Sử dụng chỉ thị phân tử Microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dòng keo lá tràm (Acacia auriculiformis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG
PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR








Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN










Thành phố Hồ Chí Minh
09/2007




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG
PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR






Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN
KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG













Thành phố Hồ Chí Minh
09/2007
iii

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y,
trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại
Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng
Đại Học Nông Lâm
Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa
luận tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những
kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng.

- Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí
nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .

- Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình
học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận.

Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học
Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn
trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận.

Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục
con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay.




Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007.
Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền.
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại
thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”.
Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân
KS. Lƣơng Quý Phƣơng
Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân
tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản
phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình
phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR.
Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:
1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 80
0
C/15’,
120
0
C/15’, 120
0
C/30’, 130
0
C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt

xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn.
2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm
nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều
chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi
trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ
MgCl
2
2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt
độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (94
0
C/1phút), bắt
cặp (54
0
C/45giây), kéo dài (72
0
C/1phút).
3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của
cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ
của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l.
4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý
nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính
80
0
C/15’, 120
0
C/15’, 120
0
C/30’, 130
0
C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên.

5) Thực hiện quy trình trên với bột thịt của 3 hãng CE, A, VY, kết quả bột thịt của
các hãng này có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò.
SUMMARY
TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species:
pig, bovine, sheep by multiplex PCR”
Suspervisors : PhD. Nguyen Ngọc Tuan
BCs. Luong Quy Phuong
To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish
protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR.
The results:
1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures:
80
0
C/15 min, 120
0
C/15 min, 120
0
C/30 min, 130
0
C/15 min), average ratio of OD
were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality.
2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998)
and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of
thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR
protocol. This protocol was MgCl
2
2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB:

RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 94
0
C/1
min, anealing 54
0
C/45 sec, elongation 72
0
C/1 min).
3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat
with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA
sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep.
4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at
processing temperatures: 80
0
C/15 min, 120
0
C/15min, 120
0
C/30 min, 130
0
C/15min
the meats of pig, bovine, sheep were still identified.
Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the
established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine
and bovine, respectively.

MỤC LỤC


NỘI DUNG TRANG
Bìa ............................................................................................................................. i
Trang tựa .................................................................................................................. ii
Lời cảm tạ ................................................................................................................ iii
Tóm tắt khóa luận .................................................................................................... iv
Summary .................................................................................................................. v
Mục lục .................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... x
Danh sách các bảng ................................................................................................. xi
Danh sách các hình và biểu đồ .......................................................................................... xii
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Mục đích ............................................................................................................ 2
1.3 Yêu cầu .............................................................................................................. 2
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 3
2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến ..................................................................................... 3
2.1.1 Giới thiệu về thịt ......................................................................................... 3
2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến ........................................................................... 4
2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến ................................................ 4
2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của
thế giới .......................................................................................................... 4

2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ
động vật ở Việt Nam .................................................................................... 5
2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật ................................................................. 6
2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ... 7
2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt ........................................................... 8
2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học ................................... 8
2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) ............................................................ 8
2.4.3 Protein array ................................................................................................ 9
2.4.4 Điện di 2 chiều ............................................................................................ 9
2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) ..... 10
2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR ....................................................................... 16
2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng
phƣơng pháp multiplex PCR ................................................................................. 16
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 18
3.1 Nội dung thực hiện .......................................................................................... 18
3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành ...................................................................... 18
3.3 Vật liệu ............................................................................................................ 19
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA ..................................................................... 19
3.3.2 Đoạn mồi................................................................................................... 19
3.3.3 Hóa chất .................................................................................................... 19
3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA ............................................. 19
3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di ........................................................... 19
3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ............................................... 20
3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 20
3.4 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 20
3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ................................................................................ 20
3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt .......................... 20
3.4.3 Tách chiết DNA ........................................................................................ 21

3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR ....................................................................... 22
3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR .................................................................... 24
3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana
và ctv (1998) ............................................................................................... 24
3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng ................................. 24
3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ........................................... 24
3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng .................. 25
3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các
nồng độ DNA khác nhau ................................................................................... 26
3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu .................. 27
3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau:
80
0
C/15 phút, 120
0
C/15 phút, 120
0
C/30 phút, 130
0
C/15 phút .......................... 27
3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
ở các nhiệt độ kha
́
c nhau .................................................................................... 28
3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt ........................................................................... 28
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 29
4.1 Kết quả tách chiết ............................................................................................ 29

4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana
và ctv (1998) .......................................................................................................... 31
4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và
ctv (1998) ............................................................................................................... 32
4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR ........................... 33
4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng .................................................................... 33
4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg
2+
.......................................... 33
4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ......................................... 34
4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi ............................................ 36
4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................. 38
4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài ......................................................................... 39



4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA
bò, cừu ................................................................................................................... 40
4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt .................................................................. 40
4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ...................................... 43
4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt ....................................................................... 45
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 47
5.1 Kết luận ........................................................................................................... 47
5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 48
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 51

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) ........ 3

Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt .................................................. 21
Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................ 23
Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR ............................ 23
Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng .................................................................... 23
Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................ 24
Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh ....................... 25
Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) .......................................................... 25
Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) ........................................................... 26
Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau .......................... 26
Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau ...................... 27
Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu .......................................... 27
Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau .......................................... 28

Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu ................................ 29

Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt....... 30














DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

HÌNH TRANG
Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1999) ............... 32
Hình 4.2 Sản phẩm m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) .............. 33
Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh thể tích phản ứng ................................ 34
Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg
2+
......................................... 35
Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp: 56
0
C và 54
0
C .......... 35
Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt .............................. 36

Hình 4.7 Kết quả m-PCR khi giảm RS ................................................................... 38
Hình 4.8 Kết quả m-PCR khi tăng RP .................................................................... 38
Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................ 39
Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR đối với heo, bò .................................................................... 40
Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR đối với DNA heo, cừu .............................................. 40
Hình 4.12 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp DNA ................................................. 41
Hình 4.13 Kết quả s – PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 80
0
C/15 phút ................................. 42
Hình 4.14 Kết quả phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 120
0
C/15 phút ....... 42
Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 120
0
C/30 phút ............................ 43
Hình 4.16 Sản phẩm s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 130
0
C/15 phút .......................... 43
Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ 80
0
C/15 phút ..... 44
Hình 4.18 Kết quả m – PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở120
0
C/15 phút ...... 45
Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 120
0
C/30 phút .......... 46
Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130
0
C/15 phút ....... 46

Hình 4.21 Kết quả m-PCR của bột thịt ................................................................... 47
BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4. 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu .................. 290
Biểu đồ 4. 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt .. 301




DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp: base pair
BSE :Bovine spongiform encephalopathy
ctv: cộng tác viên
DNA: deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA: ethylene diamine tetra acetate
ELISA: enzyme link imuno assay
Lad: Ladder
MBM: Meat and bone meal
mtDNA : mitochondrial cytochrome b DNA
m – PCR : multiplex PCR
NST: nhiễm sắc thể
OD: optical density
PCR: polymerase chain reaction
SDS: sodium dodecyl sulfate
RNA: ribonucleic acid
Taq: Taq polymerase
TBE: Tris borate EDTA
TE: Tris EDTA
t. bò: thịt bò
t. cừu: thịt cừu

t. heo: thịt heo
TN: Thí nghiệm
Tỷ số OD: tỷ số OD
260 nm
/OD
280 nm

UI: unit
UV: ultra violet


1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Vấn đề chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm trong đó có các sản phẩm thịt
tƣơi, thịt chế biến đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Thịt chế biến thƣờng có
nguồn gốc từ một loại hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về chất lƣợng,
giá cả của các loại thịt đã gây ra vấn đề gian lận trong thƣơng mại (đối với cả thịt
tƣơi và thịt chế biến). Đã có rất nhiều sản phẩm thịt trên thị trƣờng ghi thành phần
trong công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm.
Thịt chế biến thƣờng đƣợc xử lý ở nhiệt độ cao trên 100
0
C (khoảng 120
0
C
đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt bột xƣơng thịt làm thức ăn gia súc
(Meat and bone meal - MBM) tuy đƣợc xử lý ở nhiệt độ khoảng 130
0

C nhƣng lại
đƣợc sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ nên một số mầm
bệnh nguy hiểm vẫn còn tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ BSE (Bovine
spongiform encephalopathy: bệnh bò điên) có khả năng lây sang ngƣời, protein
prion gây bệnh này chỉ mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ 180
0
C. Hiện nay, các
phƣơng pháp xử lý nhiệt thông thƣờng không thể loại bỏ đƣợc nguy cơ mầm bệnh
BSE. Vì lý do này, các nƣớc trên thế giới trong đó có Việt Nam không cho phép
nhập bột xƣơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò, cừu, dê của các nƣớc Châu Âu, Châu
Mỹ, Nhật Bản vì sợ bệnh BSE.
Việc gian lận thƣơng mại sẽ gây ra vấn đề không thể kiểm soát nguồn gốc
các thực phẩm nhập khẩu. Ngày nay, khi tình hình gian lận trong sản xuất và tiêu
thụ sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến vẫn diễn ra cùng với các dịch bệnh nguy hiểm
liên tiếp hoành hành thì việc đảm bảo tính trung thực và an toàn của các sản phẩm
này là rất cấp thiết.
Điều này đặt ra cho các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu phải tìm ra
phƣơng pháp phát hiện, phân biệt nhanh chóng, chính xác các loại thịt trong sản

2
phẩm thịt tƣơi cũng nhƣ thịt chế biến để ngăn chặn kịp thời những gian lận nhằm
mục đích bảo vệ lợi ích chính đáng và sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng.
Có nhiều cách để xác định nguồn gốc thịt: dùng kính hiển vi quang học,
ELISA, điện di 2 chiều, protein array, multiplex PCR... Bốn phƣơng pháp đầu hoặc
chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý ở nhiệt độ cao. Còn
phƣơng pháp multiplex PCR là một phƣơng pháp nhanh, đặc hiệu, đơn giản, thích
hợp để phân biệt các loại thịt đã xử lý nhiệt.
Vì vậy để tạo tiền đề cho việc giải quyết vấn đề trên, bƣớc đầu chúng tôi tiến
hành xây dựng quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế
biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR.

1.2 Mục đích
Bƣớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện và phân biệt thịt heo,
bò, cừu.
Ứng dụng quy trình để phát hiện và phân biệt các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt
và bột thịt.
1.3 Yêu cầu
Nắm vững qui trình tách chiết DNA.
Tối ƣu hóa quy trình multiplex PCR và ứng dụng quy trình này vào việc phát
hiện các loại bột thịt làm thức ăn gia súc.

3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến
2.1.1 Giới thiệu về thịt
Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực
phẩm có nguồn gốc từ động vật. Trong thƣơng phẩm học thành phần của thịt gồm:
mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xƣơng sụn và mô máu. Thành phần hóa học của thịt
bao gồm: nƣớc, protein, lipit, glucit, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ,
khoáng, vitamin và enzym. Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới
tính, mục tiêu sử dụng, khẩu phần nuôi dƣỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận
súc thịt và cơ thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004).
Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ)

Loại mô Thịt bò Thịt heo Thịt cừu
Mô cơ 57-62 % 40-62 % 49-58 %
Mô mỡ 3-16 % 15-40 % 4-18 %
Mô liên kết 9-12 % 6-8 % 7-11 %
Mô xƣơng - sụn 17-29 % 8-18 % 18-38 %

Mô máu 0,8-1 % 0,6-0,8 % 0,8-1 %
(Theo Xmolxki, 1975)
Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của các mô đều khác nhau. Do
đó tùy theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết
định tính chất của thịt. Ngƣời ta thừa nhận mô mỡ và mô cơ có giá trị sử dụng cao
nhất. Vì con ngƣời sử dụng thịt làm thực phẩm là để thỏa mãn nhu cầu về protein và
lipit.
4
Ngoài ra theo khái niệm hiện nay, giá trị của thịt phụ thuộc vào sự đầy đủ và cân
bằng về thành phần các axit amin thiết yếu.
2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến
Thịt có giá trị sử dụng cao thì phải đƣợc chế biến thành nhiều dạng sản phẩm
khác nhau tùy theo mục đích sử dụng khác nhau của giới tiêu dùng. Việc chế biến
làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dƣỡng, hạn chế sự hƣ
hỏng do vi sinh vật, tăng thời gian bảo quản do đó tăng giá trị sử dụng của thịt
(Romans và ctv, 1999).
Thịt chế biến có hai nhóm chính: thịt chế biến làm thức ăn cho con ngƣời,
thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc. Thịt chế biến làm thức ăn cho con ngƣời đƣợc
chế biến từ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết. Riêng thịt chế biến dùng làm thức ăn gia
súc (thƣờng là bột thịt) còn đƣợc chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác
nhƣ: da, lông, móng, máu, hệ xƣơng và các nội quan (các phụ phế phẩm lò mổ).
Có nhiều phƣơng pháp chế biến: phơi khô, muối, ƣớp đƣờng, lên men, xử lý
nhiệt (nấu, hấp, sấy). Trong đó phƣơng pháp chế biến ở nhiệt độ cao là phổ biến nhất.
Tùy theo loại sản phẩm và mục đích sử dụng mà ngƣời ta xử lý ở các nhiệt độ khác
nhau. Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến nhƣ xúc xích, lạp xƣởng... đƣợc xử lý
ở 80
0
C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp các loại... thƣờng xử lý 120
0
C trở lên; đối với bột

thịt sử dụng cho gia súc đƣợc xử lý ở 130
0
C (Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003).
2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến
2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới
Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức
nhiều cuộc điều tra trên đối tƣợng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy
có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu hàng hóa của sản phẩm.
Nhất là sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt khác nhau, các nhà sản xuất
thƣờng ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại
thịt có giá trị thấp đƣợc trộn vào trong sản phẩm. Một số trƣờng hợp lại ghi sai tỷ lệ

5
giữa các loại thịt. Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần, độ an toàn và chất
lƣợng sản phẩm thịt chế biến trên thị trƣờng của các tổ chức ban ngành có liên quan
vẫn còn ít.
(Nguồn: />htm.)
Một cuộc điều tra khác của bộ môn Kỹ thuật thực phẩm và vệ sinh thực
phẩm, trƣờng Thú y, ĐH Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt đƣợc trộn vào trong
thịt và thịt chế biến. Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là: 39,2% xúc xích lên men,
35,7 % xúc xích Ý, 27.2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tƣơi, 6,2% thịt viên có chứa
thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm. Cụ thể là xúc xích
lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức đƣợc công bố là chỉ chứa thịt bò nhƣng kết quả
kiểm tra lại phát hiện có lẫn thịt gia cầm; các mẫu thịt bò tƣơi kết quả kiểm nghiệm
lại cho dƣơng tính với thịt hƣơu và thịt ngựa; thịt bò viên lại có chứa thịt gia cầm.
(Nguồn: www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1745-4573.2006.00046.x)
2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở
Việt Nam
Ở Việt Nam, tình hình gian lận thƣơng mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và
sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với các nhà quản lý. Ngay cả thịt

tƣơi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận nhƣ: thịt trâu giả bò, thịt ngựa
giả bò, heo giả thịt dê... Đối với thịt chế biến nhƣ xúc xích tôm, xúc xích bò, chả
giò, thịt hộp… trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng thành phần
nhƣ nhãn hiệu hàng hóa đã đăng kí, đặc biệt các thức ăn chế biến nhập khẩu. Chúng
ta chƣa có các kỹ thuật để xác minh thành phần thịt trong sản phẩm.
Những năm gần đây, Việt Nam nổi lên vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Các bệnh dịch lớn đã và đang diễn ra. Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các
sản phẩm động vật vẫn thƣờng xảy ra. Cục Thú y đã phối hợp với Vụ Pháp chế –
Bộ Nông nghiệp và PTNT, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y tế, Cục Quản lý
Thị trƣờng – Bộ Thƣơng mại thƣờng xuyên tổ chức thanh tra, kiểm tra công tác

6
kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống
nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới. Kết quả thanh tra, kiểm tra cho
thấy tình hình nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức
phức tạp, chính quyền địa phƣơng chƣa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn
chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa
các cơ quan, ban ngành tại địa phƣơng chƣa thống nhất và thiếu chặt chẽ.
(nguồn: www.business.gov.vn/LicenseDetail.aspx?id=883 - 37k).
Thêm vào đó công tác kiểm dịch đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có
nguồn gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập:
Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng đƣợc các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ
thuật và quy định của Việt Nam. Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ, nên
việc kiểm tra chất lƣợng, kiểm dịch và các thủ tục phê duyệt thƣờng kéo dài.
Trong khi đó, các nƣớc nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lƣợng,
kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nƣớc nhập khẩu thƣờng rất chặt chẽ. Các yêu
cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh và an toàn thực phẩm của các nƣớc này cũng rất cao.
Các nhà nhập khẩu nƣớc ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải
đƣợc lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm long móng, dịch tả lợn, newcastle,
BSE và những vùng này phải đƣợc tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) công nhận.

Yêu cầu, tiêu chuẩn của Việt Nam thƣờng không chặt chẽ bằng các yêu cầu
tiêu chuẩn của các nƣớc nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006)
(Nguồn: http:// www.cucthuy.gov.vn).
2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật
Tế bào động vật thuộc dạng tế bào eukaryote, đƣợc bao quanh bởi màng tế
bào, bên trong chứa nhân và các bào quan khác. Khác với các tế bào eukaryote khác
nhƣ thực vật và nấm, tế bào động vật không có vách tế bào (cell wall)
(nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animalcell.html - 40k).

7
Chính vì tế bào động vật không có vách vững chắc nên khi tách chiết DNA
từ tế bào động vật không cần giai đoạn phá vỡ vách tế bào. Cũng do không có vách
tế bào, tế bào động vật phát triển rất đa dạng về hình dạng. Đặc biệt là tế bào thần
kinh và tế bào cơ (Davidson, 2005).
Các tế bào động vật đƣợc nối với nhau bằng một loại protein cấu trúc xoắn
bậc ba gọi là collagen. Còn ở thực vật và nấm các tế bào đƣợc nối với nhau bằng
loại protein khác chẳng hạn nhƣ pectin.
(Nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animals/animalmodel.html - 8k)
Nguyên sinh chất của tế bào động vật chứa khoảng 85 % nƣớc và 15 %
protein và các RNA, DNA, enzym, axit amin, các sản phẩm trung gian của sự trao
đổi chất, muối khoáng…Mỗi tế bào thƣờng có một nhân, thƣờng có hình tròn hay
hình bầu dục. Nhân thƣờng nằm ở giữa tế bào, nhƣng cũng có thể nằm lệch sát
màng tế bào nhƣ ở tế bào cơ vân (Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005).
2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR
Phƣơng pháp PCR thực chất là một phƣơng pháp tạo dòng trong ống nghiệm,
nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định. Chính vì
vậy, đoạn DNA mục tiêu đƣợc nhân lên rất nhiều lần và có thể đƣợc quan sát thông
qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002).
Năm 1997, Sawyer đã khẳng định trên gen cytochrom b ở ty thể (mtDNA)
có vùng bảo tồn cho các loài gia súc, gia cầm. Dựa vào đó tác giả thiết kế mồi xuôi

cho việc khuếch đại một đoạn DNA của các loài gia súc, gia cầm này. Và dựa vào
trình tự chuyên biệt cho từng loài trên mtDNA mà thiết kế mồi xuôi cho từng loài.
Theo Matsugana và ctv (1998), việc sử dụng 7 đoạn mồi (1 mồi xuôi, 6 mồi
ngƣợc) với tỉ lệ thích hợp để phát hiện một đoạn DNA chuyên biệt cho các loài bò,
heo, gà, cừu, dê, ngựa. Các đoạn DNA chuyên biệt này của dê, gà, bò, cừu, heo,
ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc
quan sát bằng điện di. Sự hiện diện hoặc vắng mặt sản phẩm PCR cho phép xác
định có hay không thịt loài gia súc đó trong sản phẩm.

8
Nhằm xác định nồng độ nhỏ nhất để có thể phát hiện đƣợc loài từ thịt chế
biến, năm 2004, Myers và ctv cũng đã sử dụng phƣơng pháp multiplex PCR để
khuếch đại vùng gen trên mtDNA. Tác giả thực hiện phản ứng PCR với nhiều nồng
độ DNA khác nhau. Sau đó dựa sự có hay không các sản phẩm PCR qua điện di để
xác định nồng độ tối thiểu của DNA để phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc.
2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt
2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học
Để phân biệt các loài trong bột xƣơng thịt ngƣời ta lập ra một thƣ viện hình
ảnh về các mẫu xƣơng. Theo đó các mẫu bột xƣơng thịt đƣợc quan sát dƣới kính
hiển vi và đối chiếu với thƣ viện này để xác định các loài có trong mẫu xét nghiệm.
Phƣơng pháp này đòi hỏi ngƣời xét nghiệm phải có kinh nghiệm và tay nghề
cao. Ngoài ra, phƣơng pháp này có độ chính xác không cao vì còn phụ thuộc vào
kinh nghiệm của nhân viên xét nghiệm.
(Nguồn:
2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA)
Năm 1972 – 1973, ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán
virut. Đến năm 1977, Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định
virut hại thực vật tại Scottlen. Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên
tắc bánh kẹp (sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Sự liên kết đó cho phép định lƣợng sự hiện diện của kháng thể hoặc kháng

nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể đƣợc xác định khi đƣợc nhận biết
đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – streptavidin –
enzym sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp.
Đây là kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng
nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml), rẻ tiền, an
toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001).
Tuy nhiên bản thân kỹ thuật ELISA nói chung cũng còn có một số nhƣợc
điểm. Đối chứng âm vẫn có thể cho kết quả dƣơng tính do bị nhiễm chéo từ chất tạo

9
màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm. Đối
chứng dƣơng không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu do đối chứng quá hạn
hay điều kiện bảo quản không tốt. Đặc biệt đối với việc xác định loài trong thịt chế
biến bằng phƣơng pháp ELISA không tỏ ra là phƣơng pháp thích hợp (Ali và ctv,
2005), vì protein trong thịt xử lý nhiệt phần lớn đã bị biến tính. Hơn nữa kỹ thuật
ELISA cần phải có lƣợng mẫu đủ lớn để có thể nhận diện màu.
2.4.3 Protein array
Protein array là phƣơng pháp sử dụng một loại hạt hình cầu (hay slide) để
xác định đồng thời nhiều phản ứng trong cùng một ống nghiệm hay giếng nhỏ có
chứa mẫu. Phát hiện mẫu nhờ các chất nhuộm huỳnh quang có trong hạt cầu đƣợc
kích thích. Độ nhạy của tín hiệu biểu thị cho lƣợng mẫu đích.
Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm:
Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong cùng một giếng mẫu.
Độ lặp lại cao.
Không cần lƣợng mẫu lớn.
Độ chuyên biệt cao.
Tuy nhiên, phƣơng pháp hiện đại với các thiết bị tiên tiến, đắt tiền đo đó ở Việt
Nam chƣa có điều kiện ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này vào trong các nghiên cứu
(Trần Nhật Phƣơng, 2004). Hơn nữa cũng nhƣ ELISA, phƣơng pháp này khó có thể
áp dụng đối với thịt đã xử lý nhiệt.

2.4.4 Điện di 2 chiều
Phƣơng pháp điện di 2 chiều đƣợc xây dựng từ hai kỹ thuật phân tách sản
phẩm theo 2 thành phần cấu thành của bản thân sản phẩm (điểm đẳng điện, khối
lƣợng phân tử). Phƣơng pháp này có hai giai đoạn phân tách: giai đoạn đầu phân
tách sản phẩm dựa vào điểm đẳng điện của phân tử protein mẫu; giai đoạn hai, sản
phẩm đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử (Rybicki và Purves, 2003).

10
Phƣơng pháp này có tính ứng dụng cao, cho phép phát hiện cùng lúc hàng
ngàn polypeptide khác nhau với độ nhạy cao. Kết quả tốt nhất trên mẫu huyết thanh
và dịch chiết tế bào (Garfin, 2000).
Tuy nhiên, để kỹ thuật điện di 2 chiều đạt kết quả tốt cần phải có tay nghề kỹ
thuật cao. Và cũng nhƣ hai kỹ thuật ELISA và protein array, kỹ thuật này không
phù hợp để xác định protein của thịt đã xử lý nhiệt.
2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction)
Phƣơng pháp PCR là một công cụ đã trở nên phổ biến trong sinh học phân
tử, đem lại một cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền học phân tử, đánh dấu
một bƣớc tiến cực kỳ quan trọng cũng nhƣ các khám phá trƣớc đây về enzym cắt
giới hạn và phƣơng pháp Southern blot. Phƣơng pháp này do K. Mulis cùng cộng sự
phát minh năm 1985. Đây là một phƣơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu
và phân tích gen và hệ gen. Đối với các phƣơng pháp trƣớc đây khó khăn lớn nhất
trong phân tích gen ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ
gen phức tạp, khổng lồ. Trong khi đó kỹ thuật PCR lại giúp chúng ta có thể tạo ra
một số lƣợng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn.
Nhờ các ƣu điểm nổi trội trong nghiên cứu sinh học phân tử mà kỹ thuật
PCR nhanh chóng đƣợc áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn,
nấm, ký sinh trùng và cho kết quả chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và
trật tự nucleotid trên phân tử DNA bằng phƣơng pháp PCR còn có ý nghĩa to lớn
trong công tác phân loại các loài sinh vật.
Thực chất đây là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện

của tế bào và nguyên tắc sẽ đƣợc trình bày sau đây.
Nguyên tắc
Nguyên tắc của phƣơng pháp là tạo lƣợng lớn các đoạn DNA đặc thù từ phân
tử DNA khuôn dựa trên sự hoạt động của DNA – polymerase để tổng hợp sợi mới
bổ sung.


11
Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR
Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotid của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn
cần nhân lên để thiết kế hai đoạn mồi oligonucleotid.
Hai đoạn mồi ngắn xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA, là tín hiệu chỉ
hƣớng đi (5’ – 3’) của enzym DNA polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotid và ở
hai đầu của mồi không kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
Có đầy đủ 4 loại nuclotid tự do (dNTP): dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
Enzym chịu nhiệt Taq polymerase.
Dung dịch đệm.
Ion Mg
2+
.
Nƣớc tinh khiết không có enzym nuclease.
Các bƣớc cơ bản của một chu kỳ phản ứng PCR:
Bước 1: Biến tính (denaturation).
Sợi DNA khuôn mạch đôi tách thành hai sợi DNA mạch đơn dƣới tác dụng
của nhiệt độ cao khoảng 94 – 95
0
C trong vòng 30 giây – 1 phút.
Bước 2: Bắt cặp (hybridization)
Nhiệt độ trong giai đoạn này đƣợc hạ thấp xuống khoảng 37 – 68
0

C tùy
thuộc vào nhiệt độ nóng chảy (Tm) của cặp mồi sử dụng để đoạn mồi bắt cặp với
sợi DNA khuôn. Thời gian cho giai đoạn này kéo dài từ 30 giây – 1 phút.
Bước 3: Kéo dài (elongation)
Nhiệt độ đƣợc tăng đến 72
0
C giúp cho enzym polymerase hoạt động tổng
hợp sợi DNA mới bổ sung với mạch khuôn từ vị trí bắt cặp của đoạn mồi. Thời gian
của giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Một chu kỳ gồm ba bƣớc trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại
làm tăng gấp đôi lƣợng mẫu của lần trƣớc. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân,
theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 10
6
so với số lƣợng mẫu ban đầu
.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR
DNA mẫu
Phản ứng PCR tối ƣu xảy ra khi đoạn DNA khuôn mẫu không đƣợc quá dài,

12
thƣờng khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1 – 1,5 kb.
Phƣơng pháp này cũng cho phép xác định DNA với một lƣợng thấp, khoảng
nhỏ hơn 100 ng (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Tính trung thực của DNA
polymerase không những phụ thuộc vào mức độ sai sót của bản thân enzym này mà
còn phụ thuộc vào số bản sao ban đầu của DNA mẫu (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị
Lang, 1999). Lƣợng bản sao của DNA mẫu ban đầu quá lớn sẽ gây ra sai số cao
trong quá trình sao chép. Sai số ngẫu nhiên trong vài chu kỳ đầu sẽ lan rộng đến
những chu kỳ sau. Do đó, việc giảm lƣợng DNA mẫu ban đầu còn hạn chế đƣợc các
khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn.
Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên nhiều kỹ thuật PCR

vẫn đạt kết quả tốt đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Thậm chí
phƣơng pháp PCR còn cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không đƣợc bảo
quản tốt, đã bị phân hủy nhƣ vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc,
móng tay ngƣời chết,... (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002).
Enzym DNA polymerase
Hiệu quả của phƣơng pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzym
polymerase (vì phản ứng PCR luôn phải thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau).
Phƣơng pháp PCR chuyển sang bƣớc ngoặc mới với việc phát hiện enzym taq
polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn (Thermus aquaticus) phân lập từ suối nƣớc
nóng nên chịu đƣợc nhiệt độ cao. Enzym này không bị biến tính ở nhiệt độ biến tính
và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng tạo ra các sản phẩm DNA
tinh sạch. Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bƣớc của chu trình nhân bản
DNA. Từ đó máy luân nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển cả về nhiệt độ
lẫn thời gian (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999).
Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác cũng đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng
với nhiều chức năng hoàn thiện hơn. Tth polymerase hoạt động nhƣ một enzym
phiên mã ngƣợc khi có mặt RNA khuôn và ion Mn
++
. Tth pol lại xúc tác phản ứng
tổng hợp cDNA trên bản mẫu RNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002).

13
Tuy vậy trong phản ứng PCR, nếu DNA Taq polymerase quá dƣ thừa, chúng
ta sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của mồi trên dây đơn. Hầu hết
ở các quy trình, ngƣời ta khuyến cáo nồng độ Taq nên sử dụng là 0,5 UI/25 l để
kiểm soát tính chuyên tính của phản ứng và không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5
UI/25 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Mồi
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng và
có hiệu quả cao nhất. Chọn mồi là một công việc rất quan trọng quyết định thành

công của phƣơng pháp và công việc đó phải dựa theo một số nguyên tắc sau đây:
Chọn trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc sao cho chúng không bắt cặp bổ
sung giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do
sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi.
Mồi phải đặc hiệu đối với DNA cần khuếch đại và không trùng với
các trình tự khác trên gen.
Trình tự nằm giữa mồi xuôi và ngƣợc không đƣợc quá lớn, khoảng
dƣới 1kb là tốt nhất và phản ứng PCR sẽ không cho kết quả tốt nếu đoạn khuếch
đại lớn hơn 3 kb.
Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 – 30 nucleotid. Nếu mồi dài hơn 30
nucleotid sẽ ảnh hƣởng đến sự tổng hợp ở bƣớc 3. Trong trƣờng hợp tiến hành
trên những DNA đƣợc dòng hóa nhƣ cosmid thì mồi cần dùng sẽ có chuỗi mã
ngắn khoảng 10 nucleotid.
Nhiệt độ bắt cặp của mồi xuôi và ngƣợc không đƣợc quá cách biệt,
thông thƣờng trong khoảng 4 – 5
0
C. Thành phần nucleotid của các mồi phải cân
bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Công thức tính nhiệt độ bắt cặp
của mồi trong trƣờng hợp có khoảng 20 nucleotid là:
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Trong đó: A, T, C, G là thành phần các nucleotid của đoạn mồi.
Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều
chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu đƣợc tần suất đa hình cao