Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 5 (4 bromobenzyliden) hydantoin và một số dẫn chất base mannich

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TIẾN HIỆP

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(4’BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ
MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TIẾN HIỆP

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(4’BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ
MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Vũ Trần Anh
2. PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải
Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa hữu cơ

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ
Trần Anh, PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải, PGS. TS Nguyễn Quang Đạt là
người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tơi
hồn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của : Ths Đặng Vũ
Lƣơng (phịng NMR-Viện Hóa Học và Công Nghệ Việt Nam), Nguyễn Thị
Sơn (bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa –Trường Đại học Khoa học Tự nhiên),
TS. Trần Thị Nhƣ Hằng (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên) và tồn thể
các thầy cơ giáo, cán bộ kỹ thuật viên của Bộ mơn Hóa hữu cơ, các thầy cơ
giáo trong trường, các phịng ban, thư viện-Trường Đại học Dược Hà Nội.
Cuối cùng tôi, xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã ln giúp đỡ và động viên
tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu vừa qua.

Hà Nội, Ngày 13 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Tiến Hiệp


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN..... 2
1.1.1 Tác dụng chống co giật ........................................................................... 2

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ........................................................ 3
1.1.3 Tác dụng chống ung thư .......................................................................... 4
1.2

CÁC

PHƢƠNG

PHÁP

TỔNG

HỢP

5-(4'-

BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH ….9
1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin .............................................. .10
1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich…………………………….13
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MƠI ............................ 15
2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM .................................................................... 16
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 16
2.3.1 Phương pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và dẫn chất
base Mannich................................................................................................... 16
2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc ........................................................... 17


2.2.3 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư. ............................. 17

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC ........................................................................ 20
3.1.1 Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin (H0). .............................. 21
3.1.2 Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của 5-(4’bromobenzyliden)hydantoin (H1-H 6). ............................................................ 22
3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC ... 27
3.2.1 Phổ hồng ngoại ...................................................................................... 27
3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ................................................................. 27
3.2.3 Phổ khối lượng ...................................................................................... 27
3.3 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ ........................ 27
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1 VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC. ................................................................ 36
4.2 VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC.
4.2.1. Về phổ hồng ngoại (IR)......................................................................... 36
4.2.2 Về phổ cộng hưởng tử hạt nhân 1H-NMR ............................................ 37
4.2.3 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR ........................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
13
1

C- NMR

H- NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

A549

: Tế bào ung thư phổi ở người

Ac2O

: Anhydrid acetic

AcOH

: Acid acetic

DMF

: Dimethylformamid

EGFR

: Epidermal growth factor receptor
(thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô)

EtOH

: Ethanol

ESI

: Phương pháp phun mù điện tử

Hep- G2

: Tế bào ung thư gan ở người

HMBC

: Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

HSQC

: Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
(Heteronuclear Single-Quantum coherence)

IC50

: Nồng độ ức chế 50%

IR

: Phổ hồng ngoại

MCF7

: Tế bào ung thư biểu mô vú ở người

MeOH

: Methanol

MS

: Khối phổ
(Mass spectrometry)

PC3

: Tế bào ung thư tuyến tiền liệt


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 kết quả tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và các dẫn

29

chất base Mannich (H1-H6)
Bảng 3.2 Số liệu phổ IR và phổ 1H-NMR của các chất tổng hợp được

30

(H0-H6)
Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR của các chất tổng hợp được (H0-H6)

31

Bảng 3.4 Số liệu phổ ESI_MS của chất H0 và các dẫn chất base Mannich

32

(H1-H6)
Bảng 3.5 Kết quả thử tác dụng của các chất tổng hợp được trên một số

34

dòng tế bào ung thư người (theo phương pháp SRB)

Bảng 3.6 Kết quả xác định giá trị IC50 (µg/ml) của một số chất tổng hợp

35

được trên dòng tế bào Hep G2 (theo phương pháp SRB).

Bảng 4.1 Các tương tác 1H-13C của 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin

42

Bảng 4.2 Các tương tác 1H-13C của 5-(4’-bromobenzylden)-3-

45

pyrrolidinomethylhydantoin (H6)


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
HÌNH

TRANG

Hình 4.1.1. Phổ tương tác HSQC của chất H0

40

Hình 4.2.1.Phổ tương tác HMBC của chất H0

41

Hình 4.6.1. Phổ HSQC của hợp chất H6

43

Hình 4.6.2 Phổ HMBC của hợp chất H6

44


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc chiến chống lại bệnh tật, con người khơng ngừng tìm tịi, nghiên
cứu để phát hiện ngày càng nhiều loại thuốc mới có hiệu quả trong phịng và
điều trị bệnh. Thuốc mới được tìm ra có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong đó
các thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp đóng vai
trò quan trọng.
Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tao ra các thuốc mới, các nhà
nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc

hoặc các chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo ra các chất mới dự
đóan có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị
Các dẫn chất của hydantoin là dãy chất đã được quan tâm nghiên cứu về tổng
hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng rộng rãi làm thuốc. Một số dẫn
chất hydantoin đã được dùng rộng rãi trong lâm sàng như phenytoin (thuốc
chống động kinh), nitrofurantoin (thuốc kháng khuẩn), dantrium (thuốc giãn
cơ vân), nilutamid (thuốc điều trị ung thư tuyến tiền liệt di căn) [19].
Trong những năm qua, đã tìm thấy nhiều dẫn chất 5-arylidenhydantoin thiên
nhiên và tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, và có tác dụng
chống ung thư rất đáng quan tâm [1], [5], [7], [8], [15], [20].
Để tiếp tục góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 5-arylidenhydantoin
có tiềm năng về hoạt tính chống ung thư, chúng tơi thực hiện khóa luận với
các mục tiêu sau.
1. Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và một số dẫn chất base
Mannich.
2. Thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên một số dịng tế bào ung thư
người của các chất tổng hợp được.


2

CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN
Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) là hợp chất hữu cơ được A.Bayer
phát hiện năm 1861[29] bằng phản ứng hydro phân (hydrogenolysis) allantoin
( chất được phát hiện trong túi dịch niệu (the allantoin fluid) của bị cái), đó
là nguồn gốc tên hydantoin. Sau đó, năm 1864, A.Bayer [30] tổng hơp được
hydantoin với nguyên liệu đầu là bromoacetylure. Tuy nhiên cấu trúc vòng
của hydantoin chỉ được xác dịnh bởi Strecker vào năm 1873 [31].
O

NH

4 3
5 1 2

N
H

O

Hydantoin
Bản thân hydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên nhiều cơng
trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của
hydantoin có tác dụng phong phú và đa dạng như thuốc chống động kinh,
kháng khuẩn, chống ung thư [1], [3], [4], [8], [11],.... Các dẫn xuất thế ở vị trí
N1, N3, đặc biệt thế 2 lần ở vị trí C5 đã được nghiên cứu và cho thấy tác dụng
sinh học đáng chú ý
1.1.1 Tác dụng chống co giật
Dẫn chất hydantoin được dùng nhiều nhất trong điều trị là 5,5diphenylhydantoin (phenytoin)

(1), biệt dược là Dilantin (biệt dược của

Parke-Davis), Epanutin (biệt dược của Pfizer) [3],[9].

H
N
O
NH
O

1


3

Phenytoin có tác dụng chống co giật, thường được sử dụng trong điều trị bệnh
động kinh [3],[9]. Tuy nhiên phenytoin cịn có một số tác dụng phụ như giảm
bạch cầu, giảm tiểu cầu, buồn nơn, phát ban,... vì thế đã có nhiều nghiên cứu
nhằm tổng hợp các dẫn chất của hydantoin có ít tác dụng phụ hơn nhưng vẫn
duy trì được tác dụng chống co giật. Ví dụ, các dẫn chất của phenytoin được
tổng hợp gồm ethotoin (3-ethyl -5-phenylhydantoin), mephenytoin (5-ethyl-3methyl-5-phenylhydantoin), 5-methyl-5-phenylhydantoin, và 5-pentyl-5phenylhydantoin . Các chất được tổng hợp đều chứa khung hydantoin, chứa
các nhóm thế có khả năng tạo liên kết hydro (nhóm –C=O, nhóm –NH) và
phần khơng kỵ nước như nhân thơm liên kết với C-5 [27].
1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Nitrofurantoin (2) là dẫn chất hydantoin được dùng điều trị nhiễm khuẩn
đường tiết niệu từ năm 1959 và cho đến nay vẫn được sử dụng trong điều trị
[12].
O2N

O

N N
O

NH
O
2

Một dẫn chất của nitrofurantoin thế ở N-3 với nhóm hydroxymethyl là
Nifurtoinol

[3-hydroxymethyl-1-(5-nitrofurfurylidenamino)hydantoin]

(3)

cũng có tác dụng như Nitrofurantoin và được áp dụng trong điều trị [17].
O
O2N

O
N

OH
O

3

Một số dẫn chất base Mannich ở N-3 của Nitrofurantoin (4) đã được tổng hợp
và thử nghiệm có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt, trong đó có chất
đang được dùng làm thuốc tương tự như Nitrofurantoin nhưng bệnh nhân dễ


4

dung nạp hơn với biệt dược là Nifurfolin (1-(5’nitro-2-furfurylidenamino)-3morpholinomethylhydantoin) (5) [17]

-N(CH3)2
O

N N

O2N

O

N
O

-N

NHR

(CH2)nNHR
-N

O

4

O

N N

O2N

O

N
CH2

O

N

O

5

Dẫn chất khác cũng có tác dụng kháng khuẩn, hiện được sử dụng trong điều
trị

nhiễm

khuẩn

đường

tiết

niệu

là

Furazidin

(1-{[3-(5-nitro-2-

furyl)allyliden]amino}hydantoin (6) [17].
O
N

HN

O

O

N

NO2
6

1.1.3 Tác dụng chống ung thư
Một số dẫn chất hydantoin đã được ứng dụng trong điều trị ung thư như
là Nilutamid (7).
O
F F
F

N
O

O2N

NH
CH3
CH3

7

Chất này được tổng hợp từ năm 1992, được ứng dụng trong điều trị ung thư

tuyến tiền liệt di căn từ năm 1996 [9],[17].


5

Một số hợp chất thiên nhiên có cấu trúc 5-arylidenhydantoin được phân
lập và tìm thấy có hoạt tính ức chế tế bào ung thư như các chất aplysinopsin
(8) và spongiacidin (9) từ bọt biển [16].
R
CH3
N

O

O

H
N

O

O
HN

N

N
H

Br

HN

NH

CH3

O

8

9

Nhiều dãy chất 5-arylidenhydantoin đã được tổng hợp và thử nghiệm hoạt
tính chống ung thư ở nước ngoài cũng như ở Việt Nam.
Năm 2003, các tác giả Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai
Hương [6] cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng hai dịng tế bào ung thư ở
người (tế bào ung thư biểu mô (KB) và tế bào ung thư màng tử cung (FL))
của dãy chất 5-(5’-nitro-2’-furfurliden)hydantoin và các dẫn chất base
Mannich của nó. Kết quả là đã tìm được hai chất là 5-(5-nitro-2’furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (10) và 3-piperidinomethyl-5-(5’-nitro-2’furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (11) có hoạt tính kháng tế bào ung thư rất
mạnh (giá trị IC50 là 0,2-1,04 (µg/ml) đối với dịng tế bào FL và 0,6-1,15
(µg/ml) đối với dòng tế bào KB).
N

H
N

O
NO2

O
O

N
H
10

CH2
N
O

O
N
H

O

NO2

11

Năm 2006, C.Carmi và cộng sự [13] đã nghiên cứu tổng hợp một số dẫn
chất 1-phenyl-5-benzylidenhydantoin và thử hoạt tính ức chế EGFR (receptor
của yếu tố tăng trưởng biểu mô) và chống tăng sinh của ung thư biểu mô ở
người A431. Kết quả nghiên cứu của tác giả Carmi cho thấy một số chất tổng


6

hợp được có tác dụng ức chế q trình phosphoryl hóa của EGFR, có tác dụng

ức chế sự phát triển và tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô A431 khi thử ở
nồng độ 20µM. Chất có tác dụng mạnh nhất là (E)-5-p-hydroxybenzyliden-1phenethylhydantoin (12) với IC50=27µM trên invivo.
Năm 2009, V.Zuliani và C.Carmi tiếp tục hướng nghiên cứu các dẫnchất
5-benzylidenhydantoin có hoạt tính ức chế EGFR và hoạt tính chống ung thư,
đã tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh dòng tế bào ung thư
phổi A549 của một số chất [28]. Kết quả cho thấy một số dẫn chất 5benzyliden-1-phenethylhydantoin có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ở nồng
độ 20µM. chất có tác dụng mạnh nhất (E)-5-p-hydroxybenzyliden-1phenethylhydantoin (12).
N
HO

O

N
H

O

12

Các tác giả đã giả thiết cơ chế tác dụng kép của dãy chất này là do liên kết đơi
liên hợp ở ngồi vịng đã tạo cho nhân hydantoin có khả năng tác dụng là
tương tác với vị trí hoạt động của EGFR và alkyl hóa các chất ái nhân sinh
học. Giả thuyết này được ủng hộ bởi hoạt tính gây độc tế bào ung thư đã biết
của nhiều hợp chất thiên nhiên và tổng hợp có chứa nhóm carbonyl α,β-không
no [14].
Năm 2009, M.Mudit, M.Khanfar đã công bố công trình nghiên cứu về
phát minh, thiết kế và tổng hợp các dẫn chất 5-benzylidenhydantoin có hoạt
tính chống ung thư di căn lấy cảm hứng từ hợp chất thiên nhiên ở biển [21].
Từ loài bọt biển Hemimycale Arabica (Mycalidae) ở biển Hồng Hải, các tác
giả đã phân lập được 3 chất đã biết là (Z)-5-(4-hydroxybenzyliden)hydantoin

7

(13), 5-(4-hydroxybenzyl)hydantoin

(14), (Z)-5-(6-bromo-1H-indol-3-

yl)methylenhydantoin (15).
O
HO

HN

13

O
HO

NH

HN

O
14

NH
O

Br

O
HN

NH

NH
O
15

Tiếp đó các tác giả đã tổng hợp 39 dẫn chất 5-benzylidenhydantoin, trong đó
có 8 chất mới. Thử nghiệm hoạt tính chống ung thư cho thấy chất (13) tự
nhiên và chất tổng hợp (Z)-5-(4-ethylthio)benzylidenhydantoin (16) có hoạt
tính mạnh ức chế sự tăng trưởng và sự xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền
liệt trên invitro. Về mối liên quan cấu trúc –tác dụng của dãy chất này, các tác
giả có nhận xét là yếu tố lập thể ảnh hưởng đến tác dụng nhiều hơn yếu tố
điện tử và các chất có nhóm thế ở vị trí para của nhóm benzyliden mà có chứa
các nguyên tử oxy, nitơ hoặc lưu huỳnh có hoạt tính cao. Các hợp chất này có
tính chất nhận hydro, vì thế có thể có tương tác liên kết hydro ở vị trí para
O
S

HN

NH
O

16

Năm 2010, tác giả Vũ Trần Anh [1] đã nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt

tính của các dẫn xuất hydantoin 17→25, 17(a-d)-25(a-d). Kết quả đã tổng
hợp được 43 dẫn chất của hydantoin trong đó có 9 dẫn xuất của 5arylidenhydantoin và 34 dẫn chất base Mannich của các dẫn xuất 5arylidenhydantoin. Tác giả đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 43 chất
tổng hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư gan
Hep-G2 và tế bào ung thư phổi LU. Kết quả cho thấy trong số 43 chất tổng


8

hợp được có 4 dẫn chất 5-arylidenhydantoin và 9 dẫn chất base Mannich của
chúng có hoạt tính kháng tế bào ung th

gan ngi Hep-G2

(IC50=0,38ữ5àg/ml). Cỏc dn cht base Mannich u có đặc điểm cấu tạo
chung là chứa nhóm hút điện tử (-Cl, -NO2) trong hợp phần aryliden.
O
3'

2'
1'

4'

R

NH
4 3
51 2

CH

N
H

6

6'

5'

17

R= H; 2' -OH; 4'-N(CH3)2; 4'-OH; 4'-F
2' -Cl; 4'-Cl; 3'-NO2; 4' -NO2

O

N
4 3
51 2

CH2 NR1R2

25
O

3'

2'
1'

4'

R

CH
6

5'

6'

N
H

O

17(a-d) - 25(a-d)

R1
N
R2

N

R1
N
R2

N

O

(a)

R1
N
R2

(b)

N

N

(c)

N-CH3

R1
NH

CH3

(d)

R2

Năm 2012, tác giả Đỗ Thị Thu Hằng [7] đã tổng hợp và thử họat tính kháng
tế bào ung thư của 15 dẫn chất 5-halogenoarylidenhydantoin và base Mannich

18(a-d)-20(a-d). Kết quả cho thấy 11 chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư
đại tràng HTC116 với IC50=10,17-19,23µg/ml.


9

R

O

2'

3'

1'

4'

NH
4 3
5 1 2

CH

N
H

6

6'

5'

R
3'

O

2'
1'

4'

CH
6

6'

5'

R = F (18) ; Cl (19) ; Br (20).
O

N
4 3
5 1 2

CH2NR1R2
O

N
H

18(a-d) - 20(a-d)
R1
N
R2
R1
N
R2

N

O

R1
N
R2

(a)

(b)

N

N

N

N CH3

(c)

CH3

(d)

R1
NH
R2

Năm 2013, tác giả Trịnh Văn Ninh [8] đã tổng hợp và thử hoạt tính kháng
tế bào ung thư của 13 dẫn chất 3-aryl-5-arylidenhydantoin . Kết quả cho thấy
có 2 chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư đại tràng HTC116 với IC50
=10,99 µg/ml và IC50=15,25 µ/ml, và có 2 chất có hoạt tính ức chế tế bào ung
thư tuyến tiền liệt PC3 với IC50=4,04 µg/ml và IC50=2,01 µg/ml.
O2N

N
O

O

N
H
(21-31)

R

R = H (21) ; 4'-F (22) ; 3'-Cl(23) ; 4'-Cl (24) ; 2',6'-Cl2 (25) ; 2'-Br (26) ; 3'-Br (27)

4'-Br (28) ; 3'-NO2 (29) ; 2'-OH (30) ; 4'-OH (31).

1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP 5-(4’BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH
Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) có cơng thức cấu tạo như sau:


10

O

NH

4 3
5 1 2

N
H

O

Từ cấu trúc phân tử hydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa
để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của hydantoin.
1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin
Sơ đồ phản ứng:
O
RCHO

+

NH

4 3
51 2
N
H

O

NH
4 3
5 1 2

R HC
N
OH H

O

O

NH
4 3
5 1 2

R

O

N
H

O

R = phenyl, phenyl thế, furyl, pyryl, pyridyl, quinolyl, hoặc indolyl

Năm 1911, Wheeler và Hoffman là những người đầu tiên nhận thấy
hydantoin có thể ngưng tụ với aldehyd thơm tạo thành dẫn chất có nối đơi gắn
ở C-5 của hydantoin [26]. Phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng,
với natri acetat khan, anhydrid acetic. Các aldehyd thơm đã được sử dụng là
benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd, furfural, vanillin,…
O
Ar-CHO

+

NH
4 3
5 2
1
N
H

O
-H2O
O

AcOH, AcONa

Ar

NH

4 3
5 12

N
H

O

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn
chất thế ở C-5 của hydantoin [26]. Một nhược điểm của phương pháp trên là
phải sử dụng một lượng lớn acid acetic và natri acetat.
Năm 1982, tác giả A.Kleeman và cộng sự [16] đã tiến hành phản ứng
ngưng tụ hydantoin với một số aldehyd thơm với xúc tác muối amoni của các
acid carboxylic trong acid acetic băng. Kết quả thu được so sánh với phương
pháp sử dụng xúc tác natri acetat của Wheeler và Hoffman cho hiệu suất tốt
hơn hẳn. Ví dụ: hiệu suất tổng hợp 5-benzylidenhydantoin từ benzaldehyd và


11

hydantoin theo phương pháp Kleeman là 95% so với 46% theo phương pháp
Wheeler và Hoffman.
Năm 1993, Marton, J. [20] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là
ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin
trong dung môi là hỗn hợp nước:ethanol (1:1), phản ứng được tiến hành ở
nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ. Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (pclorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd,…), hiệu suất
phản ứng 44-89%. Năm 2004, tác giả Thenmozhiyal và cộng sự [24] đã sử
dụng xúc tác này trong điều chế các phenylmethylenhydantoin và điều chế
được 54 dẫn chất.

Sơ đồ phản ứng:
O

H

O
O

+

NH
O

N
H

R

NH

NaHCO3/H2O-EtOH

Ethanolammin,t0

N
H

R

O

R = Alkyl, alkoxy (-OR), -NR, -OH, -X, -CN, -CF3, -NO2

Để rút ngắn thời gian phản ứng, hiện nay các nhà hóa học đã sử dụng vi sóng
trong tổng hợp hữu cơ. Năm 2006, tác giả Lamiri [17] đã sử dụng vi sóng
trong tổng hợp 5-arylidenhydantoin. Hỗn hợp natri acetat, oxyd nhôm được
cho vào hỗn hợp hydantoin và aldehyd trong dung môi CH2Cl2. Khuấy hỗn
hợp phản ứng ở nhiệt độ phịng, sau đó cất loại CH2Cl2, dùng vi sóng tần số
2405Hz, công suất 1250W tác động vào trong 2 phút.
O
RCHO

+

NH
N
H

O

O
Natri acetat/oxyd nhơm
vi sóng, 2 phút

H
R

NH
N
H

O


12

Phản ứng có hiệu suất tương đối cao (74-96%), với các aldehyd là
benzaldehyd,

0-clorobenzaldehyd,

m-clorobenzaldehyd,

p-

clorobenzaldehyd,....


Về cơ chế phản ứng ngƣng tụ
Phản ứng ngưng tụ giữa hydantoin và aldehyd thơm là phản ứng ngưng

tụ kiểu aldol xảy ra theo cơ chế sau [2]:
Giai đoạn cộng hợp:

-

Nhóm methylen ở vị trí 5 của hydantoin rất hoạt động, nguyên tử H ở đây dễ
dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là
một tác nhân ái nhân mạnh:
O

O

NH
N
H

+

O

NH

HC

B

BH

+

O

N
H

Anion (II) tấn cơng vào carbon mang điện tích dương phần Cδ(+) của nhóm
carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):
O
H

O
NH

(+)
Ar C H
O
(-)

HC

+

(III)

N
H

NH

N
O
Ar CH H
O
(IV)

O

(II)

Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác B(-) :
O

O
NH

H
Ar HC
O

N
H

(IV)

NH

H
O

+

BH

Ar HC N
H
OH
(V)

O

+

B


13

-

Giai đoạn ngƣng tụ loại nƣớc:
O
H

O
H
Ar HC
HO

NH
O +

N
H

Ar

H

CH

O

NH

NH
O

N
H

Ar C
H

N
H

O

+

H2O + H

OH2

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich
a) Định nghĩa phản ứng Mannich.
Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ có
nguyên tử H linh động bằng tác dụng của formaldehyd (hoặc các aldehyd
khác) và các amin bậc 1 hoặc amin bậc 2 (hoặc NH3) tạo ra dẫn chất có nhóm

thế aminomethyl gọi là base Mannich [2]. Điều kiện cần thiết để xảy ra phản
ứng là tính ái nhân của amin phải mạnh hơn tính ái nhân của hợp chất chứa
hydro linh động. Phản ứng thường được tiến hành trong môi trường acid [2],
[25].
Sơ đồ phản ứng:
R1
C

H

+

HCHO

+

H+
H2O

NH
R2

C

C

R1

N

R2

Phản ứng xảy ra dễ dàng trong dung môi alcol ở nhiệt độ không cao (<1000C)
và xúc tác là các acid hoặc nhiều trường hợp không cần xúc tác.
b) Cơ chế phản ứng Mannich: phản ứng xảy ra qua hai giai đoạn:
-Giai đoạn 1: Amin phản ứng với fomaldehyd trong sự có mặt của acid, tạo
thành một chất trung gian, chất này lọai nước tạo thành tác nhân ái điện tử:
R1 ..
N H
R2

+

H2C OH

R1 +
NH CH2OH
R2

- H2O

R1
R2

N CH2

R1
R2

N CH2

14

Giai đoạn 2: Cation aminomethyl phản ứng với hợp chất có hydro linh

động.

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động khơng có khả năng tạo enol hóa
(như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở
liên kết C-H ở nhân indol, pyrol …) thì cation aminomethyl tấn cơng vào
ngun tử mang hydro linh động tạo sản phẩm base Mannich:
R1

R1

+

CH2

N

H

+

C

N

H+

+

CH2 C

R2

R2

+Trường hợp hợp chất có hydro linh động có khả năng tạo enol (hydro linh
động nằm bên cạnh nhóm carbonyl của phân tử) thì cation aminomethyl là tác
nhân ái điện tử tấn công vào liên kết đôi C=C của dạng enol tạo ra hợp chất
chứa nhóm aminomethyl (base Mannich):
R1

C

+ H2C N

H O

O

H
C

R2

H

C

C

OH
C

R1
C

H2C N
R2

O
- H

C

R1
C

H2C N
R2

Base Mannich


15

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUN VẬT LIỆU, HĨA CHẤT, DUNG MƠI
STT

Tên ngun liệu

Nguồn gốc

TCCL

1

Hydantoin

Merck

≥98%

2

4-bromobenzaldehyd

Merck

100%

3

Morpholin

Merck

≥98%

4

Piperidin

Merck

≥98%

5

N-methylpiperazin

Merck

≥98%

6

P-toluidin

Merck

≥98%

7

Pyrrolidin

Merck

≥98%

8

P-anisidin

Merck

≥98%

11

Cloroform

Trung Quốc

≥99%

12

Dimethylformamid

Trung Quốc

≥99.5%

13

Ethyl acetat

Trung Quốc

≥99.5%

14

Formaldehyd

Trung Quốc

37-40%

15

Methanol

Trung Quốc

≥99.5%

16

Natri bicarbonat khan

Trung Quốc

≥99.5%

17

Ethanol tuyệt đối

Đức Giang (VN)

≥99.5%


16

2.2
-

THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 500ml, sinh hàn, phễu nhỏ
giọt, ống đong, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner …)

-

Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật).

-

Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ).

-

Bơm hút chân không VRL mode 200-7.0 (Mỹ).

-

Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ).

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

-

Tủ sấy chân không Shellab (Đức).

-

Máy khuấy từ IKA-RCT (Đức).

-

Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ).

-

Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, phịng Hóa Vật liệu,
Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia
Hà Nội

-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13

C-NMR, HQSC, HMBC) ghi

trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện hóa học, Viện khoa học và
công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lượng (MS) ghi theo phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS)
trên máy LC-MSD-Trap-SL, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Cơng nghệ Việt Nam.
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phƣơng pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và dẫn
chất base Mannich.
-

Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các
chất dự kiến.

-

Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được.

-

Dùng SKLM để theo dõi phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết.


17

2.3.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Các phương pháp phổ (IR, 1H-NMR,

13

C-NMR, HQSC, HMBC, MS)

được sử dụng để khẳng định cấu trúc các sản phẩm tổng hợp được. Các số
liệu phổ của các chất tổng hợp được đối chiếu với tài liệu.
2.3.3 Phƣơng pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thƣ.
Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo
phương pháp: SRB [18], [22]
Nguyên tắc:
Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế
bào. Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng..
- Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu
hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu. Càng nhiều tế
bào sống, sự hấp thu càng nhiều. Các tế bào sống, sau đó được cố định. Định
lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sóng
495-515 nm. Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót. Phương pháp này hiện
đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National
Cancer Institution - NCI).
Dòng tế bào thử nghiệm:
3 dòng tế bào:
-

Dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú)

-

Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

-

Dòng tế bào PC3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt)

Chất chuẩn dƣơng tính
Sử dụng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc
Taxol pha trong DMSO