xác định và định lượng các vi sinh vật gây bệnh nhiễm trong thực phẩm

MC LC

M ĐU 1
I. TÌNH HÌNH NG ĐC THC PHM TRÊN TH GII VÀ VIT NAM 2
II. MT S VI SINH VT CÓ TH GÂY NG ĐC THC PHM 6
2.1 Salmonella 6
2.2 Campylobacter 6
2.3 Clostridium perfringens 7
2.4 Clostridium 7
2.5 Staphylococcus 8
2.6 Vibrio spp 9
2.7 Escherichia coli 10
2.8 Shigella 10
2.9 Listeria monocytogenes 11
2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm 12
2.11 Coliforms 13
2.12 Nm men và nm mc 13
III. CÁC PHNG PHÁP ĐNH LNG VI SINH VT 15
3.1 Đnh lng vi sinh vt bằng phng pháp đm trc tip 15
3.1.1 Đm bằng buồng đm hồng cu 15
3.1.2 Kỹ thut đm Breed 17
3.1.3 Đm bằng kính hin vi huỳnh quang 18
3.2 Các kỹ thut đnh lng vi sinh vt trong mu bằng phng pháp nuôi cy 19
3.2.1 Phng pháp đm khun lc 20
3.2.2 Phng pháp c đoán s lng vi sinh bằng kỹ thut MPN (Most Probable
Number): 28
3.2.3 Phng pháp lai khun lc 29
3.3 Phng pháp đo đ đc 31
IV. ÁP DNG ĐI VI MT S VI SINH VT GÂY BNH TRONG THC PHM 32
4.1 Đnh lng Fecal Coliform và E. Coli bằng phng pháp đm đĩa 32
4.2 Đnh lng Vibrio Parahaemolyticus 33

4.3 Đnh lng Coliforms, Coliforms chu nhit, E. Coli gi đnh (Fecal Coliforms) bằng
phng pháp MPN 35
4.4 Đnh lng Enterococci đng rut trong nc bằng phng pháp màng lọc 37
Thit b: 37
4.5 Đnh lng Clostridium khử sunfite trong nc bằng phng pháp tăng sinh trong môi
trng cy lng 38
KT LUN 40
TÀI LIU THAM KHO 41
PH LC 42




1
M ĐU
Các vi sinh vt gây bnh nhim trong thc phm thng gặp gồm các vi
khun Salmonella Shigella, E.coli, Bibrio choterea, Clostridium botulinum,
Clostridium perfringens; các vius Hepatis, virus Hepatis virus A, Rotavirus;
các ký sinh trùng Amip, sán lá gan, sán bò, trùng lông; các nm mc và nm
men Aspergillus, candida, Furanium
Vi sinh vt gây bnh nhim trong thc phm bằng 4 con đng chính: qua
súc vt, qua môi trng, ch bin và bo qun. Mc đ nguy him và triu
chng ca bnh có th gây nên do đc t ca vi sinh vt tit vào thc phm hay
do chính t bào ca chúng gây nên. Đ có th gây ng đc thc phm, vi sinh
phi hin din vi s lng t bào ln và ph thuc liu lng ca từng chng
loi nhim vào, thc phm phi có các đu kin lý hoá thích hp cho vi sinh vt
đó phát trin, nhit đ và thi gian phi thích hp cho quá trình tăng trng ca
chúng từ khi chúng nhim vào cho đn khi tiêu th đ vi sinh vt nhân lên đn
đ liu lng hay sn xut đ lng đc t gây hi. Khi nhim thc phm, vi
sinh vt gây h hng làm thc phm b đổi màu, đổi v, có mùi. Tuy nhiên cũng

có mt s loi gây nhim thc phm nhng không làm thay đổi màu, mùi, v
hay hình dng bên ngoài ca thc phm. Vì vy rt khó nhn bit bằng cm
quan. Do đó, vic xác đnh và đnh lng các vi sinh vt gây bnh nhim trong
thc phm là điu rt cn thit.

















2
I. TÌNH HÌNH NG ĐC THC PHM TRÊN
TH GII VÀ VIT NAM
 các nc phát trin có ti 10% dân s b ng đc thc phm và mắc
bnh truyn qua thc phm mi năm; vi các nc kém phát trin tỷ l này cao
hn nhiu. Nhiu nc có quy đnh báo cáo nhng ch đt 1% s ca b ng đc
thc phm. Ng đc thc phm  Mỹ chim 5% dân s/năm (>10 triu ng-
i/năm), trung bình 175 ca/100.000 dân, mi năm cht 5.000 ngi;  Anh: 190
ca/100.000 dân;  Nht: 20-40 ca/100.000 dân;  Úc là 4,2 triu ca/năm.

Thc trng vi phm v sinh an toàn thc phm  nc ta rt đáng báo
đng. Ng đc thc phm cp tính trong nhng năm qua vn có chiu hng
gia tăng c v s v và quy mô mắc. Tỷ l mắc/100.000 dân trung bình từ năm
2001 – 2005 là 5,48. Có nhiu nguyên nhân gây ra các v ng đc thc phm
trong toàn quc nh thc phm ô nhim, môi trng ô nhim; thc phm có
đc; điu kin sn xut, ch bin thc phm không bo đm an toàn, nhn thc
– hành vi đúng v phòng chng ng đc thc phm ca cng đồng còn nhiu
hn ch…
Trung bình mi năm có 202.2 v ng đc thc phm xy ra vi 5.525,1
ngi mắc và 55.2 ngi cht. S v ng đc xy ra nhiu nht là từ tháng 4 - 7
và tháng 9 – 11. Tỷ l mắc ng đc trung bình là 7.14/100.000 dân, tỷ l cht là
0,06/100.000 dân/năm.
S v ng đc ln (≥ 30 ngi) chim 26,8% vi s mắc chim 83,2%.
V ng đc nh và vừa (<30 ngi) chim 73,2% vi s mắc chim 16,8%. Tỷ
l mắc ng đc chim 18.7% tổng s đi tng cùng ăn chung ba ăn; tỷ l
cht là 0,8% tổng s đi tng b mắc ng đc thc phm. Mọi la tuổi đu có
th b ng đc, tuổi nh (0 - 4 tuổi) và tuổi cao ≥ 50 có nguy c mắc và cht
cao do ng đc Biu hin chung trong các v ng đc là buồn nôn (81,0%), nôn
(83,9%), đau bng chim 79.0%, a chy 72.2 %, đau đu chim 53.2%, chóng
mặt 43,4%, st 26,3%….
C s nguyên nhân ng đc ch yu là gia đình (54,6%), bp ăn tp th
(15,6%), đám ci/gi (16,6%), thc ăn đng ph (5,4%), bp ăn trng học
(4,0%). Thc ăn nguyên nhân ch yu là thc phm hn hp (40,0%); thuỷ sn
14,1%; nm 13,2%; ngũ cc và các sn phm là 7,8%…
Nguyên nhân ng đc ch yu là nguyên nhân vi sinh vt (34,0%), đc t
t nhiên (24,0%), hoá cht (10,0%). Còn 32,0% s v không xác đnh đc
nguyên nhân. Vi sinh vt gây ng đc là Salmonella, Streptoccocus, E.coli,
Staphylococcus aurerus và Vibrio parahaemolyticus; đc t t nhiên ch yu là
đc t ca nm đc (13,2%).

3
Thi gian báo cáo trung bình ca v ng đc là 9.74 ngày. Vi v ng đc
thc phm ≥30 ngi là 8.53 ngày (0-31 ngày), vi v ng đc <30 ngi là
10,20 ngày (1-37 ngày).
Ly mu xét nghim nguyên nhân v ng đc đt tỷ l rt thp: Mu thc
phm là 47,3%, mu bnh phm là 23,9 %; dng c, bao gói đt t l thp 1,5 %
các v ng đc.

Bảng 1: S lng các v ng đc thc phm toàn quc từ năm 2000 – 2008
Kt qu điu tra
Năm
V ng đc (vụ) S mắc (người) Cht (người)
2000 213 4233 59
2001 245 3901 63
2002
218 4.984 71
2003
238 6.428 37
2004
145 3.584 41
2005
144 4.304 53
2006
165 7.135 57
2007

247
7.329
55
2008

205
7.828
61
Trung bình/năm 202.2 (247 - 144) 5.525,1 (7.828 - 3.584) 55.2 (71 – 31)
Tổng cng 1.820 49.726 497


Bảng 2. Tình hình ngộ độc tại Hà Nội trong 3 năm gần đây
S v ng đc Nguyên nhân gây ng đc
Năm
S
v
S
ngời
mắc
S
ngời
cht
Vi sinh
vt
Thc
phm
bin
chất
Hóa
chất
tồn d
trong
thc
phm

Đc t
t
nhiên
Nguyên
nhân
khác
2006 2 41 0 2 0 0 0 0
2007 8 137 0 7 0 1 0 0
2008 8 354 0 8 0 0 0 0
Cộng 18 620 0 17 0 1 0 0


4
Bảng 3: Nguyên nhân trong các v ng đc thc phm trong năm 2007
Kt qu điu tra
TT Nguyên nhân ng đc
Số lượng Tỷ lệ (%)
1
Salmonella
3 1.5
2
Streptoccocus
2 1.0
3
E.coli
4 2.0
4
Staphylococcus aurerus
7 3.4
5

Vibrio parahaemolyticus
1 0.5
6 Thuc dit chut 0 0.0
7 Hoá cht 1 0.5
8 Đc t ca cá nóc 8 3.9
9 Đc t con so 2 1.0
10 Đc t ca con sam 2 1.0
11 Đc t trong tht cóc 2 1.0
12 Đc t Histamin 3 1.5
13 Đc t trong mắm tép 0 0.0
14 Đc t trong ru 5 2.4
15 Đc t ca Lá ngón 2 1.0
16 Nm đc 27 13.2
17 Không rõ nguyên nhân 136 66.3
Tổng cng 205 100,0






5

Salmonella Shigella E. coli Vibrio
Staphylococcus Campylobacter Clostridium Listeria

6
II. MT S VI SINH VT CÓ TH GÂY NG
ĐC THC PHM
2.1 Salmonella

Salmonella Trc năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3
loài da theo phn ng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S.
enteridis.
Salmonella là trc khun garm (-), hiu khí và k khí tùy ý, có kh năng di
đng không to bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhng không lên
men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân gii urê không có kh
năng tách nhóm amin từ tryptophane, hu ht các chng đu sinh H2S. pH ti
u cho chúng phát trin nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát trin
trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có kh năng phát trin  nồng đ mui cao.
Vi khun Salmonella tồn ti trong c th nhiu loài đng vt và có th gây
bnh cho ngI. Vi khun Salmonella có th gây bnh truyn nhim cho đng
vt nh phó thng hàn bò, phó thng hàn ln, bnh sy thai cừu và nga,
bnh bch lỵ gà, bnh viêm rut bò,… Nhng bnh k trên do Salmonella gây
ra ngi ta gọi là bnh truyn nhim nguyên phát, ngoài ra có th phá hin
đc Salmonella trong cht bài tit ca đng vt.
S lng Salmonella đ đ gây ng đc là khi chúng hin din c triu t
bào trong mt gam thc phm. Các triu chng do Salmonella gây ra thng là
tiêu chy, ói mửa, buồn nôn. Thi gian  bnh cho đn khi các triu chng biu
hin thng sau 12-36 gi k từ khi tiêu th thc phm b nhim. Triu chng
thng kéo dài ít nht từ 2-7 ngày. Không phi tt c mọi ngi khi tiêu th
th
c phm b nhim Salmonella điu có biu hin bnh, ngc li mt s ngi
không có triu chng lâm sàng khi tiêu th phi thc phm nhim vi sinh vt
này khi đó chúng đc bài tit ra ngoài. Các loi thc phm có nguy c b
nhim Salmonella nh tht gia cm, sn phm tht, trng và các sn phm ca
trng, thy sn. Nguồn nhim vi sinh vt vào các loi thc phm thng có
nguồn gc từ đng rut ca ngi và các loài đng vt, chúng có th đc
nhim gián tip hay trc tip. Salmonella gây nên bnh st thng hàn thuc
các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. các dòng này
thng không gây bnh cho các loài đng vt.

2.2 Campylobacter
Đây là vi sinh vt gây nên bnh viêm nhim đng rut, bằng các phng
pháp phân lp đã chng minh vi sinh vt này hin din khắp ni.
Campylobacters là mt trong nhng h vi sinh vt ca nhiu loi đng vt và
chim. Nhng các dòng có kh năng gây ng đc thc phm không th phát
trin khi nhit đ thp hn 30
0
C, đây là vi sinh vt a nhit bắt but. Sn phm

7
sa và tht gia cm là nhng nguồn có th gây nên ng đc do vi sinh vt này.
Nc cũng là mt trong nhng nguồn mang bnh này. Campylobacters là vi
sinh vt rt nhy vi nhit đ, chúng b tiêu dit hoàn toàn bằng phng pháp
thanh trùng Pasteur, chúng không th sng sót trong thc phm có môi trng
acid. Chúng không th phát trin trong thc phm bo qun trong điu kin
hiu khí mà ch phát trin trong các loi thc phm hút chân không.
Khi xâm nhim Campylobacter, thi gian  bnh thng từ 2-11 ngày.
Các triu chng do vi sinh vt này gây nên nh đau nhc, tiêu chy, st, đau
đu, khó chu, chut rút, lnh cóng, mê sn. Thnh thong có nhng biu hin
bnh ging nh cm cúm.
2.3 Clostridium perfringens
Quan nim v s ng đc thc phm do Clostridium perfringens gây ra đã
có nhng thay đổi trong nhng năm gn đây. Theo nhng quan nim trc đây
cho rằng các dòng C.perfringens kháng nhit, to bào tử và không làm tan máu
mi có th gây ng đ thc phm. Nhng trong nhng năm gây đây các dòng
nhy cm vi nhit, không làm tan máu cũng đc tìm thy trong các v ng
đc do vi sinh vt này gây nên.
Vì các bào tử ca C. perfringen kháng nhit nên chúng thng sng sót
qua quá trình nu chín. Tuy nhiên cũng ph thuc vào thi gian tip xúc vi
nhit. Nu nhng bào tử sng sót, khi gặp điu kin thích hp chúng s ny

mm và nhân lên. Khi đun nu thc ăn  nhit đ thp và thi gian ngắn có th
làm cho các dòng kháng nhit tồn ti vì th chúng s gây tái nhim sau khi bo
qun. Các nguồn thc phm có th gây ng đc vi các vi sinh vt này thng
là tht gia cm, nht là các loi gia cm ln đông lnh sâu, tht trong các hm
cha. C. perfringens cũng đc tìm thy trong đt, trong phân ngi và trong
các loi thc phm khác. Các triu chng do vi sinh vt này gây ra thng là
đau thắt vùng bng, tiêu chy. Thi gian  bnh từ 12-24 gi. Các triu chng
lâm sàng gây nên do đc t ca chúng.
2.4 Clostridium
Clostridium là các vi khun garm (+), hình que, k khí sinh bào tử , không
di đng, có th thy gii saccaride và protein trong các hot đng thu nhn
năng lng to ra các sn phm nh acid acetic, butiric, ru, to ra các mùi
khó chu trong sn phm. Clostridium phát trin mnh  nhit đ 55
o
C, nhit đ
ti u là 43 ÷ 47
o
C. Nhit đ 15 ÷ 20
o
C làm chm hoặc làm ngng s phát trin
ca vi khun này. Không phát trin  pH hn 5,0 hoặc trên 9,0, b c ch bi
5% NaCl. Clostridium hin din trong đt, mt s loài trong nhóm này gây
bnh cho ngi và đng vt, mt s loài khác gây h hng thc phm, khử
sunphit thành sunphur to ra màu đem và gây mùi khó chu.

8
Clostridium botulinum là vi sinh vt sinh đc t gây bnh ng đc tht cho
ngi (botulism). Bnh biu hin rt nghiêm trọng  ngi. Bnh gây ra do đc
t đc hình thành bi C.botulinum nhim trong thc phm. Triu chng lâm
sàng ca bnh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có nhng biu hin ri lon thành

kinh nh choáng váng, ri lon th giác, ri lon các c  cổ và ming, đau 
vùng ngc, khó th và tê lit, có th dn đn tử vong. Các triu chng trên biu
hin sau 12-36 gi sau khi tiêu th thc phm nhim đc t. Các triu chng
thng kéo dài 2-6 ngày tuỳ theo tình trng nhim đc và sc khoẻ cng từng
bnh nhân.
Các loi thc phm nh tht, rau qu không đc bo qun đúng qui đnh
hay lây nhim từ đt, phân đng vt hay do ch bin không đ nhit đ trc
khi dùng, các sn phm đóng hp không đúng qui cách cũng có nguy c nhim
vi sinh vt này ry cao. Điu kin thích hp cho vic hình thành đc t ca vi
sinh vt này điu kin môi trng kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh
vt khác cnh tranh. Đc t botuline do C. botulinum tit ra gồm mt s loi
khác nhau nh A, B, C1, C2, D, E, F, G. các đc t này là nhng protein có
trọng lng phân tử ln kho
ng 1 triu danton. Nhng nhng dng có tác đng
mnh đn con ngi là A, B, và E. đây cũng là mt trong nhng loi đc t
sinh học có cng đ mnh nht. Trong nhng năm gy đây, các v ng đc
botulism gây ra do C.botulinum dòng E thng đc phát hin khi tiêu th cá
và các sn phm thy sn. Dòng vi sinh vt này thng xuyên phân lp đc từ
các mu bùn đáy ti các cửa sông.
2.5 Staphylococcus
Staphylococcus là loi cu khun gram (+), các t bào ca chúng liên kt
thành hình chùm nho. Khi phát trin trong môi trng, Staphylococcus có kh
năng to ra sắc t từ màu trắng đn vàng sm, nhit đ 20 ÷ 25
o
C thích hp
nht cho chúng to màu. Staphylococcus không di đng, không to bào tử,
nhit đ thích hp cho s phát trin là 37
o
C, chu đc s khô hn, hi nóng (
nhit đ 50

o
C chúng vn sng trong 30 phút), có kh năng sng  nồng đ
mui 9 ÷ 10%. Staphylococcus phát trin  pH rt rng (pH = 4,0 ÷ 9,8).
Khong pH ti u ca chúng là 6 ÷ 7 và aw ti u khong 0,83 ÷ 0,86.
Staphylococcus có kh năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,
sucrose. Staphylococcus đc phân b khắp ni nhng ch yu đc phân lp
từ da và màng nhy ca ngi và đng vt máu nóng. Staphylococcus có th
nhim vào trong thc phm qua con đng tip xúc vi ngi thao tác trong
quá trình ch bin thc phm. S hin din vi mt đ cao ca Staphylococcus
trong thc phm ch th điu kin v sinh và kim soát nhit đ kém ca quá
trình ch bin.
Staphylococcus aureus là VSV có kh năng sn sinh mt s loi đc t
đng rut bn nhit, không b phân huỷ khi đun  100
o
C trong khong 30

9
phút. Khi vi sinh vt này xâm nhim vào trong thc phm, chúng tit đc t
vào trong sn phm và gây đc. Khi con ngi tiêu th loi thc phm có cha
đc t này, sau 4-6 gi  bnh s bc phát các triu chng lâm sàng nh tiêu
chy, nôn ma, các triu chng này kéo dài từ 6-8 gi. Các loi thc phm có
cha hàm lng mui cao thng có nguy c nhim vi sinh vt này nh
jambon, kem tổng hp, nc soup… vì các loi thc phm này ít khi đc xử
lý  nhit đ cao hn 40
o
C. Các loi thuỷ sn hay thc phm đóng hp cũng
thng hay b nhim loài vi sinh vt này. Các nguồn lây nhim vào thc phm
ch yêu từ các khâu ch bin trong nhà bp. Trong t nhiên các vi sinh vt này
thng tình thy trên da, mũi, tóc hay lông ca các loài đng vt máu nóng.
2.6 Vibrio spp

Các loài Vibrio có nguồn gc từ bin, chúng cn ion Na+ đ phát trin.
Ging Vibrio có mt s loài có kh năng gây bnh cho ngi nh V. cholerae,
V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V.
fluvialis, V. alginolyticus.
V. cholerae là tác nhân gây nên các v dch t trên toàn th gii. Loài vi
sinh vt này đc chia thành hai kiu huyt thanh chính đó là O1 và non-O1,
kiu huyt thanh O1 bao gồm ba kiu huyt thanh ph nh sau: Ogawa; Inaba
(hai kiu này đc gọi chung là kiu cổ đin – Classic) và kiu Eltor (kiu
Eltor còn đc gọi là kiu O139). Hai kiu huyt thanh Inaba và Ogawa ngày
nay ch còn đc tìm thy ti các nc thuc khu vc châu A. Trong khi đó các
v dch t trên khắp th gii gây ra do kiu Eltor. Khi có các trn dch do V.
cholerae gây ra thng lan truyn rt nhanh vào trong nc, gây nhim vào
thc phm, nu điu kin v sinh kém, vi khun s lan truyn qua con ngi và
dch bnh càng thêm nghiêm trọng. Vi sinh vt này sn sinh đc t
cholaratoxin, đây là loi đc t đng rut có cng đ mnh, ch cn 5µg gây
nhim qua đng ming có th gây tiêu chy cho ngi trng thành. Mt s
đc t khác cũng đc vi sinh này tit ra nh hemolysine có đc tính tng t
tetrodotoxin (đc t cá nóc) hay đc t tng t shiga-toxin.
Các loi thc phm có th lan truyn V. cholerae nh nc ung, nc
trái cây, rau qu, sa và các sn phm sa, thm chí bia cũng có kh năng
nhim vi sinh vt này. Các loi sn phm thuỷ sn ti sng, không qua gia
nhit, gia nhit nhẹ hay do s nhim chéo sau khi gia nhit cũng đc khuyn
các là có nguy c mang V.cholerae khá nghiêm trọng.
V. parahaemolyticus là loài vi sinh vt tồn ti và phát trin trong môi
trng có hàm lng mui cao, chúng thng xuyên đc phân lp từ các sn
phm thy sn, trong các vùng nc m ven b bin. Chúng sn sinh đc t
hemolysine bn nhit, cht này chu trách nhim cho đặc tính kháng nguyên
Kanagawa. Nhng trong nhng năm gn đây các dòng V.parahaemolyticus có
phn ng Kanagawa âm tính cũng có th gây bnh. Triu chng biu hin ca

10
bnh có th xut hin trong khong 2-96 gi sau khi tiêu th thc phm b
nhim, thi gian này ph thuc vào liu lng xâm nhim và th trng ca từng
bnh nhân, loi thc phm tiêu th và hàm lng acid trong d dày. Các biu
hin bnh lý khi vi sinh vt này xâm nhim và đau thắt vùng bng, viêm nhim
đng rut và tiêu chy nhẹ.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhim vào trong thc phm cũng có th gây
nên các bnh đng rut và có biu hin bnh lý tng t nh hai loài trên. Dĩ
nhiên tuỳ từng loài và liu lng mà có nhng biu hin bnh nặng nhẹ khác
nhau. Ch riêng loài V. vulnificus không gây các triu chng bnh đng rut
mà chúng gây nhim trùng máu cho ngi.
2.7 Escherichia coli
E.coli thuc họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), trc
khun ngắn, không to bào tử, chu đc nhit, không b hy khi đun nóng
100oC trong 2 gi. E.coli có th kháng cồn, không b hy khi tip xúc vi cồn
50%, b hy bi focmol 5%, có kh năng phát trin  nhit đ từ 30 ÷ 50
o
C,
nhit đ phát trin ti u ca chúng là 37
o
C, phát trin  pH ti u là 4,4 và aw
ti u là 0,95.
E. coli là vi sinh vt hiu khí phổ bin trong đng tiêu hoá ca ngi và
các loài đng vt máu nóng. Hu ht các dòng E. coli tồn ti mt cách t nhiên
và không gây hi trong đng tiêu hoá, ngc li chúng còn đóng vai trò quan
trọng trong vic ổn đnh sinh lý đng tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nht 4 dòng
sau đây có th gây bnh cho ngi và mt s loài đng vt:
Enterobathogenic E. coli (EPEC)
Enterotocigenic E. coli (ETEC)
Enteroinvasive E. coli (EIEC)

Enterohaemorrhagic E.coli
(EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli
O157: H7
Các dòng E. coli gây bnh khi chúng xâm nhim vào ngi qua con
đng thc phm có th gây nên các bnh ri lon đng tiêu hoá, các biu
hin lâm sàng bin đng có th từ nhẹ đn rt nặng, có th đe do mng sng
ca con ngi ph thuc vào liu lng, dòng gây nhim và kh năng đáp ng
ca từng ngi.
2.8 Shigella
Ging Shigella cũng là mt thành viên ca họ vi khun đng rut
Enterobacteriacae, chúng gồm có 4 loài sau: S. dysenteriae, S. sonnei, S.
plexneri, S. boydii. Đây là ging vi sinh vt có t bào ch đặc hiu, chúng ch
thích nghi và phát trin trong t bào ch là ngi và các loài linh trng. S
hin din ca chúng trong môi trng là do s nhim phân ca ngi và các
loài mang vi sinh vt này. Shigella có th tồn ti hn 6 tháng trong môi trng

11
nc. Các v ng đc thc phm do Shigella gây ra ch yu tp trung  các
nc kém phát trin, ch bin thc phm trong điu kin kém v sinh. Bnh
cũng có th truyn trc tip từ ngi qua ngi.
Shigella ch yu gây nên các bnh l trc trùng. Thi gian  bnh sau khi
tiêu th thc phm b nhim là 1-7 ngày. Các biu hin triu chng bnh có th
nhẹ, biu hin không rõ, ch thoáng qua nh tiêu chy nhẹ, nhng đôi khi cũng
có nhng biu hin nghiêm trọng nh đi tiêu ra máu, có nhng mnh niêm mc
rut, mt nc, st cao và b co rút thành bng. Các triu chng trên có th kéo
dài 12-14 ngày hay lâu hn. Đi vi ngi ln, các trng hp tử vong do
Shigella him khi din ra, nhng bnh biu hin rt nghiêm trọng đi vi tr
ẻ
em và ngi già. Hàng năm có khong nửa triu ngi tử vong do vi sinh vt
gây ra trên khắp th gii.

S lây nhim vi khun Shigella ch yu đng ming. Nc là mt môi
trng truyn bnh quan trọng, đặc bit  nhng ni kém v sinh. Tuy nhiên
các loi thc phm cũng là nguyên nhân gây nên các bnh do Shigella. Vi sinh
vt này nhim vào thc phm qua nguyên liu hay quá trình ch bin. Ðôi khi
nhim bnh do v sinh cá nhân kém.
2.9 Listeria monocytogenes
Trong nhng năm gn đây L. monocytogenes nổi lên nh mt mt tác
nhân gây bnh nguy him. Đi tng gây bnh ca vi sinh vt này là trẻ em,
ph n mang thai hay nhng ngi già. Đi vi nhng vi sinh vt gây bnh g
đc thc phm khác, chúng bc phát bnh khi con ngi hp thu đ liu lng,
sau thi gian  bnh các triu chng lâm sàng biu hin. Ngc li L.
monocytogenes hin din vi mt s lng nh trong thc phm, khi đc đa
vào c th, chúng tồn ti và ch c hi. Khi có điu kin thun li, chúng nhân
lên xâm nhim vào các mô sâu và gây bnh. Các bnh do vi sinh vt này gây
nên bắt đu từ đng tiêu hoá nh tiêu chy, st nhẹ. Sau đó chúng xâm nhim
vào các đi thc bào gây nên bnh nhim trùng máu, tác đng lên h thn kinh
trung ng, tim mắt, và có th xâm nhp vào bào thai gây nên sy thai, đẻ non
hay nhim trùng thai nhi.
L. monocytogenes thuc loi vi sinh vt a lnh, chúng có th phát trin 
nhit đ từ 2-44
o
C. Chúng thng đc phân lp từ các loi thc phm nh
phomat sa, tht cá rau qu và thm chí phân lp đc từ trong nc mặt.
Trong tt c các công đon ch bin thc phm, sa hay rau qu đu có kh
năng xâm nhim vi sinh vt vt này. Đặt bit trong công đon bo qun các sn
phm  nhit đ thp, vi sinh vt này có c hi phát trin thành s lng ln.
Các sn phm thanh trùng Pasteur và đc bo qun  nhit đ thp trong các
t lnh có nguy c nhim vi sinh vt này rt cao.

12
2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm
Các đt dch bnh gây ra từ thc phm do tác nhân virus cho đn nay vn
là vn đ bí n. Nhng mt s tác gi vn tin rằng virus trong thc phm là tác
nhân gây nên các bnh him nghèo. Nhng tin b trong các nhiên cu v virus
thc phm vn còn hn ch. Cho dn nay các đặc đim sinh lý ca virus đng
rut vn còn bit rt hn ch. Cho đn nay các phng pháp nuôi cy đ phát
hin virus trong thc phm cho đn nay vn cha th thc hin đc. Nhng
vi các tin b v kỹ thut sinh học phân tử nh kỹ thut lai phân tử, kỹ thut
PCR có th phát hin đc các virus có hi cho con ngi trong thc phm.
S lan truyn virus cho ngi qua con đng thc phm đc bit từ
nhng năm 1950. Các virus gây bnh đng rut cho ngi ch yu có nguồn
gc từ các sn phm thuỷ sn. Cho đn nay đc bit có khong hn 100 loi
virus đng rut. Nhng ch mt vài loài trong s đó có kh năng gây bnh cho
ngi. Theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có th gây nguy him
cho ngi.
Hepatitis type A (HAV)
Virus Norwalk
Calicivirus
Astrovirus
Virus NonA và Non B.
Virus tồn ti  th không hot đng khi  bên ngoài t bào, chúng không
th t nhân lên trong nc hay trong các sn phm th
c phm cho dù  bt kỳ
điu kin hoá lý nh th nào. Chúng xâm nhim vào thc phm hoàn toàn do
quá trình ch bin, từ nc b ô nhim. Các loài nhuyn th ăn lọc có kh năng
tích luỹ nhiu virus trong nc. Hàng ngày mt con nguyn th có th lọc 1500
lít nc, theo đó mt s lng ln virus có th vào c th ca con vt này và
tích luỹ ti đó. Vì th mt đ virus trong c th nhuyn th cao hn rt nhiu so
vi môi trng nc chúng đang sinh sng.

Liu lng gây bnh ca virus có th thp hn rt nhiu so vi vi khun khi
con ngi tiêu th thc phm b nhim. Liu lng gây nhim ti thiu ca mt
s loài vurus đng rut tng đng vi s lng hin din trong thc phm
mà các phòng thí nghin có th phát hin đc bằng phng pháp nuôi cy.
C th ngi và các loài đng vt là nguồn cha các virus đng rut. Virus
đc tìm thy vi s lng ln trong phân ca nhng ngi b nhim và tồn ti
trong nhiu ngày đn nhiu tun. S nhim phân vào trong thc phm bằng con
đng gián tip hay trc tip là con đng xâm nhim virus vào thc phm.
S sng sót ca virus trong môi trng hay trong thc phm ph thuc
vào yu t nh nhit đ, nồng đ mui, cng đ bc x mặt tri hay s hin
din ca các thành phn hu c khác. Virus đng rut cũng có kh năng tồn

13
ti nhiu tháng trong nc bin  nhit đ < 10
o
C thm chí có th lâu hn. Vì
th đây cũng là nhân t ch th ô nhim phân. Tt c các virus đng rut đu
kháng vi acid, các enzym thy gii, hay mui mt có trong đng tiêu hoá.
Mt s virus có th kháng nhit nh Hepatits type A, mt s khác có th kháng
vi các cht ty u nh phenolic, ethanol …. Ozon và chlorine là nhng tác
nhân có th làm bt hot mt vài loi virus đng rut.
Đ ngăn ngừa các bnh do virus từ thc phm, các loi thc ăn phi đc
nu chín,khử virus trc khi tiêu th, các loi nhuyn th ăn lọc phi đc khai
thác tronng nhng vùng nc không nhim virus hay đc nuôi trong các vùng
nc sch trc khi tiêu th.
2.11 Coliforms
Coliforms là nhng trc khun hình gy, gram âm (-), không sinh bào tử,
hiu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Chúng có kh năng phát trin  nhit đ rt rng từ
-2
o

C đn 50
o
C, pH trong khong 4,4 ÷ 9,0. Coliforms có kh năng lên men
lactose sinh acid và sinh hi  37
o
C trong 24 ÷ 48gi.
Coliforms hin din rng rãi trong t nhiên trong rut ngi, đng vt.
Khi s Coliforms ca thc phm cao thì kh năng hin din ca các vi sinh vt
gây bnh khác cũng cao….
Coliforms chu nhit là nhng Coliforms có kh năng lên men lactose sinh
hi trong khong 24 gi khi đc   44
o
C tromg môi trng canh EC.
Coliforms phân là Coliforms chu nhit có kh năng sinh indole khi đc 
khong 24 gi  45,5
o
C trong canh Trypton. Coliforms phân là mt thành phn
ca h vi sinh vt đng rut  ngi và các đng vt máu nóng khác và đc
sử dng đ ch th mc đ v sinh trong quá trình ch bin, bo qun, vn
chuyn thc phm, nc ung.
Căn c vào nhit đ vi sinh vt có th phát trin đ chia nhóm Coliform
thành hai nhóm. Nhóm Coliform có nguồn gc từ phân ca các loài đng vt
và, nhóm này đc gọi là Coliform phân và nhóm không có nguồn gc từ phân
đng vt. Trên thc t, các phng pháp kim nghim ch xác đnh Coliform
phân là xác đnh nhóm coliform có nguồn ngc từ rut ngi và các đng vt
máu nóng bao gồm các ging nh Escherichia; Klebsiella và Enterobater.
2.12 Nấm men và nấm mc
Nm men và nm mc là nhóm vi sinh vt rt đa dng, đây là nhóm vi
sinh vt nhân tht có vách t bào và lp v chitin, có nhân và các bào quan
khác. Tt c các loài nm men và nm móc đu thuc nhóm vi sinh vt d

dng. Chúng ch có kh năng nhn các cht dinh dng  dng hòa tan. Trong
quá trình trao đổi cht xy ra  t bào chúng li có kh năng chuyn hóa các
cht hòa tan thành các cht không hòa tan nh lignocellulose,…. Ngoài ra,
chúng còn có th to ra các cht đc, các cht đc ca chúng đc gọi chung là

14
đc t vi nm (mycotoxins). Tiêu biu có Aspegillus flavus, Aspegillus
parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum,
Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii. Trong thc phm nm mc
và nm men hin din có th tăng trng làm thay đổi màu ca thc phm, làm
phát sinh muồi hay v l, làm h hng hay thay đổi c cu ca thc phm, mt
s có th to đc t gây ng đc thc phm.

















15

III. CÁC PHNG PHÁP ĐNH LNG VI
SINH VT
3.1 Đnh lng vi sinh vt bằng phng pháp đm trc tip
S lng Vi sinh vt trong mu có th đc xác đnh bằng cách đm trc
tip trên kính hin vi. Qui trình đn trc tip cho phép xác đnh đc s lng
vi sinh vt vi kt qu cao nht. Mặt dù phng pháp đm trc tip bằng kính
hin vi cho phép c lng nhanh chóng s lng vi sinh vt có trong mu.
Tuy vy phng pháp này có nhng đim hn ch nht đnh nh không phân
bit đc s lng t bào sng và s lng t bào cht, d nhm ln t bào vi
sinh vt vi các mnh v nh ca mu và không cho phép tìm hiu các đặc
đim khác ca ca vi sinh vt đc đc quan sát.
3.1.1 Đm bằng buồng đm hồng cu
Đi vi các vi sinh vt có kích thc ln nh
 nm men, nm mc, to và
protozoa, phng pháp đm trc tip d dàng thc hin vi các loi buồng
đm. Có rt nhiu loi buồn đm vi sinh vt khác nhau phù hp vi từng th
tích và kích thc ca từng nhóm vi sinh vt. Ví d có th sử dng buồng đm
hồng cu Petroff – Hauser đ đm vi khun. Đi vi các mu nc và các mu
khác, buồng đm Holber đc sử dng rng rãi nht.
Buồng đn Holber là mt lam kính dày 2-3mm có mt vùng đĩa đm nằm
gia lame kính vùng này đc bao quanh bi mt rãnh. Đĩa đm thp hn b
mặt ca lame kính khong 0,02mm, có hình tròn vì th khi ph lên trên bằng
kính đy vt thì đ sâu ca đĩa đm s đồng đu nhau. Vùng đĩa đm có đin
tích 1mm
2
và đc chia thành 400 ô vuông nh hn, mi ô có din tích
0.0025mm
2
. th tích ca mi ô là 0,02 x 0,0025 mm
2

, th tích này tng đng
vi 0,00005ml. Thêm vài giọt formalin vào trong nhng lọ cha mu, trn đu.
Pha loãng mu cn đm sao cho trong mi ô nh ca buồng đm có khoãng 5 -
10 t bào vi sinh vt. Đ đt đc đ pha loãng nh vy cn phi c lng
đc s lng vi sinh vt trong mu, đồng thi phi thử vài ln trong quá trình
pha loãng. Mu phi đc pha loãng bằng dung dch pha loãng cha 0,1%
pepton và 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. Tt c các dung dch pha
loãng đu phi cn lọc trc khi sử dng.

16

17
Đặt mt giọt mu đc pha loãng vào trong đĩa đm trên buồng đm, đy
bằng kính đy vt. Tt c các buồng đm và kính đy vt phi đc lau tht
sch. Th tích mu cha trong buồng đm là khong không gian gia đĩa đm
và kính đy vt, không đ mu tràng ra bên ngoài rãnh ca đĩa. Sau khi đt
mu, đ yên khong 5 phút đ ổn đnh v trí ca các t bào trong buồng đm.
Đm ngu nhiên khong 50-100 ô nh. Tính trung bình s lng vi khun trong
tt c các ô đã đm. Sau đó nhân vi 20 000 và vi đ pha loãng mu trc khi
đm đ có đc s lng t bào trong 1ml. Lặp li hai ln hay nhiu hn đ ly
giá tr s đm trung bình. Đi vi các vi sinh vt t thành từng cm, không th
phân bit từng t bào thì mi cm đc xem là mt vi khun.
Vi nhng kinh nghim ca mi cá nhân v đ pha loãng, thao tác kỹ
thut thành tho có th nhn đc các s đm chính xác. Tuy vt kt qu có
chính xác hay không còn ph thuc vào s sch s ca buồng đm, kính đy
vt nhằm đm bo không có vi khun khác không phi từ mu hin din trong
buồng đm và trong kính đy vt.
3.1.2 Kỹ thut đm Breed
Kỹ thut này r
t hu ích trong vic xác đnh tổng s vi sinh vt bằng

phng pháp đm trc tip. Lame kính Breed có mt vùng có din tích 1cm2
đc đánh du trên lame. Dùng bm tiêm, hay que cy vòng cho 0,01ml mu
cn đm vào trong vùng này, sy khô bằng ngọn lửa sau đó nhum vi methyl
blue. Khi đm, cho du nhúng lên din tích vùng cn đm. Thông thng vùng
này có đng kính 0,16 mm. Din tích vùng đm là pr2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08
= 0,02mm2. Vi din tích này chim 1/5000 trong tổng din tích đặt mu là
100mm2 hay th tích trong vùng đm là 1/5000 x 0,01ml. Nh
vy nu có 1 vi
sinh vt trong vùng đm thì tng đng vi 5000/0,01ml hay 500 000 t
bào/ml. S đm ca các vi sinh vt trong các vùng khác nhau ca vùng qui c
đc tính bằng công thc nh sau:
4
2
Nx4x10
C =
d
π

d: đng kính va vùng đm
N: s lng t bào trong 1 vùng
C: s t bào trong 1ml
Khi sử dng kính hin vi huỳnh quang vi các cht nhum khác nh
acridin cam (AODC), 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein
isothiocyanate (FITC) cũng đc sử dng rng rãi đ đm s lng vi khun.
Các nghiên cu ca K.G. Porter và Y.S. Feig cho thy rằng khi sử dng DAPI
đ đm s lng vi khun trong nc cho kt qu tt hn khi sử dng cht
nhu
m AODC khi trong mu nc có nhiu cht dinh dng và nhiu phiêu
sinh vt khác. V đ bn tính phát huỳnh quang ca DAPI cũng cao hn

18
AODC. Hai tác gi trên cũng chng minh rằng khi nhum vi DAFI có th bo
qun trong ti đn 24 tun mà cng đ phát quan không thay đổi. Trong khi
đó AODC cng đ và s lng phát quang b gim khi bo qun trong vòng 1
tun  cng điu kin.
3.1.3 Đm bằng kính hin vi huỳnh quang
Mt kỹ thut khác da trên nguyên tắc nhum màu đặc hiu DNA đc
gọi là Hoechst 33258 cũng đc sử dng đ nhum và đm s lng vi sinh vt
trên kính hin vi huỳnh quang. Phng pháp này nh sau: Bisbenzumide kt
hp vi vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn phc hp này s phát
huỳng quang. Hoechst 33258 đc sử dng nhiu trong vic đnh lng vi sinh
vt trên b mặt. Đặt bit trên b mặt có gắn các acridine orange. Mt s thun
li khác khi sử dng phng pháp nhum màu bisbenzimide cho phép đm s
lng vi sinh vt trong các dng dch cht ty rửa, trong mui dùng cho các
phòng thí nhim hay trong các ch phm sinh học khác mà không có s hin
din ca DNA. Phng pháp đm s lng vi sinh vt bằng phng pháp phát
huỳnh quang đc ng dng rng rãi trong vic phân tích các mu môi trng
nh nc đt ….
Sử dng du nhúng phát quang thp là mt phát minh quan trọng trong
vic hn ch s phát huỳnh quang ca các màng lọc. Màng carbonate
Nuclepore là mt màng cellulose cao cp dùng trong vic đm trc tip vi
khun bi vì chúng có kích thc lổ đồng nht và b mặt màng phẳng, chúng
có th gi li tt c các vi sinh vt trên b mặt ca chúng. Màng Nuclepore có
th nhum vi thuc nhum Irgalan đen hay các loi thuc nhum phù hp
khác đ to nên mt nn màu đen tng phn vi màu phát quang ca vi sinh
vt vì th vic đm đc thc hin d dàng. Khi sử dng thuc nhum là
acridine cam vi khun và các vi sinh vt khác phát quang màu xanh hay màu
cam. Màu phát quang xanh hay cam là ph thuc vào tình trng sinh lý ca
từng vi sinh vt. Nhng kh năng phân bit t bào đang sng hay t bào đã cht
bi mu phát quang đôi khi đa đn s nhm ln. Sử dng ADPI nhum DNA

ca t bào vi khun chúng đa đn s phát quang màu xanh dng đc cho là
ti u hn so vi vic sử dng acridin cam đ nhum các vi khun có kích
thc nh.
S đm nhn đc từ phng pháp đm trc tip trên kính hin vi phát
huỳnh quang luôn cho kt qu cao tng đng hai ln so vi kt qu nhn
đc bằng kỹ thut nuôi cy khác. Nhng vi khun có kích thc nh, có hình
dng bt thng khác cũng đu có th nhìn thy bằng phng pháp phát huỳnh
quang. Mt s dng vi sinh vt không th nuôi cy trong các môi trng tổng
hp trong phòng thí nghim. Hin tng không th nuôi cy ca các vi sinh vt
cho đn nay vn cha rõ là do chúng thoái hoá, không th nhân lên trong các
môi trng nhân to hay do không đáp ng đc các điu kin sinh lý cn thit

19
cho s phát trin ca chúng. Trong mt s trng hp, s tng quan cao gia
phng pháp đm trc tip bằng phng pháp phát huỳnh quang và phng
pháp đm khun. Tuy nhiên trong mt s trng hp khác s tng quang này
rt kém. S khác bit gia phng pháp đm trc tip và phng pháp đm
khun lc phn ánh s chọn lọc ca môi trng và điu kin nuôi cy, mt
phn t bào b cht hay b thng tổn và s loài c th trong mu.



Giá tr ca s đm trc tip bằng phng pháp phát huỳnh quang trên kính
hin vi tng đng vi vi s lng vi sinh vt tht s có th có vi tt c các
loài khác nhau. Điu đó cho phép c đoán đc đc s lng tht s trong
nc bin, trong nc t nhiên, trong trong mt loi mu nào đó, mặt dù các loài
này có s khác bit ln v s lng ca từng chng loài, khác bit v đặc đim
sinh lý din ra trong cùng điu kin ca mu. S đm trc tip thng phn ánh
đúng vi sinh khi, vì th thng đc dùng đ c lng sinh khi vi sinh vt
có trong mu. Tuy nhiên đ có đc s đm chính xác bằng kính hin vi phát

huỳng quang cn phi đm nhiu ln và nhiu v trí khác nhau trên mu.
Thêm vào đó nu đm nhiu t bào đang phân chia có th cho phép c
đoán tc đ phát trin ca vi sinh vt trong mu. Tn sut ca t bào đang phân
chia đc nhìn thy có mi liên h vi ch s đo khác ca tc đ phát trin vi
sinh vt nh tc đ tổng hp RNA đc đo bi s phòng thích ca adenine đc
đánh du. Tng xut ca t bào đang phân chia đc tính bằng thi gian gia lúc
bắt đu s thắt ca t bào đn khi t bào phân chia là mt hằng s. Con s này
không phi là bt bin. Tht khó khăn đ nhn ra s phân chia t bào khi sử dng
kính hin vi quang học mà không sử dng kính hin vi phát huỳnh quang.
3.2 Các kỹ thut đnh lng vi sinh vt trong mu bằng phng pháp
nuôi cấy
Có hai cách đ xác đnh s l
ng vi khun bằng phng pháp nuôi cy:
phng pháp đm khun lc và phng pháp c đoán s lng vi khun
(MPN – Most probable number). Tt c các phng pháp đnh lng vi khun

20
trong mu bằng phng pháp nuôi cy đu yêu cu các t bào phi đc tách
ri nhau, qua quá trình nuôi cy các t bào này phát trin thành các dòng riêng
bit. Tt các qui trình đnh lng bằng phng pháp nuôi cy nhằm chọn lọc
mt hay nhiu nhóm vi khun nht đnh nào đó, mc đ chọn lọc ph thuc và
từng qui trình qui trình c th. Đ xác đnh tổng s vi sinh vt trong mu phi
chọn qui trình gim ti thiu kh năng chọn lọc. Nhng dù mc đ chọn lọc 
mc ti thiu cũng ch đnh lng đc s lng vi sinh vt có th nuôi cy.
Còn mt s lng ln vi sinh vt khác không th phát trin đc trong quá
trình nuôi cy thì không th đnh lng đc bằng phng pháp này. Có các
phng pháp đnh lng nuôi cy nh sau nh sau:
3.2.1 Phng pháp đm khun lc
Phng pháp đm khun lc trên đĩa đc sử dng rng rãi đ đnh lng
vi sinh vt, đặc bit là vi khun, nhng pháp này có nhng khuyt đim và đã

có nhng cách nhìn nhn khác nhau v mặt khoa học. Khuyt đim ca phng
pháp này nằm trong s lm dng đ biu đt sai các kt qu. Tt c mọi ngi
đu mắc sai lm khi nhn ra rằng phng pháp này không th dùng đ thu đc
kt qu tổng s vi sinh vt.
Phng pháp đm khun lc sử dng nhiu loi môi trng và các điu
kin nuôi cy khác nhau. Agar là cht thng đc dùng đ làm đặc các môi
trng nuôi cy vì hu hr các vi sinh vt đu mt các gen tổng hp enzym
phân gii agar. Các mu đã đc pha loãng đ trãi lên b mặt môi trng agar
(phng pháp trãi) hay khuyt tán vào trong nôi trng trc khi làm đặc
(phng pháp đổ đĩa). Mt vn đ cn phi cân nhắc là các vi sinh vt cn xác
đnh có th tồn ti và phát trin trong môi trng agar hay không. Mt s vi
sinh vt có th b cht khi trãi trên b mặt môi trng trong qui trình cy tri b
mặt. Mt s loài vi khun khác không th sng trong điu kin nhit đ duy trì
trng thái lng ca agar trong qui trình đổ đĩa. Bi vì agar ch là tác nhân làm
rắn môi trng nuôi cy trong qui trình đnh lng vi sinh vt vì th trong mt
s trng hp agar có th đc thay th bằng các tác nhân làm rắn khác. Trong
mt s trng hp các vi sinh vt có các nhu cu dinh dng đặc bit khác, các
cht nh silicagel có th đc thay th đ làm rắn môi trng. Nh ng vì chun
b môi trng silicagel khó khăn hn chun b môi trng agar nên ch dùng
môi trng silicagel khi không th thay th đc môi trng agar.
Phng pháp ng cun đc dùng đ đnh lng các vi sinh vt kỵ khí bắt
buc. Đây là mt phng pháp ci biên ca phng pháp đổ đĩa. Các đĩa hay
các ng sau khi cy vi khun đc  trong điu kin nhit đ đặc bit trong mt
thi gian nht đnh đ cho sinh vt phát trin thành các khun lc có th nhìn
thy bằng mắt trng, s lng khun lc xut hin trên đĩa s đc đm. S
lng khun lc s đc gán cho s t bào đn lẻ trong mu ban đu. Đ s
lng khun lc phn ánh đc s lng t bào vi khun, mu phi đc phân

21
tán đu vào trong môi trng hay trên b mặt môi trtng rắn. Nhng đĩa có

quá nhiu khun lc xut hin thì không th cho s lng đm chính xác bi vì
chúng có th chồng lp lên nhau. Nhng đĩa có quá ít khun lc cũng phi b đi
vì theo nguyên tắc ca xác sut.
Nhng vn đ chính yu cn xem xét trong qui trình đm khun lc là
thành phn môi trng, điu kin và thi gian nuôi . Môi trng đ đnh
lng các vi sinh vt d dng không th c đnh nit phi cha các nguồn
nit, carbon, phosphate d sử dng và các cation, anion cn thit nh sắt,
mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành phn ca các hàm lng không nht
đnh, chúng đặt thù cho từng loi môi trng và từng loi mu nht đnh đ có
th nhn đc s lng vi sinh vt mc tiêu cao nht. Nh vy môi trng nuôi
c
y phi có các thành phn dinh dng phù hp vi từng yêu cu ca loài vi
sinh vt, bao gồm c các nhân t cn thit khác cho s phát trin ca mt h vi
sinh vt nht đnh. Mc đích chung ca môi trng là hàm lng dinh dng
phi cao hn các thành phn có trong các mu đang phân tích. Hàm lng dinh
dng trong các loi môi trng đm tổng s vi sinh vt phi đ cao, và đc
tính ca môi trng đi vi sinh vt  mc thp nht.
Đ nâng cao hiu qu ca qui trình đnh lng vi sinh vt bằng phng
pháp đm khun lc, các điu kin cn phi điu chnh sao cho ch có các thành
viên vi sinh vt cn phát hin theo đnh nghĩa đc đm. Các môi trng đm
đĩa đc chọn lọc hay phân bit vi các thành viên vi sinh vt khác. Qui trình
đm đĩa chọn lọc đc thit k cho thích hp vi s phát trin ca vi sinh vt
mong mun. S phát trin ca các nhóm vi sinh vt khác đc loi b bi các
thành phn ca môi trng hay điu kin nuôi . Môi trng phân bit là môi
trng không loi b các nhóm vi sinh vt không mong mun mà ngc li cho
phép chúng phát trin cũng trên môi trng đó nhng có th bit phân bit các
nhóm vi sinh vt mong mun vi các nhóm khác bằng các đặc đim nhn dng.
Môi trng cũng có th đc thit lp đ chọn lọc các loài nm mc. Mặt
dù kỹ thut đm khun lc không phi là phng pháp đc chọn cho vic xác
đnh s lng nm mc trong các mu thc phm và trong môi trng. Bi vì

kỹ thut này ch thích hp cho vic đnh lng các loài vi sinh vt không có si
hay bào tử. Dĩ nhiên phng pháp đm khun lc cũng thích hp cho vic đnh
lng các loài nm men. Vì s lng ca vi khun luôn nhiu hn s lng ca
nm mc nên đ ngăn cn s phát trin ca vi khun trong các khun lc ca
nm mc, các tác nhân c ch vi khun đc thêm vào trong các môi trng
nuôi cy. Các thuc nhum bengal rose và các kháng sinh nh streptomycine,
neomycine thng đc sử dng là nhng tác nhân c ch vi khun. Mt bin
pháp đn gin đ c ch s phát trin ca vi khun là h thp pH ca môi
trng nuôi cy xung khong 4,5 - 5,5. Hu ht các nm mc đu không b tác
đng khi phát trin trong khong pH này nhng khi đó vi khun b c ch.

22
Môi trng chọn đc xác lp công thc đ c ch s phát trin ca nhóm
vi sinh vt và cho phép mt nhóm vi sinh vt khác phát trin. Ví d môi trng
Saubouraud Dextrose Agar đc dùng đ đnh lng nm mc da trên nguyên
tắc pH thp và nguồn carbohydrate. Bổ sung vào môi trng các cht kháng
sinh khác nh peniciline hay methyl bule là nhng tác nhân c ch vi khun
gram âm. Các vi sinh vt kháng kháng sinh cũng có th đc đnh lng trên
môi trng bằng cách thêm vào đó mt liu lng kháng sinh.
Môi trng phân bit đc thit lp da trên nhiu cách. Các thuc thử
đc thêm vào trong môi trng đ cho phép nhn ra các s khác bit ca
nhng vi sinh vt mong mun. Có th thêm thuc thử vào môi trng sau khi
nuôi cy đ nhn ra các loài vi sinh vt đặc trng cn tìm. Chìa khoá nâng cao
kh năng phân bit ca môi trng là qui trình nuôi cy đ cho phép môi
trng phân bit mt cách tt nht vi vi sinh vt cn đnh lng và các vi sinh
vt khác có trong mu.
Môi trng Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là nhng môi
trng đc sử dng rng rãi trong vic phân tích vi sinh vt trong nc.
Nhng môi trng này bao gồm tính chọn lọc và tính phân bit. Chúng chọn
lọc cho s phát trin ca các vi khun gram âm bi trong đó có thêm vào các

tác nhân c ch các vi khun gram dng. Môi trng này có th phân bit các
vi khun có th sử dng lactose bi s hình thành các khun lc có th phân
bit bằng màu sắc. Trên môi trng EMB, vi khun thuc nhóm coliforms là
nhóm gram âm to nên nhng khun lc có màu tím ánh kim. Đnh lng s
lng coliform bằng cách đm s lng khun lc có các đặc đim này. Cách
này thng xuyên đc s dng trong vic phân bit các vi sinh vt ch th
trong nc và trong thc phm.
Vi kỹ thut đn khun lc, các mu cn phân tích phi đc pha loãng
thành chui pha loãng liên tip và đc xác đnh mt vài nồng đ pha loãng
nht đnh đ cy vào các môi trng đã chọn phù hp vi các đi tng cn
xác đnh. Mổi khun lc đc hình thành đc gán cho mt đn v hình thành
khun lc (cfu-colony forming units). Kỹ thut thng qua các bc nh sau:
Dung dch pha loãng: mt s dung dch dùng đ pha loãng có th làm cht
t bào nh: nc mui, nc ct. Các dung dch pha loãng không đc dùng
ngay khi ly ra từ t lnh có th gây sc và làm cho vi sinh vt không th phát
trin đc. Dung dch pepton water là dung đch pha loãng đc sử dng nhiu
nht và đc xem là dung dch pha loãng cho tt c các loi mu. Nu trong
mu còn có mt ít các cht khử trùng thì phi thêm vào dung dch pha loãng tác
nhân gim thiu kh năng khử trùng ca chúng, ví d: nu trong mu còn d
lng ca các hp cht amonium (NH4-) thì có th thêm vào đó Tween 80 hay
lecithin. Ngc li nu trong mu có cha các hp cht chlorin hay iodin thì
cn thêm vào đó các mui nh sodium thiosulphate.

23
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
Bm chính xác 9ml dung dch pha loãng vào trong ng nghim có nắp
đy. Nu sử dng các ng nghim có nắp không đóng chặc đc thì phi khử
trùng ng nghim, sau đó bm dung dch pha loãng vào, các thao tác này phi
đc thc hin mt cách vô trùng. Phân phi dung dch pha loãng vào các ng
sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đm bo th tích dung dch pha loãng không

b mt do quá trình khử trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thuc vào từng loi
mu. C th nh sau:
- Nu pha loãng các mu là cht lng, trc khi pha loãng mu phi đc
lắc kỹ, cắm đu pippette sâu vào trong mu khong 1” hút ra 1ml, cho vào
trong ng cha dung dch pha loãng đu tiên, lắc kỹ ng nghim cha mu, b
pippette vừa sử dng, dùng mt pipptte mi thc hin li thao tác nh trên vi
các đ pha loãng tip theo. C tip tc nh vy cho đn khi đt đc đ pha
loãng mong mun. Mi đ pha loãng ch đc phép sử dng 1 pippette. Hàm
lng mu trong 1ml dung dch các đ pha loãng ca dãy nh sau:

ng s 1 2 3 4
T l pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Th tích mu
ban đu (ml)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Đ pha loãng 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4




- Đi vi các mu rắn hay bán lng, các thao tác đc tin hành nh sau:

cân 10 g mu vào trong các bao dp mu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml

24
dung dch pha loãng và đồng nht mu, phi đm bo sao cho vi khun phân
tán đu vào trong dung dch. Sau khi mu và dung dch pha loãng đc đồng
nht ta đc dung dch pha loãng 1/10. Các đ pha loãng sau đc tin hành
tng t nh phn pha loãng mu lng. Trong 1ml các dung dch pha loãng
cha hàm lng mu nh sau:

ng s 1 2 3 4
T l pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Th tích mu
ban đu (g)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Đ pha loãng 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4


Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
Các môi trng agar đc đun chy trong các chai hay trong các ng
nghim có th tích phù hp. Đc làm mát trong các b điu nhit  45
o

C.
Hút 1ml mi dung dch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mi đ
pha loãng thng đc cy vào hai đĩa petri hay nhiu hn. Cũng s dng các
pippette sch cho mi đ pha loãng. Ch chọn cy vào đĩa petri nhng đ pha
loãng có mt đ vi sinh vt phù hp, thng trong khong 25-300 t bào/ml.
Đ vào mi đĩa đã cy 10-15ml môi trng đã đc đun chy và làm ngui, lắc
đĩa theo chiu và ngc chiu kim đồng hồ khong 5-6 ln, đặc đĩa lên mặt
phẳng ngang và đi cho đn khi môi trng trong đĩa đông đặc. Lt ngc đĩa
và  trong điu kin nhit đ và thi gian xác đnh.
Cấy mẫu trên bề mặt
Đây là phng pháp thay th cho phng pháp đổ đĩa đ phân tích các ch
tiêu vi sinh trong thc phm, nht là các ch tiêu vi sinh vt nhy cm vi nhit đ
nh Pseudomonas, các vi sinh vt này s b suy yu khi tip xúc vi nhit đ ca
môi trng agar  trng thái lng. Phng pháp này cũng đc dùng đ phân tích
các ch tiêu mà các dòng nhn đc phi cy chuyn  các bc tip theo.
Cy 0,1ml hay th tích phù hp lên b mặt bằng pipettes hay bằng que cy
lên đĩa môi trng đã đc làm khô và tri đu bằng que cy trang hay que cy
vòng đ trãi mu trên khắp b mặt môi trng. U các đĩa đã cy  điu kin
nhit đ và thi gian xác đnh tuỳ theo từng ch tiêu phân tích, đm các khun
lc đặc trng hay tt c các khun lc xut hin trên đĩa.
Khi đm các khun lc, trong mt s trng hp xut hin các khun lc
mọc lan, thông thng các khun lc khác cũng đc nhìn thy bên trong các
vt khun lc loang. Khi đm ta ch coi khun lc loang là mt đn v hình