Tổng quan một số mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên động vật thực nghiệm

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


PHẠM THỊ THU

TỔNG QUAN MỘT SỐ MÔ HÌNH
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẦM MÁU
CỦA THUỐC TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC
NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU

TỔNG QUAN MỘT SỐ MÔ HÌNH
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẦM MÁU
CỦA THUỐC TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC
NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
PGS.TS. Đào Thị Vui
ThS. Trần Hồng Linh

Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược Lực
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI - 2014



LỜI CẢM ƠN


Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất
tới
PGS.TS. Đào Thị Vui – Bộ Môn Dược lực
ThS. Trần Hồng Linh – Bộ Môn Dược lực
Những người thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội,
đặc biệt các thầy cô giáo Bộ môn Dược lực đã tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện tốt
khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các phòng ban, cùng toàn thể
các thầy cô giáo, các cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp tôi có thể lĩnh hội
những kiến thức quí giá về ngành Dược trong suốt năm năm học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn ủng
hộ, bên cạnh tôi trong quá trình học tập.
Cuối cũng, tôi xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe để tiếp tục dìu dắt
những thế hệ học trò mai sau.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Phạm Thị Thu
Phạm Thị Thu


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU VÀ CÁC RỐI
LOẠN QUÁ TRÌNH CẦM MÁU 3
1.1. Giai đoạn co mạch tại chỗ 3
1.2. Giai đoạn tạo nút tiểu cầu 4
1.3. Giai đoạn đông máu 8
1.4. Giai đoạn co cục máu đông 13
1.5. Giai đoạn tan cục máu đông 13
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ QUÁ TRÌNH TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15
2.1. Nguồn dữ liệu 15
2.2. Chiến lược tìm kiếm 15
2.2.1. Dự kiến thực hiện tổng quan hệ thống 15
2.2.2. Định hướng lại quá trình tìm kiếm 15
2.3. Quy trình tìm kiếm và lựa chọn nghiên cứu 16
2.3.1. Tìm kiếm và tổng hợp các mô hình gây chảy máu bằng tổn thương 16
2.3.2. Tìm kiếm và tổng hợp các mô hình gây rối loạn cầm máu 18
2.3.3. Tìm kiếm bổ sung 20
CHƢƠNG 3: TỔNG QUAN MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
CẦM MÁU CỦA THUỐC TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 21
3.1. Mô hình gây chảy máu bằng tổn thương. 21
3.1.1. Mô hình cắt đuôi hoặc chi 22
3.1.2. Mô hình gây tổn thương da, niêm mạc 24
3.1.3. Mô hình gây tổn thương các tạng 26

3.1.4. Mô hình gây chấn thương não 30
3.1.5. Mô hình gây tổn thương các mạch máu 34
3.2. Mô hình gây rối loạn thành mạch. 37
3.2.1. Mô hình gây giãn mạch bằng acetylcholin 37
3.2.2. Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch bằng hợp chất 48/80 39
3.3. Mô hình gây rối loạn tiểu cầu 40
3.3.1. Mô hình giảm số lượng tiểu cầu 40
3.3.2. Mô hình giảm chức năng tiểu cầu 43
3.4. Mô hình gây rối loạn các yếu tố đông máu huyết tương 50
3.4.1. Mô hình giảm các yếu tố đông máu huyết tương bằng heparin. 50
3.4.2. Mô hình giảm các yếu tố đông máu bằng gây thiếu vitamin K 52
3.4.3. Mô hình giảm các yếu tố đông máu huyết tương bằng gây bệnh gan 56
3.4.4. Mô hình giảm các yếu tố đông máu huyết tương bằng di truyền 59
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ LỰA CHỌN CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU
.63
4.1. Bàn luận về các mô hình nghiên cứu 63
4.1.1. Các yếu tố trong nghiên cứu ảnh hưởng đến kết quả đầu ra 63
4.1.2. Mô hình chảy máu bằng tổn thương 66
4.1.3. Mô hình nghiên cứu trên các giai đoạn của quá trình cầm máu 68
4.1.4. Những điểm còn thiếu của đề tài 71
4.2. Bước đầu lựa chọn mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của một thuốc 71
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 75
5.1. Kết luận 75
5.2. Đề xuất 76


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
1
ADP
Adrenosin diphosphat

2
aPTT
Thời gian thromboplastin hoạt hóa
(Activated Partial Thromboplastin)
3
DDAVP
Desmopressin
(1-deamino-8-D-arginine vasopressin)
4
ELISA
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với
enzyme
(Enzyme-linked immunosorbent assay)
5
FIX
Yếu tố IX (Factor IX)
6
FVIII
Yếu tố VIII (Factor VIII)
7
GP
Glycoprotein
8
ICH
Xuất huyết não
(Intracerebral hemorrhage)
9
LMWH
Heparin phân tử lượng thấp
(Low-molecular-weight heparin)

11
PT
Thời gian prothrombin
(Prothrombin Time)
12
TT
Thời gian thrombin
(Thrombin Time)
13
UFH
Heparin không phân đoạn
(Unfractionated heparin)
14
vWF
Factor von-Willebrand
(Yếu tố von-Willebrand)
15
Ia, IIa, IIIa, IVa,
Va, VIIa, VIIIa,
IXa, Xa, XIa, XIIa,
XIIIa
(Tương ứng )Yếu tố I, II, III, IV, V, VII, VIII,
IX, X, XI, XII, XIII hoạt hóa


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1

Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu.
11
2
Bảng 2.1. Các mô hình trong nhóm mô hình gây chảy máu
bằng tổn thương
17
3
Bảng 2.2. Các bệnh lý dự kiến tìm kiếm mô hình
18
4
Bảng 2.3. Các mô hình gây bệnh tìm kiếm được
20
2
Bảng 3.1. Điểm các tiểu chí hoại tử và viêm trên mô bệnh
học các tạng.
30
3
Bảng 3.2. Chế độ ăn AIN-76 thiếu vitamin K.
55
4
Bảng 3.3. Điểm cho các tổn thương khớp gối trên chuột
hemophilia.
61

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1. Sự kết dính tiểu cầu – thành mạch và tiểu cầu – tiểu
cầu.
4
2
Hình 1.2. Các GP trên bề mặt tiểu cầu và các chất hoạt hóa
tiểu cầu.
6
3
Hình 1.3. Sự hình thành Thromboxan A2.
7
4
Hình 1.4. Sơ đồ đông máu.
9
9
Hình 2.1. Vị trí cắt trong mô hình cắt cụt chi
23
5
Hình 2.2. Vị trí của đường rạch trên mô hình gây tổn thương

gan.
27
6
Hình 2.3. Gây tổn thương gan theo phương pháp đâm thủng.
28
7
Hình 2.4. Vị trí đâm kim và đường kính vết thương trên tĩnh
mạch đùi
35
10
Hình 2.6. Vật kính trên da chuột để quan sát các mạch máu
dưới kính hiển vi.
38
11
Hình 4.1. Sơ đồ các hướng lựa chọn mô hình nghiên cứu.
74



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Chảy máu là triệu chứng xảy ra khi có chấn thương, tai nạn, phẫu thuật và
trong các bệnh di truyền như hemophilia hoặc von-Willebrand, cũng như các bệnh
mắc phải khác (rối loạn thành mạch, rối loạn số lượng và chức năng tiểu cầu, rối
loạn các yếu tố đông máu, và rối loạn quá trình tiêu fibrin) [15], [70], [98]. Mặt
khác, hiện nay số lượng người sử dụng thuốc chống huyết khối để dự phòng nguy
cơ tim mạch không ngừng tăng. Do đó, chảy máu do quá liều thuốc chống đông xảy
ra thường xuyên hơn và nghiêm trọng hơn với các triệu chứng có thể nhẹ như chảy
máu dưới da, các chấm đỏ dưới da, chảy máu cam cho đến các triệu chứng nặng

xuất huyết tụ máu ở não.
Qua nhiều nghiên cứu, quá trình cầm máu đã được hiểu biết sâu hơn, nhờ đó
gợi ra những hướng mới trong nghiên cứu và phát triển các thuốc cầm máu mới.
Hiện nay, có nhiều thuốc cầm máu được sử dụng như: các thuốc cầm máu tại chỗ
như keo fibrin, thrombin, zeolite hoặc các thuốc cầm máu toàn thân như phức hợp
yếu tố VIII, thrombin) cô đặc, thuốc desmopressin, thuốc chống tiêu fibrin (acid
tranexamic). Trong đó, các phức hợp yếu tố cô đặc là được sử dụng phổ biến hơn
cả. Nhưng các thuốc này chưa có đủ tác dụng cầm máu, đặc biệt trong các trường
hợp máu chảy nhiều, thuốc cũng gây nhiều tác dụng không mong muốn: truyền
nhiễm virus, phản ứng miễn dịch, các thuốc cầm máu tại chỗ gây bám dính và viêm
tại vị trí bị tổn thương [54], [75], [79], [94].
Vì những nguyên nhân trên nên việc tìm kiếm, nghiên cứu các thuốc cầm
máu mới có hiệu quả tốt, ít tác dụng không mong muốn, là yêu cầu cần thiết và cấp
bách. Từ lúc phát hiện ra khả năng cầm máu của một dược liệu hoặc một hợp chất
hóa dược đến lúc biến nó trở thành một chế phẩm thuốc hoàn chỉnh để đưa vào sử
dụng trên lâm sàng là cả một chặng đường dài, trong đó, giai đoạn tiền lâm sàng –
thử tác dụng dược lý là khâu rất quan trọng. Để thực hiện các nghiên cứu đó, không
thể thiếu các mô hình thực nghiệm phù hợp giúp chứng minh thuốc đó thực sự có
tác dụng hay không.
2

Hiện nay, tại Việt Nam, các mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của
thuốc còn rất ít và hạn chế, chưa được thống kê một cách đầy đủ. Nhằm đưa ra một
cái nhìn tổng hợp các mô hình nghiên cứu các thuốc cầm máu đã được thực hiện
trên thế giới, cũng như so sánh, đánh giá và nhận định các mô hình có khả năng
thực hiện ở Việt Nam, phân tích các hướng nghiên cứu và các mô hình cần sử dụng
để nghiên cứu về tác dụng cầm máu của thuốc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Tổng quan một số mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên động
vật thực nghiệm” với mục tiêu:
 Tổng quan về quá trình cầm máu và các rối loạn cầm máu.

 Tổng quan về một số mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc.
 Bàn luận các mô hình và bước đầu định hướng lựa chọn mô hình nghiên cứu
tác dụng cầm máu của thuốc.
















3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU VÀ CÁC RỐI
LOẠN QUÁ TRÌNH CẦM MÁU
Để phục vụ cho quá trình tìm kiếm, chúng tôi tiến hành tổng quan ngắn gọn
về quá trình cầm máu (và các yếu tố liên quan đến việc gây mô hình) cùng các bệnh
lý rối loạn quá trình cầm máu như sau:
Cầm máu là một quá trình diễn ra nhằm hạn chế hoặc ngăn cản máu chảy ra
khỏi thành mạch khi thành mạch bị tổn thương. Quá trình cầm máu được thực hiện
qua 5 giai đoạn: co mạch, tạo nút tiểu cầu, đông máu, tạo cục máu đông và tan cục
máu đông [3], [10].

1.1. Giai đoạn co mạch tại chỗ
Co mạch tại chỗ là phản xạ đầu tiên của cơ thể khi mạch máu bị tổn thương,
sự co mạch sẽ hạn chế lượng máu thoát ra ngoài. Co mạch còn có tác dụng làm tốc
độ lưu chuyển máu chậm lại, tạo điều kiện cho việc hình thành nút tiểu cầu và cục
máu đông. Co mạch xảy ra theo hai cơ chế: cơ chế thần kinh là do những xung động
đau nơi bị tổn thương sẽ hoạt hóa thần kinh giao cảm gây phản xạ co mạch. Cơ chế
thể dịch là do tế bào nội mạc giải phóng các chất angiotensin II và tiểu cầu bài tiết
serotonin và thromboxan A2 đều có tác dụng co mạch. Các phản xạ trên làm mạch
máu co lại, đường kính thu nhỏ, ngăn máu chảy tại vết thương.
Hiệu quả co mạch có ý nghĩa trong việc tạo đinh cầm máu ban đầu, tuy nhiên
chỉ cơ chế co mạch thôi là chưa đủ để cầm máu mà cần thiết có các cơ chế khác
tham gia vào. Mặt khác, với cùng một tổn thương, hiệu quả co mạch ở các mạch
máu lớn kém hơn nhiều so với các mạch máu nhỏ, như vậy, khi nghiên cứu về tác
dụng co mạch của thuốc cầm máu cần lưu ý kỹ điều này.
Giai đoạn co mạch có sự tham gia của nhiều yếu tố, trong đó, vai trò quan
trọng nhất thuộc về lớp tế bào nội mạc. Khi có tổn thương thành mạch máu, tế bào
nội mạc tiết ra chất co mạch cục bộ là angiotensin II. Angiotensin II là một chất có
tác dụng co mạch mạnh. Song song với vai trò cầm máu, tế bào nội mạc cũng có vai
trò quan trọng trong việc chống huyết khối (bài tiết NO, prostacyclin I2), nhờ vậy
mà máu lưu thông tốt trong thành mạch, chỉ khi có tổn thương thì quá trình cầm
máu mới được hoạt hóa [3], [10].
4

Trong các bệnh lý chảy máu do thành mạch, tình trạng máu vẫn bình thường
nhưng các mạch máu bị tổn thương làm thay đổi tính thấm thành mạch và trương
lực mạch máu [79]. Các thay đổi trên làm thành mạch không thực hiện được trọn
vẹn vai trò của nó trong giai đoạn co mạch, dẫn đến xuất huyết trên các vùng niêm
mạc miệng, mũi , hoặc xuất huyết trên da trong những tổn thương dù rất nhẹ.
Trong các bệnh lý này, thời gian chảy máu kéo dài khi số lượng tiểu cầu vẫn bình
thường. Thành mạch bị tổn thương do các nguyên nhân:

 Viêm do nhiễm khuẩn, dị ứng, độc tố, miễn dịch: làm tăng sức thẩm thấu của
thành mạch máu, gây thoát mạch, phù nề và dễ bị xuất huyết.
 Di truyền làm giãn các mao mạch trên các bệnh nhân Rendu Osler-Weber.
1.2. Giai đoạn tạo nút tiểu cầu
 Quá trình tạo nút tiểu cầu tại vị trí vết thương: [5], [3], [10]
Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mạc bị phá vỡ, các tổ chức
dưới nội mạc như collagen, màng nền, vi sợi, chất chun được bộc lộ. Đây là điều
kiện cơ bản cho hiện tượng dính và ngưng tập xảy ra, trước hết là tiểu cầu trong
phần thể tích máu tại vùng có tổn thương.


Hình 1.1. Sự kết dính tiểu cầu – thành mạch và tiểu cầu – tiểu cầu.
Sự kết dính của tiểu cầu vào collagen dưới lớp tế bào nội mạc xảy ra gần như
ngay lập tức. Lớp collagen tích điện dương, tiểu cầu tích điện âm và có receptor với
collagen, do đó, tiểu cầu dễ dàng kết dính với thành mạch tổn thương. Bản thân tế
bào nội mô bị thương còn giải phóng ra yếu tố von-Willebrand giúp gắn các phân tử
glycoprotein (GP) trên màng tiểu cầu vào collagen của tế bào nội mạc (như hình
1.1).
5

Sau khi đã kết dính vào nơi có tổn thương, tiểu cầu được hoạt hóa, bề mặt trở
nên xù xì, đồng thời giải phóng các chất: ADP, serotonin, fibronectin làm tăng Ca
2+

trong tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa GP IIb/IIIa trên màng tiểu cầu, làm tiểu cầu khác
lưu động trong máu kết tập với tiểu cầu vừa bị kết dính (hình 1.1). Các tiểu cầu mới
kết tụ sẽ tiếp tục được hoạt hóa và bài tiết các chất hóa học làm cho càng có thêm
nhiều tiểu cầu đến kết tụ hình thành nút tiểu cầu. Các tiểu cầu sau khi hoạt hóa dễ
dàng dính với fibrin (được tạo thành ở giai đoạn đông máu), tạo cục máu đông bền
vững.

Sự hình thành nút tiểu cầu có thể sơ bộ bịt kín tổn thương làm cho máu
ngừng chảy nếu tổn thương ở mạch máu nhỏ. Thời gian hình thành nút tiểu cầu
(thời gian máu chảy) bình thường khoảng 2 – 4 phút (tính từ khi máu chảy ra khỏi
những mạch nhỏ cho đến lúc máu ngừng chảy).
Giai đoạn tạo nút tiểu cầu là giai đoạn có sự tương tác của các yếu tố thuộc
thành mạch và yếu tố tiểu cầu, trong đó, tiểu cầu là yếu tố quan trọng và cần thiết
nhất. Tham gia vào quá trình cầm máu, tiểu cầu có 3 chức năng chính: kết dính
(dính tiểu cầu với collagen và các thành phần khác của tổ chức dưới nội mạc), kết
tập (khả năng kết dính lẫn nhau), thay đổi hình dạng và giải phóng hạt (quá trình
tiểu cầu phồng to lên, hình thành chân giả,co rút và giải phóng các hạt chứa trong
tiểu cầu: serotonin, yếu tố 3 tiểu cầu, ADP, Ca
2+
). Để thực hiện được 3 chức năng
trên, tiểu cầu có cấu trúc rất đặc biệt: tế bào không nhân được cấu tạo bởi hai thành
phần chính: [3]
Màng tiểu cầu tích điện âm rất mạnh, có nhiều chỗ lõm vào trong bào tương
làm tiểu cầu có tính xốp và tăng diện tích bề mặt lên rất nhiều. Trên màng tiểu cầu
có chứa các phân tử GPIb, GPIIb/IIIa, các receptor của các yếu tố collagen,
thrombin, ADP Nhờ hệ thống các GP cũng như các receptor này mà khi thành
mạch tổn thương bộc lộ lớp collagen, tiểu cầu sẽ dễ dàng kết dính vào đó khởi động
quá trình hình thành nút tiểu cầu.
Bào tương của tiểu cầu có actinin, myosin và thrombosthenin. Các protein
này giúp tiểu cầu đã được hoạt hóa có thể co lại và giải phóng các chất đựng bên
6

trong các hạt bào tương như: Ca
2+
, serotonin, adenosinediphosphat (ADP), chúng
được gọi là “chất kích hoạt tiểu cầu”.
Cơ chế tạo nút tiểu cầu được tạo nên bởi sự đóng góp của một số đại phân tử,

chúng có vai trò như chất dính hay chất hoạt hóa tiểu cầu. Chúng bao gồm các GP
trên bề mặt tiểu cầu, các ADP, von Willebrand và thrombin: [3], [10]
 GP Ib và GP IIb/IIIa: là các protein được phân bố đều trên màng bào tương
của tiểu cầu. Khi tiểu cầu được hoạt hóa, màng tiểu cầu dịch chuyển và phân tử các
GP được bộc lộ. Các protein huyết tương như fibrinogen sẽ nối những GP IIb/IIIa
của các tiểu cầu với nhau, tạo nên sự kết tập tiểu cầu. Bên cạnh đó, các GP khác
cũng nối với các yếu tố von-Willebrand, collagen để gây dính tiểu cầu với nội mạc
như hình 1.2.
 Yếu tố von-Willerbrand (v-WF): là một glycoprotein được tổng hợp từ tế bào
nội mạc và mẫu tiểu cầu, lưu hành trong huyết tương. v-WF có vai trò to lớn trong
cầm máu kỳ đầu, là chất keo sinh học để gắn các phân tử GPIb và GPIIa trên màng
tiểu cầu với collagen, dính tiểu cầu với tổ chức dưới nội mạc, tạo nên đinh cầm
máu. Ngoài ra, khi lưu hành trong máu, v-WF gắn với yếu tố VIII dưới dạng phức
hợp VIII - v-WF (là một protein mang yếu tố VIII). Do vậy, một số bệnh lý làm
giảm vWF thì cũng làm giảm yếu tố VIII, kéo dài thời gian chảy máu.

Hình 1.2. Các GP trên bề mặt tiểu cầu và các chất hoạt hóa tiểu cầu
(Nguồn:
 Thromboxan A
2
: hoạt hóa receptor GP IIa/IIb trên màng tiểu cầu gây kết tập
tiểu cầu [5]. Thromboxan A
2
được tổng hợp khi tiểu cầu hoạt hóa, các enzym như
7

cyclooxygenase và thromboxan synthetase xúc tác chuyển acid arachidonic thành
thromboxan A2. Về sau, do lượng ADP và thrombin ngày càng nhiều, hoạt hóa
càng nhiều enzym phospholipase để chuyển phospholipid thành acid arachidonic,
làm cho lượng thromboxan A2 được tổng hợp ra lại càng nhiều hơn nữa.

Hình 1.3. Sự hình thành thromboxan A2 [5]
 ADP: là một chất gây ngưng tập tiểu cầu rất mạnh có trong bào tương tiểu
cầu. Khi tiểu cầu kết dính vào collagen và vi sợi, nó sẽ thay đổi hình dạng và giải
phóng ra ADP (chính là yếu tố XIII của tiểu cầu). Một lượng ADP nhỏ khác được
tạo thành do hồng cầu bị vỡ hoặc do sự thoái hóa ATP thành ADP dưới tác động
của thrombin. Về sau sự kết tập tiểu cầu càng tăng thì lượng ADP càng được phóng
thích ra nhiều hơn. Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP là: ADP gắn vào
receptor của nó trên màng tiểu cầu, gây hoạt hóa receptor GP IIb/IIIa, ADP cũng
thúc đẩy quá trình tạo ra thromboxan A2.
Tiểu cầu có một vai trò quan trọng trong đông máu, do đó, rối loạn tiểu cầu
kể cả về số lượng hay chức năng đều có thể gây chảy máu [6]. Giảm số lượng tiểu
cầu có thể là do ức chế quá trình sinh tiểu cầu ở tủy xương (chiếu xạ, thuốc, các u ác
tính), hoặc do tăng hủy tiểu cầu trong lá lách (thuốc, nhiễm trùng do vi khuẩn hoặc
virus, lupus ban đỏ…). Trong các bệnh lý này, các xét nghiệm đông máu (aPTT,
TT, PT) là bình thường, chỉ có số lượng tiểu cầu giảm làm thời gian chảy máu kéo
dài.
Giảm chức năng tiểu cầu khi tiểu cầu thiếu hụt một trong ba chức năng của
nó. Các phân tử có vai trò như chất dính hay chất hoạt hóa tiểu cầu bị thiếu hụt
(trong các bệnh di truyền) hoặc bị ức chế (do dùng thuốc kháng tiểu cầu) là nguyên
8

nhân gây chảy máu kéo dài. Thiếu hụt các GPIIb/IIIa trên tiểu cầu trong bệnh
Thrombasthenia Glanzmann, thiếu hụt yếu tố von-Willebrand gặp ở bệnh von-
Willebrand, giảm các hạt lưu giữ trong tiểu cầu găp ở hội chứng Hermansly –
Pudlak. Bên cạnh đó, các thuốc kháng tiểu cầu như aspirin (ức chế hình thành
thromboxane A
2
), clopidogrel (ức chế ADP hoạt hóa tiểu cầu) đều có khả năng làm
giảm chức năng tiểu cầu. Trên lâm sàng, thường gặp các biểu hiện nhẹ của bệnh

(như chảy máu niêm mạc, chảy máu kéo dài khi có tổn thương, thậm chí là không
có triệu chứng), nhưng có thể tiến triển nặng gây ra các trường hợp xuất huyết não.
Xét nghiệm cho thấy thời gian chảy máu kéo dài trong khi số lượng tiểu cầu và thời
gian đông máu vẫn bình thường, xét nghiệm đo độ dính và đo kết tập tiểu cầu đều
cho giá trị giảm [1], [6], [15].
1.3. Giai đoạn đông máu
 Quá trình đông máu: [3], [10]
Đông máu là một chuỗi các phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu có
trong huyết tương, các mô tổn thương và tiểu cầu. Khi một yếu tố được hoạt hóa, nó
sẽ đóng vai trò enzym xúc tác cho sự hoạt hóa yếu tố tiếp theo, do đó tạo thành một
dây chuyền phản ứng dẫn đến sự hình thành mạng lưới fibrin và làm máu đông lại.
Kết quả là máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc, do sự chuyển fibrinogen thành
fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này sẽ trùng hợp tạo ra mạng lưới fibrin giam
giữ hồng cầu và làm máu đông lại. Quá trình này diễn ra qua 3 giai đoạn và có thể
được tóm tắt như hình 1.4:
 Giai đoạn 1: giai đoạn tạo prothrombinase.
Khi mạch máu bị tổn thương, đông máu được khởi động đồng thời bởi cả 2
con đường:
 Con đường đông máu ngoại sinh diễn ra rất nhanh, bắt đầu bằng sự giải
phóng tromboplastin của mô (yếu tố III) từ mạch máu hoặc mô bị tổn
thương. Yếu tố III sẽ kết hợp và hoạt hóa yếu tố VII. Phức hợp yếu tố IIIa –
VIIa và ion Ca
++
sẽ hoạt hóa yếu tố X. Sự kết hợp của yếu tố Xa với
9

phospholipid tiểu cầu, ion Ca
++
và yếu tố Va tạo thành phức hợp
prothrombinase (hình 1.4).

Hình 1.4. Sơ đồ đông máu [3]
 Con đường nội sinh: được hoạt hóa khi bản thân máu bị tổn thương hoặc tiếp
xúc với bề mặt lạ (ví dụ như thành ống nghiệm). Yếu tố đông máu đầu tiên
được hoạt hóa là yếu tố XII (yếu tố tiếp xúc). Sau đó, các yếu tố XI, IX sẽ
được hoạt hóa theo kiểu dây chuyền. Sự hoạt hóa yếu tố X trong cơ chế nội
sinh cần sự có mặt của phospholipid được giải phóng từ tiểu cầu, ion Ca
++
và
yếu tố VIII. Sau khi hình thành yếu tố X hoạt hóa, sự tạo thành phức hợp
prothrombinase xảy ra tương tự như cơ chế ngoại sinh.
Cả hai con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh đều tạo thành
prothrombinase. Đây là enzym xúc tác cho sự chuyển prothrombin thành thrombin,
10

qua đó hình thành nên mạng fibrin làm máu đông lại. Giai đoạn tạo prothrombinase
cũng là giai đoạn phức tạp nhất trong quá trình đông máu.
 Giai đoạn 2: giai đoạn chuyển prothrombin thành thrombin
Phức hợp enzym prothrombinase được tạo thành ở giai đoạn 1 xúc tác cho
phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin. Thrombin (yếu tố IIa) xúc tác cho
phản ứng chuyển fibrinogen thành fibrin, vì vậy nó đóng vai trò đối với sự hình
thành và ổn định mạng fibrin. Ngoài ra, nó còn đóng vai trò xúc tác cho sự hoạt hóa
của yếu tố XIII, V, VII, XI để mở rộng hoạt động đông máu. Mặt khác, thrombin
cũng có tác dụng giới hạn sự lan rộng của quá trình đông máu bằng việc hạn chế
hoạt động của chính nó thông qua hoạt hóa protein C. Do vậy, với một lượng nhỏ
thrombin có sẵn trong máu và sau đó được sinh ra nhanh chóng theo con đường
ngoại sinh sẽ lập tức tạo ra một feedback dương tính để tạo nhiều thrombin hơn,
hoạt hóa quá trình hình thành cục máu đông.
 Giai đoạn 3: giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin

Dưới tác dụng của thrombin các phân tử fibrinogen bình thường hòa tan sẽ
chuyển thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân sẽ trùng hợp để tạo ra sợi fibrin,
dưới tác dụng của yếu tố ổn định fibrin – yếu tố XIII
h
, liên kết giữa các sợi fibrin
bền hơn, mạng fibrin trở nên bền vững.
Sau khi tạo được mạng fibrin giam giữ tiểu cầu và các thành phần khác của
máu, quá trình đông máu càng được mở rộng hơn nữa bởi yếu tố 3 tiểu cầu (do tiểu
cầu biến dạng giải phóng ra từ giai đoạn tạo nút tiểu cầu), làm dính và ngưng tập
tiểu cầu nhiều hơn nữa. Khi dính và ngưng tập tiểu cầu nhiều hơn thì phóng thích
lại càng mạnh mẽ. Vòng xoắn này mỗi lúc một mở rộng. Tiểu cầu theo dòng máu sẽ
nhanh chóng bị thu hút vào vòng xoắn đó, càng về sau càng dính nhiều hơn bởi lẽ
chính sự dính và thay đổi hình dạng của nó làm cho hiện tượng dính tăng lên nữa.
Các yếu tố tham gia vào quá trình đông máu hầu hết được tổng hợp ở gan và
giải phóng vào huyết tương dưới dạng tiền chất không hoạt động, chỉ khi nào được
hoạt hóa thì chúng mới tham gia vào quá trình đông máu. Các yếu tố đông máu
dạng tiền chất được tóm tắt trong bảng:
11

Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu [3]
Danh pháp quốc
tế
Tên thông thường
Nơi khu trú
Nơi sản xuất
Yếu tố I
Fibrinogen
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố II

Prothrombin
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố III
Tromboplastin của mô
Mô
Mô
Yếu tố IV
Ion calci
Huyết tương

Yếu tố V
Proaccelerin
Yếu tố không bền
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố VII
Proconvertin
Yếu tố bền vững
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố VIII
Yếu tố chống hemophilia A
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố IX
Yếu tố Chrismast
Yếu tố chống hemophilia B
Huyết tương
Tế bào gan

Yếu tố X
Yếu tố Stuart
Yếu tố Stuart – Prower
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố XI
Tiền tromboplastin huyết
tương
Yếu tố chống hemophilia C
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố XII
Yếu tố Hageman
Yếu tố tiếp xúc
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố XIII
Yếu tố ổn định Fibrin
Huyết tương
Tế bào gan
Yếu tố tiểu
cầu
Yếu tố III của tiểu cầu
Tiểu cầu
Tế bào gan
Trong đó, các yếu tố cần lưu ý là: [3], [10]
 Nhóm các yếu tố phụ thuộc vitamin K
Gồm các yếu tố II, VII, IX, X. Đặc điểm chung là đều cần sự có mặt của
vitamin K để chuyển thành dạng hoạt động (phân cắt một hoặc hai dây nối peptid).
12

Các yếu tố trong nhóm này được lưu trữ ổn định trong huyết tương và không bị tiêu
thụ trong quá trình đông máu (trừ yếu tố II). Khi cơ thể thiếu vitamin K thì gan chỉ
tổng hợp ra tiền chất của các yếu tố trên, các tiền chất có hoạt tính sinh học đông
máu rất thấp và đôi khi còn có hoạt tính ức chế đông máu. Khi thiếu các yếu tố này,
bệnh nhân dễ bị xuất huyết, các xét nghiệm theo xu hướng giảm đông: PT kéo dài,
định lượng nồng độ các yếu tố trong huyết tương giảm.
 Anti-thrombin III (AT III): bất hoạt hầu hết các yếu tố đông máu theo con
đường nội sinh (XIIa, XIa, IXa, Xa, thrombin) và cả plasmin. Cơ chế bất hoạt là AT
III tạo ra một phức hợp bền vững, không hồi phục với các yếu tố đông máu hoạt
hóa, thông qua các vị trí gắn của nó trên bề mặt các yếu tố đông máu này. Các yếu
tố sau khi bị bất hoạt sẽ bị loại ra khỏi tuần hoàn. Tác dụng của heparin diễn ra
chậm, tuy nhiên, khi có mặt heparin, tác dụng của AT III tăng lên 1000 lần. AT III
giữ một vai trò sinh lý rất quan trọng, khi bị thiếu sẽ gia tăng nguy cơ tắc mạch do
huyết khối.
 Yếu tố VIII: là một protein đông máu lưu hành trong máu, sau khi tổng hợp
ra một thời gian ngắn (8-12 phút), chúng sẽ gắn với yếu tố von Willebrand nhờ đó
mà đảm bảo được tính ổn định của yếu tố này. Thiếu hụt yếu tố VIII gặp nhiều nhất
trong bệnh hemophilia A, gây chảy máu tự phát ở các bệnh nhân mắc bệnh nặng
(nồng độ yếu tố VIII dưới mức < 5% mức bình thường). Yếu tố VIII bị giảm trong
huyết tương của bệnh nhân hemophilia A và bệnh von-Willebrand.
Khi thiếu hụt một hoặc nhiều yếu tố đông máu sẽ làm bất thường các xét
nghiệm đông máu và gây chảy máu kéo dài. Thiếu hụt một yếu tố đông máu gặp
trong các bệnh Hemophila A (thiếu hụt yếu tố VIII do đột biến gen), Hemophilia B
(thiếu hụt yếu tố IX, bệnh Christmas), hoặc một số bệnh di truyền khác. Thiếu hụt
nhiều yếu tố đông máu gặp ở các bệnh nhân sử dụng heparin, thiếu vitamin K (do
không hấp thu hoặc do dùng thuốc kháng vitamin K), hoặc bệnh lý ở gan. Các bệnh
lý này làm các yếu tố đông máu giảm tổng hợp hoặc tổng hợp bình thường nhưng
không hoạt hóa được, do đó, không tham gia vào quá trình đông máu một cách đầy
đủ, mạng fibrin không hoàn toàn phủ kín vết thương để cầm máu [1], [6], [15].

13

Các xét nghiệm ở giai đoạn này, ngoài thời gian chảy máu kéo dài, còn có ba
xét nghiệm đặc trưng cho từng con đường đông máu là: [2], [10]
 Thời gian prothrombin (PT): xét nghiệm dùng đánh giá con đường đông máu
ngoại sinh (thăm dò các yếu tố I, II, III, V, VII, X). Do đó, dùng kháng
vitamin K, bệnh Hemophilia làm thời gian prothrombin kéo dài.
 Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (aPTT): xét nghiệm đánh giá
thời gian đông máu nội sinh (các yếu tố I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII). aPTT
kéo dài trong trường hợp sử dụng chống đông heparin.
 Thời gian thrombin (TT): xét nghiệm thăm dò giai đoạn sau cùng của quá
trình đông máu, giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin, TT kéo dài khi sử
dụng heparin hoặc khi có tình trạng tăng fibrinogen máu. Trong các bệnh lý
về gan thì cả ba chỉ số PT, aPTT, TT đều kéo dài.
1.4. Giai đoạn co cục máu đông
Sau khi máu đông khoảng từ 1- 2 giờ, cục máu đông co lại và giải phóng ra
toàn bộ dịch của nó. Hiện tượng co cục máu đông có tác dụng làm mép vết thương
khép lại gần nhau hơn để tạo điều kiện cho sự hóa sẹo. Người ta cho rằng, tác dụng
co này là của thrombostenin, một protein được giải phóng ra từ tiểu cầu, tác dụng co
của thrombostenin tương tự như actomysin của cơ.
Khi số lượng hoặc chất lượng tiểu cầu giảm sẽ làm cho thời gian co cục máu
kéo dài hơn và cục máu đông co không hoàn toàn. Sự co cục máu đông được hoạt
hóa bởi thrombin và ion Ca
++
. Do vậy, thiếu ion Ca
++
cũng làm cục máu đông co
không hoàn toàn.
1.5. Giai đoạn tan cục máu đông
Là hiện tượng cục máu đông tan ra dưới tác dụng của plasmin. Plasmin là

một enzym được hoạt hóa từ plasminogen, có khả năng phân hủy fibrin mạnh,
chuyển fibrin không hòa tan thành các sản phẩm thoái hóa có trọng lượng phân tử
thấp hơn và hòa tan trong huyết tương, do đó, làm tan cục máu đông [10]. Bình
thường plasmin không có trong máu lưu thông, khi fibrin của cục máu đông xuất
hiện, ngay lập tức xảy ra hiện tượng kích hoạt plasminogen. Tan cục máu đông là
14

một trong những cơ chế chống đông của chính cơ thể khi có xuất hiện cục máu
đông để ngăn ngừa tắc mạch và tạo điều kiện cho quá trình liền sẹo, tuy nhiên, khi
quá trình hình thành plasmin không được kiểm soát kỹ càng sẽ gây ra rối loạn tiêu
sợi huyết. Nguyên nhân có thể do thiếu hụt chất ức chế hoạt hóa plasminogen, thiếu
hụt yếu tố XIII. Các rối loạn này là tăng hủy fibrin nên làm tan cục máu đông nhanh
chóng, gây chảy máu trên lâm sàng và xét nghiệm cho thấy thời gian tan cục máu
đông kéo dài [1], [6], [15].

15

CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ QUÁ TRÌNH TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguồn dữ liệu
Tiến hành tìm kiếm trong cơ sở dữ liệu Pubmed (bao gồm tất cả tài liệu có từ
trước đến nay, không giới hạn thời gian) để thu thập các nghiên cứu phù hợp.
Thời gian tìm kiếm: từ 1/12/2013 – 15/4/2014
2.2. Chiến lƣợc tìm kiếm
2.2.1. Dự kiến thực hiện tổng quan hệ thống
Sử dụng từ khóa ban đầu “hemostatic model”, thông qua đề mục y khoa
MeSH, chúng tôi thu được danh mục các từ đồng nghĩa: “hemostatic assay”,
“antihemorrhagic model”, “antihemorrhagic assay” và bổ sung các dạng số nhiều
của nó là “hemostatic models”, “hemostatic assays”, “antihemorrhagic models”,
“antihemorrhagic assays”.
Các cụm chứa được đặt trong ngoặc kép và tất cả các cụm từ trên được kết
hợp bởi toán từ OR để tạo thành cú pháp cuối cùng, gõ vào ô tìm kiếm của Pubmed.
Chúng tôi sử dụng chức năng giới hạn duy nhất là “Other animals” (nghiên
cứu trên động vật) để thu được các mô hình trên động vật thực nghiệm có liên quan.
Sau khi thực hiện lệnh tìm kiếm thì số kết quả thu được là 23806 kết quả
(trước 12/2013). Với số lượng kết quả này thì việc tiến hành một tổng quan hệ
thống trong phạm vi khả năng của chúng tôi là không thể.
2.2.2. Định hướng lại quá trình tìm kiếm
Do việc thực hiện một tổng quan hệ thống là không thực hiện được, do đó,
chúng tôi ra soát lại các thông tin về quá trình cầm máu, bệnh lý các quá trình này

cũng như các thông tin từ sách dược lý thực nghiệm cơ bản – “Drugs discovery and
evaluation: pharmacology assay”. Theo đó, quá trình tìm kiếm chia làm 2 phần như
sau:
 Phần một: tiến hành tìm kiếm và tổng hợp các mô hình gây chảy máu bằng tổn
thương.
 Phần hai: tiến hành tìm kiếm và tổng hợp các mô hình gây chảy máu bằng cách
gây các rối loạn cầm máu.
16

2.3. Quy trình tìm kiếm và lựa chọn nghiên cứu
2.3.1. Tìm kiếm và tổng hợp các mô hình gây chảy máu bằng tổn thương
Sử dụng từ khóa “bleeding model” và dạng số nhiều “bleeding models” trên ô
tìm kiếm của thư viện y khoa Pubmed, sử dụng từ nối là toán tử OR, với chức năng
giới hạn duy nhất là “other animals”. Sau khi thực hiện lệnh tìm kiếm thì số kết quả
thu được là 99 kết quả.
 Lựa chọn các nghiên cứu: đọc kỹ tiêu đề và tóm tắt ( abstract) của tất cả các
nghiên cứu. Tất cả những bài báo này đều được đọc bản đầy đủ dựa trên khả năng
cho phép của nguồn thông tin mà nhóm nghiên cứu có thể lấy được. Các kết quả
được trích xuất một cách ngắn gọn vào bảng để thuận tiện cho việc gộp các bài báo
giống nhau.
 Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ
 Tiêu chuẩn lựa chọn: để được lựa chọn, các nghiên cứu phải thỏa mãn những
tiêu chuẩn sau:
+ Loại hình nghiên cứu: invivo
+ Thời gian xuất bản: lần tìm kiếm thứ nhất trước 12/2013 và lần tìm kiếm thứ
2 trước 15/4/2014.
+ Động vật nghiên cứu: chuột nhắt (mouse, mice), chuột cống (rat), thỏ
(rabbit), chó (dog).
 Tiêu chuẩn loại trừ
Tất cả những nghiên cứu in vitro, các nghiên cứu trên các động vật khác,

hoặc những nghiên cứu không trình bày phương pháp cụ thể để tiến hành gây mô
hình đều bị loại bỏ.
 Tìm kiếm bổ sung:
Bổ sung các tài liệu tham khảo của một số bài báo đã chọn, nhằm tìm kiếm
cách gây mô hình cụ thể, các kỹ thuật được đề cập về tên mà chưa có trong các bài
báo đã chọn. Bổ sung một số tài liệu để đánh giá, bàn luận về các mô hình trên.
 Các mô hình tìm kiếm được:
17

Qua quá trình sàng lọc thông tin ban đầu, chúng tôi nhận thấy: các mô hình
gây tổn thương mà chúng tôi tìm kiếm được có các thông số đánh giá là tương tự
nhau (đo thời gian máu chảy và lượng máu mất, cùng một số thông số khác đặc
trưng cho mỗi mô hình). Do đó, chúng tôi chia 21 mô hình tìm kiếm được vào 5
mô hình lớn như sau:
Bảng 2.1. Các mô hình trong nhóm mô hình gây chảy máu bằng tổn thương
1
Mô hình cắt đuôi hoặc
chi:
+ Gây chảy máu bằng cắt đuôi chuột
+ Gây chảy máu bằng cắt đuôi chó
+ Gây chảy máu bằng cắt đuôi chó
2
Mô hình gây tổ thương
da và niêm mạc
+ Gây tổn thương niêm mạc mũi thỏ
+ Gây tổn thương niêm mạc lưỡi chó
+ Gây tổn thương trên tai thỏ
+ Gây tổn thương da chuột
+ Gây tổn thương mô mềm
3

Mô hình gây tổn thương
các tạng
+ Gây tổn thương gan trên chuột
+ Gây tổn thương gan trên thỏ
+ Gây tổn thương lách
+ Gây tổn thương thận
4
Mô hình gây chấn
thương não
+ Gây tổn thương não thỏ
+ Gây chấn thương não chuột
+ Gây xuất huyết nội sọ (ICH) bằng
collagenase
5
Mô hình gây tổn thương
các mạch máu
+ Gây tổn thương tĩnh mạch chủ dưới ở
thỏ
+ Gây tổn thương tĩnh mạch cảnh thỏ
+ Gây tổn thương tĩnh mạch đùi chuột
+ Gây tổn thương động mạch chủ bụng
chuột