Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 182 15

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ THẮM


NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 182.15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2014



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 182.15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn: ThS. Võ Thị Thu Thủy
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội



HÀ NỘI – 2014



LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bầy tỏ lời cảm ơn chân thành đến cô giáo
ThS.Võ Thị Thu Thủy, người đã trực tiếp hướng dẫn, ân cần chỉ bảo, giúp đỡ
tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà
trường, các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Vi sinh - Sinh
học, Bộ môn Hóa lý, Bộ môn Hóa phân tích, Bộ môn Công nghiệp Dược và
các anh chị trên viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có

hạn, khóa luận này có thể còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự
góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2014.
Sinh viên
NGUYỄN THỊ THẮM












DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid deoxyribonucleic
CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên
CW Thành tế bào - Cell wall
DMHC Dung môi hữu cơ
ĐB Đột biến
Gr(-) Gram âm
Gr(+) Gram dương
IR Hồng ngoại - Infrared
KH Khoa học
KS Kháng sinh

HTKS Hoạt tính kháng sinh
SKLM Sắc ký lớp mỏng
L-DAP L - diaminopimelat
MTdt Môi trường dịch thể
MTth Môi trường thích hợp
TB Tế bào
TĐC Trao đổi chất
TLC Sắc ký lớp mỏng
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
UV Tử ngoại – Ultraviolet
B. cereus Bacillus cereus ATCC9946
B. pumilus Bacillus pumillus ATCC6633
B. subtilis Bacillus subtilis ATCC6633
S. lutea Sarcina lutea ATCC9341
E.coli Escherichia coli ATCC25922
P.mirabilis Proteus mirabilis BV108

P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa M201V
S. typhi Salmonela typhi DT220
S. flexneri Shighella flexneri DT112

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các vi khuẩn được kiểm định.
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn.
Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.
Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng.
Bảng 3.1: Bảng so sánh đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 182.15 với
Streptomyces setonii.
Bảng 3.2: Kết quả HTKS lựa chọn môi trường nuôi cấy và vi khuẩn kiểm định.
Bảng 3.3: Kết quả HTKS chọn lọc ngẫu nhiên.
Bảng 3.4: Kết quả HTKS sau đột biến lần thứ nhất

Bảng 3.5: Kết quả HTKS sau đột biến lần thứ hai.
Bảng 3.6: Kết quả lên men để chọn môi trường.
Bảng 3.7: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT1dt.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc.
Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết.
Bảng 3.11: Kết quả SKLM chọn hệ dung môi
Bảng 3.12: Kết quả chạy cột lần 1 của phân đoạn 2-19.
Bảng 3.13: Kết quả chạy cột lần 2 của 16 phân đoạn.
Bảng 3.14: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-12 sau chạy cột lần 3.
Bảng 3.15: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-12 sau chạy cột lần 4.
Bảng 3.16: Kết quả đo phổ IR








PHỤ LỤC
Phục lục 1: Hình ảnh chuỗi bào tử của Streptomyces 182.15 dưới kính hiển vi.
Phụ lục 2: Chủng Streptomyces 182.15 được chọn lọc ngẫu nhiên và cấy zigzag
trong đĩa Petri .
Phụ lục 3: Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khối thạch và phương pháp giếng
thạch.
Phụ lục 4: Bình chứa dịch lên men khi kết thúc quá trình lên men.
Phụ lục 5: Cột sắc ký trong quá trình chạy cột lần 1 và kết quả thử HTKS sau quá
trình chạy cột.
Phụ lục 6: Phổ IR chất kháng sinh sinh tổng hợp được.

Phụ lục 7: Phổ UV chất kháng sinh sinh tổng hợp được.
Phụ lục 8: Phổ MS chất kháng sinh sinh tổng hợp được.
Phụ lục 9: Kết quả thử HTKS chọn lọc ngẫu nhiên.
Phụ lục 10: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 1.
Phụ lục 11: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 2.
1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh là nhóm thuốc quan trọng trên lâm sàng với vai trò là giải pháp hữu
ích nhất để điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn. Tuy nhiên tình trạng lạm dụng kháng
sinh, không theo chỉ dẫn của bác sỹ, đặc biệt là các kháng sinh mới có hiệu lực
mạnh chỉ được sử dụng hạn chế sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng – Kháng kháng
sinh. Kháng kháng sinh đang ngày càng tăng cao và trở thành một vấn đề đáng báo
động không chỉ trên thế giới mà còn ở Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam tỷ lệ mắc
các bệnh lý nhiễm khuẩn rất cao, đứng thứ 2 (16,70%) chỉ đứng sau các bệnh lý về
tim mạch (18,40%) [7]. Điều này dẫn đến nhu cầu cấp thiết cần phải đẩy mạnh
nghiên cứu sản xuất và phát triển kháng sinh mới là tất yếu.
Kháng sinh có thể được tổng hợp theo ba hướng: sinh tổng hợp, bán tổng hợp và
tổng hợp hóa học. Tuy nhiên xu hướng trên thế giới là tìm kiếm kháng sinh mới có
nguồn gốc từ vi sinh vật, như tìm kiếm kháng sinh mới dưới lòng đại dương của các
nhà khoa học Scotland hay từ các loại nấm rừng của các nhà khoa học Mỹ và Hà
Lan [16]. Chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces được ứng dụng để sản xuất
khoảng 55% kháng sinh trên thế giới và đó là những sản phẩm có giá trị lớn trong
lĩnh vực y tế [5].
Do vậy, tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội chúng tôi
đã chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 182.15” làm
khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, với các mục tiêu sau :
- Tiến hành phân loại Streptomyces 182.15 theo khóa phân loại ISP.
- Khảo sát một số điều kiện nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ

Streptomyces 182.15.
- Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được.





2


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm VK thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn. Xạ khuẩn là các vi
khuẩn Gr(+), có tỷ lệ G+C >55% trong ADN, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng
sợi phân nhánh.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành
chất kháng sinh, khoảng 60% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất
kháng sinh. Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng
sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamicin, tobramixin, vancomixin,
rosamixin Trong số đó có tới 55% kháng sinh được tìm ra có nguồn gốc từ
Streptomyces [5], [8].
1.1.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn
Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty
cơ chất là khuẩn ty cơ bản còn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu, thậm chí
hầu như không phát triển tùy từng chi, từng loài.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi từ 0,3-1,0µm đến 2-3µm. Đa số khuẩn
ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú, có thể
gặp các màu trắng, vàng, xám, da cam, đen, đỏ, lục, lam, nâu… Khuẩn ty cơ chất có
thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có loại phụ

thuộc pH, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Trong môi trường đặc hiệu, có loại
xạ khuẩn có thể tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen.
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành các
khuẩn ty khí sinh. Người ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt
với khuẩn ty sơ cấp bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm.
Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ. Khuẩn lạc
xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng
dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [8].
1.1.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
3


Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK Gr(+), có một số khác biệt sau:
Thành TB xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng 10-20nm, có chức năng duy
trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào thành phần hóa học thành tế
bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm: CW1, CW2, CW3, CW4. Các xạ khuẩn chi
Streptomyces được xếp vào nhóm CW1, thành tế bào có chứa L-DAP và glycin [8].
 Màng tế bào chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10nm, có cấu trúc và chức
năng như của vi khuẩn nói chung.
 Mezosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay
hình ống. Mezosom làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất và qua đó
làm tăng hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử …
 Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat
(hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Sudan III), các hạt polysacharid (bắt màu
với dung dịch Lugol) [14].
1.1.3 Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
 Đối với các xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae sau một thời gian phát
triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Các chuỗi bào tử
có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng, uốn cong,
móc câu - đơn hoặc kép và xoắn lò xo. Bào tử trần của họ xạ khuẩn này có các

hình dạng: hình cầu, hình bầu dục, hình trụ… Bề mặt bào tử có thể là nhẵn, sần
sùi da cóc, có gai hoặc có tóc. Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ
khuẩn.
 Đặc điểm sinh lý của Streptomyces: là sinh vật dị dưỡng có tính oxi hóa cao.
Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và
năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như: gelatin, casein, khử nitrat
thành nitrit, Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích
của chúng là 25-30
0
C, pH tối thích là 6,8-7,5.
 Khả năng tạo sắc tố: sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố
melanoid [8].
4



1.1.4. Phân loại xạ khuẩn
Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà Khoa học nghiên cứu phát
triển để phân loại xạ khuẩn, phải kể đến khóa phân loại của Waksmans, khóa phân
loại Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze… Các khóa phân loại chia lớp xạ
khuẩn (Actinomycetes) thành bộ Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn. Bộ
Actinomycetales được chia thành các họ: Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,
Streptomycetaceae, Micromonosporaceae, Nocardiaceae… [8].
 Qua đặc điểm hình thái: Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình
Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử
dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ
Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được sử
dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố
hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, khả năng tiêu thụ các nguồn

hydratcarbon [15].
 Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN, phản ứng PCR, giải trình tự 16S
rADN và phân tích cây chủng loại phát sinh [14].
1.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập VSV sinh KS người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác
nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia súc, gia cầm, bùn, nước ở
sông, hồ… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh kháng sinh
mà ta mong muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các môi trường chọn lọc
(MT1, MT2 đối với xạ khuẩn). Trong số các phương pháp được sử dụng thì phương
pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch là phương pháp thông dụng nhất [6].
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô
thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để
thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống
5


bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích
hợp [17], [24].
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có HTKS tăng lên 20-30 % so với cá thể khác. Cần phải chọn
lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có
khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta thường áp dụng các phương pháp đột
biến nhân tạo [17], [23].
1.3.3. Đột biến cải tạo giống
Đột biến (Mutation) là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền dẫn

đến sự biến đổi đột ngột của một hay một số tính trạng, những biến đổi này có thể
di truyền đến thế hệ sau. Đột biến gen là những biến đổi đột ngột trong số lượng,
thành phần, trật tự các cặp nucleotid, xảy ra tại một thời điểm nào đó trên phân tử
ADN. Các tác nhân đột biến có thể là: tác nhân vật lý, tác nhân hóa học, tác nhân
sinh học. Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp
giả hữu tính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần [17].
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Các phương pháp bảo quản giống VSV bao gồm: bảo quản lạnh, cấy chuyền,
làm khô, đông khô, đông lạnh. Trong đó đông khô là phương pháp hiệu quả nhất để
giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong
tủ lạnh 2
0
C và định kỳ 2-3 tháng cấy lại 1 lần [17], [24].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1.Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi
sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các
6


hợp chất trung gian cho chúng. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo
thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc
vào chính pha cân bằng [6], [17], [23].
1.4.2. Phương pháp lên men
Có 2 phương pháp lên men chính:
 Lên men bề mặt: Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề
mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng.
 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi

thiết bị phức tạp.
 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện tích, tốn
nhân công, hiệu suất sử dụng trường không gian thấp, tiêu hao lớn [6], [20].
 Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong toàn bộ
môi trường lỏng.
 Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quá trình, tốn ít
diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn [12].
 Có 4 kiểu lên men chìm: Lên men mẻ (lên men chu kỳ), lên men có bổ sung,
lên men bán liên tục, lên men liên tục [17].
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
 pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác động trực
tiếp của các ion H
+
hay OH
-
đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme
hoặc là tác dụng gián tiếp.
 Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy thích hợp với
tốc độ sử dụng oxy của VSV.
1.5. Chiết tách và tinh chế sản phẩm
 Sau khi lên men, dịch lên men thu được thường có hàm lượng kháng sinh
thấp. Do đó cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản
phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị.
7


 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:
 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.

 Phương pháp tạo phức kết tủa.
 Phương pháp trao đổi ion.
 Các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng,…) [1].
 Chiết xuất:
Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp. Đó là quá
trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một
pha rắn (cân bằng lỏng-rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng-lỏng, thường
một pha là nước, pha còn lại là dung môi có độ phân cực phù hợp) [6].
 Phương pháp sắc ký:
 Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một
hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan
trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn
với nó. Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là
thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc
tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau
các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ, làm cơ
sở cho phân tích định tính hay định lượng [9].
 Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất
của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
 Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng
sinh bao gồm: sắc ký lớp mỏng, sắc ký rửa giải trên cột [11].
1.6. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR)
 Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng
lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR.
8


 Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó

đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau. Có mối tương quan giữa
nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để
nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc
trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR [4], [29].
1.6.2. Phổ tử ngoại (UV)
 Nguyên tắc: Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng
lượng điện tử của phân tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E
0
chuyển sang trạng
thái kích thích E
1
, E
2
. Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV
vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại [5], [29].
 Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết
đơn, liên kết bội, hệ thống thơm…, hay cặp electron tự do không tham gia liên
kết của O, N, các halogen [1], [29].
1.6.3. Khối phổ (MS)
 Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử
hữu cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion
hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể
hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ
đồ [9], [29].
 Phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng của các ion, phân tử, xác
định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu hoặc dùng trong phân tích định

lượng [1], [4], [5].
1.7. Các nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces trong nước và
trên thế giới.
1.7.1. Nghiên cứu kháng sinh kháng nấm mới từ Streptomyces setonii
Xạ khuẩn được phân loại theo khóa phân loại ISP cho thấy Streptomyces setonii
có các đặc điểm hình thái như chuỗi bào tử thẳng hơi cong, bề mặt bào tử trơn nhẵn,
9


không sản xuất sắc tố hòa tan, không sản xuất sắc tố melanoid. Streptomyces setonii
có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-34
0
C, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu là 25-
30
0
C. Streptomyces setonii thủy phân được tinh bột, có thể hóa lỏng gelatin nhưng
không đông sữa. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh được tiến hành trong môi
trường (chứa tinh bột 2%, cao nấm men 1%), ở nhiệt độ 30
0
C trong 1 tuần. KS tạo
thành được tinh chế và xác định tính chất lý học, hóa học, sinh học. Kết quả cho
thấy: KS tan trong nước, methanol nhưng ít tan trong aceton, cloroform. KS có
phản ứng với Ninhydrin, KMnO
4
.

Công thức phân tử của KS: C
6
H
11

NO
2
. Nhiệt độ
nóng chảy 195-196
0
C. Khối lượng phân tử (FAB-MS m/z) là 130 (M
+
+H). Hai
dung môi được chọn để tiến hành sắc ký TLC là: Buthanol: Aceton: Nước (4:1:2)
và Ethylacetat: Nước (75:25), kết quả SKLM có 2 giá trị R
f
là 0,27 và 0,46. Khi tiến
hành thử HTKS của KS trên chuột nhận thấy: KS có tác dụng bảo vệ chuột khỏi
nhiễm nấm C. albican tương đương như Aphotericin B và với liều 1g/kg thì không
xuất hiện độc tính [27].
1.7.2. Streptomyces sp.CIMAP-A1 triển vọng thúc đẩy sự phát triển việc quản lý
dịch bệnh trong nông nghiệp.
Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. CIMAP-A1 được phân lập từ rễ Phong lữ và
được phân loại bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và giải trình tự gen
(trình tự gen 16S rDNA). Chủng CIMAP-A1 có nhiều đặc điểm gần với xạ khuẩn
S.vinacendrappus, biến chủng NRRL-2363 nhất (trùng khớp 99% trình tự gen). Qua
nghiên cứu in-vitro chủng CIMAP-A1 có hoạt tính kháng sinh tiềm năng chống lại
nhiều loại nấm thực vật như Stemphylium sp, Botrytis cinerea, Sclerotina
sclerotiorum, Colletotrichum spp, Curvularia spp, Corynespora casicola, 18
Thielavia basicola. Các chất chuyển hóa trung gian ngoại bào được tạo ra trong
dịch lọc lên men ức chế đáng kể sự nảy mầm bào tử, phát triển của các bào tử nảy
mầm và quá trình phát triển của Alternaria alternata, Colletotrichum acutatum,
Curvularia andropogonis và Fusarium moniliforme. Phương pháp TLC đã tách
được một lượng nhỏ 10 hợp chất có hoạt tính chống lại nhiều loại nấm gây bệnh
trên thực vật. Biến chủng có thể tạo ra siderophores và axit indole-3-acetic. Cũng

10


nghiên cứu này cho thấy chủng CIMAP-A1 đã làm tăng 11,3% sinh khối chồi tươi
Phong lữ và 21,7% sản lượng dầu cần thiết.
Từ nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng xạ khuẩn để tăng cường sức đề
kháng cũng như tăng năng suất thu hoạch cho một số thực vật mà không cần dùng
tới các chất kích thích, thuốc trừ sâu, Từ đó góp phần làm giảm giá thành sản
phẩm và công tác bảo vệ sức khỏe con người [28].
1.7.3. Tổng hợp kháng sinh mới Spirotetronate, Lobophorins H và I từ biển Đông
có nguồn gốc từ Streptomyces sp. 12A35.
Khi phân loại bằng cách giải trình tự gen và PCR cho thấy chủng 12A35 được
xác định là Streptomyces sp. 12A35. Tiến hành lên men: Chủng 12A35 được nuôi
cấy trong nước biển (tinh bột 20,0g; KNO3 1,0g; MgSO4.7H2O 0,5g; K2HPO4
0,5g; FeSO4.7H2O 0,1g; thạch 15,0g; nước 1,0lít; điều chỉnh pH 7,0) ở nhiệt độ là
28°C trong 1 tuần. Sau đó nhân giống cấp 1 trong bình nón Erlenmeyer 500ml chứa
100ml môi trường (Saccarose 20g và 1 lít nước muối ở pH 6,0 đã khử trùng trước)
ở 28°C. Sau 2 ngày, giống cấp 1 được lên men trong bình Erlenmeyer 3,0 lít chứa
650ml môi trường trên với nồng độ 3% - 4% (V/V) ở cùng điều kiện trong 7 ngày.
Cấu trúc của các kháng sinh sinh tổng hợp được xác định bằng phương pháp MS và
NMR. Kết quả cho thấý 3 kháng sinh lần lượt là lobophorin B, lobophorin H và
lobophorin F có hoạt tính tương tự nhóm macrolid. Thử hoạt tính kháng sinh cho
thấy lobophorins không thể ức chế vi khuẩn Gr(-) (E. coli) và nấm (C. albicans, F.
moniliforme). Chỉ hợp chất 1 là lobophorin B và 3 là lobophorin F ức chế vừa phải
đối với Staphylococcus aureus ATCC29213 với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) lần
lượt là 50 và 6,25 µg/ml và tất cả 3 kháng sinh đều ức chế chống lại vi khuẩn
Bacillus subtilis CMCC63501. Đáng chú ý là lobophorin H ức chế vi khuẩn
Bacillus subtilis CMCC63501 tương tự như ampicillin [31].
1.7.4. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29-
Streptomyces microflavus.

Khi tiến hành phân loại Streptomyces 15.29 theo khóa luận ISP thì nhận thấy:
đặc trưng phân loại của Streptomyces 15.29 giống với Streptomyces sinensis (trùng
11


khớp 92,86%). Tiến hành giải trình tự gen 16S rADN ứng dụng PCR fingerprinting
sử dụng mồi MST1 của Streptomyces 15.29 cho thấy hệ gen của Streptomyces hoàn
toàn trùng khớp với gen của Streptomyces microflavus. Vì vậy, kết luận tên khoa
học của Streptomyces 15.29 là Streptomyces microflavus. Qua sàng lọc ngẫu nhiên
và đột biến UV thì hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 15.29 được
nâng cao. Sau khi tiến hành đột biến UV, chủng Streptomyces 15.29.21.23 là biến
chủng tốt nhất được chọn để tiến hành lên men chìm. Quá trình lên men được tiến
hành trên máy lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít. Kết quả cho thấy: lên men
trên máy lắc cho kết quả tốt nhất. Dịch lên men được lọc và chiết bằng Ethylacetat
ở pH= 5,0. Dịch chiết dung môi Ethylacetat được đem cất quay thu kháng sinh thô.
Quá trình tách bằng SKLM và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh thô có ít nhất
4 thành phần. Sau đó sử dụng sắc ký cột Silica gel, cột oxyt nhôm, YMC và cột
Sephadex để tinh chế các thành phần chính thu được hiệu suất là 66%. Bước đầu
xác định giá trị MIC của kháng sinh này khá thấp: từ 0,11-0,30µg/ml đối với
Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Shighella flexneri, Salmonela typhi [25].
1.7.5. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS
Sự biểu hiện của cụm gen chuyển hóa thứ cấp trong Streptomyces được điều
khiển bởi gen hoạt hóa. Các bản sao làm tăng năng suất sinh tổng hợp KS hoặc kích
hoạt các cụm gen câm. Đặc tính này đã được sử dụng trong các nhân bản của abaA,
afsQ1/Q2, afsR từ Streptomyces coelicolor và afsR2 từ Streptomyces lividans để
làm tăng sinh tổng hợp KS. Các bản sao được chuyển đến S.lividans để kiểm tra khả
năng sinh kháng sinh. Tạo một thư viện gen Streptomyces clavuligerus của 2400
cosmid trong E.coli bằng cách đưa plasmid pUZ8002 vào vi khuẩn E.coli XL-
blueMR để sản xuất dòng XLUZ pUZ8002 huy động ori T-plasmid từ E.coli XLUZ
đến Streptomyces để xây dựng các thư viện gen S.clavuligerus. Các chủng vi khuẩn

E.coli có chứa các cosmid S.clavuligerus được nuôi cấy. Kết quả: 105 thể liên kết
(4%) đã được kích hoạt, sau đó chúng được chuyển tới S. lividans để kiểm tra khả
năng sinh KS và xác nhận rằng sản xuất KS là do các cosmid mà không phải do đột
biến tự phát [32].
12


Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 182.15 đã được
phân lập tại Quận 2 - Tp. Hồ Chí Minh và hiện nay được lưu giữ tại Bộ môn Vi
sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội.
 Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh - Sinh
học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp (được giới thiệu ở bảng 2.1)
Bảng 2.1: Các vi khuẩn được kiểm định.
Vi khuẩn Gram(+) Vi khuẩn Gram(-)
Bacillus cereus ATCC9946 Escherichia coli ATCC25922
Bacillus pumilus ATCC6633 Proteus mirabilis BV108
Bacillus subtilis ATCC6633 Pseudomonas aeruginosa VM201
Sarcina lutea ATCC9341 Salmonela typhi DT220
Staphylococcus aureus ATCC1228 Shighella flexneri DT112

 Môi trường nuôi cấy: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (được giới thiệu ở
bảng 2.2), môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (được giới thiệu ở bảng 2.3).
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần
Đơn
vị

MT1

MT2

MT3

MT4

MT5

MT6

MT7
Tinh bột g 2 2 2,4 2
Lactose g 3
Glucose g 2 1
Saccarose g 3
Cao ngô g 0,5 0,5
Bột đậu tương g 1,5
Cao thịt g 0,3 0,3
13


Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Pepton g 0,3 0,5
KNO
3
g 0,1

KCl g 0,05
NaNO
3
g 0,2
NH
4
NO
3
g 0,2 0,2
CaCO
3
g 0,3 0,4 0,4 0,2
(NH
4)2
SO
4
g 0,2
FeSO
4.
7H
2
O g 0,01
K
2
HPO
4
g 0,05 0,1 0,1 0,05
MgSO
4.
7H

2
O g 0,05 0,05 0,25 0,15
NaCl g 0,05 0,1 0,5
Cao nấm men g 0,5
Thạch g 1,8 2 2 2 2 2 1,8
Nước ml 100
pH 6,8 -7,2

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần

MT
NaCl Cao thịt Pepton Thạch
Nước
(ml)
pH
Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100
7,0-7,4

Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8 100
 Chú thích:
- Đơn vị tính theo gam.
- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút.
- Các môi trường lên men dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như môi trường
nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.

14


 Các môi trường phân loại theo ISP (kí hiệu từ ISP1đến ISP9)

Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl
2.
4H
2
O: 0,1g; FeSO
4.
7H
2
O: 0,1g;
ZnSO
4.
7H
2
O: 0,1g; nước cất vừa đủ 200ml; pH= 7,0-7,2.
ISP1: Tripton: 5,0g; cao nấm men: 3,0g; nước cất vừa đủ 1000 ml; pH= 7,0-7,2.
ISP2: Cao nấm men: 4,0g; dịch chiết malt: 10,0g; glucose: 4,0g; thạch: 20,0g; nước
cất vừa đủ 1000ml; pH=7,3.
ISP3: Yến mạch: 20,0g; dịch muối vi lượng: 1,0ml; thạch: 18,0g; nước cất vừa đủ
1000 ml; pH = 7,0-7,4.
ISP4: Tinh bột: 10,0g; K
2
HPO
4
: 1,0g; MgSO
4.
7H
2
O: 1,0g; NaCl: 1,0g;
(NH
4

)
2
SO
4
: 2,0g; CaCO
3
: 2,0g ; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch: 20,0g; nước
cất vừa đủ 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP5: L-Asparagine: 1,0g; glycerin: 10,0g; K
2
HPO
4
: 1,0g; dung dịch muối vi lượng
1,0ml; thạch: 20,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH= 7,0-7,4.
ISP6: Dung dịch A: pepton: 20,0g; acid citric: 0,384g; FeSO
4
.7H
2
O: 0,556g;
NH
4
OH 25%: 0,264g; Na
2
S
2
O
3
: 10ml; K
2
HPO

4
: 1g; nước cất vừa đủ 1000ml.
ISP6: Dung dịch A: 36,0g; cao nấm men: 1,0g ; thạch: 15g; nước cất vừa đủ 100ml;
pH= 7,0-7,2.
ISP7: Glycerin: 15,0g; L-tyrosine: 0,5g; L-asparagine: 1,0g; K
2
HPO
4
: 0,5g;
MgSO
4.
7H
2
O: 0,5g; NaCl: 0,5g; FeSO4.7H
2
O: 0,01g; dung dịch muối vi lượng:
1,0ml; thạch dây: 20,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH=7,2-7,4.
ISP9: Các nguồn đường được tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal (A)
1. Glucose 4. D-manitol 7. Raffinose
2. Inositiol 5. D-fructose 8. Rhamnose
3. D-xylose 6. L-Arabinose 9. Saccarose
Dung dịch Pridham và Gottlieb (B): CuSO
4.
5H
2
O: 0,64g; FeSO
4.
7H
2
O: 0,11g;

MnCl
2.
4H
2
O: 0,79g ; ZnSO
4.
7H
2
O: 0,15g ; nước cất vừa đủ 1000ml.
ISP9: (NH4)
2
SO
4
: 2,64g; KH
2
PO
4
: 2,38g; K
2
HPO
4
.3H
2
O: 5,65g; MgSO
4.
7H
2
O:
1,0g; dung dịch B: 1,0ml; thạch:15,0mg; nước cất vừa đủ 1000ml; pH=6,8-7,0.
15

D
*
ISP9: ISP sau khi tiệt trùng để nguội tới 60
0
C thì cho 1 trong các nguồn đường A
vào từng môi trường ISP9 riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong mỗi môi trường
1%.
 Dung môi sử dụng (được giới thiệu ở bảng 2.4) được mua tại các công ty hóa
chất đạt tiêu chuẩn phân tích.
Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (°C)
Aceton 0,79 56
Acetonitril 0,782-0,783 80-82
n-Butanol 0,81 116-118
Butylacetat 0,880-0,885 117-118
Dicloromethan 1,32 40
Dimethylformamid 0,95 153
Ethanol 0,789-0,791 78,3
Ethylacetat 0,889-0,901 70,4
NH
4
OH 25% 0,880 37,7
Methanol 0,791-0,793 64,5
Triethylamin 0,726-0,728 90
n-Hexan 0,654 69

 Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Aluofolien 60
F

254
(Merck). Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel (Merck),
cỡ hạt 0,040 – 0,063mm.
2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ
- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn Toshiba 60W, 220V.
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf.
- Tủ ấm Memmert, tủ ấm Binder, tủ sấy SL Shellab.
- Tủ lạnh Samsung, lò vi sóng Whirlpool.
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL303, tủ cấy vô trùng Aura VF 48.
16


- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121 S.
- Máy cất quay Buchi R220, bơm chân không Waterbath B480.
- Kính hiển vi điện tử, máy đo UV-VIS Hitachi U-1900.
- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm.
- Hộp Petri đường kính 9cm.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt.
- Các dụng cụ khác như: buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm,
bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc,
que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…
2.2. Nội dung nghiên cứu

 Phân loại xạ khuẩn
 Xác định môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, và lựa chọn 2 VSV để kiểm định
 Chọn lọc, cải tạo giống
- Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.
- Đột biến bằng ánh sáng UV 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng
sinh của chủng xạ khuẩn gốc.
 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.
- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến
chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
- Tìm pH và dung môi hữu cơ chiết xuất dịch lọc của dịch lên men tốt nhất.
- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất.
- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ.
 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được
- Xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS.


17


2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống
Chủng Streptomyces 182.15 được cấy zigzag trên ống thạch nghiêng chứa MT
nuôi cấy thích hợp, cho vào tủ ấm 28-30
0
C. Sau 6-10 ngày chủng phát triển tốt, cho
các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4
0
C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.
2.3.2. Phân loại xạ khuẩn theo ISP
- Chuẩn bị ống giống: giống gốc được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đủ 6- 10
ngày tuổi.
- Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hòa tan.
+ MT xác định: ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 đã được tiệt trùng, đổ vào hộp Petri
vô trùng (20ml/hộp).
Cấy chủng giống Streptomyces đã đủ 6 ngày tuổi lên bề mặt các môi trường ISP

để cho xạ khuẩn phát triển ở 28
0
C rồi quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14, 21 ngày.
+ Màu các khuẩn ty khí sinh: quan sát trực tiếp trên bề mặt khuẩn lạc có thể có
màu đỏ (R), màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (P), xám (Gy),
trắng (W). Trường hợp các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau.
+ Màu của khuẩn ty cơ chất: quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri)
thường có màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời
hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên kí hiệu là (1), nếu không
thấy kí hiệu là (0).
+ Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có độ
phóng đại cao.
Dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), uốn cong (Rf), móc câu (RA), lò xo (S). Nếu
chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ các đặc điểm.
Bề mặt bào tử có thể có dạng sau: phẳng nhẵn (sm), sần sùi mụn cơm (wa), có
gai (sp), có tóc (ha).
+ Sắc tố hòa tan nằm ngay trong môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím
Nếu có kí hiệu là (1), nếu không có kí hiệu là (0).
18


- Xác định sắc tố melanoid (màu đen hoặc nâu đen): Nuôi cấy xạ khuẩn trên các
môi trường ISP6, ISP7 đã hấp tiệt trùng, quan sát ở ngày thứ 2, 4. Nếu có kí hiệu là
(1), nếu không có kí hiệu là (0).
- Khả năng tiêu thụ nguồn carbon : Nuôi cấy bào tử trên các môi trường có chứa
các nguồn các đường khác nhau (các ISP9), đánh giá ở ngày 12, 14, 16.
Nếu bào tử phát triển mạnh hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên MT ISP chứa đường
glucose (chứng dương) thì kí hiệu là (+), nếu không phát triển mạnh bằng khi nuôi
cấy trên MT ISP không có nguồn đường (chứng âm) thì kí hiệu là (-), nếu phát triển
không rõ ràng, mạnh hơn chứng âm và kém hơn chứng dương thì kí hiệu là (±) [19],

[30].

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.
 Nguyên tắc: Chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường dinh dưỡng đặc đã
cấy VSV kiểm định, tạo các vùng ức chế VSV gọi là vòng vô khuẩn.
 Tiến hành:
 Tạo hỗn dịch VSV: Lấy 1 vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5ml môi
trường canh thang, để vào tủ 37
0
C trong 18-24h (đối với vi khuẩn).
 Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt khuẩn và để nguội
về 45-50
0
C với tỉ lệ 2,5:100 (V:V). Lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng.
 Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
- Phương pháp khối thạch: Đặt các khối thạch Φ=6,0 mm có VSV sinh kháng
sinh lên bề mặt thạch đã cấy VSV kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch (dùng cho mẫu dịch lọc nước): Đục các giếng
thạch Φ=6,0mm trên môi trường đã cấy VSV kiểm định, nhỏ 0,05ml mẫu
thử vào mỗi giếng thạch.
- Phương pháp khoanh giấy lọc (dùng cho mẫu dung môi hữu cơ): Đặt các
khoanh giấy lọc Φ=6,0mm đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ và
sấy khô lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.
 Các hộp Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37
0
C trong khoảng 18-24h.