Xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc

BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







TRẦN QUỐC LONG




XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ
SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN
QUAN ĐẾN CÓC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014



BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI









TRẦN QUỐC LONG




XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ
SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN
QUAN ĐẾN CÓC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia











HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời chân thành cảm ơn tới thầy TS. Lê Đình Chi đã tận
tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài
và viết khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo mọi điều kiện cho em
được thực hiện đề tài tại đây.
Em xin chân thành cảm ơn Ths. Trần Cao Sơn, CN. Đỗ Thị Thu Hằng cùng toàn
thể các anh chị trong labo Hóa đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên em trong

suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia
sẻ mọi khó khăn cùng em.


Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Trần Quốc Long
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Các bufotoxin và bufalin. 2
1.1.1. Giới thiệu chung về họ cóc và các bufotoxin. 2
1.1.2. Bufalin. 3
1.1.3. Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc 4
1.1.4. Các chế phẩm và bài thuốc dân gian có nguồn gốc từ cóc 4
1.2 Một số phương pháp xác định bufalin 5
1.2.2. Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) 5
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector PDA (HPLC-PDA). 6
1.2.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 7
1.2.4. Phương pháp LC-MS/MS 7
1.3. Kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ (LC-MS). 9
1.3.1. Sắc ký lỏng. 9
1.3.2. Khối phổ (Mass Spectrometry). 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu. 15
2.2. Nguyên vật liệu- trang thiết bị. 15
2.2.1. Nguyên vật liệu 15
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 16
2.3. Nội dung, phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1. Nội dung nghiên cứu 17
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 17
3.1. Thiết lập điều kiện phân tích bufalin bằng LC-MS/MS 22
3.1.1. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS) 22
3.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 24
3.1.2.1. Pha tĩnh. 24
3.1.2.2. Pha động 25
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30
3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu. 30
3.2.3. Khảo sát thể tích chiết 32
3.2.4. Khảo sát cột chiết 33
3.2.5. Khảo sát dung dịch rửa giải. 33
3.2.6. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải. 34
3.3. Thẩm định phương pháp. 36
3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc. 36
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ). 38
3.3.3. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn. 38
3.3.4. Độ lặp lại 39
3.3.5. Độ đúng 40
3.3.6. Bàn luận 41
3.4. Phân tích mẫu thực tế 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
Kết luận 43
Kiến nghị 44


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
Tiếng anh
Tiếng việt
AOAC
Association of Official Analytical
Community
Hiệp hội cộng đồng phân
tích chính thức
APCI
Atmospheric pressure chemical
ionization
Chế độ ion hóa ở áp suất
khí quyển
ESI
Electrospray ionization
Ion hóa phun điện tử
GC-MS
Gas chromatography mass spectrometry
Sắc ký khí khối phổ
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
HSCCC

High speed countercurrent
chromatography
Sắc kí phân bố ngược
dòng tốc độ cao.
LC-MS/MS
Liquid chromatography tandem mass
spectrometry
Sắc ký lỏng ghép khối
phổ hai lần
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lượng
MS
Mass spectrometry
Khối phổ
PDA
Photodiode Array
Dãy diod quang
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
SPE
Dispersive solid phase extraction
Chiết pha rắn
R(%)
Recovery
Hiệu suất thu hồi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các nghiên cứu dùng phương pháp HPLC-PDA để phân tích bufalin. 6
Bảng 1.2: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề phân tích
bufalin 8
Bảng 2.1: Sản phẩm có thành phần làm từ cóc được nghiên cứu trong đề tài 15
Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 22
Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS 24
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic
bufalin 26
Bảng 3.4: Khảo sát các chương trình chạy gradient 27
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát chương trình chạy gradient 28
Bảng 3.6: Khảo sát tốc độ dòng pha động 29
Bảng 3.7: Chương trình gradient tối ưu 29
Bảng 3.8: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 31
Bảng 3.9: Khảo sát dung môi chiết 32
Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết 32
Bảng 3.11: Khảo sát cột chiết pha rắn 33
Bảng 3.12: Khảo sát dung dịch rửa giải 34
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thể tích dung dịch rửa giải 35
Bảng 3.14: Ion mẹ và 2 ion con của bufalin 37
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của bufalin 39
Bảng 3.16: Kết quả đánh giá độ lặp lại 40
Bảng 3.17: Kết quả đánh giá độ đúng 41
Bảng 3.18: Kết quả phân tích bufalin trong mẫu sản phẩm dinh dưỡng có thành phần
từ cóc 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Sắc ký lớp mỏng phát hiện bufalin 7
Hình 1.2: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 9

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS 11
Hình 1.4: Bộ nguồn ion hóa 12
Hình 1.5: Mô hình bộ phân tích tứ cực chặp ba 14
Hình 2.1:Các bước của quá trình chiết pha rắn 18
Hình 3.1: Sắc ký đồ của dung dịch bufalin chuẩn với pha động ACN - HCOOH 0,1% 26
Hình 3.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 31
Hình 3.3: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 36
Hình 3.4: Sắc đồ mẫu trắng 37
Hình 3.5: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn 50 ng/ml 37
Hình 3.6: Sắc đồ mẫu bột đạm cóc phát hiện có bufalin 38
Hình 3.7: Sắc đồ bufalin tại LOD 38
Hình 3.8: Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chuẩn bufalin 39
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cóc nhà (Bufo melanostictus) thuộc họ Cóc-Bufonidae, được dùng trong đông y
và dân gian như một loại thực phẩm bổ dưỡng cho người già, một loại thuốc quý để hỗ
trợ, tăng cường dinh dưỡng sau ốm dậy, dùng để chữa bệnh trẻ em suy dinh dưỡng,
chán ăn, chậm lớn, gầy còm, còi xương, cam tích, lở ngứa trẻ em [2]. Trong thịt cóc, có
rất nhiều acid amin có giá trị (asparagin, histidin, tyrosin, methionin, leucin, isoleucin,
phenylamin, tryptophan, cystein), hàm lượng một số nguyên tố vi lượng có ích như
kẽm, mangan cao hơn rất nhiều so với các loài động vật khác [2]. Như vậy giá trị dinh
dưỡng của thịt cóc rất cao.
Bên cạnh giá trị dinh dưỡng đã được chứng minh của thịt cóc, đã có nhiều
trường hợp tử vong do ăn thịt cóc có nhiễm độc tố cóc, tính tới ngày 8/9/2010, toàn
quốc ghi nhận 06 vụ ngộ độc do độc tố trong cóc (bufotoxin) xảy ra trên địa bàn 6
tỉnh/thành phố làm 17 người mắc, 13 người đi viện và 05 người chết [1]. Các nghiên
cứu đã công bố xác định trong nhựa cóc Việt Nam – Bufo melanostictus có bufalin,
resibufogenin, bufotalin và nhiều bufadienolides khác, trong đó bufalin là thành phần
chính. Đây là điểm khác biệt so với cóc Trung Quốc - Bufo gargarizans (trong nhựa có

chứa cinobufagin là thành phần chính) [21].
Hiện nay ở Việt Nam chưa có một phương pháp chính thức để phân tích phát
hiện độc tố cóc trong các sản phẩm dinh dưỡng có thành phần từ cóc. Vì vậy, để góp
phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc” với
mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp xác định bufalin trong các sản phẩm dinh dưỡng chế
biến từ cóc bằng kỹ thuật LC – MS/MS.
- Ứng dụng phương pháp xây dựng được để phân tích bufalin trong một số loại
sản phẩm dinh dưỡng chế biến từ cóc.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Các bufotoxin và bufalin.
1.1.1. Giới thiệu chung về họ cóc và các bufotoxin.
Họ Cóc (Bufonidae) có 529 loài [11], trong đó 16 loài có các chất độc nhóm
bufotoxin (trong nội tạng (gan, trứng) và nhựa ở da, tuyến mang tai), bao gồm loài cóc
nhà Việt Nam B. melanostictus. Trong thịt cóc không có chất độc. “Nhựa cóc” còn gọi
là thiềm tô (secretio bufonis) là nhựa tiết ở tuyến sau mang tai, tuyến trên mắt và các
tuyến trên da của cóc. Chất độc trong nhựa cóc, trong gan và buồng trứng cóc có độc
tính rất cao [7].
Hợp chất bufotoxin là nhóm các chất độc thường thấy ở tuyến nhựa sau tai, da
và nội tạng của nhiều loài cóc, một số loài lưỡng cư khác và ở một số loài cây và nấm
[12]. Đây là một hỗn hợp gồm hơn 36 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: 5-
MeO-DMT, bufalin, resibufogenin, cinobufagin, bufagin, bufotalin, bufogenin,
bufothionin, epinephrin, norepinephrin và serotonin… trong đó có những chất được
xếp vào nhóm không gây độc bao gồm cholesterol, provitamin D, ergosterol và gamma
sitosteral. Những chất gây độc được xếp thành 3 nhóm:
- Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolides) chủ yếu gồm
bufalin, cinobufagin và resibufogenin có tác động trên hệ tim mạch của động vật và

con người.
- Nhóm 2: Phenethylamines và dẫn xuất. Bao gồm các catecholamines như:
dopamine, norepinephrine và epinephrine.
- Nhóm 3: Tryptamines và dẫn xuất: serotonin, bufotenin, 5-methoxy-N,N-
dimethyltryptamin (5-MeO-DMT) chúng có tác dụng tăng huyết áp và gây ảo giác
và/hoặc hưng thần (psychoactive).
3

1.1.2. Bufalin [24].
 Tên thông thường: Bufalin.
 Danh pháp quốc tế: (3β,5β)-3,14-Dihydroxybufa-20,22-dienolide,
5β,20(22)-Bufadienolide-3β,14-diol.
 Công thức phân tử: C
24
H
34
O
4.

 Cấu trúc phân tử:

 Khối lượng phân tử: 386,52 g/mol.
 Tính chất vật lý:
 Tan trong chloroform (5 mg/ml), DMSO (25 mg/ml), ethanol (25
mg/ml).
 Nhiệt độ nóng chảy 235-236
0
C.
 Tỷ trọng 1,23 g/cm3.
 Tác dụng và độc tính:

Bufalin có tác dụng trên tim giống digoxin [13]: Ức chế kênh Na
+
-K
+
-ATPase
(giúp trao đổi giữa K
+
ngoài tế bào và Na
+
trong tế bào), khi kênh bị ức chế nồng độ
Na
+
trong tế bào tăng dẫn đến giảm hoạt tính của bơm Na
+
/Ca
2+
(bơm này trao đổi Na
+

ngoài tế bào và Ca
2+
trong tế bào). Hậu quả là tăng nồng độ Ca
2+
nội bào dẫn tới co cơ,
tăng điện thế màng lúc nghỉ dẫn tới tăng tốc độ khử cực tự nhiên và tăng tính tự động,
tăng trương lực đối giao cảm và giảm hoạt tính giao cảm trong mô cơ tim. Ngoài ra,
bufalin ức chế kênh Na
+
-K
+

-ATPase làm giảm sự trao đổi Na
+
và K
+
dẫn tới tăng K
+

máu.
4

Gần đây bufalin được nghiên cứu có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u.
LD50 của bufalin trên chuột là 2.35 mg/kg, rất độc đối với tim gây sung huyết tế
bào cơ tim [25].
Tác giả Yasuharu H. [29] đã nghiên cứu so sánh hoạt lực của bufalin tác dụng
trên kênh Na
+
-K
+
-ATPase tại tế bào cơ tim của chuột với các glycosis tim khác, kết
quả như sau: bufalin > digoxin > digitoxin > telocinobufagin > gamabufotalin >
cinobufotalin > cinobufagin > g-strophanthin > digitoxingenin > resibufogenin [29].
1.1.3. Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc.
Trong thời gian qua trong thực tế có rất nhiều vụ ngộ độc do độc tố cóc gây ra.
Triệu chứng ngộ độc độc tố cóc biểu hiện cấp tính, xuất hiện từ 1 - 2 giờ sau khi ăn (có
thể sớm hơn nếu uống rượu, bia) với các biểu hiện sau:
+ Rối loạn tiêu hoá: Bệnh nhân bị chướng bụng, đau bụng trên rốn; kèm theo nôn mửa
dữ dội; có thể bị tiêu chảy.
+Rối loạn tim mạch: Bệnh nhân hồi hộp, đánh trống ngực, tim đập nhanh; sau đó loạn
nhịp tim (ngoại tâm thu thất, cơn nhịp nhanh thất), rung thất, block nhĩ - thất dẫn đến
truỵ tim mạch; huyết áp lúc đầu cao sau đó tụt.

+Rối loạn tâm thần kinh: Bệnh nhân rối loạn cảm giác (đau như kim chích ở đầu ngón
tay, ngón chân, tê môi ), chóng mặt, ảo giác, vã mồ hôi lạnh, tăng tiết nước bọt; có thể
khó thở, ngừng thở, ngừng tim.
+Rối loạn tiểu tiện: Bệnh nhân xuất hiện bí đái, thiểu niệu, vô niệu và nặng dẫn đến
suy thận cấp.
+Một số triệu chứng khác: Bệnh nhân xuất hiện bỏng rát, phù nề niêm mạc, mắt nếu bị
nhựa cóc bắn dính vào trực tiếp niêm mạc.
1.1.4. Các chế phẩm và bài thuốc dân gian có nguồn gốc từ cóc
- Dân gian [2]: Nhựa cóc là 1 trong 6 vị của đơn thuốc “Lục thần hoàn”. Trong
nhân dân dùng nhựa cóc chữa giảm đau, tán thuỷ, dùng chữa phát bối, đinh độc, yết
5

hầu sưng đau, đau răng. Thịt cóc khô dùng với liều 2 – 3 g tán bột uống hoặc làm thành
thuốc viên, chữa gầy còm, chậm lớn, kém ăn, suy dinh dưỡng, Hiện nay có khá nhiều
sản phẩm hỗ trợ sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc làm từ cóc như: bột đạm cóc
(Viện Dinh Dưỡng), bột cóc baby (Công ty CP Dược Hải Phòng), bột cóc royal baby
(Công ty CP Công nghệ và Hóa sinh Hà Nội),…
- Tại Trung Quốc thuốc Chansu (được biết đến với tên Senso tại Nhật Bản, tên
Somsa tại Hàn Quốc) chế từ chất tiết trên da và tuyến mang tai cóc hiện được sử dụng
khá rộng rãi [12]. Thuốc có hoạt tính gây tê cục bộ, tăng huyết áp, cường hô hấp,
kháng ung thư và ảnh hưởng trên tim mạch tuy nhiên giới hạn điều trị hẹp nên khá thận
trọng khi sử dụng [11].
1.2 Một số phương pháp xác định bufalin
1.2.2. Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC)
Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp sắc ký trong đó cả pha tĩnh và pha
động ở trạng thái lỏng. Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược
dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha
tĩnh rắn như mất mẫu hay phân hủy mẫu.
Tác giả Li J. và cộng sự [14] đã sử dụng phương pháp HSCCC kết hợp với sắc
ký điều chế HPLC để phân lập và tinh chế thành công tám bufadienolides (trong đó có

bufalin) từ ChanSu. Tác giả sử dụng chế độ rửa giải từng bước của HSCCC với hệ
thống dung môi gồm petroleum ether-ethyl acetate-nước-methanol (4:6:4:6, 4:6:5:5, v /
v). Sau đó sử dụng sắc ký điều chế HPLC để tách các bufadienolides, cấu trúc của
chúng được xác nhận bởi ESI-MS và phổ
1
H-NMR.
6

1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector PDA (HPLC-PDA).
Bảng 1.1: Các nghiên cứu dùng phương pháp HPLC-PDA để phân tích bufalin.
TLTK
Nền mẫu và điều kiện phân tích
Đánh giá phương pháp
[9]
- Nền mẫu: Venenum Bufonis (một loại thuốc tương
tự Chansu).
- Cột: Diamonsil C18 (250 mm x 4.6 mm, 5µm).
- Pha động: Acid acetic 0,3% - acetonitril theo
chương trình gradient.
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Bước sóng phát hiện 296 nm.
- Độ thu hồi đạt
100,6%.
- LOD=0,48 ng.
- LOQ=1,55 ng.

[16]
- Nền mẫu: Nhựa cóc.
- Cột: Alltech Alltima C18 (250 mm x 4.6 mm, 5
µm).

- Pha động: Đẳng dòng, acetonitrile - đệm acetate
(pH 3,2) (50:50, v/v).
- Tốc độ dòng 0,8 ml/phút.
- Bước sóng phát hiện 299 nm.
- Độ tuyến tính tốt
trong phạm vi từ 0,15-
0,525 µg (r = 0,9990).
- Độ thu hồi trung bình
của bufalin là 98,0%.
[22]
- Nền mẫu: Gan người.
- Chất nội chuẩn: Ethinyl estradiol (10 µg/ml)
- Dung môi chiết: Hỗn hợp acid photphoric đậm đặc
và chloroform.
- Mẫu được làm sạch bằng cột Oasis®HLB.
- Cột: Symmetry C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm).
- Pha động: Đẳng dòng, acetonitril-nước (48:52)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Bước sóng phát hiện: 299 nm.
- Thời gian lưu của
bufalin: 9.7 phút.
- Đường chuẩn (n=5)
có hệ số tương quan là
0.9994.
- LOD = 0,4 ng.
- Độ thu hồi > 70%.

7

1.2.3.Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Tác giả Hyo-Jae Lee và cộng sự [13] đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng
để phân biệt và phát hiện bufadienolides (bufalin, cinobufagin, resibufogenin,
cinobufotalin) chiết từ nọc độc cóc. Điều kiện phân tích: bản mỏng silica GF
254
, pha
động: chloroform – aceton (10 : 3), hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%.

Hình 1.1: Sắc ký lớp mỏng phát hiện bufalin
1.2.4 Phương pháp LC-MS/MS
Có nhiều nghiên cứu về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích bufalin.
Một số nghiên cứu được thể hiện ở bảng sau:
8

Bảng 1.2: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề phân tích bufalin.
Tài
liệu
tham
khảo
Nền mẫu
Dung môi
chiết
Pha động/ Tốc độ
dòng
SPE
Kỹ thuật
Độ thu
hồi
LOD
[27]
Huyết

tương
chuột
Ethyl
acetate–
diethyl
ether (4:1)
Acetonitrile - H
2
O
(0,1% HCOOH),
chế độ gradient/ 0,2
ml/phút

UPLC-ESI-
MS/MS
86.3±0.7
1
ng/ml
[26]
Chansu
Ethyl
acetat
Acetonitrile - H
2
O
(0,3 %
CH3COOH), chế độ
gradient/ 0,7
ml/phút
Silicagel

HPLC/APCI-
MS/MS
99.9
1
ng/g
[24]
Huyết
tương
chuột
Ethyl
acetate
Acetonitrile - H
2
O
(0,1% HCOOH),
chế độ gradient/ 0,3
ml/phút

LC–MS/MS
85
1
ng/ml
[10]
Venenum
Bufonis
Methanol
Acetonitrile - H
2
O
(0,1% HCOOH),

chế độ gradient


LC/ESI-
MS/MS
84-
106%
0.25
ng/ml
[6]
Huyết
tương
chó
Methanol
Acetonitrile - H
2
O
(0,2% HCOOH),
chế độ gradient/ 0,9
ml/phút

Oasis
®
HLB
HPLC/TOF-
MS
85,28
0.15
ng/ml
Để phân tích hàm lượng các độc tố của cóc, hiện tại phương pháp chính được sử

dụng là sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS). Về cơ bản, đây là phương pháp sắc
ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là thiết bị khối phổ. Phương pháp có nhiều ưu điểm
9

như: giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời
các chất có thời gian lưu giống nhau, có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các
chất dựa vào khối lượng và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất [18]…Với
những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để nghiên
cứu thiết lập phương pháp phân tích bufalin.
1.3. Kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ (LC-MS).
Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận
phát hiện là detector khối phổ. Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình 1.2

Hình 1.2: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS
1.3.1. Sắc ký lỏng [4].
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động
là chất lỏng. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến
hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh.
Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất
khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do
vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 2 – 5 µm. Trong phần
tổng quan này, chúng tôi chỉ đi sâu trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật
phổ biến nhất. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân bố
được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)
Sắc ký lỏng
Ion hóa
Bộ phân
tích khối

Detector/Lưu
giữ số liệu
Chân không
10

 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica không xử
lý hóa học mang nhóm silanol hoặc các silica được gắn các nhóm chức phân cực: -
NH
2
, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan,
toluene Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực.
 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực,
loại thông dụng nhất là –C
18
H
37
, còn pha động phân cực: nước, methanol,
acetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước
nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất
phân cực, ít phân cực tới không phân cực.
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các
chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa
giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt.
Có thể chia pha động làm hai loại:
 Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân
tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như MeOH,
ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược.
 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như
cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS
2

),
chlorobutan, triclomethan, toluen
Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa
giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực
từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời
gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.
Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn góp
phần vào khả năng ion hoá của chất. Chúng cũng có những yêu cầu cao hơn về độ tinh
khiết, hàm lượng các tạp chất. Có những loại pha động được sản xuất riêng cho LC-
MS/MS.
11

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc
bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp. Một số loại
detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS),
detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn, detector mảng diot (PDA), detector khối
phổ (MS).
1.3.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) [18].
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và
điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của
chúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z
và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp
chất.

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị
phân tích và bộ phận phát hiện (hình 1.3). Trước hết, các mẫu được ion hóa trong
nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Sau
Nguồn ion

Phân tích
khối
Detector
Xử lý và
lưu giữ liệu
Phổ khối
Chân không cao
Tránh ion phân tích va chạm
với ion trong không khí
12

đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín
hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
 Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển
thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử
dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (ESI), ion hóa hóa học
ở áp suất khí quyển (APCI). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá
phun điện tử (ESI).
Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:
+ Tạo thành các giọt mang điện tích.
+ Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt.
+ Quá trình hình thành pha hơi các ion.

Hình 1.4: Bộ nguồn ion hóa
Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào ống mao quản bằng kim
loại. Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4-6 kV). Khi điện tích dư trên đầu mao
quản vượt qua sức căng bề mặt của dịch mẫu thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích.
Tiếp đó các giọt mang điện này được làm giảm kích thước nhờ hai quá trình liên tục
xảy ra, đó là sự hóa hơi dung môi nhờ dòng khí N
2
được liên tục thổi vào và sự bắn phá
của các giọt tích điện cùng dấu. Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha hơi của các ion.
13

Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phân tích khối phổ qua một cửa
sổ rất nhỏ. Dung môi và khí trơ N
2
được hút ra ngoài do một dòng khí (Curtain Gas).
Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm.
 Loại hình thành ion dương.
o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ.
o Thường hình thành nên ion [M+H]
+
.
o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]
n+
, [M+Na
+
]
+

 Loại hình thành ion âm.

o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất phân tích có tính acid.
o Hình thành nên ion [M-H]
-
, [M-nH]
n-

Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích
các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen
glycocol, và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ.
 Bộ phận phân tích khối: Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân
tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện
bắn pha thêm để thu được các ion con. Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ
biến là bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay. Bộ phân
tích khối ba tứ cực được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây chính là
kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống
để các ion bay qua. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một
chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc
khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động
phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có
thể đi qua được bộ lọc này.
Bộ phân tích khối ba tứ cực gồm ba tứ cực ghép nối với nhau (hình 1.5). Trong
đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định
14

từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử bị
phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N
2
, Ar, He. Bộ Q2 tạo ra phân ly do các
ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions). Q2

không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến. Sau
đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3. Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ
tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện.
.

Hình 1.5: Mô hình bộ phân tích tứ cực chặp ba
 Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới
phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép
khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được
khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện
phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có
độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt diod làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp
sau đó được dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo
thành dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân
electron, các ion ban đầu đập vào một diod tạo ra dòng các electron. Khác với detector
nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng
ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như
thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt
trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.
Q1
Q2

Q3
Q0
15


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.

Bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc hiện có trên
thị trường:
Bảng 2.1: Sản phẩm có thành phần làm từ cóc được nghiên cứu trong đề tài
Tên mẫu
Số kiểm soát
Thành phần
Ngày sản xuất
Hạn dùng
Bột cóc royal
baby-Công ty
CP Dược và
CN Hóa sinh
Hà Nội
4777/2012/ATTP-
XNCB
Bột cóc, lyzin,
vitamin B1,
kẽm gluconat,
canxi lactat,
bột đậu.
15/07/2013
15/7/2016
Bột đạm cóc-
Viện Dinh
Dưỡng
CBCL
3095/2011/YT-
CNTC
Cóc sấy khô,
đậu tương, đậu

xanh, natri
sorbat, hương
vani
02/08/2013
02/08/2014

2.2. Nguyên vật liệu- trang thiết bị.
2.2.1. Nguyên vật liệu
a. Chất chuẩn
- Chất chuẩn Bufalin: Hãng Wako Pure, Ltd. Độ tinh kiết > 98%.
- Dung dịch chuẩn gốc bufalin nồng độ 1000 µg/ml: Cân 10 mg chất chuẩn pha
vào 10 ml methanol, bảo quản trong bình tối tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2-8
0
C.
- Dung dịch chuẩn trung gian 100 µg/ml: Hút 0,5 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc
vào bình định mức 5 mL và định mức vừa đủ bằng. Bảo quản ở 2-8
0
C.
16

- Dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml.
Nồng độ dung dịch chuẩn trung gian (µg/ml)
100
100
100
100
Thể tích hút chuẩn trung gian (µl)
500
250
100

50
Định mức (ml)
5
5
5
5
Nồng độ chuẩn làm việc (µg/ml)
10
5
2
1

b.Hóa chất, dung môi
- Dung môi tinh khiết cho HPLC: methanol, acetonitril (Merck).
- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic, acid acetic băng, amoni acetat
(Merck).
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
 Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL
của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung
môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS.
- Cột sắc ký Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm) và tiền cột C18 (4
mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm).
- Máy lắc vortex IKA.
- Máy li tâm (Heraus)
- Cân phân tích Metter Toledo (có thang đọc tới 0,1 mg và 0,01 mg).
- Máy cất quay chân không (Eyala).
- Bộ chiết pha rắn (Sulpelco) và máy hút chân không (New Askir 30).
- Bộ thổi khô (OA-Sys).
 Dụng cụ

- Ống li tâm 50 ml.
- Bình cô quay 100 ml.
- Vial loại 1,8 ml.
17

- Ống nghiệm thủy tinh.
- Ống đong, phễu, giấy lọc.
- Autopipet loại 100 µl ,200 µl, 1000 µl, 5000 µl và đầu côn tương ứng.
2.3. Nội dung, phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
 Tối ưu hóa điều kiện xác định bufalin bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS/MS).
 Khảo sát quy trình chiết bufalin từ nền mẫu.
 Thầm định phương pháp:
 Độ đặc hiệu của phương pháp.
 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn.
 Độ lặp lại của phương pháp.
 Độ thu hồi của phương pháp.
 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
 Ứng dụng phương pháp: Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định
bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe có chứa thành phần làm từ cóc hiện
đang lưu hành.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp tách chiết mẫu.
Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn này là sản phẩm dinh dưỡng có nền
mẫu phức tạp. Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng
của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện.
Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách
chiết mẫu [6][15][22].