Tổng quan về phương pháp đánh giá tác dụng của các chất ma túy dựa vào kỹ thuật thẩm tách micro

B Y T
TRNG I HC DC HÀ NI




PHM THU HÀ

TNG QUAN V PHNG PHÁP
ÁNH GIÁ TÁC DNG CA CÁC
CHT MA TUÝ DA VÀO K THUT
THM TÁCH MICRO
KHÓA LUN TT NGHIP DC S




HÀ NI – 2013

B Y T
TRNG I HC DC HÀ NI



PHM THU HÀ


TNG QUAN V PHNG PHÁP
ÁNH GIÁ TÁC DNG CA CÁC
CHT MA TUÝ DA VÀO K THUT
THM TÁCH MICRO

KHÓA LUN TT NGHIP DC S

Ngi hng dn:
1. PGS.TS. Thái Nguyn Hùng Thu
2. TS. Nguyn Thành Hi
Ni thc hin
1. B môn Hoá phân tích và c cht –
Trng i hc Dc Hà Ni
2. B môn Dc lâm sàng – Trng i
hc Dc Hà Ni.


HÀ NI - 2013


LI CM N
Vi lòng bit n sâu sc, tôi xin gi li cm n chân thành nht n:
PGS. TS. Thái Nguyn Hùng Thu
TS. Nguyn Thành Hi
là nhng ngi thy ã trc tip hng dn và ch bo tn tình  tôi hoàn thành
khoá lun này.
ng thi, hai thy cng ã dn dt và chia s cho tôi nhng kinh nghim vô cùng
quý báu  hoàn thành các bài báo "Nghiên cu hiu qu tác dng ca morphin trên nng
 dopamin và serotonin da vào k thm tách micro" và “Nghiên cu mô hình ánh giá
hiu qu tác dng ca các cht ma túy thông qua nng  dopamin da vào k thut thm
tách micro”.
Tôi cng xin chân thành cm n nhng góp ý, chnh sa quý báu ca TS. Phm
Hng Lân, Vin K thut Hoá sinh và Tài liu nghip v - B Công An,  hoàn chnh
nghiên cu này có th ng dng vào thc t ti Vit Nam.
Tôi xin cm n b môn Hoá phân tích và c cht và b môn Dc lâm sàng ã to

iu kin cung cp cho tôi các tài liu cn thit  hoàn thành khoá lun này.
Tôi xin cm n Ban giám hiu, các phòng ban, các thy cô giáo và cán b nhân viên
trng i hc Dc Hà Ni – nhng ngi ã dy bo và trang b cho tôi nhng kin
thc khoa hc nn tng sut 5 nm hc di mái trng này.
Cui cùng, tôi xin gi nhng li thân thng nht n gia ình, bn bè, tp th lp
A2K63 ã luôn  bên ng viên, giúp  tôi vt qua mi khó khn trong quá trình hc
tp và hoàn thin khoá lun.
Hà ni, ngày 21 tháng 5 nm 2013
Sinh viên



Phm Thu Hà


MC LC
Danh mc các kí hiu vit tt
Danh mc các bng
Danh mc các hình và biu 
T VN  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

PHN 1. TNG QUAN V K THUT THM TÁCH MICRO VÀ NG DNG . 3
1.1. TÓM TT V LCH S PHÁT TRIN VÀ NG DNG CA K THUT THM
TÁCH MICRO 3
1.2. KHÁI QUÁT V K THUT THM TÁCH MICRO 5
1.3. NGUYÊN LÝ VÀ CU TO CA K THUT THM TÁCH MICRO 6
1.3.1. Nguyên lý 6
1.3.2. Kim thm dò 7
1.3.3. Dch truyn 9
1.3.4. Phng pháp nh lng các phân t thuc 10

1.3.4.1. Sc ký lng hiu nng cao (HPLC) 10
1.3.4.2. Sc ký lng khi ph (LC-MS) 12
1.3.5. Hiu sut kim thm dò 18
1.3.5.1. Hiu sut tng i in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 
1.3.5.2. Hiu sut thc nghim in vivo 20
1.4. U NHC IM CA K THUT THM TÁCH MICRO 25
1.4.1. u im 25
1.4.2. Nhc im và mt s bin pháp khc phc 27
1.5. QUY TRÌNH NGHIÊN CU CHUNG KHI S DNG K THUT THM TÁCH
MICRO TRONG NGHIÊN CU Y DC 28
PHN 2: TNG QUAN V MA TUÝ, DOPAMIN VÀ MI LIÊN H GIA
DOPAMIN VI CÁC CHT MA TUÝ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9

2.1. TNG QUAN V CÁC CHT MA TUÝ 29
2.1.1. nh ngha “ma tuý” 29
2.1.2. Phân loi các cht ma tuý 30


2.2. DOPAMIN 31

2.2.1. nh ngha 31
2.2.2. Các con ng dn truyn dopamin trong não 31
2.2.3. Vai trò ca dopamin 33
2.3. MI LIÊN H GIA DOPAMIN VÀ S DNG CÁC CHT MA TUÝ 34
PHN 3: TNG QUAN PHNG PHÁP ÁNH GIÁ HIU QU TÁC DNG
CA CÁC CHT MA TUÝ THÔNG QUA NH LNG DOPAMIN TRONG
NÃO NG VT DA VÀO K THUT THM TÁCH MICRO 38

3.1. NGUYÊN VT LIU S DNG 38
3.1.1. ng vt thí nghim 38

3.1.2. Các thuc c s dng trong thí nghim 38
3.1.3. Ta  cy kim thm dò vào các vùng não ly DA 40
3.1.4. Chun b kim thm dò 41
3.1.5. Chun b các thit b m và nh lng 42
3.2. CÁC BC TIN HÀNH 43
3.2.1. Phu thut cy kim thm dò vào não chut 43
3.2.2. Tin hành ly mu thu c có cha DA 44
3.2.3. Ct b phn não  xác nh chính xác v trí cy kim thm dò 45
3.2.4. nh lng bng HPLC hoc LC-MS/MS và tính toán kt qu thng kê. 46
3.2.5. Báo cáo kt qu thu c 49
3.3. TNG HP KT QU T CÁC NGHIÊN CU Ã CÔNG B V ÁNH GIÁ HIU
QU TÁC DNG CHT MA TUÝ TRÊN NÃO CHUT DA VÀO K THUT THM
TÁCH MICRO 50
KT LUN VÀ  XUT 53
1. KT LUN 53
2.  XUT 54
TÀI LIU THAM KHO 55
PH LC: Các bài báo khoa hc ã c công b ca  tài 67


DANH MC CÁC KÍ HIU VIT TT
aCSF Dung dch gi não tu (artificial cerebrospinal fluid)
AMP Amphetamin
C Nng  (concentration)
CID Va chm phân ly (collision-induced disociation)
CNS H thng thn kinh trung ng (central nervous system)
CSF Dung dch não tu (cerebrospinal fluid)
DA Dopamin
Da Dalton
DC Dòng in mt chiu (direct current)

DRE Chng trình nhn bit ma tuý (drug recognition expert)
ECF Dch ngoi bào (extracellular fluid)
EF T l chit xut (extraction fraction)
ESI Ion hoá bng tia in (electrospray ionisation)
HPLC Sc ký lng hiu nng cao
kDa Kilo Dalton
LC Sc ký lng (liquid chromatography)
LC-MS Sc ký lng khi ph
LC-MS/MS Sc k lng khi ph ghép
LSD Acid lysergic
MDMA 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamin
MS Khi ph (mass spectrometry)
MRM Ch  a nhim (multiple reaction monitoring)
NAc Nhân accumben (nucleus accumbens)
NNF No-net flux
PCP Phencyclidine
PET Positron emission tomography
QQQ T cc chp ba gm 3 t cc (quadrupole)
RF Tn s (radio frequency)
RR Hiu sut tng i (relative recovery)
sNPC Substantia nigra par compacta
THC Tetrahydrocannabinol
TLTK Tài liu tham kho
VTA Ventral tegmental area
ZNF Zero-net-flux


DANH MC CÁC BNG
Bng 1.1. Thành phn nng  các dch truyn c s dng trong k thut thm tách
micro 10

Bng 1.2. So sánh nh hng ca mt s yu t thc nghim n hiu sut in vitro và in
vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Bng 2.1. Mc  tng DA trong vùng não trên chut nht thc nghim khi nghiên cu
trên các loi tác ng kích thích 33

Bng 2.2. So sánh v kh nng gii phóng DA  2 nhóm i tng: liu n – i tng
không nghin, liu kéo dài – i tng nghin 37

Bng 3.1. c im ca chut thc nghim dùng trong nghiên cu thm tách micro 38
Bng 3.2. Mt s cht ma tuý ã c s dng trong các nghiên cu thm tách micro 39
Bng 3.3. Thành phn dch gi não tu 39
Bng 3.4. Ta  cy kim thm dò ti mt s vùng trong não 40
Bng 3.5. Cài t detector khi ph áp dng cho nh lng DA 47
Bng 3.6. Thành phn pha ng 48
Bng 3.7. Tng hp các kt qu v % tng DA trong não chut cng và chut nht ti mt
s vùng trong não (nhân accumben, th vân, caudate) khi s dng morphin, amphetamin
và cocain 51



DANH MC CÁC HÌNH VÀ BIU 
Hình 1.1. Kt qu tìm kim trên medline vi t khoá “microdialysis” và “microdialysis
dopamine” 4

Hình 1.2. Các mô ích tác dng ca thuc trên ngi ã c thc hin nghiên cu lâm
sàng bi k thut thm tách micro 4

Hình 1.3. Khái quát v k thut thm tách micro 5
Hình 1.4. S khuch tán th ng ca các phân t có trng lng thp khi i qua các l

ca màng bán thm ti mô ích tác dng 6

Hình 1.5. Cu to ca kim thm dò dng ng tâm 7
Hình 1.6. Quá trình cy kim thm dò vào mô s dng kim dn 9
Hình 1.7. S  ly mu bng k thut thm tách micro online 12
Hình 1.8. Nguyên tc và cu to ca máy MS 13
Hình 1.9. C ch to ion ca ESI gm 3 giai on chính 15
Hình 1.10. Cu to b phân tích t cc 16
Hình 1.11. Cu to b t cc chp ba 16

Hình 1.12. Cu to ca b phân tích by ion 17
Hình 1.13. Mô hình th nghim ánh giá hiu sut kim thm dò in vitro 18
Hình 1.14. Phng pháp tính toán NNF 21
Hình 1.15. Phng pháp ngoi suy tc  dòng chy 23
Hình 1.16. ng vt thc nghim có th di chuyn và sinh hot bình thng trong quá
trình ly mu 25

Hình 1.17. Kim thm dò c cy vào mô c (trái) và mô não (phi) 26
Hình 1.18. B thu tín hiu thm tách micro online bên ging bnh 27
Hình 2.1. Các con ng dn truyn và c ch gii phóng DA trong não 32
Hình 2.2. Các con ng dn truyn “phn thng” trong não khi s dng mt s cht
in hình nh: opioids, ethanol, barbiturat, AMP, cocain, cannabioids, PCP cho thy dn
truyn DA tp trung ch yu v vùng nhân accumben 34



Hình 2.3. C ch làm tng gii phóng DA trong não ca amphetamin 35

Hình 2.4. C ch kích thích gii phóng DA ca opiat 36
Hình 2.5. C ch tng gii phóng DA ca cocain 36

Hình 2.6. So sánh v mt  th th DA  ngi bình thng và ngi nghin 37
Hình 3.1. Hp s ca chut nhìn t trên xung 40
Hình 3.2. Kim thm dò và kim dn 41
Hình 3.3. Máy c nh 3 chiu dùng  phu thut 42
Hình 3.4. Máy ct lát mô não 42
Hình 3.5. H thng sc ký LC-MS vi detector t cc chp ba (trái) và HPLC (phi) 42
Hình 3.6. Phu thut cy kim thm dò lên não chut 43
Hình 3.7. Chut c chm sóc sau phu thut 44
Hình 3.8. Biu  vt kim thm dò  nhân accumben 45

Hình 3.9. Mô hình thm tách micro offline trong thí nghim 46
Hình 3.10. Hiu qu ca morphin trên nng  DA ti vùng nhân accumben  chut nht
thc nghim 50




-1-
T VN 
Ma tuý t lâu ã tr thành vn  nhc nhi ca xã hi và phòng chng t nn ma
tuý luôn là mt trong nhng nhim v hàng u ca mi quc gia. Theo báo cáo nm
2012 ca Liên Hp Quc, trên th gii c tính có t 153 n 300 triu ngi s dng ma
túy trái phép ít nht mt ln trong mt nm, trong ó có t 15,5 n 38,6 triu ngi
nghin, và con s này có chiu hng gia tng theo tng nm
[97]
.  Vit Nam, theo thng
kê t B Lao ng - Thng binh và Xã hi nm 2011 cho n nay c 63 tnh, thành ph
u có ngi nghin ma túy, c nc có khong 149.900 ngi nghin có h s qun lý
[1]
.

Hn na, vi din bin phc tp ca ti phm ma tuý, các loi ma tuý tng hp mi c
ra i vi cu trúc và thành phn a dng, khin cho vic phát hin và qun lý ma tuý tr
nên càng khó khn hn. Các loi phn ng test nhanh (screening test) nc tiu, máu hay
dch sinh hc khác trên th trng tuy ph bin và tin dng, nhng có nhiu hn ch nh
là ch phát hin c 5 nhóm ma tuý ph bin vi  nhy thp, rt d b cho kt qu
nhm ln nh khi pha loãng hay tráo mu, d xy ra phn ng chéo gây kt qu dng
tính gi
[81]
, do ó không th áp ng  trong công cuc phòng chng t nn ma tuý và
m bo giá tr pháp lý cho các c quan thc thi pháp lut.
K thut thm tách micro (Microdialysis - MD) là mt k thut vi nguyên tc n
gin, ã c áp dng mt cách hiu qu trên th gii trong các nghiên cu tin lâm sàng
và lâm sàng v ánh giá hiu qu tác dng ca các cht ma tuý. Thông qua vic o nng
 ca mt cht trung gian trong não là dopamin (cht to nim vui) ti các vùng não gii
phóng dopamin, hoàn toàn có th ánh giá c mt cht có phi là ma tuý hay không mà
không cn xác nh cu trúc hoá hc c th ca cht ó. Hn th na, thm tách micro
da trên nguyên tc khuch tán th ng ca cht cn phân tích qua màng bán thm  u
kim thm dò (trung tâm ca k thut), cho phép thu c mu sch, không ln protein hay
các enzym ti dch k mô, do ó khâu làm sch mu có th c b qua. ng dng vt
tri ca k thut thm tách micro chính là mô hình thm tách micro online xác nh trc
tip các bin i nng  ca cht cn phân tích ti mô ích khi i tng nghiên cu vn
có th di chuyn và hot ng bình thng, cho kt qu khách quan vi  tin cy rt cao.


-2-
Vi nhng trin vng ca k thut thm tách micro và  xây dng mt mô hình
chun cho phng pháp ánh giá hiu qu tác dng ca các cht ma túy, chúng tôi tin
hành thc hin  tài “Tng quan v phng pháp ánh giá tác dng ca các cht ma
tuý da vào k thut thm tách micro” vi các mc tiêu:
1. Tng quan v k thut thm tách micro và ng dng.

2. Tng quan v ma tuý, dopamin và mi liên h gia dopamin vi vic s dng
các cht ma tuý.
3. Tng quan v phng pháp ánh giá hiu qu tác dng ca các cht ma tuý
thông qua vic xác nh nng  dopamin trong não da vào k thut thm tách
micro.




-3-
1. PHN 1. TNG QUAN V K THUT THM TÁCH MICRO
VÀ NG DNG
1.1. TÓM TT V LCH S PHÁT TRIN VÀ NG DNG CA K THUT
THM TÁCH MICRO
K thut thm tách micro (Microdialysis - MD) c bit n t u thp niên 60
nh vào các nghiên cu khi t trc tip các túi thm tách có mt u truyn dch vào và
mt u truyn dch ra vào mô ng vt thc nghim, ch yu ti não chut, nhm mc
ích nghiên cu chc nng sinh hoá t bào thn kinh trên ng vt sng
[26, 95]
. n nm
1974, nh s h tr ca các phng pháp nh lng mi vi  nhy cao, Ungerstedt và
cng s ã ci tin li k thut di dng kim thm dò có u là mt màng bán thm
[64]

và a ra công trình nghiên cu u tiên v nh lng nng  dopamin trong v não
chut thc nghim
[96]
.
Ban u, k thut thm tách micro ch yu c s dng  nghiên cu sinh hoá t
bào thn kinh trong não chut hot ng bình thng, nhng sau ó, thm tách micro ã

nhanh chóng c s dng trong các nghiên cu dc ng hc tin lâm sàng và lâm
sàng ca các phân t thuc nh hng n quá trình thay i sinh lý t bào thn kinh.
Khi u vào nm 1987, thm tách micro c áp dng nghiên cu nh lng phân t
glucose trong dch k t bào ca ngi tình nguyn, tuy nhiên ban u ng dng ca thm
tách micro ch c gii hn trên các mô m
[18, 57]
. Sau ó, rt nhiu nghiên cu khoa
hc ã c thc hin da trên k thut thm tách micro trên các b phn não, tim, phi
và mô ung th  ngi
[26, 44, 64]
.
u nhng nm 90, thm tách micro bt u thc hin trên ngi
[95]
và nó ã tr
thành công c phân tích sinh hc ph bin trong các nghiên cu theo dõi ánh giá lâm
sàng v não
[11]
. T ó n nay k thut thm tách micro càng c ci tin và có nhiu
ng dng quan trng trong khoa hc Y Dc trên th gii, c bit trong nghiên cu
thuc. Ch cn s dng t khoá "Microdialysis" trên các công c tra cu medline có th
cho hn 14700 kt qu, trong ó có gn 4600 kt qu liên quan n dopamin. Con s này


-4-
cho thy vic ng dng k thut thm tách micro càng ngày càng phát trin trong nhng
nm gn ây.

Hình 1.1. Kt qu tìm kim trên medline vi t khoá “microdialysis” và “microdialysis
dopamine”
Các nghiên cu mô hc, t rt sm, ã cho thy tính u vit v giá tr lâm sàng so

vi các d liu ly c t máu. C th hn, dch k mô là ni gn nht vi v trí phn
ng ca thuc (mô ích), do ó kt qu o c s phn ánh c chính xác mi quan h
dc lc hc - dc ng hc ca thuc
[80]
. Thm tách micro là k thut duy nht cho
phép xác nh c các d liu này
[26, 48]
. Hn na, thm tách micro còn là công c tt
nht  ánh giá sinh kh dng (bioavaiablitily) và tng ng sinh hc
(bioequivalence) ca thuc ti mô ích
[80]
. n nay, hu ht các mô trong c th con
ngi u ã c nghiên cu dc ng hc áp dng bng k thut thm tách micro và
cho kt qu rt kh quan, trong ó các mô ích c nghiên cu nhiu nht là: mô não,
mô vú, mô di da, mô phi, mô gan (Hình 1.2).

Hình 1.2. Các mô ích tác dng ca
thuc trên ngi ã c thc hin
nghiên cu lâm sàng bi k thut thm
tách micro
[66]



-5-
1.2. KHÁI QUÁT V K THUT THM TÁCH MICRO
Thm tách micro (Microdialysis) là k thut cho phép xác nh nng  các cht ni
sinh (endogen) và ngoi sinh (exogen) ti mô ích tác dng, da vào s khuch tán th
ng ca các phân t có trng lng thp qua mt màng bán thm
[7, 84]

.














Hình 1.3. Khái quát v k thut thm tách micro
Bm thm tách (syringe pump)
c thit k vi tc  truyn rt
nh t 0,1 n 20 µl/phút, có th
iu chnh  phù hp mc ích
cho mi thí nghim.
L cha mu (microvial)
dùng  cha dch thu c
sau khi thm tách, dch này
s c em i nh lng
bng HPLC, LC – MS.
ng vt có th
di chuyn t do
trong quá trình
thí nghim.

Kim thm dò (probe) là trung tâm ca thm
tách micro, là mt que kim thit k c bit
vi mt u truyn dch vào và mt u ly
dch ra,  u kim có mt màng bán thm.
Quá trình xy ra  màng bán
thm tuân theo s khuych tán
th ng ca các phân t theo
gradient nng .


-6-
1.3. NGUYÊN LÝ VÀ CU TO CA K THUT THM TÁCH MICRO
1.3.1. Nguyên lý
Thm tách micro là k thut cho phép xác nh nng  các cht ni sinh (các cht
dn truyn thn kinh nh dopamin, serotonin, noradrenalin … hay phân t glucose,
glutamat, lactat…) và các cht ngoi sinh (phân t thuc) ti mô ích tác dng, da vào
s khuch tán th ng theo gradient nng  ca các phân t có trng lng thp qua
mt màng bán thm  u kim thm dò c cy vào mô ích (Hình 1.4)
[7, 84, 106]
.
Thm tách micro có th áp dng  a các phân t thuc n tn các mô ích tác
dng
[71]
, c gi là thm tách ngc (retrodialysis). Nu ti mô iu tr, nng  thuc
bng 0 hoc thp hn nng  trong dch truyn vào, các phân t thuc s i qua màng
bán thm và vào mô ích tác dng
[13, 80]
.

Hình 1.4. S khuch tán th ng ca các phân t có trng lng thp khi i qua các l

ca màng bán thm ti mô ích tác dng
[64]

Não là c quan c áp dng nhiu nht và sm nht trong các nghiên cu lâm sàng
ca k thut thm tách micro. Ngày nay, hu ht các mô khác trên c th u ã c
nghiên cu áp dng k thut này. Tuy nhiên, vic thc hin trên não din ra phc tp hn,

-7-
do mô não d b tn thng, hàng rào máu não cng rt d b nh hng, và c bit là
dch não tu có thành phn khác vi dch ngoi bào  các mô thông thng
[26, 66, 67]
.
 thc hin các nghiên cu ng dng k thut thm tách micro, cn chun b: (1)
kim thm dò, (2) dch truyn, (3) phng pháp nh lng các phân t thuc và (4) xác
nh hiu sut in vitro và in vivo ca kim thm dò.

1.3.2. Kim thm dò
Kim thm dò là phn ct lõi ca k thut thm tách micro. Nó c mô phng nh
mt mch máu trong c th
[67, 95]
.
 thc hin nghiên cu thm tách micro trong não, kim thm dò dng ng tâm là
ph bin và an toàn nht
[71, 76]
(Hình 1.5), kim c làm t thép không g, thch anh hoc
polyethylen
[67]
. Thm tách micro trong não yêu cu phi cy cn thn kim thm dò vào
mt vùng c bit ca não, kim thm dò s óng vai trò nh mch máu nh vi ng
kính khong 200 µm

[13]
.
Cu to mt kim thm dò bao gm 3 b phn: (1) mt dây truyn dch vào, (2) màng
bán thm  u kim và (3) mt dây  ly dch ra (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cu to ca kim
thm dò dng ng tâm
[21]

(1) Dây truyn dch vào (inlet tube)
Dây c ni vi thit b bm thm tách, truyn vào c th dch truyn trung gian
hoc dch có cha thuc vi tc  xác nh
[25]
.


-8-
Thí nghim ti não yêu cu dch truyn vào phi có thành phn và áp sut thm thu
tng ng vi dch não tu, vi tc  t 0,1 – 20 µl/phút. Thành phn ca dch
truyn s c mô t chi tit  phn 1.3.3.
(2) Màng bán thm (semi-permeable membrane)
c im quan trng nht là kích thc ca l màng, vì màng bán thm s ch cho
phép các phân t có kích thc nh hn l màng i qua màng theo s chênh lch
gradient nng , vào dch truyn và c a ra ngoài
[25, 26, 64, 66, 80]
. Trng lng
phân t gii hn trong khong t 5 n 100 kDa
[3, 44, 71, 106]
(ph bin nht là loi
màng có gii hn trng lng phân t trong khong 10 – 30 kDa

[25]
), do ó có th
dùng k thut thm tách micro  ly mu nhiu cht khác nhau. S vn chuyn các
phân t qua màng da trên s chênh lch gradient nng .
Màng bán thm thng có ng kính ngoài t 220 – 380 µm, chiu dài ca màng
t 7-12 mm tu thuc vào v trí cy kim
[80]
. Vt liu ch to màng có  tng hp
sinh hc cao nh cellulose acetat, polycarbonat – ether, polyamid, polyacrylonitril,
polyether sulfonat
[3, 80]
. Chúng u có kh nng hút nc và không có tính chn lc
hóa hc. Chúng khác nhau v  dày ca màng, màng càng dày thì hiu sut ca
màng càng thp.
(3) Dây truyn dch ra ngoài (outlet tube)
Dây c ni vi thit b cha mu. Dch thu c s c chuyn vào các ng
nghim xoay t ng trong khay cha ng, sau ó cn c làm lnh  bo qun
(trong thm tách micro offline) hoc nh lng ngay (thm tách micro online).
Dch thu c rt giàu các cht cn phân tích  dng t do c thm tách t dch
ngoi bào i qua màng bán thm theo c ch khuch tán th ng ca các phân t
theo gradient nng  t mô ích có nng  cao vào dch truyn. Nng  thuc
trong dch thu c là mt phn t l ca nng  thuc trong dch ngoi bào
(extracellular fluid-ECF). Tc  dòng càng thp, hiu sut thm tách càng cao.


-9-
Vì kim thm dò khá mnh, d gãy nên 
cho vic cy kim vào mô c d dàng hn,
thng dùng mt kim dn (guide cannula) có cu
to phù hp vi tng loi kim thm dò  to

ng dn trc khi cy kim thm dò.
Quá trình cy kim thm dò vào mô c
mô t nh trong Hình 1.6. u tiên kim dn s
c cy vào ngay sát vùng mô cn nghiên cu,
sau ó kim thm dò c cy qua kim dn sao
cho ch có phn màng hot ng vt ra ngoài
chiu dài kim dn  vào mô ích
[104]
.
Vic cy kim thm dò trong iu kin
không vô khun có th làm cho phn ng ca mô
ti v trí cy trm trng hn và to iu kin cho
vi khun phát trin
[44]
. Ngoài ra,  gim cm
giác au và khó chu, có th s dng thuc gây tê
ti ch hay chm á lên vùng cy kim
[48]
.


Hình 1.6. Quá trình cy kim thm dò
vào mô s dng kim dn
1.3.3. Dch truyn
Dch truyn có vai trò vô cùng quan trng trong thm tách micro trong não. iu
thit yu ca dch truyn ó là phi vô khun, có áp sut thm thu phù hp vi máu và
cha các ion in gii tng ng vi dch não tu (CSF – cerebrospinal fluid)
[11, 71]
.
Nó cng cn có pH và nhit  tng t trong mô não

[11]
.
Các ion trong dch gi não tu có vai trò "m gim sc" cho s thay i thành phn
ion trong não
[27, 71]
. m bo úng t l ca các thành phn rt quan trng trong các thí
nghim ti não, vì nó nh hng trc tip n cân bng trong dch ngoi bào ca não.




-10-
Bng 1.1. Thành phn nng  các dch truyn c s dng trong
k thut thm tách micro
Loi dch Thành phn
Dch truyn tng
ng dch não tu
(perfusion fluid
CNS)
NaCl 147 mM
KCl 2,7 mM
CaCl
2
1,2 mM
MgCl
2
0,85 mM
pH ~6
(hãng sn xut CMA, Thu in)
Dch truyn cho mô

ngoi vi
(perfusion fluid T1)
NaCl 147 mM
KCl 4 mM
CaCl
2
2,3 mM
pH ~6
(hãng sn xut CMA, Thu in)

1.3.4. Phng pháp nh lng các phân t thuc
Vì lng mu thu c trong k thut thm tách micro là rt nh (c microlit) nên
òi hi các phng pháp nh lng phi có  nhy cao, ph bin hay s dng nht là
phng pháp sc ký lng hiu nng cao (HPLC) và sc ký lng kt hp khi ph (LC -
MS)
[44, 80]
.
1.3.4.1. Sc ký lng hiu nng cao (HPLC)
HPLC là mt k thut tách (separation) trong ó các cht phân tích di chuyn qua
ct cha các ht pha tnh và c phân tách da vào ái lc tng i ca nó vi pha tnh
và pha ng. Tu thuc vào bn cht ca cht cn phân tích, pha tnh s c chn cho
thích hp. Pha tnh và cht cn phân tích hp  phân cc vi nhau s cho hiu qu ra
gii cao hn
[2]
. Tuy nhiên, các nghiên cu ã chng minh rng, hoàn toàn có th tách các
cht dn truyn thn kinh (các cht phân cc) bng sc ký pha o (pha tnh không phân

-11-
cc) nh vào lc tng tác gia các nhóm chc không phân cc ca phân t cht tan vi
gc hydrocarbon ca pha tnh

[62]
.
Hin nay, sc ký phân b pha o rt ph bin nh s n gin, kh nng tái s
dng tt, và có th tin hành tách c cht acid và base trong mt ln chy sc ký, iu này
vt tri hn so vi sc ký pha liên kt, hay sc ký cp ion
[62]
.
Detector là b phn quan trng nht trong HPLC, nó quyt nh n  nhy và tính
chn lc ca k thut này. Có nhiu loi detector nh detector in hoá (ECD –
electrochemical detector), detector hunh quang (fluorescent detector), detector UV và
detector khi ph (MS). Trong ó, ph bin nht là detector in hoá và detector khi ph
[44]
. Khi ph kt hp vi sc ký lng s c trình bày chi tit  phn 1.3.4.2.
Phn ln các máy sc ký lng cn lng mu phân tích ti thiu t 5 n 10 µl. Khi
s dng thm tách micro vi tc  truyn dch vào là 1,5 µl/phút thì sau mt ln ly mu
khong 15 – 20 phút s có  th tích  nh lng (22,5 – 30 µl). Gim tc  truyn
dch s làm tng hiu sut, tuy nhiên s nh hng n thi gian phân tích. Vn  có th
khc phc bng cách tác ng n h thng sc ký.  ci thin  nhy và thi gian, ct
microbore và ct mao quan ang tr nên rt ph bin. Chúng có chiu dài ngn hn và
ng kính trong nh hn nhiu so vi ct bình thng, do ó cho các pic sc ký vi 
phân gii cao và rõ nét
[80]
.
Mu sau khi ly có th bo qun ông lnh vi nhit  thích hp trong khi ch nh
lng (thm tách micro offline). Hin nay, vi nhng tin b trong phân tích hóa hc cho
phép thit k mt h thng ly mu và nh lng trc tip nng  ca thuc hay các
cht ni sinh (thm tách micro online). iu này thc hin c là nh nguyên lý hot
ng ca thm tách micro cho phép b qua khâu chun b mu
[102]
, do mu thu c

không cha protein và enzym mà ch có cht cn phân tích.
S  kt hp ly mu bng k thut thm tách micro và nh lng trc tip bng
phng pháp HPLC (thm tách micro online) c th hin trong Hình 1.7.


-12-

Hình 1.7. S  ly mu bng k thut thm tách micro online
1. H thng bm tiêm 2. B phn chnh dòng 3. Thit b thu mu 4. Kim thm dò 5. Dng c cha
ng vt thc nghim di chuyn t do bên trong 6. Bàn  7. Van tiêm 8. Ct HPLC 9. Bm pha
ng 10. Pha ng 11. Detector 12. Máy tính.
Phng pháp HPLC thích hp phân tách nhiu loi hp cht hu c khác nhau nh
các phân t ngoi sinh (thuc) hay các phân t ni sinh (các cht dn truyn thn kinh,
các neuropeptid). Tuy nhiên, trong mt s trng hp HPLC kt hp detector hunh
quang và in hoá cho  nhy cha 
[70]
. Vì vy hin nay các mu thng c nh
lng bng sc ký lng kt hp vi khi ph
[70]
.
1.3.4.2. Sc ký lng khi ph (LC-MS)
Trong hn 10 nm tr li ây, khi ph (MS - mass spectrometry) ã tr thành mt
detector cc k ph bin cho thm tách micro offline và online liên kt vi sc ký lng
(LC - liquid chromatography).
 Khái quát v LC-MS
Sc ký lng (LC, liquid chromatography) là mt k thut c bn dùng  phân tách
các cht. Khi ph kt hp vi sc ký lng (LC-MS) ngha là khâu np mu s là gián
tip, nó là u ra ca mu sau khi ã tin hành phân chia (separation) bi ct sc ký, và
khi ph s hot ng nh mt detector ca sc ký lng.
Kt hp sc ký lng vi khi ph (LC-MS) hay khi ph ghép (tandem mass

spectrometry) (LC-MS/MS) làm tng áng k tính chn lc và  nhy ca phng pháp

-13-
phân tích. Gii hn phát hin có th n 10
-14
gam
[2]
. Nng  các cht trong mu thm
tách micro rt nh, thành phn tng i phc tp, bao gm c thuc, các cht chuyn
hóa ca thuc và các cht khác có trong dch ngoi bào. S dng LC - MS giúp cho kt
qu thu c chính xác hn và có giá tr hn. Vì vy rt nhiu nghiên cu v thm tách
micro ã s dng phng pháp này  nh lng.

 Nguyên lý hot ng ca khi ph
Khác vi các k thut quang ph, khi ph không dùng bc x in t nhng vn có
th xác nh c các ng v hoá hc. ây là mt k thut o trc tip t s khi lng
và in tích ca ion (m/z) c to thành trong pha khí t phân t hoc nguyên t ca
mu. T s này c biu th bng n v khi lng nguyên t (1 n v khi lng
nguyên t bng 1/12 khi lng ca Carbon
12
C) hoc bng dalton (1 dalton bng khi
lng ca nguyên t Hydro)
[2]
.
Khi ph cung cp nhng thông tin v khi lng phân t, cu trúc hóa hc ca hp
cht, s lng hp cht và  tinh khit ca mu phân tích. Nhng d liu này làm chc
chn thêm các kt qu nh tính và nh lng
[2]
.
Máy MS có nguyên tc hot ng và cu to nh sau :

Hình 1.8. Nguyên tc và cu to ca máy MS


-14-
(1) B np mu : ni mu c a vào máy. Nu mu  dng lng hoc rn
thì s c chuyn sang dng hi thích hp  b phn hoá hi.
(2) B ngun ion: Ion hoá các phân t, nguyên t ca mu  trng thái khí
hoc hi.
(3) B phân tích khi: tách các ion theo t s m/z. Các ion c gia tc và tách
riêng nh tác dng ca t trng, in trng,  i n detector.
(4) Detector: có nhim v chuyn các ion ã n thành tín hiu in o bng
h in t ca máy khi ph.
(5) B thu tín hiu.

Tt c quá trình này din ra trong h chân không vi áp sut t 10
-3
n 10
-6
Pa. Tín
hiu thu c c th hin di dng các pic các cng  khác nhau, tp hp li
to thành mt khi ph  hoc ph khi.

B phn quan trng nht ca máy khi ph ó là b ngun ion và b phân tích khi.

 B ngun ion (ionisation) ca máy khi ph
Trong 2 thp k qua, b ngun ion hoá bng tia in (electrospray ionisation – ESI)
ã th hin tính u vit và tr thành công c quan trng trong các phòng nghiên cu lâm
sàng. ESI – MS (khi ph s dng b ngun ion hoá bng tia in) là mt công c nhy
bén, mnh m và áng tin cy, nó cho phép phát hin c nhng mu vi th tích nh c

microlit, các cht khó bay hi, các cht b phá hu bi nhit (do ó không th áp dng ion
hoá bng nhit)
[47]
. ESI cho phép ion hoá nh nhàng các phân t, làm cho phân t cht
không b phá hu hay to ra nhiu ion mnh (ion fragment) (Hình 1.9)
Sau khi ion hoá, các ion c chuyn n b phân tích khi. Ti ây, ion s c
chn lc theo t s m/z.


-15-

Hình 1.9. C ch to ion ca ESI gm 3 giai on chính
[47]
:
(1) Gii phóng các git mn mang in t u mi mao qun di tác dng ca in
trng.
(2) Bay hi dung môi to các git nh.
(3) Gii phóng ion t các git mn nh tích in.


 B phân tích khi (mass analysers)
Di tác dng ca b phân tích khi, ion di chuyn qua t trng hoc in trng
theo t s m/z ca ion.
Có 3 loi b phân tích khi ph bin trong ESI – MS, ó là (1) b phân tích t cc
(quadrupole), (2) b phân tích t cc chp ba (tandem quadrupole), (3) by ion (ion trap)
[47]
. Trong ó, b phân tích t cc chp ba và by ion là thông dng nht
[2]
.
(1) B phân tích t cc gm 4 thanh kim loi t song song cách u nhau (Hình

1.10) Mi cp i nhau có in tích bng nhau. Hai u ca khi t cc c t vào
dòng in mt chiu (DC) vi tn s (RF) xác nh, to nên in trng bên trong, khin
cho các ion i theo phng z (Hình 1.10) hp vi mt phng x-y ca nó
[75]
. Ba phng x-


-16-
y-z to nên ng dao ng c trng ca ion.
Ngi ta có th chnh các giá tr DC và RF 
thu c ion mong mun
[47]
. B phân tích t
cc c ánh giá là rt mnh m, tit kim, nh
gn và tng thích vi u vào (inlet) ni tip
ca các k thut khác
[47]
nh sc ký khí, sc ký
lng
[75]
.
Thit b này la chn các ion theo t l
m/z. Tuy nhiên, giá tr m/z này có th bao hàm
nhiu nhóm ion khác nhau (wide band pass)
hoc ch mt loi ion duy nht (narrow band
pass)
[75]
.

(2) B phân tích t cc chp ba hay còn gi là QQQ gm 3 b phân tích t cc lin

nhau trên mt ng thng (Hình 1.11). Ion sau khi c chn lc (rational ion) qua t
cc u tiên (Q1) s c va chm vi khí tr (Ar, N
2
)  Q2 và b chia nh, ây gi là
quá trình va chm phân ly (collision-induced disociation CID). Ion con (product ions) có
khi lng phân t tng ng ion gc tip tc c chn lc bi Q3  cung cp thông
tin v cu trúc phân t
[47, 70]
. T cc chp ba, hay MS/MS, cho phép sàng lc kt qu k
lng hn khi ch dùng mt b t cc, do ó cho các tín hiu c hiu hn so vi khi ch
phân tích MS
[47]
.
T cc chp ba có th hot ng  nhiu ch  (mode of data), tu theo mc ích
có th chn quét ph ion gc, ion con hoc c hai (a nhim)
[47]
.

Hình 1.11. Cu to b
t cc chp ba
[47]

Hình 1.10. Cu to b phân
tích t cc
[47]