Nghiên cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
LIPOXYGENASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI - 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
LIPOXYGENASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực vật

2. Bộ môn Vật lý – Hóa lý
Trường Đại Học Dược Hà Nội


HÀ NỘI – 2013


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hoàng
Quỳnh Hoa,người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên, kĩ thuật viên Bộ môn Thực
vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm tại Bộ
môn Thực vật.
Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vật lý – Hóa lý đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình sử dụng máy đo quang phổ tại bộ
môn Vật lý – Hóa lý.
Tôi xin cảm ơn toàn thể cán bộ, giảng viênTrường Đại học Dược Hà
Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ, người thân và
bạn bè của tôi – những người đã luôn động viên, chăm sóc và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Đào Thu Trang

MỤC LỤC
Trang
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ … ……………………………………….………………. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN………………… ………………………… 3
1.1. T
ổng quan về enzym Lipoxygenase ….…………………………… 3
1.1.1. Đị
nh nghĩa….…………………………………………………. ……3
1.1.2. P
hân loại enzym LOX ……………………………………… ……3
1.1.3. C
ơ chế phản ứngcủa enzym LOX và cơ chất……………….…… 4
1.1.4. V
ai trò của LOX trong động thực vật … ……………………….… 5
1.1.5. C
ác chất ức chế LOX ………………………………………… …6
1.1.6. C
ơ chế ức chế LOX….…………………………………………. … 7
1.2. C
ác mô hình thử tác dụng ức chế LOX……………………… 7
1.2.1. N
guyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX………… 7

1.2.2. C
ác mô hình thử tác dụng ức chế LOXdựa trên phương pháp
đo độ hấp thụ………………………………………………………… 9
1.3. T
ổng quan vềrutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu……… 14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị trong nghiên cứu…….…………………… 18
2.2. Nội dung nghiên cứu… …………………………………………… 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………. 20
2.3.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu……………….………………… 20
2.3.2. Phương pháp lựa chọn điều kiện nghiên cứu……………….…… 20
2.3.3. Phương pháp khảo sát tương tác enzym – chất ức chế……….…… 23
2.3.4. Lựa chọn mô hình thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu….…… 24
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …….…… 27
3.1. Lựa chọn điều kiện nghiên cứu………………………… …………. 27
3.1.1. Xác định hoạt độ enzym …………………………….……….…… 27
3.1.2. Lựa chọn nồng độ enzym………… ……………… …… …… 27
3.1.3. Lựa chọn nồng độ cơ chất……………………………….…….… 29
3.1.4. Lựa chọn thời gian ủ………………………………….……… … 31
3.2. Khảo sát tương tác enzym – chất ức chế………………… …….…. 33
3.3. Thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu theo mô hình 6 cuvet.……. 33
3.4. Bàn luận……………………………………………………….…… 35
3.4.1. Về mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp
đo quang ………………………………………………………………… 35
3.5.2. Về kết quả thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu……………… 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AST Aspartate aminotransferase
ALT Alanine aminotransferase
DMSO Dimethylsulfoxid
LOX Enzym Lipoxygenase
LDL Low Density Lipoprotein
% ƯC Phần trăm ức chế












DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Số bảng Tên bảng Trang
1 1.1
Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của
Cayman
11
2 2.1 Danh mục các mẫu nghiên cứu 18
3 3.1
Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 5
nồng độ enzym
28
4 3.2
Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 6
nồng độ cơ chất
30
5 3.3
Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng theo
thời gian ủ
32
6 3.4 Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế 33


7 3.5
Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của các
mẫu nghiên cứu
34
8 3.6
Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của chè
dây
35

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Số hình Tên hình Trang
1 1.1 Cơ chất thường gặp của LOX 3
2 1.2 Cấu trúc của 15-LOX ở thỏ 4
3 1.3 Cơ chế xúc tác của LOX 5
4 1.4
Phương pháp đo độ hấp thụ của
hydroperoxid
9
5 1.5 Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman 11
6 1.6 Cấu trúc hóa học của rutin 14




1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cơ thể người, enzym lipoxygenase (LOX) đóng vai trò quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng
viêm, dị ứng và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên
quan nhiều bệnh như hen phế quản [23], xơ vữa động mạch [40], [48], ung
thư [56], viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy
nến [32].
Các chất ức chế LOX đã được chứng minh có tác dụng ngăn cản nguy cơ
ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ

dày [66], ung thư vú [25],ung thư gan di căn [28] và ung thư miệng [45], v.v.
Một số chất ức chế LOX đã được sử dụng để điều trị hen mạn tính [52], phổi
tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22],
[51],viêm khớp gối [29]và bệnh da liễu [15]. Có nhiều chất ức chế LOX đã
được nghiên cứu có nguồn gốc từ cây cỏ. Đây là một hướng nghiên cứu rất
tiềm năng trong việc sàng lọc và phát triển các sản phẩm chữa bệnh theo cơ
chế ức chế enzym LOX.
Nhiều phương pháp đã được tìm ra để thử hoạt tính của LOX như: Sử
dụng điện cực oxygen [14], gắn đồng vị phóng xạ
14
C [16] hay phương pháp
đo màu [65], [38]. Những phương pháp trên yêu cầu các thiết bị chuyên dụng
đồng thời lại phức tạp nên không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu.
Phương pháp đo quang dựa trên cơ chế hình thành hydroxyperoxid (sản phẩm
tạo thành trong phản ứng enzym – cơ chất) có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh
sáng mạnh nhất ởbước sóng 234nm là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và
tiết kiệm nhất để đánh giá hoạt tính của LOX [27]. Tuy nhiên, cho tới nay,
chúng tôi chưa thu thập được tài liệu nào công bố tại Việt Nam về phương
pháp này. Trên thế giới, cũng chưa có một mô hình thống nhất để thử tác
dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang, đồng thời các tài liệu đều
2

không đưa ra vấn đề khảo sát để tìm ra nồng độ enzym, cơ chất hay thời gian
ủ phù hợp nhất.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên
cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase” với hai mục
tiêu sau:
Mục tiêu 1: Xây dựng mô hình thử tác dụng dụng ức chế enzym lipoxygenase
của dịch chiết dược liệu bằng phương pháp đo quang.
Mục tiêu 2: Áp dụng mô hình vừa xây dựng để khảo sát tác dụng ức chế

enzym lipoxygenase của dịch chiết các dược liệu: chè dây, dâu tằm, lá móng,
kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ đen.












3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan vềenzym lipoxygenase
1.1.1. Định nghĩa
Lipoxygenases (LOX)là một nhóm các enzyme phức tạp. Thành phần
cấu tạo gồm có phần protein và phần nhóm ngoại chứa sắt. LOX xúc tác cho
phản ứnggắn phân tử oxy vào các acid béo có nhóm cis, cis-1,4-pentadien.
Hai acid béo acid linoleic và acid arachidonic là những cơ chất thường gặp
của LOX trong động thực vật [19], [26].

Hình 1.1. Cơ chất thường gặp của LOX
1.1.2. Phân loại enzym LOX
LOX có trong thực vật, động vật và nấm. Có nhiều loại LOX, nếu phân
loại dựa trên vị trí hydroperoxide hóa thì có các loại LOX sau: LOX-1, LOX-
3, LOX-5, LOX-9, LOX-12, LOX-13, LOX-15. Trong đó chỉ có LOX-5,

LOX-12, LOX-15 được tìm thấy trên người. Hiện nay các nhà khoa học đã
tìm ra cấu trúc của LOX-1 và LOX-3 từ đậu nành, LOX-15 từ thỏ[58].
4


Hình 1.2. Cấu trúc của LOX-15 ở thỏ [18]
Trong cấu trúc của LOX-15 được mô tả ở hình 1.2, có 2 phần riêng biệt:
phần màu xanh là phần gắn với acid béo do có cấu trúc tương tự một phần cấu
trúc lipase tụy người, phần còn lại là phần xúc tác, vị trí màu tím là trung tâm
hoạt động của enzym.
1.1.3. Cơ chế phản ứng của enzym LOX và cơ chất
Ở bước đầu tiên của phản ứng, 1 H được tách ra khỏi –CH
2
– nằm giữa 2
nối đôi trong phân tử acid béo. Gốc carbon còn lại sẽ mang một điện tử tự do.
Một phân tử oxygen sẽ gắn vào nguyên tử Cacbon ở vị trí +2 và -2 tạo thành
một acid béo chưa no có gốc peroxy và 2 nối đôi liên hợp. Gốc peroxy không
bền nên sẽ bị hydrogen hóa tạo thành dạng hydroperoxid [61].
5




Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của LOX
1.1.4. Vai trò của LOX trong động thực vật
Trong thực vật, LOX tham gia vào các hoạt động sinh lý khác nhau bao
gồm sinh trưởng phát triển (LOX là một loại protein dự trữ cho quá trình phát
triển, đặc biệt là trong hạt lúc nảy mầm [24]), phản ứng khi bị thương, thiếu
nước [49], sâu bệnh [47].
Ở động vật có vú, LOX là một trong những enzym chính trong quá trình

sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng
và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan đến các
bệnh hen phế quản [23], xơ vữa động mạch do làm tăng sự oxy hóa LDL
6

trong máu [40],[48], ung thư [56],viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm
cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32].
Các chất ức chế LOX có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã
được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư
vú [25],ung thư gan di căn [28], ung thư miệng [45], hen mạn tính [52], phổi
tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22],
[51],viêm khớp gối [29] và bệnh da liễu [15].
Bên cạnh đó, các chất ức chế LOX cũng có vai trò quan trọng trong
ngành công nghiệp thực phẩm. Sự xúc tác quá trình oxy hóacác acid béo trong
thực phẩm của LOX là một trong những nguyên nhân gây ôi thiu thực
phẩmvà làm thay đổi hương vị, màu sắc của thực phẩm. Nước chè đã được
ứng dụng để bảo quản cá do các hợp chất polyphenol trong chè có tác dụng ức
chế LOX tốt [61].
1.1.5. Các chất ức chế LOX
Cho tới nay, các nhà khoa học đã tìm ranhiều chất có tác dụng ức chế
LOX bao gồm cả các chất có nguồn gốc thiên nhiên và các chất tổng hợp hóa
học. Trong số các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên, flavonoid chiếm đa số,
bao gồm: Rutin [60], quercetin [30], baicalein, esculetin [54], artemitin và
casticin [20]. Ngoài ra còn có tanin như epigallocatechin gallate [31] và nhiều
hợp chất phenolic tự nhiên khác như acid boswellic [25], acid caffeic,
curcuminoid [39], eugenol [50], acid nordihydroguiaretic [64], daidzein và
genistein [63]. Các chất tổng hợp hóa học có tác dụng ức chế LOX
gồmzileuton, tebufelone, darbufelone, phenidone, docebenone và lonapalene
[18]. Các chất đã liệt kê ở trên đều đã được nghiên cứu trên invitro cho kết
quả ức chế LOX tốt, zileuton còn được ứng dụng trên lâm sàng dùng để điều

trị hen mạn tính và phổi tắc nghẽn mạn tính [52], [15]. Một số chất đã được
thử nghiệm trên người và cho thấy kết quả điều trị tốt như acid boswellic
7

chiết xuất từ cây Boswellia serratatrong điều trị ung thư vú [25] và viêm đại
tràng [29], baicalein trong điều trị ung thư dạ dày [66]
Bên cạnh đó, rất nhiều dịch chiết thực vật đã được chứng minh có tác
dụng ức chế lipoxygenase tốt nhưng chưa phân lập chất tinh khiết như: Bidens
pilosa, Solanum nigrum, Justicia flava, Galinsoga parviflora, Oxygonum
sinuatum, Chenopodium album, Cleome monophylla, Physalis viscosa
[60],Embrica ribes, Terminala chebula, Symplocos racemosa, Rosa
demacena [13],Thespesia lampas [41], Woodfordia fructicosa [42], Mahonia
aquifolium [46], Camellia sinensis, Theobroma cacao [61],…
1.1.6. Cơ chế ức chế LOX
Enzym LOX được ức chế bằng 2 cách chính: (1) tạo phức chelat với ion
ở vị trí hoạt động của enzym, (2) chuyển enzym từ dạng ferric (dạng có hoạt
tính) thành dạng ferrous (bất hoạt) [35]. Các chất ức chế LOX có thể hoạt
động theo một trong 2 cách trên.
1.2. Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX
1.2.1. Nguyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX
Các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase có thể dựa trên lượng
oxy tiêu thụ, lượng cơ chất tiêu thụ hoặc lượng sản phẩm hydroperoxid tạo
thành.
- Dựa trên lượng oxy tiêu thụ: xác định lượng oxy tiêu thụ sử dụng điện
cực oxygen [14]. Phương pháp tuy chính xác nhưng lại yêu cầu thiết bị
chuyên dụng và không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu.
- Dựa trên lượng cơ chất tiêu thụ:sử dụng acid linoleic gắn đồng vị
phóng xạ
14
C, sản phẩm tạo thành gắn đồng vị phóng xạ sẽ được tách ra bằng

phương pháp sắc ký [16]. Phương pháp này phức tạp và không nhanh.
- Dựa trên lượng sản phẩm hydroperoxide tạo thành:
8

Sản phẩm đầu tiên của phản ứng biến đổi acid linoleic dưới xúc tác của
lipoxygenase là một acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-cis, trans-1,3-
pentadien liên hợp [19], [26].Việc xác định lượng hydroperoxid tạo thành
được thực hiện dựa trên 2 nguyên tắc đo màu và đo độ hấp thụ.
o Phương pháp đo màu: sản phẩm hydroperoxid tạo thành phản ứng
với I
–
giải phóng I
2
, thêm hồ tinh bột, định lượng sản phẩm có màu tạo
thànhdo hồ tinh bột kết hợp với I
2
bằng phương pháp đo màu [65].Một số tác
giả khác cho sản phẩm hydroperoxide oxy hóa Fe
2+
thành Fe
3+
, sau đó cho
Fe
3+
phản ứng với thiocyanat và định lượng sản phẩm có màu tạo thành bằng
phương pháp đo màu [38]. Bên cạnh đó, một số tác giả lại cho hydroperoxid
oxy hóa cặp 3-methyl-2-benzothiazolinon và 3-(dimethylamino)benzoic acid
dưới xúc tác của hemoglobin tạo thành sản phẩm có màu rồi định lượng bằng
phương pháp đo màu [27]. Phương pháp đo màu đơn giản, tuy nhiên không
phù hợp với các mẫu có màu.

o Phương pháp đo độ hấp thụ: Sản phẩm hydroperoxid tạo thành có
nối đôi liên hợp, hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 234nm [27] nên có
thể xác định lượng sản phẩm tạo thành qua sự thay đổi độ hấp thụ ở bước
sóng 234nm.Đa số các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase đều áp
dụng phương pháp này vì đơn giản, nhanh chóng.Thiết bị là máy đo quang
phổ UV-VIS sử dụng cuvet hoặc máyquang phổ Elisasử dụng đĩa nhiều giếng.




Acid béo + O
2
→ Hydroperoxidcủa acid béo (R-O-O-H)
LOX
9









Hình 1.4. Phương pháp đo độ hấp thụ của hydroperoxid
Phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm hydroperoxid tạo thành có
nhiều mô hình đo khác nhau.
1.2.2. Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX dựa trên phương pháp đo
độ hấp thụ
1.2.2.1. Mô hình của Sigma – Aldrich [57]

Mô hình của Sigma – Aldrich sử dụng máy quang phổ
spectrophotometer UV – VIS và cuvet thạch anh, đọc độ hấp thụ ở bước sóng
234nm.
Đơn vị hoạt tính enzym được sử dụng là Unit, được định nghĩa như sau:
1 unit enzym tương ứng sự tăng của độ hấp thụlà 0,001mỗi phút ở bước sóng
234nm, pH9,0, nhiệt độ 25
o
C, cơ chất sử dụng là acid linoleic, tổng thể tích
dung dịch trong cuvet là 3ml, bề dày dung dịch là 1cm, 1unit tương ứng với
sự oxy hóa 0.12µmol acid linoleic.
Có cis, cis-1,4-pentadien
Acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-
cis,trans-1,3-pentadien liên hợp
Có nối đôi liên hợp hấp thụ
ánh sáng mạnh nhất ở bước
sóng 234 nm [27] → Đo
được hydroperoxid tạo
thành bằng phương pháp
quang phổ hấp thụ UV
10

Phương pháp xác định hoạt tính enzym là phương pháp đo quang. Phản
ứng thực hiện trong cuvet. Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu
trắng. Mẫu thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung
dịch enzym. Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất.
Nồng độ dung dịch cơ chất là 536µM, nồng độ dung dịch enzym là 5000 –
10000U/ml và đệm borat pH9,0. Ở 25
o
C, bước sóng 234nm, đo độ hấp thụ
của mẫu thử so với mẫu trắngtại thời điểm 5 phút.

Hoạt độ thực sự của dung dịch enzym được tính theo công thức:

Trong đó:
ΔA là độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng.
df là độ pha loãng
0,001 là độ hấp thụ tăng lên mỗi phút tương ứng với 1 unit enzym
5 là 5 phút
Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện nhưng nhược điểm là mỗi
lần đo chỉ đo được một mẫu.
1.2.2.2. Mô hình của Cayman [19]
Mô hình của Cayman sử dụng máy quang phổ Elisa microplate reader và
đĩa 96 giếng, ngừng phản ứng bằng chromogen, đọc độ hấp thụ ở bước sóng
490 – 500 nm.Mô hình đĩa 96 giếng được trình bày trong hình 1.4. Bố trí thí
nghiệm được trình bày trong bảng 1.1.

11


Hình 1.5. Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman


Bảng 1.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của Cayman
Các bước
phản ứng
B + * 1-45

100µl đệm
10µl đệm
10µl methanol

90µl 15-LO
90µl 15-LO
90µl 15-LO

10µl
chất ức chế
Bắt đầu
phản ứng
10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất
Lắc đĩa trong 5 phút
Ngừng
phản ứng
100µl
chromogen
100µl
chromogen
100µl
chromogen
100µl
chromogen
Lắc đĩa trong 5 phút
Đọc độ hấp thụ ở 490 – 500nm





12

Tỷ lệ phần trăm ức chế của chất ức chế được tính theo công thức:


Trong đó:
IA là độ hấp thụ trung bình của các mẫu mà enzym có 100% hoạt tính
I là độ hấp thụ trung bình của các mẫu chất ức chế giống nhau
Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả chính xác vì tất cả các mẫu và
tất cả các nồng độ đo cùng thời điểm. Tuy nhiên nhược điểm của phương
pháp này là khó thưc hiện vì cần pha các mẫu cùng lúc để đo độ hấp thụ ở
cùng thời điểm.
1.2.2.3. Các mô hìnhthử hoạt tính kháng LOX của dịch chiết thực vật
Tất cả các nghiên cứu thử hoạt tính của dịch chiết thực vật đều thực hiện
ở 25
o
C. Phần lớn các nghiên cứusử dụng máy quang phổ spectrophotometer
UV – VIS với cuvet thạch anh và giống nhau ở quy trình thí nghiệm như
sau:Phối hợp enzym với chất ức chế. Sau 5 phút, thêm cơ chất. Đo độ hấp thụ
ở 234nm.
Công thức tính % ức chế của dịch chiết dược liệu so chất ức chế chuẩn:


Các mô hình nghiên cứu khác nhau về chất chuẩn, dung môi chiết xuất,
dung môi hòa tan cắn,dung dịch đệm sử dụng, nồng độ enzym và nồng độ cơ
chất.
a. Mô hình của Kumaraswamy M.V.[41], [42]
Kumaraswamy M.V. và cộng sự đã sử dụng phương pháp chiết xuất
dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn
13

trong đệm borat pH9,0. Thêm 0,25ml dung dịch enzym (20 000U/ml). Ủ 5
phút ở 25
o
C rồi thêm 1ml dung dịch acid linoleic 0,6mM. Đo độ hấp thụ ở
234nm. Song song thực hiện với mẫu indomethacin chuẩn.
b. Mô hình của Veronica Sanda Chedea[62]
Veronica Sanda Chedea và cộng sự đã thử tác dụng ức chế LOX theo
quy trình sau: Ủ 160µl dung dịch LOX (2300U/ml) với 50µl chất ức chế trong
5 phút. Thêm 8,4µl dung dịch cơ chất 2,2mM. Đo độ hấp thụ ở 234nm. Song
song làm một mẫu trắng gồm 840µl đệm borat pH9,0 và 160µl dung dịch
LOX.
c. Mô hình của Ali Shah S.M.[13]
Ali Shah S.M. dùng methanol để chiết xuất dược liệu. Cắn thu được sau
khi cất thu hồi dung môi được hòa tan trong Tris-buffer pH7,4. Ủ dung dịch
ức chế tạo thành với enzym trong 10 phút ở 25
o
C, thêm cơ chất. Đo độ hấp
thụ sau 6 phút. Song song làm với baicalein chuẩn để so sánh.
d. Mô hình của Sekhar Rao [53]
Sekhar Rao và cộng sự dùng ethyl acetat để chiết xuất dược liệu, thu hồi
dung môi thu cắn, hòa tan cắn trong DMSO. Quy trình thí nghiệm như sau:
Phối hợp 60µl dung dịch cơ chất 10mM với 10µl dung dịch chất ức chế, thêm
2,91ml đệm borat, bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20µl enzym. Đo độ hấp
thụ sau 3 phút. Song song làm mẫu trắng, thay 10µl dung dịch chất ức chế
bằng 10µl DMSO.
e. Mô hình của Uma Sankar Akula [60]
Uma Sankar Akula và cộng sự đã công bố phương pháp chiết xuất
dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn
trong DMSO. Dung môi hòa tan enzym và cơ chất là đệm phosphate pH9,0.
Chất chuẩn được sử dụng là rutin và nordihydroguaiaretic acid.Phối hợp 50µl

dung dịch enzym với 30µl dung dịch chất ức chế. Thêm 2ml dung dịch cơ
14

chất 100µM. Đo độ hấp thụ ở 234nm. Song song làm một mẫu trắng, thay
30µl dung dịch chất ức chế bằng 30µl đệm phosphate pH9,0.
1.3. Tổng quan về rutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu
1.3.1. Rutin

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của rutin
Rutin có nhiều trong các loại dược liệu như cây hoa hòe (Sophora
japonica L.), táo ta (Zizyphus jujuba Lamk.), mạch ba góc (Fagopyrum
esculentum Moench.) [8].Rutin có khả năng ức chế LOX mạnh nên đã được
dùng làm chất chuẩn trong nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế LOX của
dịch chiết thực vật [60]. Nhiều tác dụng của rutin liên quan trực tiếp đến khả
năng ức chế LOX đã được thử nghiệm trên động vật cho thấy kết quả tốt như
tác dụng chống viêm [55], chống oxy hóa [33] và giảm nguy cơ tim mạch do
làm giảm oxi hóa LDL [34].
1.3.2. Chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.), họ Nho (Vitaceae)
Lá chè dây chứa flavonoid, tanin, đường, protein, giàu K
+
, Ca
2+,
Fe
2+
,
Zn
2+
, cùng các vitamin E, B1, B2. Lá chè dây có hàm lượng flavonoidvà tanin
cao.Hai flavonoid của lá chè dây là myricetin và dihydromyricetin. Tanin
trong lá chè dây thuộc loại tannin catechic [12].

15

Chè dây có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, khu phong, lợi thấp, giảm đau,
chống viêm[1].Chè dây có tác dụng tốt trong điều trị viêm loét dạ dày – hành
tá tràng, có tác dụng kháng khuẩn khá và tác dụng chống oxy hóa mạnh [12].
Cao khô chè dây có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của
một số chủng vi khuẩn, điều trị hiệu quả bỏng và loét dạ dày tá tràng, ức chế
đột biến gen gây nên bởi một số tác nhân độc hại [43].
1.3.3. Dâu tằm(Morus alba L.), họ Dâu Tằm (Moraceae)
Lá dâu tằm chứa 4 flavonol là quercetin-3-β-D-glucose, quercetin-3-O-
glucose-6″-acetate, rutin và quercetin[37]. Ngoài ra còn có caroten, tanin, rất
ít tinh dầu, vitamin C, cholin, adenin, trigonellin, pentozan, đường, canxi
malat và canxi cacbonat [8].Các flavonol khử các gốc peroxyl, gốc hydroxyl
nên chống oxy hóa mạnh [37].
1.3.4. Lá móng(Lawsonia inermis L.), họ Tử Vi (Lythraceae)
Trong lá và rễ cây lá móng chứa flavonoid, saponin, acid hữu cơ, đường
khử, chất béo, hợp chất steroid và polysaccharid [3]. Ngoài ra còn có tannin,
tinh dầu, chất nhựa, chất màu, glucose, manitol. Rễ chiết được chất sterol là
lawsaritol và dihydroxysterol là lawsaritol A. Hoa chứa tinh dầu có ionon. Hạt
chứa protein, chất béo và hydratcarbon.Vỏ cành cây chứa một naphtoquinon
gọi là isoplumbagin [8], [2]. Lá chứa anthranoid. Từ lá đã phân lập được 6
chất sau: 2β, 3β–dihydroxy–12–oleanen–28–oic acid; 1β, 2α, 3α, 19α–
tetrahydroxy–12–ursen–28–oic acid; Suavissimoside R1; Afzelin; Catechin;
và Rubinaphthin [3]. Ngoài ra, lá móngcòn chứa một oxynaphtoquinon gọi là
Lawsone, một hydrocarbon no là 3–methylnonacosan–1–ol, một lawsoniasid
có cấu trúc 1,2,4–trihydroxynaphtalen–1,4–dibeta–D–glucopyranosid và một
laliosid là 2,3,4,6–tetrahydroxyacetophenol–2–beta–D–glucopyranosid[8],
[2].
16

Lá móng có tác dụng kháng khuẩn, giảm đau, hạ sốt, chống viêm, lợi
tiểu, lợi mật, ức chế co thắt cơ trơn gây bởi histamine và acetylcholine trên
chuột lang, giảm AST và ALT huyết thanh chuột, kháng estrogen chuột nhắt
trắng [2]
1.3.5. Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), họ Cơm Cháy
(Caprifoliaceae)
Trong kim ngân có 2 nhóm chất chủ yếu là flavonoid và saponin
triterpenoid. Flavonoid được biết đến nhiều trong kim ngân là luteolin và
luteolin – 7 – glucosid.Ba loại saponin triterpenoid là caroten, cryptoxanthin
và auroxanthin. Lonicerosid là một saponin kim ngân có có tác dụng chống
viêm. Tinh dầu kim ngân chứa α–pinem, genaniol, α–terpeniol, eugnol,
linalol. Tanin kim ngân gồm acid chlorogenic và acid isochlorogenic.
Kim ngân có tác dụng kháng khuẩn, tăng đường huyết, chống choáng
phản vệ [8], kháng virus, chống lao [2], hạ cholesterol máu [10]. Tác dụng
chống viêm [6], chữa viêm kết mạc tốt [2], chống oxy hóa mạnh bằng cách
làm tăng hoạt động của peroxydase trong máu người và ức chế sự peroxyd
hóa lipid màng tế bào [4].
1.3.6. Cườm rụng (Ehretia acuminata P. Br), họ Vòi Voi (Boraginaceae)
[5]
Trong lá và cành cườm rụng có flavonoid, tanin, acid hữu cơ, acid amin,
đường khử. Acid hữu cơ chỉ có trong cành, saponin và sterol thì chỉ có ở lá.
Cườm rụng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, bảo vệ
gan (giảm hoạt độ các enzm ALT và AST ở gan chuột bị gây độc bằng
paracetamol)
1.3.7. Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor), họ Vòi Voi (Boraginaceae)
Thành phần hóa học của lá xạ đen gồm có flavonoid, tanin, các acid
amin, đường khử, cyanoglycosid, triterpenoid.