xuất huyết não).
Ảnh hưởng đến tai: [18]
Vào 10/2007 US FDA ghi nhận 29 trường hợp bị giảm thính giác khi sử
dụng nhóm ức chế PDE-5. Các triệu chứng ghi nhận là ù tai, chóng mặt hoặc
hoa mắt. Trong các trường hợp ghi nhận, giảm khả năng thính giác bao gồm
giảm chức năng một bên tai hoặc một phần hoặc hoàn toàn. 1/3 trong các

trường hợp là giảm chức năng tạm thời.
Ảnh hưởng lên chức năng tâm thần [18]
Có vài báo cáo về chứng mất trí nhớ tạm thời khi sử dụng sildenafil
hoặc taladafil. Từ 1/1998 đến 12/2001, FDA đã ghi nhận có 35 trường hợp về
chứng mất trí nhớ mà sildenafil được xem là nguyên nhân nghi ngờ hàng đầu.
1.1.3.6 Tương tác thuốc [18]
Thuốc được chuyển hóa chủ yếu bởi hệ enzyme CYP3A4.
Tránh sử dụng đồng thời sildenafil với các nhóm thuốc ức chế enzyme
CYP3A4, các thuốc giãn mạch.
Sildenafil làm tăng tác dụng của các thuốc: chẹn kênh alpha, nhóm ức
chế HMG-CoA reductase, nhóm thuốc ức chế men chuyển
phosphodiesterase-5, nhóm thuốc giãn mạch.
Tác dụng của sildenafil tăng lên khi dùng cùng các thuốc: thuốc chống
nấm, thuốc ức chế enzyme CYP3A4, kháng sinh marcolid, thuốc ức chế
enzyme protease, saproterin.
Tác dụng của sildenafil giảm đi khi dùng cùng các thuốc: Bosentan,
thuốc cảm ứng enzyme CYP3A4, Etravirin.
7


1.1.4. Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược
Qua một số tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu để phát hiện
Sildenafil trong chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng cả trên thế giới
và tại Việt Nam [6], [9], [12], [15], [19], [22], [23]. Bảng 1.1 trình bày một số
nghiên cứu đó:
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu phát hiện sildenafil.
STT

Phương
pháp

Đặc điểm phương pháp
TLTK

1
IR So sánh phổ của chất có mặt trong dịch chiết với phổ chuẩn hoặc phổ củ
a
chất chuẩn
[12]
2
HPLC Điều kiện sắc ký:
- Cột Phenomenex C18 (150 × 4,6 mm; 5 µm )
- Detector DAD : 280 nm
- Pha động : ACN : đệm CH
3
COONH
4
0,05M, pH 4,0 (8:2)
- Tốc độ dòng : 0,4 ml/ phút
- Thể tích tiêm mẫu : 25 µl
- Dung môi pha mẫu : pha động
[6]
3
TLC Điều kiện sắc ký :
- Bản mỏng silicagel GF
254.
(Merck)
- Dung môi khai triển : chloroform : ethyl acetat : nước : methanol (
40:
40: 15: 11) v/v
- Phát hiện vết : UV λ= 254 nm

[22]
4
MS Điều kiện khối phổ :
- MS : quét toàn thang (TIC,150- 170 amu)
- Khí sheath gas ( SG ) 20 đơn vị, Aux/ sweep gas ( AG) : 10 đơn vị
- Nhiệt độ mao quản chuyển ion : 350
0
C
- MS
2
: quét toàn thang ( TIC, 150-600 amu)
- Năng lượng va chạm ( CE) : 20%-50%
[6]
5
HPTLC Điều kiện sắc ký:
- Bản mỏng silicagel GF
254
(Merck).
- Dung môi khai triển: chloroform: methanol: diethylamine (90:10:1) v/v

- Phát hiện vết: UV λ= 305 nm.
[9]
1.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
1.2.1. Nguyên tắc [1]
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin - Layer Chromatography) là một kỹ
thuật phân tích dùng để tách các chất trong hỗn hợp.
8


Quá trình tách bằng SKLM được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các

hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm
hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Pha động là chất lỏng gồm một
hay hỗn hợp nhiều dung môi, pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao
dẫn.
Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào
bản chất của chúng, và kết quả là chúng được tách riêng, đứng ở các vị trí
khác nhau trên bản mỏng. Sự tách các chất khác nhau cũng phụ thuộc vào
tính phân cực của các thành phần trong pha động. Cơ chế tách có thể là phân
bố, hấp phụ, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hoặc phối hợp nhiều cơ chế.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ
số lưu giữ R
f
. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển
của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
R
f
= d
R
/ d
M
Trong đó:
d
R
: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
d
M :
khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên

cùng đường đi của vết, tính bằng cm ).
R

f
có giá trị dao động giữa 0 và 1. Tốt nhất là khoảng 0,2 đến 0,8.
1.2.2. Pha tĩnh [1].
Pha tĩnh của SKLM là các hạt có kích thước 10-30 µm được rải đều và
kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ nhôm,
thủy tinh, nhựa. Bản mỏng có sẵn trên thị trường với nhiều kích thước khác
nhau và nhiều khi người ta có đưa thêm các chất phát huỳnh quang không tan
vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích.
Một số chất thường được dùng làm pha tĩnh cho SKLM kèm theo cơ
chế sắc ký và ứng dụng được trình bày trong bảng sau:
9


Bảng 1.2. Một số chất thường làm pha tĩnh cho SKLM
Pha tĩnh
Cơ chế sắc
ký
ứng dụng phân tích
Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin
Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực
Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid
Alumina Hấp phụ
Hydrocarbon, alkaloid, chất màu thực
phẩm, lipid
Cát biển Phân bố Đường, acid béo
Cellulose trao đổi
ion
Trao đổi ion
Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,
halogenua

Gel sephadex Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại

Trong những chất kể trên, được dùng phổ biến nhất là silica (SiO
2
) và
alumina (Al
2
O
3
).
1.2.3. Pha động [1]
Pha động cho SKLM rất thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký (bảng
1.2). Để tăng cường sức rửa giải thường kết hợp 2 dung môi. Nguyên lý chia
tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha. Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc
ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm. Sau đây là một số gợi ý chung nhất
cho pha động của SKLM:
 Dung môi cần có độ tinh khiết cao.
10


 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số R
f
nằm trong
khoảng 0,2 ÷ 0,8 đạt độ phân giải cực trị.
 Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi
phân cực như hỗn hợp n-BuOH – H
2
O. Thêm một ít acid acetic hoặc
amoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng.
 Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực

của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị
số R
f
của chúng. Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether
ethylic vào dung môi không phân cực như methylbenzen sẽ làm tăng
đáng kể trị số R
f .

1.2.4. Kỹ thuật [1], [11], [13]
Bản sắc ký thường có kích thước khác nhau. Hai loại thông dụng là
10×20cm và 20×20cm. Sau khi chọn được bản mỏng phù hợp, tiến hành
SKLM gồm có 4 bước sau:
 Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng.
 Khai triển sắc ký với pha động phù hợp.
 Phát hiện các vết trên sắc ký đồ (SKĐ).
 Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm.
1.2.4.1. Đưa chất phân tích lên bản mỏng [1], [11]
Trước khi thực hiện việc đưa chất phân tích lên bản mỏng cần thực
hiện việc hoạt hóa bản mỏng.
Dụng cụ chấm sắc ký có thể là: mao quản thủy tinh, pipet nhọn,
micropipet với nhiều kích cỡ khác nhau, máy chấm sắc ký với bơm tiêm
mẫu…. Hiện nay có rất nhiều loại máy chấm sắc ký với bơm tiêm mẫu điều
chỉnh được thể tích chấm, số lượng mẫu chấm trên một bản mỏng, vị trí chấm
một cách chính xác. Người dùng có thể chấm tại một điểm hoặc một vạch tùy
theo yêu cầu.
11


Lượng hỗn hợp các chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng
đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến trị số R

f
. Nếu lượng chất quá
lớn, vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các chất có trị số R
f
gần nhau sẽ chồng
lên nhau không tách riêng được. Nếu lượng quá nhỏ có thể không phát hiện
được vết (do thuốc thử không đủ độ nhạy).
Đường xuất phát (để chấm sắc ký) cách mép dưới bản mỏng khoảng
1,5÷2,0 cm và cách bề mặt pha động 0,8 ÷ 1,0 cm. Các vết chấm phải nhỏ,
đường kính 2-6 mm và cách nhau khoảng 15mm. Các vết ở bìa phải cách bờ
khoảng 1 cm. Trong trường hợp bản định lượng phải dùng mao quản định
mức chính xác vì độ tin cậy của kết quả phụ thuộc vào lượng chất phân tích
đưa lên bản mỏng.
1.2.4.2. Khai triển sắc ký [1], [11]
Thiết bị khai triển sắc ký thường là bình thủy tinh trong suốt có nút
xoáy kín. Thường dùng loại bình cổ điển đáy phẳng hoặc bình có đáy hai
ngăn (twin trough chambers- TTC) với các kích thước khác nhau, bình 2
ngăn dùng tiết kiệm dung môi hơn. Để tăng độ bão hòa dung môi pha động
trong bình (nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi) người ta
đặt một tờ giấy lọc áp sát thành bình.
Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô (đã bay hết dung môi) được cho
vào bình sắc ký đã bão hòa pha động. Mép dưới bản mỏng được nhúng vào
pha động nhưng vết chấm còn cách bề mặt pha động khoảng 1 cm.
Có nhiều cách khai triển sắc ký, nhưng thường gặp 3 cách:
1. Sắc ký lên: mẫu phân tích được đưa lên từ mép dưới của bản mỏng,
pha động di chuyển nhờ lực mao dẫn.
12


2. Sắc ký ngang: mẫu phân tích được đưa lên ở 2 bờ đối diện của bản

mỏng, pha động từ 2 phía chạy vào giữa bản. Có bấc để dẫn pha động
đi vào bản mỏng.
3. Sắc ký hai chiều: trường hợp này bản mỏng hình vuông, vết chấm sắc
ký ở một góc bản mỏng. Đầu tiên chạy sắc ký với pha động A, làm khô
bản mỏng, quay 90
o
chạy với pha động B. Làm khô bản mỏng và phát
hiện vết.
1.2.4.3. Phát hiện vết trên sắc ký đồ [1], [11], [13]
Dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn
cách phát hiện thích hợp các vết sắc ký.
Một số kỹ thuật phát hiện thường gặp:
 Phun thuốc thử hiện màu:
Dùng thuốc thử tạo màu với chất phân tích. Đôi khi người ta làm nóng
bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu.
Một số thuốc thử tạo màu trong SKLM được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong SKLM
Thuốc thử Màu của vết Ứng dụng phân tích
1.thuốc thử chung
- acid phosphomolypdic
- acid sulfuric đặc
- hơi iod

Xanh tối
Nâu- đen
Nâu

Nhiều chất hữu cơ
Tất cả các chất hữu cơ
Nhiều chất hữu cơ

2.thuốc thử chọn lọc
- Ninhydrin

-2,4- dinitrophenylhydrazon

Hồng- tím

Da cam, đỏ

Acid amin,các nhóm chức amin
Các hợp chất carbonyl
Các acid hữu cơ
13


-xanh hoặc lục bromocrezol
-2,7 fluorescein
-vanilin/acid sulfuric
-rhodamin B
-anisaldehyd/SbCl
3

-diphenylamin/Zn
2+
Vàng
Vàng- lục
Xanh- lục- hồng
Huỳnh quang đỏ
Nhiều màu
Nhiều màu

Nhiều chất hữu cơ
Alcol, ceton
Các chất lipid
Các chất steroid
Các chất bảo vệ thực vật

 Soi dưới đèn UV:
Nhiều vết chất hữu cơ trên SKĐ trở nên tối hoặc phát quang sáng khi
soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm hoặc 366 nm. Một số bản tráng sẵn có
chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang.
 Dùng densitometer:
Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới
đèn UV-VIS. Chất phân tích hấp thụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký.
1.2.5. Ứng dụng [1], [2]
SKLM là một kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: hóa
học, dược phẩm, hóa sinh, lâm sàng với 3 mục đích sau:
1.2.5.1. Định tính
Thường dựa vào trị số R
f
, màu sắc vết của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy
sắc ký trong cùng điều kiện. Đôi khi do sắc ký liên tục không xác định được
tuyến dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối R
r
để đặc
trưng cho chất phân tích:
R
r
= d
R,x
/d

R,c
Trong đó: d
R,x
đường đi của chất phân tích (cm).
d
R,c
đường đi của chất chuẩn (cm).
R
r
càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất.
14


1.2.5.2. Thử tinh khiết
Đây là ứng dụng rất phổ biến của SKLM, là biện pháp đơn giản để kết
luận sự tinh khiết của hợp chất. Khi khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung
môi khác nhau mà ngoài vết chính không kèm theo các vết khác trên sắc ký
đồ, ta có thể kết luận chất đó tinh khiết. Trong các Dược điển thường quy
định kiểm tra tạp chất có mặt trong dược chất bằng SKLM.
1.2.5.3. Định lượng
Bằng các biện pháp chính xác hóa lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể
sử dụng SKLM để định lượng. Tùy theo phương tiện sử dụng mà độ chính
xác của phép định lượng ở cấp độ khác nhau:
Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:
- Định lượng chất phân tích sau khi tách chiết ra khỏi bản mỏng bằng
dung môi thích hợp.
- Định lượng chất phân tích trực tiếp trên bản mỏng: bằng cách đo diện
tích hay cường độ màu của vết sắc ký.
1.2.6. Ưu nhược điểm [1]
1.2.6.1. Ưu điểm

- Chi phí thiết bị đơn giản, không đòi hỏi nhiều thao tác quá khó như
nhiều phương pháp khác mà vẫn cho một độ chính xác có thể chấp nhận
được.
- SKLM cung cấp thêm thông tin bán định lượng về các thành phần
chính của thuốc và các tiền chất làm thuốc, do đó nó cho phép đánh giá chất
lượng thuốc.
- SKLM cung cấp hình ảnh SKĐ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc bởi
vậy phương pháp này thực sự thích hợp trong việc kiểm tra sự đồng nhất, tinh
khiết của thuốc và phát hiện sự giả mạo, thay thế thuốc.
15


1.2.6.2. Nhược điểm
- Độ lặp lại thấp của trị số R
f
do thành phần pha động thay đổi trong
quá trình khai triển sắc ký.
- Tăng giãn rộng pic do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp.
1.3. Phương pháp xử lý mẫu [4], [5], [8]
Các chế phẩm đông dược thường có thành phần phức tạp, vì vậy để
phát hiện được thuốc tân dược có thể bị trộn trong đông dược chúng ta cần
chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp.
Một số kỹ thuật chiết hay được sử dụng:
1.3.1. Chiết hệ dị thể rắn-lỏng
- Nguyên tắc: là kỹ thuật chiết đơn giản nhất, sử dụng dung môi hữu cơ
để chiết các đối tượng phân tích tan trong dung môi chiết từ mẫu đã được làm
nhỏ.
- Để chiết hiệu quả thì cần lưu ý các yếu tố sau:
 Diện tích tiếp xúc giữa mẫu và dung môi lớn làm tăng khả năng chiết,
mẫu càng nhỏ thì khả năng chiết càng tốt. Tuy nhiên, nếu mẫu quá mịn

thì quá trình tách chiết sẽ khó thực hiện đồng thời có thể kéo thêm
nhiều tạp chất.
 Thời gian tiếp xúc phải đủ để dung môi thấm vào mẫu, hòa tan các
chất phân tích. Nếu thời gian không ảnh hưởng đến chất phân tích thì có
thể ngâm mẫu trong dung môi cần chiết vài giờ hoặc qua đêm.
 Nếu chiết bằng dung môi kém phân cực thì hàm ẩm không được quá
lớn.
Thông thường để tăng hiệu quả và rút ngắn thời gian chiết người ta có
thể sử dụng các tác nhân vật lý như nhiệt độ, siêu âm…
16


- Ứng dụng: kỹ thuật chiết rắn-lỏng được áp dụng phổ biến cho các
mẫu dạng rắn như : thuốc bột, thuốc viên, dược liệu…hoặc mẫu bán rắn như
thuốc mỡ, cream….
1.3.2. Chiết Soxhlet
- Nguyên tắc: Dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết lặp lại liên tục và cạn
kiệt các hoạt chất trong mẫu phân tích đã làm nhỏ trong một loại trang bị
chiết riêng. Đây là kỹ thuật chiết toàn phần và có hiệu suất cao.
- Khi chiết cần lưu ý không để nhiệt độ sôi của hỗn hợp dung môi quá
cao vì có thể làm phân hủy mẫu và đồng thời chú ý đến lượng mẫu thử và
thời gian chiết.
- Ứng dụng: kỹ thuật chiết Soxhlet thường được dùng phổ biến để chiết
các hợp chất bảo vệ thực vật từ các loại mẫu cây, lá, rau quả, thực phẩm hay
mẫu đất.
1.3.3. Chiết pha rắn (SPE)
- Là kỹ thuật chiết dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các
chất có ảnh hưởng đến chất phân tích, làm giàu chất trước khi phân tích
chúng. Kỹ thuật này có thể làm giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ, chiết
có chọn lọc các chất cần quan tâm, thời gian chiết nhanh, hiệu quả chiết cao,

và độ lặp lại cao.
- Ứng dụng: kỹ thuật SPE được áp dụng rộng rãi để chiết tách, tinh chế,
làm giàu mẫu, đặc biệt hiệu quả cho các mẫu dịch sinh học, phân tích vi
lượng, môi trường….