Sử dụng chỉ thị phân tử SSR đánh giá sự đa dạng di truyền tập đoàn nấm mốc Aspergillus oryzae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI














NGUYỄN THỊ THU PHƯƠNG




SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA
DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae




LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI













NGUYỄN THỊ THU PHƯƠNG

SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA
DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
TS. ðẶNG XUÂN NGHIÊM





HÀ NỘI - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác.
Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều
ñược ghi rõ nguồn gốc.

Học viên

Nguyễn Thị Thu Phương















Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

ii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ
Vi sinh và Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông
nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều
sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng
tới TS. ðặng Xuân Nghiêm, người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn

thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Nguyễn Ngọc Hòa,
Ks. Nguyễn Ngọc Chỉnh, Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt
tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo Khoa
Công nghệ Sinh học Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tạo mọi ñiều
kiện và giúp ñỡ tôi trong suốt 2 năm học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình,
bạn bè, ñồng nghiệp ñã luôn ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 12 tháng 09 năm 2013
Học viên


Nguyễn Thị Thu Phương


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

iii

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

iv

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iv

Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
Danh mục viết tắt viii
TÓM TẮT 1
MỞ ðẦU 2
1. ðặt vấn ñề 2
2. Mục ñích, yêu cầu của ñề tài 3
2.1. Mục ñích của ñề tài 3
2.2. Yêu cầu của ñề tài 3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Nấm mốc A. oryzae 4
1.1.1. ðặc ñiểm của A. oryzae 4
1.1.2. Ứng dụng 5
1.2. Protease nấm mốc 6
1.2.1. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp protease 6
1.2.2. Ứng dụng của protease nấm mốc 11
1.3. Tổng quan về SSRs (Simple sequence repeats) 13
1.3.1. Khái niệm 13
1.3.2. Phân loại SSRs 13
1.3.3. ðặc ñiểm di truyền của SSRs 14
1.3.4. Cơ chế tạo ñột biến của SSRs 15
1.3.5. Phân bố của SSRs 15
1.3.6. Vai trò của SSRs 16
1.3.7. Các phương pháp phát hiện các trình tự SSRs 17
1.3.8. Phân tích trình tự SSRs 18
1.4. Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan ñến ñề tài 19
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

v

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 22
2.1.1. Vật liệu 22
2.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 26
2.2.1. Phân lập và nhận diện nấm A. oryzae dựa trên ñặc ñiểm hình thái 26
2.2.2. Phát hiện các trình tự SSRs bằng phầm mềm tin sinh học 26
2.2.3. Thiết kế mồi bằng tiện ích của Workbench 3.2 26
2.2.4. Tách chiết DNA tổng số 27
2.2.5. Phản ứng PCR kiểm tra sự ña hình ở các locus SSR 27
2.2.6. Phân tích kết quả 27
2.2.7. Khảo sát pH tối thích của các enzyme protease ngoại bào của các isolate
A. oryzae bằng phương pháp khuyếch tán ñĩa thạch. 28
2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ của enzyme 28
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Kết quả phân lập chủng nấm mốc A. oryzae 29
3.2. Hệ SSR của Aspergillus oryzae và mồi nhân dòng các locus SSR tiềm
năng 32
3.3. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi cho các ñoạn SSR tiềm năng 37
3.4. Khảo sát sự ña hình của 19 locus SSR 40
3.4.1. Khảo sát ñánh giá mức ñộ ña hình của các locus SSR 40
3.4.2. Khảo sát mức ñộ tương ñồng di truyền của các chủng Aspergillus oryzae 42
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH và ñộ bền nhiệt của enzyme protease của
nấm mốc 44
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của protease 44
3.5.2. Khảo sát ñộ bền nhiệt của protease 47
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 50
1. Kết luận 50
2. ðề nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Các yếu tố thích hợp cho sự tổng hợp enzyme của A. oryzae 8
2.1 Danh sách các chủng nấm mốc sử dụng trong nghiên cứu trong ñề tài
22
2.2 Danh mục máy móc sử dụng trong ñề tài 24
2.3 Danh mục hóa chất sử dụng trong ñề tài 25
3.1 Một số ñặc ñiểm hình thái sai khác giữa các chủng nấm mốc 30
3.2 Sự phân bố của các locus SSR trên từng NST của A. oryzae 33
3.3 Phân loại SSR theo dạng lặp ở nấm mốc 34
3.4 Phân loại SSR theo mức ñộ hoàn hảo ở nấm mốc 35
3.5 Phân loại SSR dựa theo chiều dài ñoạn lặp ở nấm mốc 36
3.6 Danh sách 19 mồi nhân dòng các locus SSR ứng viên 38
3.7 Kết quả khảo sát sự ña hình của từng locus SSR 40
3.8 Hoạt tính của protease ngoại bào ở các pH khác nhau 45

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.2 Cấu trúc bộ gene của Aspergillus oryzae (Machida và cs., 2005). 5
3.1 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của một số chủng nấm mốc A. oryzae 32
3.2 Thành phần hệ SSR của A. oryzae theo score 37
3.3 Kết quả sản phẩm SSR của locus AoIV1.1 trên gel agarose 2,5% 41
3.4 Kết quả sản phẩm SSR của locus AoVIII 1.2 trên gel agarose 2,5% M:
thang chuẩn DNA 100Kb 41
3.5 Sơ ñồ hình cây về mức ñộ tương ñồng di truyền dựa trên 19 trình tự
SSR của 27 isolate A. oryzae. Thang trục hoành chỉ hệ số tương ñồng
(coefficient). 43
3.6 Hoạt tính của protease ở các pH khác nhau 47
3.7 Kết quả bền nhiệt của protease ngoại bào ở một số chủng A. oryzae ở các
mức nhiệt ñộ khác nhau: a: 30
0
C, b: 45

0
C, c: 60
0
C, d: 75
0
C, e: 90
0
C 48
3.8 Hoạt ñộ tương ñối của protease ngoại bào sau khi xử lý ở các nhiệt ñộ
khác nhau 49
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

viii

DANH MỤC VIẾT TẮT


A. oryzae : Aspergillus oryzae
A. kawachii : Aspergillus kawachii
A. flavus : Aspergillus flavus
A. fumigatus : Aspergillus fumigatus
A. nidulans : Aspergillus nidulans
A. niger : Aspergillus niger
AFLP : Amplified fragment length polymorphism
Bp : Base pair
DNA : Deoxyribonucleic acid
EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Kb : Kilo base
Mb : Mega base pair
NCBI :

National Center for Biotechnology
Information
NST : Nhiễm sắc thể
NXB : Nhà xuất bản
PCR : Polymerase chain reaction
PDA : Potato dextrose agar
RNA : Ribonucleic acid
RFLP : Restriction fragment length polymorphism




Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

1

TÓM TẮT

Aspergillus có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào hữu dụng, các acid hữu
cơ và các hợp chất trao ñổi thứ cấp có tầm quan trọng trong công nghệ sinh học. Trong
số hơn 15 loài Aspegillus có bộ gene ñã ñược nghiên cứu kỹ, hữu dụng nhất với ñời
sống con người là A. oryzae, loài này ñược sử dụng trong công nghệ lên men truyền
thống từ hàng ngàn năm nay. Ngày nay, A. oryzaeñược quan tâm nhiều trong lĩnh vực
sản xuất tương bởi khả năng phân giải protein và chất lượng sản phẩm cho giá trị dinh
dưỡng cao, an toàn. Tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ giữa sự
khác biệt về kiểu locus SSR và hệ enzyme protease ngoại bào của chúng. ðể hiểu rõ
hơn tiềm năng sinh enzyme ngoại bào của nhóm nấm mốc này một cách có hệ thống
chúng tôi ñã tiến hành: “Sử dụng chỉ thị phân tử SSR ñánh giá sự ña dạng di truyền tập
ñoàn nấm mốc Aspergillus oryzae”.
Những công việc chính trong ñề tài bao gồm phân lập các chủng nấm mốc

Aspergillus oryzae từ nhiều nguồn khác nhau (mẫu men rượu, mẫu mốc tương, mẫu hạt
mốc các loại); khảo sát về mặt hình thái qua ñó sơ bộ ñịnh danh và so sánh ñặc ñiểm
hình thái của các chủng.; nghiên cứu cấu trúc hệ SSR của A. oryzae từ ñó xác ñịnh tập
hợp các locus SSR có tiềm năng ña hình, ñánh giá sự ña dạng di truyền giữa các chủng
A. oryzae dựa trên việc chạy PCR nhân dòng các locus ñã chọn, so sánh hoạt tính của
protease ngoại bào của các chủng ở các ñiều kiện khác nhau (pH, nhiệt ñộ) và cuối
cùng so sánh sự giống và khác trong hệ enzyme của các nhóm ñã ñược phân chia theo
hình thái và kiểu gen các locus SSR nghiên cứu.
Trong phạm vi nghiên cứu của ñề tài, 26 chủng nấm mốc A. oryzae ñã ñược
phân lập, tuyển chọn và sơ bộ ñịnh danh. ðồng thời 19 locus SSR ñược xác ñịnh có
tính ña hình cao (hệ số PIC = 6,5 ÷ 8,9). Căn cứ vào ñó ñánh giá mối quan hệ di truyền
giữa các chủng theo 19 locus trên, chúng ñược chia thành 3 nhóm lớn và 8 nhóm nhỏ.
Nghiên cứu ñặc ñiểm hệ protease ngoại bào của các chủng nấm mốc A. oryzae, chúng
tôi xác ñịnh ñược khoảng pH thích hợp cho hoạt tính protease hoạt ñộng là 7,0 ÷ 9,0.
Hệ protease ngoại bào của các chủng hoạt ñộng mạnh trong khoảng nhiệt ñộ từ 30
o
C
cho tới 45
o
C, ở nhiệt ñộ 60
o
C hoạt tính protease bắt ñầu giảm và khi nhiệt ñộ tăng ñến
75
o
C và 90
o
C thì ña số chúng gần như mất hoạt tính. Trong thí nghiệm này chúng tôi ñã
xác ñịnh ñược các chủng có protease bền nhiệt khá tốt là M76, M36.2, M48.2, M60,
M67, M72.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

2

MỞ ðẦU

1. ðặt vấn ñề
Aspergillus là một chi nấm mốc ưa khí cao gồm vài trăm loài khác nhau, trong
ñó có loài chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử. Hình thái cuống bào tử ñính (conidiophore),
cấu trúc mang các bào tử ñơn tính, là ñặc ñiểm phân loại chính của nhóm sinh vật này.
Các loài Aspergillus phổ biến rộng rãi. Chúng là một trong những nhóm thành công
trong chiếm lĩnh các ổ sinh thái tự nhiên và có vai trò kinh tế quan trọng. Chúng
thường mọc trên các thực phẩm giàu tinh bột và trên/trong các thực vật.
Các nhà công nghệ sinh học quan tâm ñến các tiềm năng ứng dụng của
giống nấm mốc này như khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào hữu dụng, các
acid hữu cơ và các hợp chất trao ñổi thứ cấp có tầm quan trọng trong công nghệ
sinh học. Trong số hơn 15 loài Aspegillus có bộ gene ñược nghiên cứu kỹ, hữu dụng
nhất với ñời sống con người là A. oryzae, loài này ñược sử dụng trong công nghiệp
sản xuất ñồ uống có cồn và nước chấm. Chúng ñã ñược sử dụng hơn một ngàn năm
trong ngành công nghiệp lên men truyền thống ở các nước châu Á như: Nhật Bản,
Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam…v.v. ñể sản xuất rượu gạo, nước sốt hoặc nước
chấm bởi A. oryzae có khả năng tiết ra nhiều enzyme ngoại bào (Kobayashi và cs.,
2007; Machida và cs., 2008) như amylase, protease, cellulase, A. oryzae, ñặc
biệt sử dụng lên men ñể sản xuất axit kojic, sử dụng trong mỹ phẩm làm trắng da
(Bennett, 2010). Hơn nữa, A. oryzaevà sản phẩm lên men của chúng ñược sử dụng
bổ sung probiotic trong chăn nuôi thú y (KyungWoo và cs., 2006). Ngày nay, trong
công nghệ lên men truyền thống A.oryzae ñược chú trọng trong sản xuất nước tương
bởi vai trò hàng ñầu của chủng này là khả năng phân giải protein của chúng. Sản
phẩm nước chấm ñược lên men theo phương pháp truyền thống ñảm bảo an toàn
sức khỏe, giá trị dinh dưỡng cao cho người sử dụng so với con ñường thủy phân
bằng acid. Trong công nghệ sinh học, A. oryzaecó khả năng biểu hiện lượng lớn các

protein dị hợp. Gần ñây, A. oryzaeñã ñược phát triển như hệ thống biểu hiện ñể sản
xuất các enzyme tái tổ hợp và một số sản phẩm ñã ñược công nhận ñược áp dụng
trong thực phẩm (Ward và cs., 2006).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

3

Phương pháp khuyếch ñại các trình tự lặp lại ngắn ñơn giản (SSR - PCR) là
công cụ hữu ích và cho khả năng ứng dụng cao trong việc phân loại. Phương pháp
này ñược ñánh giá có khả năng cung cấp thông tin nhanh, ñặc trưng và nhiều nhất
từ một chỉ dấu ñơn (Gallego và cs., 2005; Schuller và cs., 2004) và nó cũng ñã ñược
sử dụng trong một số trường hợp ñể nghiên cứu di truyền của A. oryzae, A. flavus và
A. niger (Hadrich và cs., 2010; Tomimura và cs., 2009; Esteban và cs., 2008).
Hầu hết các nghiên cứu so sánh các phương pháp sinh học phân tử sử dụng
trong việc phân biệt các chủng/loài sinh vật về mặt di truyền phân tử ñều có chung
nhận ñịnh là phương pháp SSR- PCR là một công cụ hữu ích, kinh tế, ñáng tin cậy
và hiệu quả nhất (Gallego và cs., 2005). Tuy bộ gene của nấm mốc A. oryzae ñã
ñược giải trình tự nhưng chưa có nghiên cứu mang tính hệ thống ñiều tra về phân bố
các trình tự SSR và mức ñộ ña hình của từng locus (Goffeau và cs., 1996) cũng như
mối liên quan kiểu hình SSR với các ñặc ñiểm hệ enzyme protease của nhóm vi sinh
vật này. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Sử dụng chỉ thị phân tử SSR ñánh giá sự ña dạng di truyền tập ñoàn nấm
mốc Aspergillus oryzae”.
2. Mục ñích, yêu cầu của ñề tài
2.1. Mục ñích của ñề tài
Mục ñích của ñề tài là nghiên cứu cấu trúc hệ SSR của nấm mốc A. oryzae
dựa trên các công cụ tin sinh học. Từ cơ sở này, chúng tôi chọn lọc ñược tập hợp
các locus SSR có tiềm năng ña hình và ñánh giá ñược mức ñộ ña hình của từng
locus, mối quan hệ di truyền giữa các chủng A. oryzae nghiên cứu. ðồng thời,
chúng tôi nghiên cứu ñặc ñiểm và mối liên quan giữa kiểu hình SSR và ñặc ñiểm

của hệ enzyme protease ngoại bào của các chủng A. oryzae trong ñề tài.
2.2. Yêu cầu của ñề tài
Phân lập, mô tả và so sánh ñặc ñược ñiểm hình thái của các chủng nấm mốc
A. oryzae, nghiên cứu ñược kiểu gen một số locus SSR, chọn lọc tập hợp các locus
SSR ña hình, ñánh giá ñược mối quan hệ di truyền giữa các chủng A. oryzae.
Thu ñược dịch thô enzyme ngoại bào và ñánh giá ñược ñặc ñiểm protease
của các chủng nấm mốc A. oryzae phân lập ñược.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nấm mốc A. oryzae
1.1.1. ðặc ñiểm của A. oryzae
A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002).
A. oryzae có khả năng tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulose,
pectinase, xylanase, hemicellulase khi sống trên môi trường có nguồn cơ chất tương
ứng cellulose, pectin, xylan, hemicellulose. Chính nhờ khả năng này mà A. oryzae
ñã ñược ứng dụng rất rộng rãi trong công nghệ sản xuất nước chấm và ñồ uống có
cồn và trong công nghiệp sản xuất enzyme (MacKenzie và cs., 2000).
Cơ thể sinh dưỡng của A. oryzae là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh,
chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều tế
bào. Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi ñứng thẳng gọi là cuống
ñính bào tử, ở ñó có cơ quan sinh sản vô tính. Phía ñầu cuống ñính bào tử phồng lên
gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai (thể bình). ðầu các tế bào hình chai phân chia thành những
bào tử ñính vào nhau, nên gọi là ñính bào tử. ðính bào tử của A. oryzae có màu vàng lục

hay màu vàng hoa cau. Nấm mốc A. oryzae có các ñặc ñiểm sinh học sau:
+ Khuẩn lạc của nấm mốc A. oryzae nuôi trên môi trường thạch Czapek ở
25
o
C sau 7 ngày có ñường kính từ 4 – 5 cm.
+ Cuống ñính bào tử thường xen lẫn với hệ sợi nấm khí sinh.
+ Cuống ñính bào tử trong suốt dài từ 4- 5µm.
+ Bọng hình cầu, ñường kính 40-80 µm.
+ Thể bình thường sinh ra trực tiếp trên bọng hoặc trên cuống thể bình, thông
thường có kích thước 10-15 x 3-5 µm, cuống thể bình 8-12 x 4-5 µm.
+ ðính bào tử lúc non hình elip, hình cận cầu hoặc cầu lúc già, ñường kính 4,5-8
µm. ( Lê Văn Nhương, Quản Văn Thịnh, 1968; Nguyễn Lân Dũng và cs., 2003).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

5

Năm 2005, bộ gen di truyền của A. oryzae ñã ñược phân tích và giải mã. Bộ
genome A. oryzaegồm 8 NST với 37 triệu cặp base mã hóa cho khoảng 12322 gen
trong ñó tỷ lệ G + C chiếm khoảng 48.26% (Machida và cs., 2005).

Hình 1.2. Cấu trúc bộ gene của Aspergillus oryzae (Machida và cs., 2005).
1.1.2. Ứng dụng
Nấm mốc A. oryzae ñược sử dụng trong vài thế kỷ qua ñể sản xuất nhiều loại
thực phẩm lên men ở phương ðông như: nước tương, xốt tương, rượu Sake. Nấm
mốc A. oryzae còn ñược xem như là một loại mốc Koji an toàn trong hàng trăm năm
qua và còn dùng ñể sản xuất probiotic ñể bổ sung trong khẩu phần ăn của gia súc
(Machida và cs., 2008).
Theo Nguyễn Lân Dũng (2005), mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng
ñể làm tương là một loài nấm sợi có tên khoa học là A. oryzae. ðây cũng chính là
loài mà người Nhật dùng ñể ñường hóa gạo khi làm rượu Sake. Người nghiên cứu

sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine.
Nghề làm tương và làm rượu Sake với loài nấm sợi này ñã có từ rất lâu ñời. Trước
ñây bào tử nấm này từ thiên nhiên rơi vào trong xôi hay gạo và mọc lên mốc làm
tương hay làm rượu. Bây giờ nấm sợi A. oryzae ñã ñược chọn lọc ñể có các chủng
có hoạt tính rất cao ñể làm giống cho sản suất gọi là koji. Koji ñược sản xuất ra
dưới dạng bánh thì gọi là mochi-koji, còn dưới dạng hạt thì gọi là bara-koji. Quá
trình sản xuất ra koji gọi là sei - koji. Nấm này còn ñược dùng ở Nhật Bản ñể sản
xuất tương từ ñậu tương, dạng ñặc gọi là miso, dạng loãng gọi là shoyu (nước
tương) (Nguyễn Lân Dũng, 2005).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

6

Một ñiểm ñáng chú ý là loài nấm mốc A. oryzae thuộc nhóm flavi, nhóm này
còn bao gồm 3 loài khác là: A. sojae, A. nomius, A. parasiticus (Raper và Fernnell,
1965), trong ñó A. flavus và A. parasiticus là 2 loài có khả năng sinh ra aflatoxin là
một loại ñộc tố có thể gây ung thư. Loài A. oryzae chỉ khác biệt với loài A. flavus ở
một số ñặc ñiểm mà chỉ một số chuyên gia có thể phân biệt. Qua một quá trình sử
dụng lâu dài, các chủng A. oryzae thể hiện một số ñặc ñiểm khác với loài A. flavus
như: khả năng tạo bào tử giảm, có nhiều hệ sợi nấm khí sinh hơn, không sinh ra ñộc
tố aflatoxin (chức năng của aflatoxin có thể là ñể hạn chế sự tấn công của côn
trùng), các ñặc ñiểm trên có thể là do sự thích nghi với việc nuôi cấy trên môi
trường nhân tạo như quá trình sản xuất koji (Kurtzman và cs., 1986).
1.2. Protease nấm mốc
1.2.1. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp protease
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp ñến sự sinh tổng hợp
enzyme của vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng chứa thành phần có tác dụng ñến
hoạt ñộng sống của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme. Do ñó môi trường dinh
dưỡng phải có ñầy ñủ các chất ñảm bảo ñược sinh trưởng bình thường của vi sinh

vật và sự tổng hợp enzyme. Vi sinh vật muốn phát triển ñược cần phải có các nguồn
cung cấp các chất chứa C, N, H, O. Thành phần môi trường cũng phải chứa các chất
kháng như: Mg, Ca, P, S, Fe, K, Cu, Zn, v.v. chọn môi trường dinh dưỡng ñể nuôi
cấy vi sinh vật cần phải cần chú ý ñến thành phần, chất lượng và sự tương quan về
số lượng giữa các cấu tử của môi trường.
Có nhiều chất thuộc nhóm hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon
thích hợp ñối với nấm mốc tống hợp proteinase có hoạt lực cao như frucrose, maint,
sucharose, glucose hoặc mantose. Các nguồn cacbon có tác dụng ñến sinh tổng hợp
proteinase – acid của nấm mốc theo thứ tự sau:
- ðối với A. flavus 74: fructose > glucose > sucharose > monose> galactose>
arabinose > lactose.
- ðối với A. oryzae79: fructose > sucharose > mantose > glucose > manit >
arabinose > lactose.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

7

- ðối với A. awamori 200: fructose > manit> sucharose > arabinose > lactose.
Qua ñây, chúng ta thấy fructose, manit hoặc sucharose là những nguồn
carbon tốt nhất ñối với sinh tổng hợp protease bằng nấm mốc. Còn lactose và
galactose là những nguồn carbon kém nhất ñối với các chủng nấm mốc sinh
protease nêu trên.
Tinh bột cũng là nguồn carbon tốt ñể tổng hợp proteinase, nhưng kết quả này
phụ thuộc vào các chủng nấm mốc có hoạt lực amylase ñể thủy phân sâu xa tinh
bột. Vì vây, nhiều chủng nấm mốc nuôi cấy trên môi trường tinh bột cũng cho kết
quả như ñối với glucose.
ðối với môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp proteinase trong môi
trường có chất cảm ứng – các nguồn nitơ hữu cơ (bột ngô, bột mỳ, bột ñậu tương,
mầm mạch, dịch tự phân nấm men, pepton, v.v.). Ngoài ra, còn có các nguồn nitơ
vô cơ như các muối nitrat, muối amon, thậm chí cả HNO

3
, HNO
2
.
Nhiều loại nấm mốc khác nhau (A. oryzae, A. awamori, A. niger) trên môi
trường có nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp proteinase – acid cao. Trên môi trường
Czapek, NaNO
3
ñược thay bằng casein thì hoạt lực proteinase của nấm mốc ñược
tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucose và ñược bổ sung thêm pepton
thì hoạt lực enzyme tăng gấp 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng
tổng hợp enzyme của nấm mốc ñược nâng cao khi trong môi trường có ñồng thời cả
nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ.
Ví dụ: khi thêm HNO
3
hoặc NH
4
với lượng 0,6 – 3,8% vào môi trường có
chứa nguồn nitơ hữu cơ làm tăng khoảng 140 – 190 % proteinase – acid trong môi
trường nuôi cấy của nhiều giống thuộc Aspergillus.
Thêm vào môi trường cám mì, bột ñậu tương ñã tách chất béo, các dạng nitơ
vô cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22 – 74 % (Trịnh cương, 1963).
Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn
ñến ngừng sinh tổng hợp protein nói chung.
Tỷ lệ C : N thích hợp sẽ tổng hợp proteinase – acid ở A. oryzae là từ 8 : 1 ñến
2 : 1. Theo Aleeva và cs (1973), tăng lượng carbon quá nồng ñộ tối thích không ảnh
hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, nếu tăng lượng nitơ trong môi
trường quá nồng ñộ thích hợp sẽ kìm hãm sinh tổng hợp protease (Trịnh cương, 1963).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

8

Trong sản xuất enzyme protease, người ta có thể sử dụng một số cơ chất tự
nhiên là nguồn carbon, nguồn nitơ và những yếu tố khoáng. Thí dụ: bột mỳ ñen, bột
ñậu tương, cám mì, cám ngô, cám ñại mạch và các dịch chiết từ các loại cám này,
cao ngô, v.v. Trong môi trường dinh dưỡng, nếu bổ sung mỡ cá voi thì hoạt lực
proteinase có thể tăng 30 %.
Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
Glycine, alanine, methlonine và leucine có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của
chủng ñột biến A. oryzae 251 – 90 ñến 6 - 9 % và chủng nguyên thủy A. oryzae 132
– 63 tới 7 – 24 %. Nhiều acid amin có tác dụng ức chế ñến sinh tổng hợp enzyme.
Valine, acid glutamic, isoleucine… làm giảm hoạt lực protease ở A. oryzae 251 – 90
ñến 22 – 24 %, v.v.(Lê Ngọc Tú, 1982).
Các acid amin cũng như các hợp chất phân tử thấp dễ xâm nhập vào bên
trong tế bào vi sinh vật và ñặc biệt ảnh hưởng ñến sự tạo thành enzyme. Do ñó,
thêm acid amin vào môi trường dinh dưỡng dễ gây kích thích hay ức chế tổng hợp
enzyme từ vi sinh vật.
Bảng 1.1. Các yếu tố thích hợp cho sự tổng hợp enzyme của A. oryzae
Thành phần môi trường
Chủng nấm
mốc
Cấu tử
Hàm
lượng
(%)
ðộ ẩm
môi
trường
(%)
Nhiệt

ñộ (
0
C)
Thời gian
nuôi (giờ)
Hoạt ñộ
enzyme
(ñv/g canh
trường)
Tấm ngô 6,5
Trấu 25,5 55 30 36 15
Bột mỳ 5,0
Mầm thóc 4,0 55 30 42 485
A. oryzae
BK 72 - 59
(NH4)2SO4 1,0
70,0 Cám
55 32 38 26,1
A. oryzae BK 74
- 33
Trấu 30,0
Cám 70
Trấu 20 55 32 38 26,1
A. oryzae G.73
Khô ñỗ tương 10

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

9

 Ảnh hưởng của lượng giống nuôi cấy
Lượng giống nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn ñến sự tổng hợp protease của vi khuẩn,
xạ khuẩn, ñặc biệt là nấm mốc. Khi lượng giống ñưa vào ñể nuôi cấy với tỷ lệ cao
thường quan sát thấy hệ sợi sinh trưởng dạng bào tử và giảm hiệu suất enzyme.
Năm 1969, Misuzawa ñã nghiên cứu và kết luận rằng tổng hợp enzyme protease từ
Streptomyces retus var proteclyticus ñược tiến hành rất mạnh khi nuôi cấy trong
môi trường có lượng giống 10% (Lê Ngọc Tú, 1997).
 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Các chủng vi sinh vật khác nhau có tốc ñộ sinh trưởng khác nhau. Tốc ñộ sinh
trưởng nấm mốc thường liên quan ñến thời gian nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy nấm
mốc tối thích ñể ñảm bảo cho nấm mốc tích tụ enzyme tối ña thường ñược ñưa vào
thực nghiệm sản xuất.
Các tác giả như Lesiacova (1965), Shilova (1976), Trainin (1969) ñã nghiên cứu
ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sự tích tụ enzyme khi nuôi cấy nấm mốc
Aspergillus bằng phương pháp bề mặt. Qua những nghiên cứu, các tác giả nhận thấy
rằng thời gian nuôi cấy nấm mốc phụ thuộc vào các chủng giống ñó. Như chủng A.
oryzae sau 21 – 30 giờ nuôi cấy tích tụ lượng enzyme amylase lớn nhất, sau ñó bắt
ñầu tích tụ lượng protease và ñạt cực ñại ở giai ñoạn ñầu tạo bào tử (Lương ðức
Phẩm, 1983).
ðộng học của tổng hợp protease ñã ñược nghiên cứu như sau:
- Ở giai ñoạn phát triển nhất ñịnh, tế bào vi sinh vật tổng hợp protease. Tốc ñộ tổng
hợp enzyme thường không ñồng nhất với chu kỳ sinh trưởng chủng giống.
- ðặc tính sinh lý của vi sinh vật sản sinh enzyme và ñiều kiện nuôi cấy có ý nghĩa
cơ bản ñến ñộ hoạt ñộng enzyme protease.
Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi trường ñược chia làm 3 thời kỳ:
- Khoảng 10 -14 giờ ñầu, bào tử trương nở và bắt ñầu nảy mầm.Thời kỳ này chưa
hình thành enzyme. Giống rất nhạy cảm với nhiệt ñộ ở những giờ này. Nhiệt ñộ
buồng nuôi cần giữ ở 29 – 31
o
C, làm khoảng 2 - 3 thể tích không khí/ 1 thể tích

phòng/1 giờ.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

10

Thời kỳ giữa kéo dài 14 – 16 giờ, nấm mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh.
Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh ñể phục vụ cho các quá trình
trao ñổi chất trong tế bào, cần thông khí mạnh. Nhiệt ñộ buồng nuôi nên giữ 28 –
29
o
C. ðộ ẩm phòng cần 100 %.
- Thời kỳ thứ ba kéo dài 10 -20 giờ, các quá trình trao ñổi chất vẫn tiếp tục
nhưng yếu dần. Lượng nhiệt tỏa ra giảm và tạo thành enzyme của tế bào vẫn tiếp
tục, giữ nhiệt ñộ buồng nuôi ở 30
o
C.
Tùy thuộc vào từng ñặc tính sinh lý của từng giống nấm mốc, thời gian nuôi
cấy có thể kết thúc vào thời ñiểm mà lượng enzyme tạo thành tối ña (Lê Ngọc
Tú, 1997).
 ðộ ẩm của môi trường
Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt, ñộ ẩm của môi trường là
một trong những yếu tố rất cần thiết cho sự sinh sản của nấm mốc và có ảnh hưởng
ñến hoạt ñộ enzyme. ða số vi sinh vật phát triển tốt khi ñộ ẩm không khí lớn hơn 80
% và ñộ ẩm môi trường lớn hơn 20 %. ðộ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi
sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng. Nhờ ñộ ẩm, các chất dinh dưỡng dễ thâm nhập
vào cơ thể, các hệ enzyme thủy phân mới hoạt ñộng ñược. Nếu ñộ ẩm quá thấp sẽ
xảy ra hiện tượng thay ñổi trạng thái của nguyên sinh chất, làm rối loạn quá trình
sinh lý bình thường của vi sinh vật dẫn ñến vi sinh vật không phát triển ñược. ðộ
ẩm thích hợp ñể thu canh trường vi sinh vật có hoạt ñộ enzyme cao 53 - 70 % tùy

thuộc vào tính chất sinh lý của các chủng giống, tính chất cấu trúc cơ học của môi
trường và ñiều kiện nuôi cấy (Lê Ngọc Tú, 1997).
 Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme
Những enzyme ñược tạo thành do tế bào vi sinh vật không chỉ phụ thuộc vào
ñặc tính riêng của từng loại vi sinh vật mà còn phụ thuộc vào thành phần môi
trường nuôi cấy, ñiều kiện nuôi cấy.
Chính dựa vào những ñặc ñiểm rất nhạy cảm với tác ñộng của môi trường
của vi sinh vật mà người ta ñã nghiên cứu thành phần môi trường nuôi cấy ñể thu
lượng enzyme lớn với hoạt tính cao từ những cơ chất ñơn giản chỉ là phế liệu công
nghiệp hay nông nghiệp như xác bã khoai mỳ, rỉ ñường, rơm rạ, bã ñậu nành, v.v.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

11

có bổ sung những chất thích hợp ñể kích thích tổng hợp một enzyme theo ý muốn
nào ñó.
Khi nuôi cấy nấm mốc A. oryzae trên môi trường cám mỳ, theo phương pháp
bề mặt có hàng chục enzyme tự do ñược tạo thành, trong ñó amylase, protease,
maltase, pectinase, invetase, ribonuclease, v.v. nuôi nấm mốc này trên môi trường
Czapek với tinh bột và nitrat thì chỉ có α – amylase ñược tạo thành, còn các enzyme
khác chỉ có vết. Nhưng nếu thay natri nitrat bằng các casein ở dạng sữa ñã tách chất
béo, protease ñược tạo thành cùng với α – amylase.
Sự tổng hợp enzyme theo cách này ở vi sinh vật ñược gọi là sự tổng hợp
enzyme cảm ứng nhằm tăng về lượng của một enzyme nào ñó, nó tồn tại song song
với tổng hợp những enzyme bình thường (bản thể) của vi sinh vật và chỉ xuất hiện
khi trong môi trường có chất cảm ứng tương ứng. Hiện tượng này xảy ra trong khi
nuôi cấy vi sinh vật (khá nhậy cảm), còn ở ñộng vật và thực vật biểu hiện chậm và
kém nhậy cảm hơn.
Trong công nghiệp sản xuất enzyme nên cần lựa chọn những chất cảm ứng
thích hợp và xác ñịnh nồng ñộ tối ưu của chúng trong môi trường ñể có hiệu quả

sinh tổng hợp cao nhất.
Theo khẳng ñịnh của nhiều nhà nghiên cứu thì tinh bột, isomaltose, maltise,
panose và các oligosaccharide có chứa liên kết α- 1,6 – glucoside ( Tonomurs và cs,
1961) là những chất cảm ứng tốt nhất ñể tổng hợp α- amylase từ nấm mốc
(A.oryzae). Pectin là chất cảm ứng sinh tổng hợp pectinase (A. oryzae, A niger)
hemicelluloses là chất cảm ứng tổng hợp hemicellulase, v.v. (xạ khuẩn
Streptomyces fradiae) (Lương ðức Phẩm, 1983).
1.2.2. Ứng dụng của protease nấm mốc
Trong phương pháp sản xuất thực phẩm lên men, cơ sở khoa học của nó là
lợi dụng hệ enzyme của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu ñạm nuôi chúng
ñể phân hủy protein có trong nguyên liệu thành phẩm. Nấm mốc ñược ứng dụng
rộng rãi trong quá trình sản xuất các thực phẩm lên men truyền thống như nước
chấm, tương, ñạm tương, chao, Miso, Tempeh, phomai.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

12

Nhiều chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus có khả năng tổng hợp ñồng
thời amylase, protease và một số enzyme khác như enzyme oxy hóa khử ñược sử
dụng nhiều trong công nghiệp chế biến các thực phẩm lên men ñể thủy phân tinh
bột thành ñường, thủy phân protein thành acidamin và peptide.
Những thành viên của nhóm A. flavus – oryzae, ñặc biệt là A. oryzae có tầm
quan trọng về mặt công nghiệp rất lớn. Ở Nhật A. oryzae ñược dùng ñể ñường hóa
tinh bột trong quá trình sản xuất rượu sake và các loại rượu khác, trong quá trình
sản xuất rượu shoyu, miso, A. oryzae cũng ñược dùng trong việc sản xuất hỗn hợp
enzyme xuất hiện trên thị trường dưới những tên thương mại như Takadi astase,
Polyzyme, digestin, oryzyme (Samuel Cate Prescott và cs., 1959).
Những chủng A.niger ñược dùng trong ngành công nghiệp lên men acid
citric và lên men acid gluconic.

Chủng Penicillium ñược dùng sản xuất loại phô mai xanh như là Roquefort.
Sữa ñông ñược bổ sung chủng Penicillium. Chủng này ảnh hưởng ñến ñộ chín và
ñặc ñiểm bên ngoài màu xanh của loại phô mai này. Mốc sẽ phát triển bên ngoài
khối sữa ñông và thủy phân protein, vì thế sẽ làm mềm khối sữa.
Nước tương (soy sauce) ñược làm từ ñậu lành rang và bột mỳ ñược bổ sung
chủng nấm mốc A. oryzae và ñể trong3 ngày. Nguyên liệu ñược bao phủ mốc gọi là
koji – ñược thêm vào hỗn hợp muối và vi sinh vật và ñược ñể khoảng 1 năm.
Nguyên liệu mọc mốc, acid do Lactobacilli và alcohol do nấm men sẽ quyết ñịnh
hương của sản phẩm. Chất lỏng ñược ép ra từ hỗn hợp gọi là nước tương (Edward
Alcamo, 1997).
Ở Nhật, người ta ñã sử dụng những chủng ñột biến cảm ứng khả năng phân
giải protein của nhóm Aspergillus vàng trong quá trình sản xuất mốc ñể làm nước
chấm. Vai trò của mỗi nhóm vi sinh vật liên quan ñến quá trình lên men. ðiều này
dẫn ñến thu ñược chất lượng sản phẩm cao và ổn ñịnh. Kết quả nâng tỷ lệ thủy phân
protein chứa trong vật liệu thô thành acid amin từ 60% trong quá khứ ñến hơn 90 %
(Marcel Dekker, 1989).
ðể tăng hoạt ñộ của enzyme trong koji (nguyên liệu mọc mốc), người ta dùng
chủng ñột biến cảm ứng có hoạt tính protease cao hơn từ nhóm Aspergillus vàng.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

13

Sau những thí nghiệm dùng các tác nhân gây ñột biến như tia UV,
methylnitronitrosoguanidine (MNNG) và ethylmethansulfornate (EMS), có thể thu
ñược những chủng ñột biến mà hoạt tính thủy phân protein của chúng tăng gấp bốn
lần so với hoạt tính của những chủng gốc. Công ty Kikkoman ở Nhật ñang sử dụng
những chủng ñột biến này của nhóm mốc vàng. Những ñột biến này góp phần vào
tỷ lệ thủy phân protein trong vật liệu thô ít nhất là 5 % (Marcel Dekker, 1989).
1.3. Tổng quan về SSRs (Simple sequence repeats)
1.3.1. Khái niệm

Simple sequence repeats (SSRs), còn ñược gọi là các chuỗi lặp ñơn giản hay
các chuỗi lặp liền kề ngắn = short/simple tandem repeats (STRs) hay các ñoạn ña
hình chuỗi ñơn giản = simple sequence length polymorphisms (SSLPs) là nhóm các
chuỗi DNA ñơn giản lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20–100
bp. SSRs ñược tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, ñặc biệt là ở những cơ thể sống có
bộ gen lớn và phân bố ñều trên genome.
SSRs có tính ña hình rất cao (ña hình theo chiều dài), là những alen ñồng trội
(codominant-allelen) bao gồm 2 loại: alen ñồng hợp và alen dị hợp, nó có các tính
chất cần thiết cho một marker. Tần số ñột biến từ 10
-4
- 5.10
-6
, nó tuân theo ñịnh
luật Mendel. Vị trí của SSRs trên nhiễm sắc thể có thể ñược xác ñịnh bằng PCR từ
một lượng DNA rất nhỏ. Xác ñịnh SSRs - PCR trên một loài nào ñó thì có thể áp
dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Hà Viết Cường, 2009; Nguyễn Thị
Phương Dung, 2005).
Các chuỗi lặp thường ñơn giản, bao gồm 2, 3, 4 nucleotide (gọi là di-, tri-, and
tetranucleotide repeats). Một ví dụ phổ biến của microsatellite là 1 dãy chuỗi lặp 2
dinucleotide (CA)n, trong ñó n là tổng số chuỗi lặp nằm trong phạm vi từ 10 – 100.
Ví dụ: SSRs lặp 1 nucleotide (A)11: AAAAAAAAAAA;
SSRs lặp 2 nucleotide (GT)6: GTGTGTGTGTGT;
SSRs lặp 3 nucleotide (CTG)4: CTGCTGCTGCTG; v.v.
1.3.2. Phân loại SSRs
Căn cứ vào số lượng nucleotide cấu tạo lên mỗi ñơn vị lặp, SSR ñược phân
loại thành 6 nhóm. Trong ñó, dạng lặp 3 xuất hiện ít hơn dạng lặp 2 khoảng 10 lần,
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

14

và dạng lặp 4 còn hiếm hơn nữa (Ma và cs, 1996). Trong khi, những ñoạn lặp lại
của A/T là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ gene nhưng tần số phân bố giữa
các loài rất khác nhau (Webster và cs, 2002). Một số nghiên cứu gần ñây ñã chỉ ra
dạng lặp 1 nucleotide có khả năng ứng dụng cao trong lập bản ñồ di truyền trên
người (Edwards, 2004). Tuy nhiên trong phản ứng PCR, tác ñộng của enzyme Taq
polymerase có thể làm cho kích thước alen bị thay ñổi bằng cách thêm một
nucleotide A vào cuối ñoạn hoặc chèn vào vùng lặp lại của alen (Crowe và cs,
1991). Do ñó, dạng này hầu như ít ñược các nhà nghiên cứu sử dụng. ðối với dạng
lặp 2, những phân tích trong số liệu của những ñoạn lặp lại chỉ ra rằng cặp CA/GT
là loại thường gặp hơn cả ở ñộng vật, trong khi AT/TA thường gặp nhiều trên thực
vật (Powell và cs, 1996). Một nghiên cứu tương tự với dạng lặp 3 cho thấy CAG và
ATT là các dạng lặp nhiều nhất nhiều nhất tuy nhiên tần số xuất hiện các kiểu này
tùy thuộc vào loài.
Theo Gallego và cs. (2005) các microsatellite rất ña dạng ñược phân loại theo
loại chuỗi lặp như sau:
Microsatellite hoàn hảo: gồm các chuỗi lặp ñều ñặn chẳng hạn
TATATATATATATATA.
Microsatellite không hoàn hảo: có một bp nằm xen giữa các chuỗi lặp (ví dụ:
TATATATACTATATA).
Microsatellite gián ñoạn: có các chuỗi nhỏ khác nằm bên trong (Ví dụ:
TATATACGTGTATATATATA).
Microsatellite phức: gồm 2 chuỗi lặp khác nhau (Ví dụ:
TATATATATAGTGTGTGT)
1.3.3. ðặc ñiểm di truyền của SSRs
Ở một locus SSRs ñồng hợp tử, số các chuỗi lặp giống nhau. Ở một locus
SSRs dị hợp tử, số các chuỗi lặp khác nhau (chẳng hạn 1 SSRs có 9 chuỗi lặp còn
SSRs có 10 chuỗi lặp). Nhìn chung tại một locus SSRs của một quần thể ña alen
(theo nghĩa alen của SSRs) thì SSRs của mỗi allele sẽ khác nhau về số chuỗi lặp.
ðây là ñặc ñiểm di truyền quan trọng của SSRs làm cho nó trở thành một marker
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

15

cực kỳ hữu hiệu trong việc phân biệt các cá thể của 1 quần thể => ñược ưa thích
trong nghiên cứu di truyền quần thể và tội phạm (Hà Viết Cường, 2009).
1.3.4. Cơ chế tạo ñột biến của SSRs
Tốc ñộ ñột biến của SSRs cao hơn nhiều so với các vùng khác của bộ gen, nằm
trong phạm vi từ 10
-2
ñến

10
-6
/locus/thế hệ. Một số các cơ chế gây ra tốc ñộ ñột
biến cao của microsatellite là: lỗi trong quá trình tái tổ hợp, trao ñổi chéo không
ngang bằng, trượt (slippage) của DNA polymerase trong quá trình tái sinh và sửa
chữa DNA.
Lỗi trong quá trình tái tổ hợp: ñây không phải là cơ chế chủ yếu vì người ta
ñã phát hiện tốc ñộ ñột biến SSRs tương ñương nhau ở chủng vi khuẩn E. Coli có
hệ thống tái tổ hợp và chủng không có hệ thống tái tổ hợp.
Trao ñổi chéo không cân: ñây là một cơ chế quan trọng, tạo ra các ñột biến
mất ñoạn và thêm ñoạn lớn. Lý do là trong quá trình tiếp hợp, trên vùng
microsatellite của một nhiễm sắc thể hình thành 1 cấu trúc kẹp tóc (hairpin). Hậu
quả là sau khi trao ñổi chéo, một nhiễm sắc thể sẽ có một satellite dài hơn còn
nhiễm sắc thể kia sẽ có SSRs ngắn hơn.
Trượt (slippage) của DNA polymerase trong quá trình tái sinh và sửa chữa
DNA: ðây cũng là một cơ chế quan trọng. Trong quá trình tái sinh và sửa chữa
DNA, một sợi tạm thời tách khỏi sợi kia và nhanh chóng tái hợp nhưng ở một vị trí
khác dẫn tới lỗi ghép cặp bazơ. Hậu quả là 1 allele sẽ tăng số chuỗi lặp nếu lỗi xuất
hiện ở sợi thứ (sợi tương ñồng) hoặc giảm số chuỗi lặp nếu lỗi xuất hiện ở sợi chủ.

Mặc dù cơ chế trượt của DNA polymerase khá phổ biến nhưng hậu quả thường chỉ
dẫn tới sự thêm hay giảm số lượng chuỗi lặp của SSRs (có nghĩa là ñoạn thêm hay
giảm ngắn hơn nhiều so với hậu quả gây ra bởi cơ chế trao ñổi chéo không ngang
bằng) (Hà Viết Cường, 2009).
1.3.5. Phân bố của SSRs
Trên một bộ genome, SSRs phân bố không ñều vì:
Tần số của chúng khác nhau giữa vùng mã hóa và vùng không mã hóa. Do tốc
ñộ ñột biến cao nên vùng mã hóa có mật ñộ SSRs thấp hơn so với vùng không mã
hóa. Người ta ñã chứng minh rằng, các SSRs với chuỗi lặp là 3 hoặc 6 bp tồn tại với