Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trong cấy ghép và tái tạo xương trên cơ sở hydrogel composite sinh học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.47 MB, 196 trang )
VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU
NGUYỄN THỊ PHƢƠNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU
MỚI TRONG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO
XƯƠNG TRÊN CƠ SỞ HYDROGEL
COMPOSIT SINH HỌC GỒM BIPHASIC
CALCIUM PHOSPHATE VÀ POLYMER
SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC VẬT LIỆU
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU
NGUYỄN THỊ PHƢƠNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU
MỚI TRONG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO
XƯƠNG TRÊN CƠ SỞ HYDROGEL
COMPOSIT SINH HỌC GỒM BIPHASIC
CALCIUM PHOSPHATE VÀ POLYMER
SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN)
Chuyên ngành: VẬT LIỆU CAO PHÂN TỬ VÀ TỔ HỢP
Mã số: 62440125
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC VẬT LIỆU
Những ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA
2. TS. TRẦN NGỌC QUYỂN
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
i
LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Cửu Khoa và TS. Trần Ngọc Quyển, những người Thầy đã dành cho tôi sự
động viên giúp đỡ tận tình và những định hướng khoa học hiệu quả trong suốt
quá trình thực hiện luận án này.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và khích lệ của các cán bộ, đồng nghiệp
khác trong Viện Khoa học vật liệu ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Khoa
học vật liệu đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Luận án này được hỗ trợ kinh phí của đề tài nghiên cứu cơ bản của
Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số
104.04-2011.49.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn và thực sự không thể quên được sự giúp đỡ
tận tình của các thầy cô, bạn bè, anh em xa gần và sự động viên, tạo điều kiện
của những người thân trong gia đình trong suốt quá trình tôi hoàn thành luận
án này.
Tp. HCM, tháng 01 năm 2015
Tác giả
Nguyễn Thị Phƣơng
ii
LỜI CAM ĐOAN
Công trình được thực hiện tại phòng Hóa dược − Viện Khoa học Vật
liệu ứng dụng − Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố
Hồ Chí Minh.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Cửu Khoa và TS. Trần Ngọc
Quyển. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, được
hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên
cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.
Tác giả luận án
Nguyễn Thị Phƣơng
iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4
1.1.GIỚI THIỆU VẬT LIỆU DÙNG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO XƢƠNG 4
1.1.1.Thành phần, cấu tạo của xƣơng 4
1.1.2.Vật liệu dùng cấy ghép và tái tạo xƣơng 8
1.2.HYDROGEL 12
1.2.1.Giới thiệu về hydrogel 12
1.2.2.Tính chất của hydrogel 20
1.3.HYDROGEL COMPOSIT 23
1.3.1.Giới thiệu về hydrogel composit 23
1.3.2.Biphasic calcium phosphate 27
1.3.3.Polymer sinh học và các phản ứng biến tính, polyethyleneglycol
hóa polymer sinh học (gelatin và chitosan) 32
1.3.4.Ứng dụng của hydrogel composit trong cấy ghép và tái tạo
xƣơng 37
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 42
2.1. HÓA CHẤT 42
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 43
2.3. PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 44
2.3.1. Tổng hợp BCP 44
2.3.2. Tổng hợp hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 45
2.3.3. Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 46
2.3.4. Tổng hợp hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 48
2.3.5. Tổng hợp hydrogel composit TA-Te-Chitosan /BCP 50
2.3.6. Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 52
2.3.7. Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 55
iv
2.4. CÁC KHẢO SÁT CÁC TÍNH CHẤT CỦA HYDROGEL VÀ
HYDROGEL COMPOSIT 58
2.4.1. Khảo sát thời gian tạo gel của hydrogel và hydrogel composit 58
2.4.2. Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composit 58
2.4.3. Khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel và hydrogel
composit 58
2.4.4.Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel và hydrogel
composit 58
2.4.5. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel
composit 59
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 62
3.1 TỔNG HỢP BCP 62
3.1.1 Kết quả phân tích XRD của BCP 62
3.1.2. Kết quả phân tích IR của BCP 65
3.1.3. Kết quả khảo sát hình thái của BCP bằng hình ảnh SEM 66
3.2 HYDROGEL COMPOSIT TA-Gelatin/BCP 68
3.2.1. Tổng hợp TA-Gelatin 68
3.2.2. Tổng hợp hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-
Gelatin/BCP 70
3.2.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit
TA-Gelatin/BCP 73
3.2.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-Gelatin
và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 73
3.3. HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-GELATIN/BCP 74
3.3.1. Tổng hợp TA-PEG-Gelatin 75
3.3.2. Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-
PEG-Gelatin/BCP 80
v
3.3.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel
composit TA-PEG-Gelatin/BCP 82
3.3.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-
Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 83
3.3.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-Gelatin
và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 84
3.3.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 86
3.4. HYROGEL COMPOSIT HPA-CHITOSAN/BCP 89
3.4.1. Tổng hợp HPA-Chitosan 89
3.4.2. Tổng hợp hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-
Chitosan/BCP 91
3.4.3. Khảo sát hình thái hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel
composit HPA-Chitosan/BCP 93
3.4.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel HPA-
Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 93
3.5. HYROGEL COMPOSIT TA-Te-Chitosan 95
3.5.1. Tổng hợp TA-Te-Chitosan 95
3.5.2. Tổng hợp hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-
Te-Chitosan/BCP 100
3.5.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP 101
3.5.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-Te-
Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 102
3.5.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-Te-Chitosan
và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 104
vi
3.5.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-Te-Chitosan và
hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 106
3.6. HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-CHITOSAN/BCP 108
3.6.1. Tổng hợp TA-PEG-Chitosan 108
3.6.2. Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit
TA-PEG-Chitosan/BCP 111
3.6.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel
composit TA-PEG-Chitosan/BCP 113
3.6.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-
Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 113
3.6.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-
Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 114
3.6.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 117
3.7. HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-CHITOSAN OXI HÓA/BCP 119
3.7.1. Tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa 119
3.7.2. Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel
composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 122
3.7.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 124
3.7.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-
Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi
hóa/BCP 125
3.7.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-Chitosan
oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 126
3.7.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Chitosan
oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP . 128
vii
3.8. SO SÁNH CÁC HỆ HYDROGEL VÀ HYROGEL COMPOSIT
TRÊN CƠ SỞ POLYMER SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN) VÀ
BCP 130
KẾT LUẬN 135
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 137
TÀI LIỆU THAM KHẢO 139
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Sơ đồ tổng hợp BCP P1
Phụ lục 2: Sơ đồ tổng hợp TA-Gelatin P2
Phụ lục 3: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Gelatin P3
Phụ lục 4: Sơ đồ tổng hợp HPA-Chitosan P4
Phụ lục 5: Sơ đồ tổng hợp TA-TE-Chitosan P5
Phụ lục 6: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Chitosan P6
Phụ lục 7: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa P7
Phụ lục 8: Xây dựng đƣờng chuẩn β-TCP P8
Phụ lục 9: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,57 tại các pH:
(a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 P9
Phụ lục 10: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,61 tại các pH:
(a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 P10
Phụ lục 11: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,57: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11 P11
Phụ lục 12: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,61: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11 P12
Phụ lục 13: Xây dựng đƣờng chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ Tyramin P13
Phụ lục 14: Phổ FTIR của gelatin P14
Phụ lục 15: Phổ FTIR của TA-PEG-gelatin P14
viii
Phụ lục 16: Giản đồ XRD (a) hydrogel TA-PEG-gelatin và hydrogel composit
TA-PEG-gelatin/BCP trƣớc khi ngâm dung dịch SBF, (b) hydrogel composit
TA-PEG-gelatin/10%BCP sau khi ngâm dung dịch SBF P15
Phụ lục 17: Xây dựng đƣờng chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ HPA P16
ix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1. Danh mục các ký hiệu
W
0
Khối lƣợng mẫu ban đầu
Wt
Khối lƣợng mẫu tại thời gian t
A
Độ hấp thu
C
Nồng độ dung dịch
2. Danh mục các chữ viết tắt
BCP
Biphasic calcium phosphate
HAp
Hydroxyapatite
-TCP
Bêta-tricalcium phosphate
TA
Tyramin
TA-Gelatin
Tyramin-Gelatin
TA-PEG-
Gelatin
Tyramin-Polyethylenglycol-Gelatin
HPA
4-hydroxyl phenylacetic axit
HPA-Chitosan
Hydroxyl phenylacetic axit-Chitosan
Te
Tetronic
TA-Te-
Chitosan
Tyramin-Tetronic-chitosan
TA-PEG-
Chitosan
Tyramin-Polyethylenglycol-Chitosan
TA-PEG-
Chitosan oxi
hóa
Tyramin-Polyethylenglycol-Chitosan oxi hóa
HRP
Horseradish peroxidase
UV-Vis
Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible Spectrum)
PLA
Polylactic axit
x
PLGA
poly(lactic-co-glycolic) axit
PPO
Poly propylene oxid
PEO
Poly ethylene oxid
PEG
Poly (ethyleneglycol)
DMF
Dimethyl formamide
THF
Tetrahydrofurane
NPC
p-nitrophenyl chloroformate
EDC
1-3 Dimethylamino -5- ethyl carbodiimide
1
H-NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Da
Dalton
M
W
Molecular weight
MWCO
Molecular weight cut-off
xi
DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Cấu tạo của xƣơng 4
Hình 1.2: Thành phần, cấu trúc của collagen (hydroxylysyl pyridinoline
và lysyl pyridinoline) 6
Hình 1.3: Liên kết ngang 14
Hình 1.4: Phản ứng Michael 15
Hình 1.5: Phản ứng liên kết ngang hình thành hydrogel giữa các protein dƣới
xúc tác của enzyme transaminase 16
Hình 1.6: Phản ứng liên kết ngang hình thành hydrogel giữa các protein dƣới
xúc tác của enzyme tyrosinase 16
Hình 1.7. Enzyme HRP và cơ chế xúc tác hình thành gốc tự do phenoxyl tham
gia tạo liên kết ngang 17
Hình 1.8: Phản ứng tạo gel bằng enzyme horseradish peroxidase (HRP) 17
Hình 1.9: Tƣơng tác kỵ nƣớc 18
Hình 1.10: Tƣơng tác ion 19
Hình 1.11: Sự trƣơng nở của hydrogel 20
Hình 1.12: Các giai đoạn của quá trình lành xƣơng 25
Hình 1.13: Phản ứng oxi hóa cellulose: (a) oxi hóa alcohol bậc một; (b) oxi
hóa cắt diol 34
Hình 1.14: Phản ứng oxi hóa chitosan 35
Hình 1.15: Ảnh minh họa sự tƣơng tác giữa hydrogel trên cơ sở chitosan oxi
hóa với collagen trong mô 36
Hình 2.1: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Gelatin 46
Hình 2.2: Các bƣớc tổng hợp Tyramin-Tetronic-Chitosan 50
Hình 2.3: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Chitosan 49
Hình 2.4: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa 55
xii
Hình 3.1: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53 tại các pH: (a)
pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 62
Hình 3.2: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11 65
Hình 3.3: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp bằng phƣơng pháp kết tủa kết
hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol ca/P=1,61 tại pH=9 66
Hình 3.4: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa không
sử dụng sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,67 tại pH=8 (h-1) và
pH=9 (i-1) 67
Hình 3.5: Hình ảnh SEM của HAp và β-TCP tại các điều kiện phản ứng khác
nhau 67
Hình 3.6: Sơ đồ tổng hợp TA-Gelatin 68
Hình 3.7: Phổ
1
HNMR của TA-Gelatin 68
Hình 3.8: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel
composit TA-Gelatin/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/TA-Gelatin tại lƣợng
HRP/TA-Gelatin là 0,00025% và nồng độ TA-Gelatin 10%
71
Hình 3.9: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel
composit TA-Gelatin/BCP theo lƣợng HRP/TA-Gelatin tại lƣợng
H
2
O
2
/TA-Gelatin là 0,01% và nồng độ TA-Gelatin 10% 71
Hình 3.10: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit
TA-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 73
Hình 3.11:Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel và hydrogel composit
TA-Gelatin/BCP theo thời gian 74
Hình 3.12: Sơ đồ tổng hợp PEG NPC 75
Hình 3.13: Phổ
1
H NMR của NPCPEGNPC 75
Hình 3.14: Sơ đồ tổng hợp TA- PEG NPC 76
Hình 3.15: Phổ
1
H NMR của TAPEGNPC 77
xiii
Hình 3.16: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Gelatin 78
Hình 3.17: Phổ
1
H NMR TAPEGgelatin 78
Hình 3.18: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/TA-
PEG-Gelatin tại lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin là 0,00025% và
nồng độ TA-PEG-Gelatin 10%
80
Hình 3.19: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lƣợng HRP/TA-
PEG-Gelatin tại lƣợng H
2
O
2
/TA-PEG-Gelatin là 0,0125% và
nồng độ TA-PEG-Gelatin 10% 81
Hình 3.20: Hình ảnh SEM của TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-
PEG-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 82
Hình 3.21: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo thời gian 83
Hình 3.22: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 84
Hình 3.23: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel
TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
sau thời gian 5 ngày 85
Hình 3.24: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Gelatin sau 2 tuần
ngâm trong dung dịch SBF 86
Hình 3.25: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-
Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 87
Hình 3.26: Sơ đồ tổng hợp HPA-Chitosan 88
Hình 3.27: Phổ
1
H NMR của HPA-Chitosan 89
Hình 3.28: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel
composit HPA-Chitosan/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/HPA-Chitosan
xiv
tại lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin là 0,00025% và nồng độ HPA-
Chitosan 5%
91
Hình 3.29: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel
composit HPA-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/HPA-Chitosan tại
lƣợng H
2
O
2
/TA-PEG-Gelatin là 0,005% và nồng độ HPA-
Chitosan 5% 92
Hình 3.30: Hình ảnh SEM của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit
HPA-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 93
Hình 3.31: Đồ thị thời gian suy giảm của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel
composit HPA-Chitosan/BCP 94
Hình 3.32: Sơ đồ tổng hợp Tetronic NPC 95
Hình 3.33: Phổ
1
H NMR của TetronicNPC 95
Hình 3.34: Sơ đồ tổng hợp TA Tetronic NPC 96
Hình 3.35: Phổ
1
H NMR của TyraminTetronicNPC 97
Hình 3.36: Sơ đồ tổng hợp TA Tetronic Chitosan 98
Hình 3.37: Phổ
1
H NMR của TyramintetronicChitosan 98
Hình 3.38: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/TA-Te-Chitosan
tại lƣợng HRP/TA-Te-Chitosan là 0,0025% và nồng độ TA- Te-
Chitosan 10%
101
Hình 3.39: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/TA-Te-Chitosan
tại lƣợng H
2
O
2
/TA-Te-Chitosan là 0,05% và nồng độ TA- Te-
Chitosan 10% 101
Hình 3.40: Hình ảnh SEM của hydrpgel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 102
xv
Hình 3.41: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-Te-Chitosan và
hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP theo thời gian 103
Hình 3.42: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-Te-Chitosan và
hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 104
Hình 3.43: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel
TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP sau
thời gian 5 ngày 105
Hình 3.44. Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-Te-Chitosan sau 2 tuần
ngâm trong dung dịch SBF
Hình 3.45.Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-Te-
Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 107
Hình 3.46: Sơ đồ tổng hợp TAPEGChitosan 109
Hình 3.47: Phổ
1
H NMR TAPEGChitosan 109
Hình 3.48: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/TA-
PEG-Chitosan tại lƣợng HRP/TA-PEG-Chitosan là 0,005% và
nồng độ TA-PEG-Chitosan 10%
111
Hình 3.49: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/TA-
PEG-Chitosan tại lƣợng H
2
O
2
/TA-PEG-Chitosan là 0,08% và
nồng độ TA-PEG-Chitosan 10% 112
Hình 3.50: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel
composit TA-PEG-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau . 113
Hình 3.51: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo thời gian 114
Hình 3.52: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 115
xvi
Hình 3.53: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel
TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP
sau thời gian 5 ngày 116
Hình 3.54: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Chitosan sau 2 tuần
ngâm trong dung dịch SBF 117
Hình 3.55: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-
Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 118
Hình 3.56: Sơ đồ phản ứng oxi hóa chitosan 119
Hình 3.57: Sơ đồ tổng hợp PEG ghép chitosan oxi hóa 120
Hình 3.58: Phổ
1
H NMR của TAPEGchitosan oxi hóa 120
Hình 3.59: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa
và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP theo lƣợng
H
2
O
2
/TA-PEG-Chitosan oxi hóa tại lƣợng HRP/TA-PEG-Chitosan
oxi hóa là 0,008% và nồng độ TA-PEG-Chitosan oxi hóa 10%
123
Hình 3.60: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa
và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP theo lƣợng
HRP/TA-PEG-Chitosan oxi hóa tại lƣợng H
2
O
2
/TA-PEG-Chitosan
oxi hóa là 0,08% và nồng độ TA-PEG-Chitosan oxi hóa 10% 123
Hình 3.61: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP với các lƣợng
BCP khác nhau 124
Hình 3.62: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi
hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP theo
thời gian 125
Hình 3.63: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Chitosan
oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 126
xvii
Hình 3.64: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel
TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-
Chitosan oxi hóa/BCP sau thời gian 5 ngày 127
Hình 3.65: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa
sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 128
Hình 3.66: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-Chitosan
oxi hóa/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 129
xviii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 42
Bảng 2.2 Các chất để pha 1000mL SBF có pH=7,4 61
Bảng 3.1: Tổng hợp các thông số và phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp
theo tỉ lệ mol Ca/P 64
Bảng 3.2: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Gelatin 69
Bảng 3.3: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Gelatin 79
Bảng 3.4: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch
SBF 87
Bảng 3.5: Tính toán lƣợng HPA có trong HPA-Chitosan 90
Bảng 3.6: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Te-Chitosan 99
Bảng 3.7: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch
SBF 107
Bảng 3.8: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Chitosan 110
Bảng 3.9: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch
SBF 118
Bảng 3.10: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Chitosan oxi hóa 121
Bảng 3.11: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP sau 2 tuần
ngâm trong dung dịch SBF 129
Bảng 3.12: So sánh các hydrogel và hydrogel composit trên cơ sở polymer
sinh học (gelatin, chitosan) và BCP 132
1
MỞ ĐẦU
Vật liệu y sinh đã và đang đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ để đáp ứng nhu
cầu thay thế các bộ phận cơ thể, cấy ghép mô, xƣơng của con ngƣời, hứa hẹn
cho việc chữa trị và tái tạo các mô và cơ quan bị mất hoặc bị tổn thƣơng do
chấn thƣơng, bệnh tật hoặc lão hóa.
Trong lĩnh vực vật liệu dùng cho xƣơng, nhiều loại vật liệu dùng trong
cấy ghép và thay thế xƣơng đã phát triển đáng kể trong những thập kỷ qua
nhƣ kim loại và hợp kim (titan, hợp kim của titan, thép không rỉ ). Những
vật liệu này tuy tƣơng hợp sinh học nhƣng tính chất cơ lý của kim loại, hợp
kim khác biệt nhiều so với xƣơng dẫn đến nguy cơ gãy xƣơng do kém tƣơng
thích giữa phần xƣơng tiếp xúc với kim loại ghép.
Vì vậy, các nhà khoa học trên thế giới hiện nay quan tâm đến vật liệu
trên cơ sở Hydroxyapatite (HAp) và biphase calcium phosphate (BCP). HAp
và BCP có tính tƣơng hợp sinh học, hoạt tính sinh học cao, và khả năng chữa
lành xƣơng do thành phần tƣơng tự thành phần khoáng trong xƣơng. Mặt
khác, HAp và BCP có thể từ từ hòa tan trong cơ thể giải phóng ion calcium và
phosphate có lợi trong việc hình thành và phát triển xƣơng. Tuy nhiên HAp
và BCP ở dạng bột nên khó tạo hình có thành phần, cấu trúc xốp tƣơng tự nhƣ
xƣơng.
Hydrogel composit trên cơ sở BCP và polymer sinh học có thành phần,
cấu trúc xốp tƣơng tự xƣơng, tƣơng hợp sinh học, suy giảm sinh học và BCP
thúc đẩy sự tạo khoáng, cải thiện tính chất cơ học của vật liệu. Nhƣng các vật
liệu này suy giảm nhanh, chƣa phù hợp với sự phát triển của xƣơng.
Để giải quyết vấn đề trên cần thiết phải biến tính các polymer sinh học
nhằm giảm khối lƣợng suy giảm, hƣớng tới ứng dụng các vật liệu hydrogel
composit này trong cấy ghép và tái tạo xƣơng.
2
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu
mới trong cấy ghép và tái tạo xƣơng trên cơ sở hydrogel composit sinh
học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin,
chitosan)”.
Mục tiêu của luận án:
Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trên cơ sở hydrogel composit sinh
học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)
nhằm mục đích tạo ra vật liệu có khả năng tƣơng hợp sinh học, kích thích sự
phát triển xƣơng, có thời gian suy giảm phù hợp với thời gian xƣơng phát
triển để có thể ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.
Nội dung nghiên cứu luận án bao gồm:
- Nghiên cứu tổng hợp nano BCP bằng phƣơng pháp kết tủa kết hợp
sóng siêu âm ứng dụng trong vật liệu sinh y.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
gelatin (TA-Gelatin) và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
polyethyleneglycol gelatin (TA-PEG-Gelatin) và hydrogel composit TA-
PEG-Gelatin/BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel
hydroxyphenyl acetic chitosan (HPA-Chitosan) và hydrogel composit HPA-
Chitosan /BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
tetronic chitosan (TA-TE-Chitosan) và hydrogel composit TA-TE-
Chitosan/BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
polyethyleneglycol chitosan (TA-PEG-Chitosan) và hydrogel composit TA-
PEG-Chitosan/BCP.
3
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
polyethyleneglycol chitosan oxi hóa (TA-PEG-Chitosan oxi hóa) và hydrogel
composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP.
4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VẬT LIỆU DÙNG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO
XƢƠNG
1.1.1. Thành phần, cấu tạo của xƣơng
Xƣơng của động vật có chức năng cơ học và chức năng cân bằng nội
môi (biological homeostasis). Xƣơng đảm nhận các vai trò trong việc tạo hình
cơ thể, tạo các khoang chứa cơ quan nội tạng, hỗ trợ quá trình vận động, là
nơi sản sinh các tế bào máu, lƣu trữ và cung cấp các ion khoáng.
Xƣơng là vật liệu dạng composit có thành phần bao gồm chất nền hữu
cơ (organic matrix), các khoáng chất, tế bào và nƣớc [1]. Sự tích hợp của các
khoáng chất trong chất nền hữu cơ làm cho xƣơng có tính chất cơ học cao do
kết hợp giữa các tính chất giòn của khoáng chất và tính đàn hồi của chất nền
hữu cơ [2].
Hình 1.1: Cấu tạo của xƣơng ( />skeleton-of-a-human-body-laboratory-exercise)
Xƣơng tƣơng đối cứng đƣợc tạo bởi hydroxyapatite Ca
5
(PO
4
)
3
OH.
Xƣơng có sức nén tƣơng đối cao nhƣng sức căng kém, khá giòn và có độ co
giãn phụ thuộc vào thành phần sinh học. Xƣơng có thành phần, cấu trúc mắt
5
lƣới và từng vùng khác nhau của xƣơng có độ đặc khác nhau. Cơ thể ngƣời có
206 xƣơng và đƣợc chia làm 3 phần: xƣơng đầu, xƣơng mình và xƣơng chi.
Xƣơng có hai loại rắn chắc và xốp. Vỏ (lớp ngoài) xƣơng rắn chắc
chiếm phần lớn khối lƣợng của xƣơng. Vỏ xƣơng đặc nên có diện tích bề mặt
thấp. Xƣơng xốp có thành phần, cấu trúc tổ ong, có diện tích bề mặt lớn,
nhƣng chỉ chiếm phần nhỏ khối lƣợng của xƣơng.
Xƣơng có thể mềm hay cứng. Xƣơng mềm với thành phần, cấu trúc
không đồng nhất, sức chịu nén kém có thể thay thế trong quá trình phát triển
hoặc hồi phục xƣơng. Xƣơng mềm thƣờng đƣợc thay thế bởi xƣơng cứng
trong quá trình phát triển xƣơng.
a. Chất nền hữu cơ
Nhƣ trên đã nói, xƣơng bao gồm những tế bào sống (living cells) nằm
bên trong chất nền hữu cơ-khoáng (mineralized organic matrix). Chất nền này
chứa thành phần hữu cơ (phần lớn là collagen) và thành phần vô cơ (chủ yếu
là các hydroxyapatite). Thành phần hữu cơ chiếm khoảng 30% khối lƣợng
xƣơng và 70% khối lƣợng xƣơng là hydroxyapatite. Các bó sợi collagen tạo
nên tính co dãn (tensile strength) và kết hợp với (synergistic) các tinh thể
hydroxyapatite phân bố bên trong giữa các sợi collagen tạo nên tính chịu nén
(compressional strength) của xƣơng.
Collagen loại I là thành phần chính của chất nền hữu cơ của xƣơng,
chiếm khoảng 30% của chất nền khô không khử khoáng (dry
nondemineralized matrix). Collagen loại I là một dị polymer (heteropolymer)
của hai chuỗi giống nhau và một chuỗi riêng biệt, mỗi chuỗi đều có thành
phần, cấu trúc chính (Gly-X-Y)n, trong đó X và Y thƣờng là proline hoặc
hydroxyproline [3]. Mô tip phổ biến nhất trong dãy axit amino của collagen là
glycin-proline-X và glycin-X-hydroxyproline, với X là axit amino bất kỳ nào
đó khác với glycin, proline hay hydroxyproline.
