SKKN Đề tài Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp


… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



PHẦN A: ĐẶT VẤN ĐỀ
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Thế kỉ XXI là thế kỉ của công nghệ sinh học, nó đang trở thành ngành khoa học
mũi nhọn và then chốt của nhiều nước. Sự phát triển của công nghệ sinh học là một trong
những tiêu chí hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển của một nước nào đó. Chính vì
vậy, các nước đã tập trung rất ngân sách của và nhân lực cho sự phát triển của ngành
công nghệ sinh học (biotechnology).
Với tầm quan trọng như vậy nên ở tất cả các Trường Đại học: Nông nghiệp, Lâm
nghiệp, Thủy Sản, Y học và Sự phạm đều có bộ môn hay khoa công nghệ sinh học.
Trong chương trình môn Sinh học và Công nghệ Trung học phổ thông có khoảng
từ 5 -10 bài học có liên quan đến công nghệ sinh học. Trong các đề thi tuyển sinh đại học
có khoảng 2 - 5 câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến công nghệ sinh học. Điều này đòi
hỏi các đồng chí giáo viên và các em học sinh phải có những hiểu biết sâu sắc và toàn
diện về công nghệ sinh học. Tuy nhiên, do đây là nội dung mới nên các đồng chí giáo
viên và các em học còn nhiều bỡ ngỡ.
Xuất phát từ những lí do trên, nên khi tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh
nghiệm, tôi đã mạnh dạn chọn đề tài:
“Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp”
II. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
1- Mục đích :
Xây dựng và hoàn thiện chuyên đề “ Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong
nông nghiệp” và trở thành nguồn tư liệu quý cho giáo viên và học sinh.
2- Yêu cầu :
Trình bày được ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau:
- Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn

- Chọn dòng tế bào thực vật
- Lai tế bào thực vật
- Chuyển gen thực vật
- Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam
III. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn tư liệu phong phú giúp cho mỗi giáo
viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công
nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp. Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo
viên và học sinh trở thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự
phát triển của ngành công nghệ sinh học nước nhà.
Ngoài ra, đề tài này còn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt môn Sinh học nói
chung và chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học nói riêng. Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ
vào chuyên ngành khối B của các trường Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp.
IV. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Thực vật.
Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực.
Tuy nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy
mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn, chọn dòng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật

GV: Đỗ Ngọc Thái - 1 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



chuyển gen ở thực vật. Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy -
học và ôn thi đại học và cao đẳng của học sinh Trung học phổ thông.
V. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như giáo trình
đại học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dưỡng giáo viên các trường

chuyên, internet, Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện
đề tài.
Phương pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia.
Phương pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề “ Công nghệ sinh học”
Phương pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ương,
Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học,
Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp
tham gia đề tài cấp nhà nước “Chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt động
đặc thụ bầu nhụy vào cây cam Vinh và quýt Đường canh“.
Phương pháp đánh giá qua thực tiễn sư phạm.
PHẦN B. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
I. VI NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhân giống in vitro. Quá trình
nhân giống này phải trải qua nhiều công đoạn:
Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những
quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của
D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di
truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm
sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân.
Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên
môi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh
trưởng (xitokinin và auxin). Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô
phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù
hợp có xitokinin. Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt
độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển
sang môi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. Để tạo rễ thì chồi nhân phải chuyển
sang môi trường có auxin. Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương
pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc
điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển
những môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (5

8
– 5
15
chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong môi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong các
reactor.
Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi
hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng
thường kéo theo sự biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần
kiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền.
Vi nhân giống có những ưu việt sau:
- Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 2 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



- Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m
2
nền có thể
để được tới 18.000 cây.
- Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm
các cây giống sạch bệnh.
- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng
15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4
o
C trong
hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đến 95%.
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm

trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp
ứng được yêu cầu thực tiễn.
Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao
(300 - 8000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc
biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật quí hiếm và có giá
trị kinh tế cao. Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn
cây giống từ hạt.
Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa
hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông
Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây, còn có thể
rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm
tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai.
II. TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY HẠT PHẤN
Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn
bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng
nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell &
cs, 1977) hoặc môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt
phấn phân chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây.
2.1. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo
2.1.1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt
phấn nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là
những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của
Dunwell (1976) cho thấy tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành
sớm và cây phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ
lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn.
Ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở
một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu
gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ
cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ.

Ngoài ra, xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 - 10
o
C) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ
hạt phấn (Wenzel & cs, 1977).
2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro
Thành phần cacbonhydrat trong môi trường hết sức quan trọng, đặc biệt là đường
sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến
6%, thậm chí 12%.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 3 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Trong các chất hữu cơ, các axit như glutamic có tác dụng kích thích phát triển
phôi ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn
thuốc lá. Các dịch chiết tự nhiên như dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất
khác như vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây
trong nuôi cấy bao phấn.
Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhưng lại ức chế tạo phôi. Vì thế trong
trường hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thường có tác dụng ở giai
đoạn nuôi cấy ban đầu. Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy.
Trong một số ít trường hợp etylen kích thích tạo mô sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết
nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch.
Bổ sung vào môi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm
tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn.
Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối
với thuốc lá mật độ tối ưu là 10
5

hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao
động từ 10
4
- 10
5
.
Ánh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần
300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28
o
C là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và
hạt phấn của hầu hết các giống cây.
2.2. Tái sinh cây
Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ,
thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một
số loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy ban đầu
chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải
chuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Một số trường hợp phải
dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây.
Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên
môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môi
trường có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là
BAP và kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa
thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc.
Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ
lệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc
thường có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977)
thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao.
Ngoài ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-
Ping, 1978).
Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số loài cây có cả cây

nhị bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị
bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự
phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
2.3. Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn
Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu
để tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lưỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử

GV: Đỗ Ngọc Thái - 4 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói
trên, ở một số loại cây có thể nhận được cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao
phấn hoặc hạt phấn, nhưng trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ
lưỡng.
Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng được sử dụng
tạo các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và
rút ngắn thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất
lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống
thuốc lá cho năng suất cao và chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy
bao phấn (Hu han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1
(Yin & cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo
bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn. Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn được sử dụng
để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử.
Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các
cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di
truyền các tính trạng lặn. Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội
lệch. Cây đơn bội cũng được dùng trong lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định về

NST. Nuôi cấy bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến.
Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn
Bao phấn hoặc Giống mới
hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn

Cây đơn bội

Lưỡng bội hóa

Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng
III. CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV)
3.1.Cơ sở khoa học.
Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng.
Mỗi loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các
tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật
ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được
tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những
quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng
và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay
đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các
chất điều hòa sinh trưởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh
lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong
việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng như cây
trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một
loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại

GV: Đỗ Ngọc Thái - 5 - Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



không liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài
gen không di truyền được.
Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượng
phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào
có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào.
Hiện tượng này gọi là hiện tượng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ
tế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái
sinh từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981)
đưa ra một định nghĩa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả
những thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào.
3.2. Vật liệu và phương pháp chọn dòng
Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể
là tế bào cho đến các mô phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểm
riêng. Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các
phương pháp nuôi cấy đối với từng loại cây.
Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo được
dùng để chọn các dòng chống chịu như chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối
(McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp
cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986).
Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn
trên môi trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào
đột biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng
phương pháp chọn lọc từng bước tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ
nhất định của tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngoài ra cũng có
thể sử dụng kết hợp cả hai phương pháp. Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát

triển bình thường liên tục trên môi trường chọn lọc hoặc khi chuyển môi trường chọn lọc
và sau một thời gian dài cấy trên môi trường không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã
được chọn lọc.
Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyên
liệu này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn có
nhiều tế bào bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây
mang đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong
một cây có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình
thường. Để khắc phục nhược điểm này có thể giảm kích thước của mô: mô càng nhỏ
càng tốt. Trọng lượng mô thường dùng là 100-150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-
20 mg (Wakaha & Widholin, 1987).
Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV
(Kishinami & Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương
pháp chọn lọc trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối
tượng. Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế
bào được tiếp xúc đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là
sau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể
mất hẳn. Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhận
đuợc cây (Dix, 1990). Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng
có khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này

GV: Đỗ Ngọc Thái - 6 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



thì tế bào dịch lỏng đáp ứng được mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là
việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt

trong CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát
triển đồng đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô
sẹo, cuối cùng là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được
hiện tượng khảm. Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs,
1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs,
1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast.
Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất
là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ
thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy
protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như
khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã được công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật
liệu lý tưởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan
trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là
dung hợp tế bào và chuyển gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng
và protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên
liệu CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh &
Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr &
cs (1985) đã chọn được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs
(1989) cũng nhận được dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá.
Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo, tế bào
dịch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để
làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi
tách bằng tia cực tím (UV) hoặc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG).
Phương pháp tương tự cũng được một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng.
N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981).
Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trước khi đưa vào nuôi cấy và
chọn lọc.
3.3. Chọn dòng chịu bệnh
Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dòng hoặc giống chịu bệnh

nhưng trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chịu bệnh bằng những
phương pháp này hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây
nhiễm bệnh nhân tạo cho một số lượng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn
đề, ngoài ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công. Không những
thế bằng phương pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng
cùng một loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai
là lai ngược mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển được các gen lặn hoặc nhiều
gen một lúc. Đặc biệt đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thực
hiện được bằng lai tạo.
Đột biến thực nghiệm có thể tạo được giống cây chịu bệnh nhưng tần số xuất hiện
các đột biến đơn gen rất thấp (10
-4
- 10
-6
), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tương đối
cao.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 7 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc
phục được nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh như: qui mô thí nghiệm, thời gian
chọn lọc, khống chế được điều kiện gây nhiễm. Ngoài ra có thể nhận được các đột biến
đơn gen và đột biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thực
nghiệm là 10
-4
- 10

-6
thì ở quần thể cây tái sinh (R
o
) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5%
(Larkin & Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy
in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần
nghiên cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng
lây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác
nhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc
tố gây bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm
là protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và
phân biệt được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng
phát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard
(1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau
đó nuôi vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum)
có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trường phù
hợp cho sự sinh trưởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô
từ tế bào sạch virus sinh trưởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh
trưởng chậm hơn và có màu vàng.
Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae
(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs,
1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs,
1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae
(Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977),
Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.
Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằng
phương pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm. Sun & cs (1986) đã nuôi mô

sẹo từ phôi lúa cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn được các
dòng kháng bệnh. Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô
trong điều kiện in vitro và nhận được những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass,
1986; Joung & cs, 1987). Ngoài ra có thể đưa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng
trên đất bị nhiễm nấm, nhưng hướng này chưa được tiến hành nhiều.
Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã được dùng nhiều
trong chọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có ưu điểm là các tế bào có
thể bị nhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế
có thể sử dụng các nguyên liệu một cách đa dạng. Ngoài ra còn có sự tương quan thuận
giữa kháng ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo. Chọn các dòng kháng ĐTGB đã
được tiến hành thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch
lỏng (Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim &
Spivey, 1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985). Sử
dụng ĐTGB đối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn được các đột biến kháng
bệnh hiếm (Carlson, 1973).

GV: Đỗ Ngọc Thái - 8 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Bên cạnh những ưu điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lưu ý một số
vấn đề như xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều
trường hợp cây bị bệnh nhưng không phát hiện có độc tố hoặc xác định được trong cây
có độc tố gây bệnh nhưng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer,
1983). Một vấn đề nữa là trong nhiều trường hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại
không có khả năng kháng bệnh. Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc
dù có những đặc điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhưng nếu ta tái sinh được số
lượng cây nhiều đến mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm

mong đợi. Điều này đã được khẳng định bằng công trình của Thanutong & cs (1983).
Các tác giả đã nhận được 10-20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của
Pseudomonas và độc tố của Alternaria.
ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết. ĐTGB
thô dưới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn được sử dụng nhiều để chọn dòng chịu
bệnh. Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai
tây kháng P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci,
thuốc lá kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng
F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke
(1985) đã nhận được dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae
khi sử dụng độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.
Ngoài phương pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế
bào, mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB,
ứng dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn
được dòng chịu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs,
1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu
bệnh theo phương pháp này. Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và
giống lhoai lang “Sarlet” chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và đưa vào
sản xuất. Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu
hết các giống cây thì chọn lọc theo hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các
giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất nhưng có một số mặt hạn chế của phương pháp
này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều kiện tự nhiên;
thứ hai là phân dòng sôma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều khi chọn được
dòng chị bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney & Shepard, 1981).
Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy
mô và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn
đề cần giải quyết như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây
bệnh, liên quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
Một vấn đề quan trọng nữa là xác định được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn
lọc in vitro. Một số vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút

ngắn thời gian nuôi cấy và tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số đặc
điểm khác. Việc chọn lựa đối tượng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vào chọn
dòng chịu bệnh cũng rất quan trọng. Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế bào có
thể áp dụng để chọn dòng chịu bệnh ở các loài cây sinh sản vô tính thì phù hợp và có kết
quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990). Ngoài ra nuôi cấy mô và tế bào có thể áp dụng để
chọn các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu bệnh mang gen lặn (Jones, 1990). Việc sử
dụng các ĐTGB không đặc hiệu để chọn các dòng chịu bệnh đặc biệt mà bằng các
phương pháp thông thường không chọn được cũng đã được đề cập (Jones, 1990).

GV: Đỗ Ngọc Thái - 9 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



3.4. Chọn dòng chống chịu các stress của môi trường
Các stress môi trường bao gồm những điều kiện bất lợi của môi trường như phèn,
chua, mặn, khô, hạn, nóng, lạnh Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu được
các stress môi trường là rất cần thiết. Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đất
trồng bị mặn (chủ yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm). 40-60% đất khô hạn.
Ngoài ra do việc cải tạo môi trường như tưới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ
và diệt cỏ cũng dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các
tác nhân trên.
Như đã trình bày ở các phần trên, nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp một phần
trong việc tạo chọn các dòng chống chịu các stress môi trường. Trước khi giới thiệu một
số thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở
cũng như phương pháp chọn các dòng chống chịu stress môi trường. Ngoài một số vấn đề
chung được đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ
cấp cao, chọn dòng chống chịu stress môi trường còn có một số vấn đề liên quan đến cơ
sở của tính chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hoàn chỉnh. Đặc biệt là cơ sở di truyền

của tính chống chịu stress môi trường còn chưa được biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có
thể có nhiều alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trường, ngoài ra các alen này
thường là lặn nên không thể hiện trong trường hợp dị hợp tử. Đây là những vấn đề làm
cho việc chọn các dòng chống chịu stress môi trường chưa có được những thành tựu
mong muốn. Ngoài ra một số vấn đề quan trọng nữa là tương quan giữa khả năng chống
chịu các stress môi trường ở cây hoàn chỉnh và tế bào nuôi cấy rất phức tạp vì thế chọn
dòng bằng nuôi cấy mô có thể không tạo được cây chống chịu những điều kiện đặc biệt
trên đồng ruộng. Mặc dù có một số vấn đề hết sức quan trọng được nêu ở trên, thực tế
vẫn có những cơ sở và số liệu đáng tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào
để chọn các dòng chống chịu với các stress môi trường: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm
đa gen có thể biến đổi bởi đột biến xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm
này. Những kết quả nghiên cứu của Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã
cho thấy tính chống chịu với một số stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di
truyền qua thế hệ sau. Ngoài ra đã có những số liệu về sự phân ly theo Mendel của các
đặc điểm được chọn lọc (Comner & Meredits, 1985).
Cho đến nay hầu hết các công trình chọn dòng chống chịu stress môi trường đều
chọn theo phương pháp chọn lọc trực tiếp. Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến
hành khi mô sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mô sẹo đã phát triển. Các stress có thể
ở mức độ thấp hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế
bào chịu được một nồng độ nào đó lại đưa lên nồng độ cao hơn. Việc tiến hành xử lý có
thể liên tục hoặc gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài. Cho đến nay chưa có
những nghiên cứu so sánh cụ thể đối với từng trường hợp trên. Tốt nhất tùy từng đối
tượng cụ thể mà kết hợp việc chọn lọc theo cách này hay cách khác. Đây là một vấn đề
nghiên cứu về mặt phương pháp nhưng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thành
công trong việc chọn các dòng chống chịu stress môi trường. Muốn nhận những đột biến
mới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc ở
mô đơn bội từ hạt phấn lai F
1
có thể nhận được các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp của
các alen sẵn có.

Trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể trong việc chọn dòng
chống chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ. Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã được chọn lọc
từ mô nuôi cấy của các loài Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium,
Ipomoea babatas L. (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985),

GV: Đỗ Ngọc Thái - 10 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Medicago sativa L. (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and
Swartz, 1984). Tính chống chịu trong một vài trường hợp được thông báo là ổn định ở
mức độ tế bào và cây hoàn chỉnh (Winnicov, 1991). Về cơ chế của tính chịu muối cũng
đã có những kết quả đáng ghi nhận. ở Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc lá
địa phương chịu muối cũng được tiến hành và đã thu được những kết quả tiến bộ
(Nguyễn Hoàng Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy
abscisic axit (ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là
protein với phân tử lượng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987). Mối
tương quan giữa ABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề
nghiên cứu hết sức lý thú trong những năm tới. Các dòng chịu hạn đã được thông báo
(Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000
hoặc PEG 6000 đưa vào môi trường để chọn. Vấn đề tạo dòng kháng nhôm được Couner
và cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner & Meredith, 1985). Các tác giả đã chọn được các
dòng thuốc lá kháng nhôm ổn định, tính kháng nhôm là đặc điểm trội và di truyền qua thế
hệ sau. Việc chọn các dòng chống chịu với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ:
Preil và cs. (1983) đã nhận được các cây cúc chịu được nhiệt độ thấp. Nhìn chung phần
lớn các nghiên cứu từ trước đến nay đều tập trung vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và
chịu nóng. Những kết quả của Chen và Gusta (198) nhận được trên Triticum aetivum L,
Secale cereale L, và Bromus inermis Leyss cho thấy ABA làm tăng khả năng chịu lạnh

đáng kể. Các tác giả cho rằng ABA là chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh. Orr và cs cũng
nhận được những kết quả tương tự về tác dụng của ABA. Cả tính chịu lạnh và tính chịu
nhiệt đều liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt các protein mới nhưng vai trò cụ thể của
từng loại protein mới này như thế nào? Chúng có vai trò gì trong quá trình chịu lạnh và
chịu nhiệt cao? Đây là những câu hỏi còn đang để ngỏ.
Chọn dòng chống chịu stress môi trường là yêu cầu chiến lược trong công tác
giống cây trồng nhưng cho đến nay phần lớn các công trình tập trung vào tìm kiếm các
phương pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này. Những kết quả nhận
được mới chỉ là những cơ sở hết sức ban đầu. Để có được những thành công trong tương
lai và có được những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hướng trên vẫn
là điều quan tâm hàng đầu.
3.5. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhưng không
có vai trò đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong
cây. Thực ra về mặt tiến hoá, các chất thứ cấp đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá
trình đấu tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất
có tác dụng quyến rũ côn trùng hoặc có mầu sắc và hương vị đặc biệt. Sự phát triển của
kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ
thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Hiện nay có nhiều
phòng thí nghiệm đã ký với các hãng sản xuất để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thực
vật nuôi cấy trên quy mô công nghiệp. Một trong những yêu cầu của quá trình công
nghiệp hoá tế bào nuôi cấy để thu nhận các chất thứ cấp là vấn đề tạo các dòng cho năng
suất cao và ổn định.
Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô
hoặc tế bào nuôi cấy dịch lỏng.
Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt. Đối với các chất thứ cấp
không có màu trước khi cấy chuyển cần được phân tích. Đây là việc làm tốn khá nhiều

GV: Đỗ Ngọc Thái - 11 - Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



công sức và thời gian. Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đưa ra phương pháp ép tế
bào. Theo phương pháp này, các cụm tế bào hoặc mô được ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa
tế bào sẽ ngấm vào giấy lọc sau đó dùng phương pháp nhuộm để xác định. Đối với một
số chất được tế bào tiết ra môi trường thì có thể xác định theo phương pháp dùng màng
phủ than hoạt tính để hấp thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop
and Beiderback, 198). Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp xác định dựa vào tính chất
kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn của các chất do tế bào tiết ra như berberine chẳng hạn
(Suzuki & cs, 1987). Các phương pháp khác như phóng xạ hoặc phân biệt tế bào bằng
huỳnh quang cũng đã được sử dụng.
Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi
cấy là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ.Tuy nhiên
vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng và nồng độ đường đã được ghi nhận. Hàm
lượng các chất thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trưởng về sinh khối, tốc độ
tổng hợp và tiết ra môi trường của các chất này.
Thường thường tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu
kỳ sinh trưởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh và
không kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào nuôi cấy có
tốc độ phân chia chậm thì có ưu thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp.
Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề
được nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có
năng suất cao cho hàm lượng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất
thấp. Cũng trên đối tượng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng
suất cao không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng được
công bố trên những loài cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến
nay vẫn chưa có chứng minh chắc chắn về tương quan giữa năng suất của cây làm

nguyên liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy. Theo Wilson (1990) nên sử dụng những
cây đa dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu.
Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dòng tế
bào không ảnh hưởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964). Nhiều tác giả
khác lại nhận được các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của
cây, thậm chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk
& cs, 1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982). Hall và Yeoman (1987) còn cho
biết trong quần thể tế bào nuôi cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các
chất màu) cũng khác nhau giữa các tế bào. Những sự biến động về tích lũy các chất thứ
cấp này là những cơ sở để tìm các phương pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòng cho
năng suất cao.
Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tế
bào nuôi cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhưng các
tế bào riêng rẽ ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ
không ổn định.
Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống
thứ hai và thứ ba tạo ra các dòng ổn định và không ổn định.
Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn chưa sáng tỏ là cơ sở của những
thay đổi kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật nuôi
cấy in vitro. Để có được những phương pháp chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất
thứ cấp cao những nghiên cứu về vấn đề này là rất quan trọng.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 12 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Ngoài những phương pháp chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp
cao đã nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo các dòng tế bào này là một hướng cần được

tiến hành, tuy nhiên ở đây cũng còn nhiều vấn đề liên quan chưa được hiểu biết đặc biệt
là những cơ sở sinh hoá và phân tử trong chu trình trao đổi chất thứ cấp.
Mặc dù còn một số vấn đề cần giải quyết nhưng những thành tựu đạt được trong
chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao đã mở ra triển vọng lớn trong việc
đưa tế bào thực vật nuôi cấy vào sản xuất các chất thứ cấp có ý nghĩa trong nông nghiệp,
công nghiệp và y học. Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố
đỏ và chất diệt khuẩn Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp
hoá việc thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Công nghệ sinh học Canada
và các phòng nghiên cứu của hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống
công nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell
Report, 1989).
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công
nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện
nay nguồn cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng
nguồn cung cấp hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang được quan
tâm đặc biệt. Vấn đề tìm ra các phương pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ
cấp cao là khâu then chốt để đưa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp.
Những thành tích đạt được trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hoá sản xuất
Shikonin bằng tế bào nuôi cấy là những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy
để nhận các chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao.
Ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã
được bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tượng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus.
Năm 1988, Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn được dòng tam thất cho hàm lượng
saponin cao. Những thay đổi về hàm lượng nicotine liên quan đến quá trình phân hoá mô
và cây tái sinh cũng đã được công bố (Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ).
IV. LAI TẾ BÀO
4.1. Dung hợp protoplast và lai nhân.
Do không có vách xellulô nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tượng lý
tưởng trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp
hai loại protoplast có thể tạo đươc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngoài

ra có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan như nhân, lục lạp,
ty thể hoặc chuyển các vectơ mang các gen mã hoá cho một số đặc điểm biết trước.
Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tượng này thường xảy ra sau khi tách
protoplast từ một loại cây. Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào các giống cây
Schieder & Vasil, 1980), ở cà độc dược tần số này đạt tới 8% (Schieder, 1974).
Để dung hợp hai loại protoplast khác nhau thường phải xử lý một số tác nhân. Một
số tác giả dùng nước biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoặc nitrat natri
(Power & cs, 1970; Carlson, 1972), một số khác sùng các chất kích thích như lectin
nhưng hiệu suất dung hợp rất thấp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974;
Glimelus & cs, 1974). Hiệu suất dung hợp khá cao có thể đạt được bằng cách xử lý
protoplast bằng ion Ca
2+
ở 37
o
C và môi trường kiềm (pH=10,5) (Keller & Melchers,
1973; Binding, 1974; Schieder, 1974).
Hiện nay phương pháp có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi là phương pháp dung
hợp của Kao và đồng nghiệp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974). Các tác
giả đã dùng polyethylen glycol (PEG) có phân tử lượng cao (6000) để gắn các protoplast

GV: Đỗ Ngọc Thái - 13 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



với nhau. Quá trình dung hợp xảy ra khi làm loãng dung dịch PEG bằng môi trường nuôi
cấy. Khi PEG bị làm loãng thì protoplast dần dần trở lại bình thường và ở phần tiếp giáp
giữa hai protoplast bị vỡ ra và quá trình dung hợp được xảy ra. Trong cùng thời gian
Wallin và cs. đã sử dụng thành công phương pháp này (Wallin & cs, 1974). Nagata đã

thay PEG bằng rượu polyvinyl để dung hợp protoplast của thuốc lá, cà rốt và cây họ đậu
(Nagata, 1978). Phương pháp sử dụng PEG có hiệu quả đối với nhiều trường hợp khi
dung hợp protoplast của các cây cùng loài và khác loài, dung hợp tế bào động vật và cả
trường hợp dung hợp protoplast thực vật với tế bào động vật (Pontecorvo, 1975; Jone &
cs, 1976; Dudits & cs, 1976; Vasil, 1976; Vasil & cs, 1976).
Về cơ chế của quá trình dung hợp đã được Nagata và Melchers nghiên cứu tỉ mỉ
(Nagata & Melchers, 1978).
Cuối những năm 70 và đầu 80 một số tác giả đã đưa ra phương pháp dung hợp
bằng dòng điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982;
Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983). Bằng phương pháp này, các tác
giả đã đạt được tần số dung hợp tới 60 và 80%. Tuy tần số dung hợp có cao nhưng vấn đề
tái sinh các sản phẩm dung hợp lại gặp khó khăn. Chỉ gần đây một số tác giả mới nhận
được cây tái sinh sau khi sử dụng phương pháp dung hợp này (Kohn & cs, 1985).
Khi dung hợp hai loại protoplast với nhau thường có ba nguồn gen tham gia (nhân,
lục lạp, ty thể) được kết hợp trong các sản phẩm dung hợp. Nếu dung hợp hai loại
protoplast giống nhau ta sẽ tạo được các sản phẩm đồng hợp gen (homogenome). Trong
trường hợp dung hợp hai loại protoplast khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm dị hợp gen
(heterogenome). Các sản phẩm đồng hợp gen sẽ tạo ra các kiểu hình giống như bố mẹ
nhưng với mức bội thể gấp đôi. Các sản phẩm dị hợp gen sẽ tạo ra tế bào dị nhân với hỗn
hợp lục lạp và ty thể. Một trong hai nhân có thể bị thoái hoá hoặc cả hai đều phân ly
trong quá trình phân chia tế bào. Sự thoái hoá hoặc phân ly của một nhân trong tế bào dị
hợp gen sẽ tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả hai loại protoplast và chỉ có một
nhân. Những tế bào kiểu này được gọi là các thể lai tế bào chất.
Muốn chọn các thể lai sôma bằng dung hợp protoplast có thể sử dụng các đặc
điểm phối hợp, các đặc điểm kháng sinh hoá và các đột biến sắc tố, ngoài ra có thể sử
dụng các đặc điểm khác nhau tự nhiên giữa các loại protoplast.
Melcher là người đầu tiên sử dụng sự phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản
phẩm dung hợp ở thuốc lá (Melchers & Labil, 1974). Một số tác giả khác đã sử dụng
phương pháp tương tự trong các thí nghiệm lai giữa các cây dại trên cùng loài như
P.innoxia (Schieder, 1977) và các cây khác loài như P Parodii + P.Hybrida (Cocking

1978), N. Tabacum + N. Glauca (Evans & cs, 1978). Sự phối hợp các đột biến tự dưỡng
như thiếu nitrate reductase, thiếu các axit amin và vitamin hoặc mẫn cảm với nhiệt độ đã
được nhiều tác giả sử dụng có kết quả (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller &
Grafe, 1978; Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs,
1983;Shimamoto & cs, 1983). Điều đáng chú ý là các đột biến sử dụng để chọn phối hợp
phải là các đột biến lặn và khác alen.
Đặc điểm kháng các chất ức chế trao đổi chất cũng được sử dụng rộng rãi để chọn
thể lai. Power và cs (1976) đã sử dụng actinomyxin để chọn thể lai giữa P. Parodii và P.
Hybrida. Maliga và cs (1977, 1982) dùng kanamyxin và streptomyxin để chọn thể lai
trong các thí nghiệm dung hợp giữa các loài thuốc lá với nhau.
Một số dòng tế bào và cây lai còn được chọn bằng sự khác nhau về khả năng sinh
trưởng và tái sinh của sản phẩm dung hợp và từng loại protoplast (Carlson & cs, 1972;
Power & cs, 1977), bằng ưu thế trong sự phát triển của cây lai (Cocking & cs, 1977;

GV: Đỗ Ngọc Thái - 14 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Schieder, 1978; Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979;
Lonnerndoker & Schieder, 1980), hoặc hình dạng không bình thường của mô và cây lai
(Melchers & cs, 1978; Binding & Nehls, 1978).
Năm 1977 Kao đưa ra phương pháp tách thể dung hợp bằng cơ học. Phương pháp
này được Gleba và đồng nghiệp phát triển và sử dụng tại phòng thí nghiệm của mình
(Gleba & Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979).
Cho đến nay dung hợp protoplast là phương pháp hiệu quả nhất để tạo cây lai
sôma. Nó cho phép tạo các tổ hợp lai bất kỳ theo ý muốn. Vấn đề là phải nghiên cứu cải
tiến phương pháp dung hợp, kỹ thuật nuôi cấy và phương pháp chọnlọc.
Từ công trình lịch sử của Carlson (Carlson & cs, 1972) đến nay bằng phương pháp

dung hợp protoplast các nhà khoa học trên thế giới đã tạo được cây lai sôma từ hàng trăm
tổ hợp lai giữa các cây cùng loài, khác loài và khác chi. Đây là những thành tựu hết sức
lớn lao mà các nhà khoa học đã đạt được trong lĩnh vực lai sôma bằng dung hợp
protoplast. Gần đây các nhà nghiên cứu đã tạo được cây lai sôma ở cả những giống cây
trồng có ý nghĩa kinh tế như khoai tây, cà chua và lúa (Handley & cs, 1986; O’Connell &
Hasnon, 1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988). Qua đây ta
thấy được triển vọng lớn lao của việc ứng dụng phương pháp này để cải biến di truyền ở
thực vật nhằm tạo ra giống cây đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi của thực tiễn.
4.2. Lai tế bào chất
Ngoài việc tạo ra các thể lai sôma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast còn có
thể tạo được các thể lai tế bào chất (hay còn gọi là lai sinh chất). Trong những năm gần
đây nhiều phòng thí nghiệm ở Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain và Hungary
đã đầu tư nhiều cho các nghiên cứu trong lĩnh vực này, vì đến nay một số các đặc điểm
chống chịu của thực vật được chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất.
Trong thời kỳ đầu, các nhà nghiên cứu đã cố gắng tạo các thể lai tế bào chất bằng
cách đưa các bào quan tách rời vào protoplast. Potrykus là người đầu tiên công bố chuyển
được lục lạp vào protoplast của Petunia hybrida (cây dạ yên) nhưng không có những số
liệu chứng minh chắc chắn sự tồn tại của lục lạp trong tế bào (Potrykus, 1973). Những
công trình của Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) và Kung ( 1975) cũng ở tình
trạng tương tự.
Vasil và vợ của ông đã công bố kết quả chuyển ty thể từ cây bất dục đực (BDĐ) ở
cây ngô và cây Dã yên vào protoplast của cây bình thường và tái sinh được cây (Vasil &
Vasil, 1974; Vasil, 1976). Các tác giả còn xác định được gen điều khiển tính BDĐ ở ngô.
Những công trình trên đã đi vào lịch sử. Từ đó đến nay không có những công bố
tiếp theo. Sở dĩ như vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào quan nguyên vẹn
và giữ nguyên hoạt động của chúng. Đây là vấn đề hết sức khó khăn vì trong quá trình
tách và làm sạch, các bào quan bị giảm sức sống. Ngoài ra chúng còn dễ bị ảnh hưởng
bởi các tác nhân trong quá trình dung hợp. Mặt khác nữa là trong các công trình kể trên
hiệu suất dung hợp còn rất thấp.
Bắt đầu từ năm 1978 đến nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật dung hợp

hai loại protoplast, trong đó một loại có các đặc điểm di truyền lục lạp và ty thể đã được
xác định để tạo các cây lai tế bào chất. Belliard và cs (1978) là những người đầu tiên sử
dụng thành công phương pháp này. Tuy nhiên tỷ lệ cây lai tế bào chất nhận được còn
thấp và việc phân tích di truyền các cây lai nhận được bị gặp nhiều khó khăn do sự hình
thành cả các thể lai nhân. Để khắc phục những hạn chế trên, Zelcer và đồng nghiệp lần
đầu tiên sử dụng phương pháp dung hợp “cho và nhận“ (Zelcer & cs, 1978). Ông dùng tia

GV: Đỗ Ngọc Thái - 15 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



X để giết nhân của một loại protoplast. Những protoplast đã bị chiếu xạ này không thể
phân chia được mà chỉ đóng góp tế bào chất trong quá trình tạo cây lai. Zelcer dung hợp
protoplast đã giết nhân (protoplast cho tế bào chấ) của N. Tabacum với protoplast nguyên
vẹn (protoplast nhận) của N. Sylvestris. ôõng đã chuyển được tính BDĐ (đặc điểm ty thể)
từ N. Tabacum sang N. Sylvestris.
Các đặc điểm liên quan tới lục lạp cũng đã được chuyển thành công nhờ phương
pháp trên (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs,
1983, 1984, 1985; Kemble & Barsby, 1988).
Ngoài việc dùng tia phóng xạ để giết nhân có thể dùng một số chất hoá học như
iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), hoặc dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977;
Maliga & cs, 1982). Nhưng trong các trường hợp này tỷ lệ nhân sống sót vẫn còn đáng
kể.
Đối với các đặc điểm di truyền lục lạp rất dễ dàng chọn lọc và theo dõi sau khi
dung hợp bằng các chỉ thị di truyền lục lạp như các đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978),
các đột biến kháng sinh hoá như kháng một số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs,
1985), các đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo &
Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) và các đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel 1984).

Đại phân tử của enzim ribulozo 1, 5 difotfat carbonxylase được tổng hợp nhờ
thông tin di truyền lục lạp đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hoá lục lạp (Kung & cs,
1975). Phương pháp phân tích sinh hoá chính xác hơn nữa đó là phương pháp phân tích
điện di đồ của ADN lục lạp (cpADN) sau khi dùng các enzim cắt giới hạn, cắt cpADN
thành những đoạn khác nhau và phân lập các đoạn cắt này bằng điện di (Belliard & cs,
1978). Hiện nay phương pháp này được sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên
thế giới. Ngoài khả năng sử dụng với bất kỳ tổ hợp lai nào, phuơng pháp này còn rất
chính xác nó cho phép xác định được 1% hỗn hợp của cpADN.
Khác với lục lạp các đặc điểm liên quan tới ty thể không có những chỉ thị để chọn
trong khi nuôi cấy in vitro. Một số tác giả đã dùng chỉ thị lục lạp để chọn (Medgyesy &
cs, 1980; Menczel & cs, 1982). Trường hợp này chỉ sử dụng được khi lục lạp và ty thể
liên kết với nhau theo một cơ chế nào đó.
Nghiên cứu hình thái của hoa có thể gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai trong
các cây lai. Tính BDĐ cũng đã được sử dụng làm chỉ thị để chọn đặc điểm ty thể ở thuốc
lá (Belliard & cs, 1979) và Dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980).
Giống như lục lạp phương pháp phân tích điện di đồ của ADN ty thể (mtADN)
cũng được sử dụng rộng rãi để xác định ty thể trong cây lai tế bào chất. Belliard và cs đã
dùng phương pháp này để nghiên cứu ty thể ở những cây lai trong thí nghiệm dung hợp
protoplast thuốc lá và đã phát hiện thấy sự tái tổ hợp của mtADN trong các cây lai
(Belliard & cs, 1979). Tiếp sau đó Nagy và cs (1981), Galun và cs (1982) và nhiều tác giả
khác đã sử dụng những phân tích mtADN để nghiên cứu và theo dõi hoạt động của ty thể
ở các cây lai tế bào chất.
Số phận của lục lạp cũng như ty thể ngoại lai trong cơ thể lai tế bào chất là một
vấn đề được các nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu vì việc biến đổi di truyền tế bào chất
chỉ có ý nghĩa khi những thông tin di truyền lục lạp và ty thể ngoại lai tồn tại và hoạt
động bình thường trong cơ thể lai.
Những kết quả đầu tiên của Kung (Kung & cs, 1975, 1977) và Chen (Chen & cs,
1977) cho thấy các cây lai giữa N. Glauca và N. Langsdorffii phần lớn chỉ chứa một loại
lục lạp (hoặc của bố, hoặc của mẹ). Trong công trình của Belliard, tác giả chỉ xác định
được một loại cpADN trong cây lai tế bào chất (Belliard & cs, 1978). Thành và cs đã

GV: Đỗ Ngọc Thái - 16 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



chứng minh cây thuốc lá nhận được từ dung hợp protoplast của hai loại cây khác tông
Salpiglossis sinuata (cây cho lục lạp) và N. Tabacum (cây nhận lục lạp) chỉ chứa một loại
lục lạp của S. Sinuata (Thanh & cs, 1988). Trong một vài trường hợp các tác giả này lại
xác định được cả hai loại lục lạp. Một số tác giả khác cũng thu được những kết quả tương
tự (Aviv & cs, 1980, 1984; Glimelius, 1981; Bonnet & Glimelius, 1983).
Mặc dù trong một số công trình các tác giả chứng minh được sự tồn tại của hai
loại cpADN trong cây lai nhưng chưa ai thấy được hiện tượng tái tổ hợp của cpADN.
Vấn đề tái tổ hợp của cpADN ở thực vật bậc cao tuy đã được nhiều phòng thí nghiệm
trên thế giới nghiên cứu, xong đến cuối những năm 80 mới có hai công bố về sự tái tổ
hợp cpADN trong cây lai tế bào chất ở thuốc lá (Medgyesy & cs, 1985) và cây lai tế bào
chất giữa thuốc lá và khoai tây (Thanh & cs, 1989). Tái tổ hợp ADN lục lạp là một vấn
đề rất có ý nghĩa, thông qua tái tổ hợp cpADN có thể tạo ra các tổ hợp gen tế bào chất
mới.
Đối với ty thể trong toàn bộ các công trình đã công bố đều cho thấy ở các cây lai
tế bào chất luôn xảy ra sự tái tổ hợp mtADN (Belliard & cs, 1978; Nagy & cs, 1981,
1983; Clark & cs, 1986; Kemble, 1986; Robertson & cs, 1987). Kết quả của sự tái tổ hợp
này là tạo ra các kiểu hình hoa mới, và các kiểu hình này rất ổn định (Belliard &
Pelletier, 1979). Tái tổ hợp mtADN xảy ra ngay cả sau khi dung hợp protoplast của hai
giống thuốc lá có mtADN tương tự nhau, tuy nhiên sự tái tổ hợp xảy ra nhiều hơn khi
dung hợp hai loài thuốc lá khác nhau như N. tabacum và N. Plumbaginifolia (Nagy & cs,
1981, 1983).
Cho đến nay, việc nhận cây lai tế bào chất bằng kỹ thuật dung hợp protoplast mới
được thực hiện chủ yếu ở các loài thuốc lá, cải và bước đầu thành công ở khoai tây. Tuy

vậy những thành tựu đạt được đã mang lại những ứng dụng thực tiễn trong việc cải biến
cây trồng. Chuyển lục lạp có thể giúp cho việc khôi phục năng suất ở cây cải dầu –
Brasica napus (Bennerot & cs, 1974; Pelletier & cs, 1983) và tạo các giống cây trồng
kháng các chất diệt cỏ (Benversdof & cs, 1980; Binding & cs, 1982; Gressel & cs, 1984;
Pelletier & cs, 1985).
Lai tế bào chất bằng dung hợp protoplast có thể rút ngắn thời gian tạo các dòng bất
dục đực 4-5 năm. Chuyển tính BDĐ đã thành công ở thuốc lá (Zelcer & cs, 1978; Aviv
&Galun, 1980; Aviv & cs, 1980; Glimelius & cs, 1981; Uchimiya, 1982; Menczel & cs,
1983; Fluhr & cs, 1984) và dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980; Izhar &
cs, 1983, 1984; Boeshore & cs, 1983; Clark cs, 1985; Rothenbenrg & cs, 1985). Đặc biệt
là chuyển tính BDĐ để tạo hạt lai ở cải dầu đã mang lại lợi ích kinh tế (Pelletier & cs,
1985; Chetrit & cs, 1985).
V. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
5.1. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Nó trở thành một phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ
bản trong sinh học thực vật. Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động
của gen. Ngoài ra nó mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng.
Từ khi khám phá ra rằng chuyển gen có thể thực hiện nhờ Agrobacterium tumefaciens
(Klee & Rogers, 1989) các nhà khoa học tin rằng Arobacterium có thể chuyển gen vào tất
cả các loài cây. Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium
không thể thực hiện được trên các cây ngũ cốc vì thế hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen
đã được phát triển đó là kỹ thuật chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1989), kỹ thuật
bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ thuật chuyển gen

GV: Đỗ Ngọc Thái - 17 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …


qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta, 1986), kỹ thuật đường dẫn bằng ống phấn (Luo &
cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt hoặc mô với ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật nhiễm vi
khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN của virus (Gronenborn & Matzeit,1989), Kỹ
thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp liposom (Ahokas, 1987), phương pháp vi
tiêm (De la Pena & cs, 1987), và phương pháp xử lý laser (Weber & cs, 1988). Đến nay
nhờ cải tiến các vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành
công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa (Hiei và cs, 1994). Kỹ thuật này trở nên một kỹ
thuật đầy triển vọng đối với chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm.
- Phân lập gen.
- Gắn gen vào các vectơ biến nạp.
- Biến nạp vào E. Coli.
- Tách ADN plasmid.
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật.
- Chọn các thể biến nạp.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh.
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề
sinh học của hệ thống chuyển gen như:
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng.
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng
thu nhận gen biến nạp vào genôm.
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có những khả năng khác nhau. Cần
xem xét một số vấn đề như: chỉ có số ít tế bào có khả năng tái sinh và biến nạp; một số
khác có một trong hai khả năng; một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả
năng; một số khác hoàn toàn không có khả năng tái sinh và biến nạp.
- Thành phần các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan,
từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.

- Cho đến nay gen chỉ có thể chuyển vào tế bào có thành xellulô bằng
Agrobacterium, virus, vi tiêm, bắn gen và chuyển gen trực tiếp.
Khả năng xâm nhập của gen vào genôm một cách ổn định không tỷ lệ với sự thể
hiện tạm thời của gen.
Các ADN không phải là của virus khi có trong genôm chưa bảo đảm là đã gắn ổn
định với genôm.
- Các ADN không phải của virus không chuyển rời từ tế bào nọ sang tế bào kia, nó
chỉ ở nơi mà nó được đưa vào.
- ADN virus không xâm nhập vào genôm cây chủ, chuyển từ tế bào này sang tế
bào khác và bị loại ở mô phân sinh.
5.2. Các phương pháp chuyển gen
5.2.1. Chuyển gen bằng Agrobacterium.
Chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để
chuyển gen ở thực vật. Phương pháp này dùng Ti- plasmid của A. tumefaciens hoặc Ri
plasmid của A. rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plasmid gồm hai thành
phần T -ADN và vùng vir (virulence). T-ADN có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế
bào thực vật, chính nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển nạp vào T -ADN để đưa vào

GV: Đỗ Ngọc Thái - 18 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



tế bào. T -ADN chức gen điều hoà sinh trưởng cục bộ và gen tổng hợp các chất opine.
Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kỳ đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập
vào phân tử ADN thực vật. Vùng vir gồm sáu nhóm từ virA đến virG trong đó virC và
virE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trước hết là cắt bỏ các gen điều hoà sinh
trưởng cục bộ sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn

điều khiển (promote) phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng là gắn gen cần biến
nạp.
Chuyển gen bằng Agrobacterium đã thực hiện có hiệu quả trên nhiều loại cây hai
lá mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng và cs, 1992), đậu tương (Hinchee & cs,
1988; Dhir & cs, 1992), bông (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngô (Gould & cs, 1991;
Citovsky & cs, 1994). Những thành công mới nhất trên lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid &
cs, 1996) đã làm cho phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn và
củng cố vị trí của nó như các nhà tiền bối hy vọng ngay từ đầu. Cho đến nay chuyển gen
thông qua Agrobacterium là phương pháp cho tần số biến nạp cao hơn và có thể xác định
được sự xâm nhập ổn định hơn bất cứ phương pháp chuyển gen nào (Chan & cs, 1993)
5.2.2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus.
Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus là phương pháp gắn ADN virus
vào T -ADN của Ti plasmid và chuyển vào tế bào thực vật. Khi vào tế bào thì ADN virus
được giải phóng để tạo virus hoạt động và xâm nhập vào genôm tế bào gần vùng u do
Agrobacterium gây nên. Bằng phương pháp này Grimsley và cs (1987) lần đầu tiên cho
thấy khả năng chuyển gen ở cây ngũ cốc bằng Agrobacterium.
5.2.3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1988) là phương pháp
chuyển ADN thông qua xử lý polyethylen glycol (PEG). Đây là phương pháp chuyển gen
cho hiệu quả cao. Bằng phương pháp này đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn
định và di truyền qua các thế hệ (Potrykus & cs, 1985). Phương pháp này có các ưu điểm
như: tần số chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao; có thể chuyển gen
vào protoplast bất kỳ loài cây nào. Tuy nhiên vấn đề tái sinh cây từ protoplast còn khó
khăn ở một số loài cây. Mặc dù đã có nhiều thành tựu trong nuôi cấy protoplast nhất là
protoplast của các giống cây có giá trị kinh tế như lúa, ngô, luá mì, đại mạch nhưng
phần lớn việc tách nuôi tế bào đều phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuôi cấy phôi để
làm nguyên liệu ban đầu mà điều này không phải dễ thực hiện đối với các giống cây
trong sản xuất.
5.2.4. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen.
Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại (vàng hoặc

vonfram) được bao bọc bởi ADN và bắn vào tế bào. Bằng phương pháp này có thể biến
nạp tất cả các loại tế bào. Người ta hy vọng phương pháp này sẽ giải quyết tất cả các vấn
đề chuyển gen, nhưng cho đến nay tần số biến nạp bằng phương pháp bắn gen còn thấp
và thường xuyên nhận được cây biến nạp khảm (cây có các tế bào biến nạp và tế bào
không được biến nạp). Có thể nói đến một số ưu điểm của phương pháp bắn gen là:
- Thao tác dễ dàng.
- Bắn một lần được nhiều tế bào.
- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, các mô).

GV: Đỗ Ngọc Thái - 19 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Cây đậu tương biến nạp đầu tiên đã nhận được bằng phương pháp này (McCabe &
cs, 1988). Nhiều phòng thí nghiệm đã nhận được cây ngô biến nạp trong cùng thời gian
(Fromm & cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990). Một vấn đề tồn tại quan trọng là tần số
biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus (1991) thì ưu điểm thực sự của phương pháp
bắn gen là ứng dụng trong nghiên cứu sự thể hiện tạm thời của gen. Nhưng trong những
năm gần đây đã có hàng loạt các công bố về biến nạp thành công trên lúa (Zhang & cs,
1996), đu đủ, mía, bông đã khẳng định những ưu việt của phương pháp này.
5.2.5. Phương pháp vi tiêm.
Phương pháp vi tiêm P (microinjection) vào hợp tử và phôi từ hạt phấn. Phương
pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đưa ADN vào những tế bào
nhất định (Neuhaus & Spangenberg, 1990). Phương pháp này đã tạo được dòng biến nạp
từ protoplast và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn ở cây cải dầu. Giống
phương pháp bắn gen, vi tiêm có thể đưa ADN vào những tế bào xác định có thành
xellulô. Vi tiêm hạn chế hơn bắn gen ở chổ một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác
cần khéo léo hơn. Vi tiêm có một số ưu điểm sau:

- Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào.
- Có thể quyết định đưa ADN vào loại tế bào nào.
- Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát đuợc.
- Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế về số
lượng cũng có thể tiêm một cách chính xác.
- Có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm.
- Có thể biến nạp mọi giống cây .
Cho đến nay bằng các phương pháp kể trên đều đã nhận đuợc cây biến nạp. Ngoài
ra một số phương pháp khác cũng được thực hiện nhưng chưa có kết quả hoặc kết quả
chưa khẳng định, đó là các phương pháp sau:
- Phương pháp ủ hạt khô hoặc phôi trong dung dịch ADN.
- Phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn. Phương pháp này dựa vào cơ sở là
ADN có thể được xâm nhập vào hạt phấn ở giai đoạn nảy mầm và có thể di chuyển vào
nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn (Hess, 1987).
- Phương pháp đường dẫn ống phấn (Luo, 1988). Phương pháp này cũng tương tự
như phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn là đưa ADN vào hợp tử bằng ống phấn.
- Phương pháp vĩ tiêm (macroinjection). Phương pháp này sử dụng kim tiêm có
đường kính lớn hơn đường kính tế bào để đưa ADN vào tế bào, các tế bào này bị phá vỡ
và ADN xâm nhập vào tế bào bị thương rồi sau đó được chuyển vào các tế bào bên cạnh
- Phương pháp xung điện (electropoation). trong phương pháp này, dùng hiện
tuợng phóng điện để tạo lỗ trên màng tế bào làm cho việc đưa ADN vào tế bào dễ dàng
hơn, nhất là khi ADN đã tiếp giáp với màng tế bào. Đối với protoplast, phương pháp
xung điện đã có một số kết quả khích lệ (Fromm, 1987), nhưng chưa có những chứng
minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa việc nuôi cấy protoplast ở một số loài cây vẫn
còn gặp nhiều khó khăn.
- Ahokas (1989) đã sử dụng điện di để vận chuyển ADN vào mô phân sinh chồi từ
hạt đại mạch để xem phương pháp điện di ADN qua mô có thể vận chuyển gen vào tế
bào hay không. Kết quả tác giả nhận được sự thể hiện tạm thời của gen chỉ thị (GUS)
nhưng không chứng minh được sự biến nạp ổn định.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 20 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



- Liposom có chứa ADN cũng đã được sử dụng như một phương tiện để đưa gen
ngoại lai vào tế bào thông qua dung hợp (Caboche, 1990) hoặc vi tiêm vào không bào
(Lucas, 1990). Cả hai phương pháp này đều chưa thu đựợc kết quả.
- Phương pháp vi laser được ứng dụng để tạo lỗ hổng trên màng tế bào sau đó ủ tế
bào với dung dịch ADN được Weber (1990) sử dụng như một phương pháp chuyển gen
không cần vectơ, nhưng sau một thời gian dài vẫn chưa có kết quả chắc chắn về sự xâm
nhập của ADN vào tế bào (1995) Guo đã kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng
trương để rút bớt nước từ tế bào sau đó chuyển vào môi trường có thế năng thẩm thấu
yếu có chứa ADN ngoại lai và dùng laser tạo lỗ trên màng tế bào để ADN xâm nhập vào
tế bào. Bằng phương pháp này các tác giả đã quan sát thấy sự thể hiện của gen biến nạp
sau khi xử lý tế bào và ở cây tái sinh.
5.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nông nghiệp
Trong nông nghiệp, kĩ thuật chuyển gen đem lại rất nhiều lợi ích:
- Chuyển gen kháng sâu bệnh vào các giồng cây trồng như chuyển gen Bt vào cây
bông để tạo ra giống bông kháng sâu hại.
- Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào nhiều giống cây trồng như ngô, bông, đậu
tương. Các giống này đã được Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam cho
trồng thử tại huyện Khoái Châu – Hưng Yên năm 2011 và cho kết quả rất khả quan.
- Chuyển gen S vào tế bào chất của lúa để tạo ra dòng lúa bất dục đực tế bào chất.
Đây là bước không thể thiếu được trong sản xuất lúa lai. Việt phát hiện ra và chuyển
thành công gen S vào tế bào chất đã mở ra bước ngược lớn cho ngành sản xuất lúa lai,
góp phần đảm bảo an ninh lương thực trên toàn cầu.
- Chuyển gen sinh auxin và mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào các
giống cam, quýt, cà chua đã tạo ra rất nhiều giống cây ăn quả không hạt, qua đó nâng cao

chất lượng và giá thành hoa quả. Mỹ là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này.
- Nhờ kỹ thuật chuyển gen đã giúp tạo ra những giống mang nhiều đặc tình quý,
như gạo vàng chứa nhiều chất tiền vitamin A (β- caroten). Đây là kết quả hợp tác của
nhiều nhà khoa học thuộc các nước Mỹ, Đức, Thụy Sỹ trong vòng 20 năm và tiêu tốn hết
100 triệu đôla. Các nhà khoa học đã chuyển được 7 gen liên quan đến quá trình tổng hợp
β- caroten vào giống lúa LD309 để tạo ra giống lúa gạo vàng. Giống lúa gạo vàng không
ngừng được hoàn thiện, năm 2000 tạo ra giống lúa gạo vàng thế hệ I có hàm lượng β-
caroten gấp 200 lần gạo trắng, đến năm 2005 tạo ra giống lúa gạo vàng thế hệ II có hàm
lượng β- caroten gấp 4600 lần gạo trắng, điều này mang lại nhiều hi vong cho các nước
nghèo tròng việc phòng và chữa bệnh thiếu vitamin A.
Tóm lại, thành tựu nổi bật của kĩ thuật chuyển gen là cho phép tái tổ hợp di truyền
giữa các loài đứng xa nhau trong bậc thang phân loại mà bằng phương pháp lai không thế
thực hiện được.

VI. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở VIỆT NAM.
Nuôi cấy mô thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết
thúc. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện Sinh học,
viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu phòng tập
trung vào nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam như
nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về nuôi cấy thành
công bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào 1978 (Lê Thị Muội, 1978). Tiếp đó là
thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Nguyễn Đức Thành, 1981).
Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh và muộn hơn nữa

GV: Đỗ Ngọc Thái - 21 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …


là tại Đại học Nông nghiệp Hà Nội và viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam các
phòng thí nghiệm cấy mô không những ở các viện nghiên cứu (viện Di truyền nông
nghiệp; viện Rau quả trung ương) mà cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Yên Bái,)
Từ giữa những năm 80 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô
và tế bào thực vật được phát triển mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh
vục nhân giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học /CNSH, ĐHNN1, viện
KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNN1, viện DTNN, viện KHKTNNVN,
viện RQTư), một số cây hoa như Phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh),
Hồng, Cúc, Cẩm chướng (Viện CNSHV, viện Lâm nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã
được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng thuốc (Lê
Bích Thủy vả cs, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và cs,
1994; Đinh Thị Phòng và cs, 1994). Các kết quả về dung hợp tạo cây lai tế bào chất và
chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành 1997). Nuôi cấy
bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại viện CNSH và DTNN. Nuôi cấy
các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các
chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo, Phan Thị
Bảy và cs, 1995).
Năm 2007, Viện khoa học nông nghiệp và phát triển nông thôn đã tạo ra được
giống lúa siêu thuần chủng bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn kết hợp với đột biến.
Việt Nam cũng đã chuyển thành công được một số gen kháng sâu bệnh, hay gen
tạo quả không hạt vào một số giống cây trồng. Năm 2010 Viện công nghệ sinh học đã tạo
ra dòng Đu đủ mang gen kháng virut xoăn lá bằng công nghệ chuyển gen. Năm 2012
trường Đại học nông nghiệp Hà Nội đã thực hiện đề tài chuyển gen sinh auxin và gen
mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống cam Vinh và cam Đường canh
nhăm dòng cam quýt không hạt,
Trong những năm gần đây Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã cho tiến
hành trồng thử nhiều giống cây chuyển gen mang gen kháng thuốc trừ cỏ, gen Bt kháng
sâu của nhiều giống cây: ngô, bông, đâu tương, và thu được kết quả khá khả quan.
VII. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM SƯ PHẠM
Đề tài đã tập trung nghiên cứu được 5 nội dung cơ bản của công nhệ sinh học thực

vật trong nông nghiệp : vi nhân giống cây bằng nuôi cấy mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi
cấy mô từ hạt phấn, chọn dòng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen ở thực vật và một số
thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp ở Việt Nam.
Các nội dung trên được trình bày một cách khá chi tiết và hoàn thiện. Điều này đã
được PGS.TS. Phan Hữu Tôn - Khoa Công nghệ sinh học -Trường ĐHNNHN và
PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết -Khoa Sinh - Trường ĐHSPHN đánh giá rất cao (10 điểm).
Đề tài này cũng được nhiều học viên Cao học trường ĐHSPHN xin làm tài liệu để
xây dựng luận văn tốt nghiệp, cũng như phục vụ cho công tác giảng dạy sau khi tốt
nghiệp Cao học.
Sau khi tốt nghiệp Cao học, tôi đã sử dụng nguồn tài liệu này giảng dạy trên lớp,
bồi dưỡng đội tuyển học sinh giỏi của trường và đã thu được kết quả rất khả quan. Cụ thể
trong năm học 2011 - 2012 : đội tuyển học sinh giỏi môn Sinh học của trường đã đạt
thành tích rất xuất sắc ( nhất đồng đội và cá nhân), kết quả thi Đại học khối B rất cao (có
3 em đỗ ĐHYHN, gần 20 em đỗ ĐHYHP). Đây là những bằng chứng sinh động nhất
chứng minh hiệu quả thực tiễn của đề tài.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 22 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Ngày 1 tháng 4 năm 2013, trường THPT Tiên Lữ đã tổ chức hội thảo sinh học
chuyên đề “Ứng dụng công nghệ sinh học trong thực tiễn’’ . Trong buổi hội thảo này các
đồng giáo viên và các em học sinh tham dự không chỉ được nghe, nhìn, mà còn được
thưởng thức các sản phẩm của ứng dụng công nghệ sinh học. Do đó, đã tạo ra một ấn
tượng khó quên về buổi hội thảo và thấy được tầm quan trọng của việc ứng dụng Công
nghệ sinh học trong thực tiễn.
Năm 2011, tôi đã bảo vệ thành công đề tài ’’Chuyển gen sinh auxin hoạt động đặc
thù vào cây cam Vinh nhằm tạo quả không hạt’’ và được Hội đồng chấm đánh giá loại

xuất sắc.
VIII. ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG ĐỀ TÀI
Đề tài là nguồn tài liệu tham khảo cho các đồng chí giáo viên các trường : THPT ,
Năng khiếu để dạy học tốt môn Sinh học, ôn đội tuyển học sinh giỏi và ôn thi Đại học,
Ngoài ra, nó còn là nguồn tài liệu cho các học sinh, sinh viên, học viên cao học
tham khảo.
PHẦN C. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Đề tài đã tập trung nghiên cứu được 5 nội dung cơ bản của công nghệ sinh học
thực vật trong nông nghiệp : vi nhân giống cây bằng nuôi cấy mô, tạo cây đơn bội bằng
nuôi cấy mô từ hạt phấn, chọn dòng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen ở thực vật và
một số thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp ở Việt Nam.
Nhờ sự phát triển của phương pháp nuôi cấy mô đã cho phép nhân nhanh các
giống quý hiếm, đặc biệt là các loài có hệ số nhân giống tự nhiên thấp như cây hoa Lan.
Đồng thời tạo ra các dòng cây sạch bệnh, như chuối Tây sạch bệnh, góp phần nâng cao
năng suất và chất lượng cây trồng.
Sự kết hợp giữa nuôi cấy hạt phấn và đa bội hóa đã cho phép tạo ra các dòng siêu
thuần chủng một cách nhanh chóng mà bằng phương pháp lai không thể có được.
Trước đây, quá trình chọn giống được diễn ra ở cấp độ cá thể, vì vậy phải tốn
nhiều thời gian và công sức. Ngày nay, cùng với sự phát triển của nuôi cấy mô, người ta
đã sử dụng thêm phương pháp chọn giống mới, đó là chọn lọc ở cấp độ tế bào và được
gọi là chọn dòng tế bào. Đây là hướng chọn lọc mới có nhiều triển vọng.
Sự phát triển của kĩ thuật dung hợp tế bào trần và sự hoàn thiện của kĩ thuật nuôi
cấy mô của các tế bào trần đã giúp tạo ra các cây lai khác loài có tính hữu thụ cao, khắc
phục được hiện tượng bất thụ do lai xa.
Thành tựu nổi bật nhất của kĩ thuật chuyển gen là cho phép tái tổ hợp di truyền
giữa các loài rất xa nhau trong hệ thống phân loại mà bằng phương pháp lai không thể
thực hiện được. Nhờ kĩ thuật chuyển gen người ta tạo ra nhiều giống mang gen kháng sâu
bệnh, mang những đặc tính quý như hạt gạo vàng,
Đây là nguồn tài liệu quý cho các đồng chí giáo viên và học sinh để dạy – học tốt

môn Sinh học và môn Công nghệ nói chung và phần nội dung Công nghệ sinh học nói
riêng. Qua đó tăng tỉ lệ học sinh thi đỗ vào các Trường Đại học và Cao đẳng.
II- KIẾN NGHỊ
Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp là một vấn đề mới và
khó nên các đồng chí giáo viên và học sinh còn nhiều bỡ ngỡ do thiếu thông tin và thí
nghiệm thực hành. Vì vậy, Kính mong các Trường THPT và Sở giáo dục và đào tạo mở
các chuyên đề hội thảo về nội dung này để trao đổi, học hỏi kinh nghiệm.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 23 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …



Đối với giáo viên khi thực hiện giảng dạy phần : ứng dụng công nghệ sinh học của
môn Công nghệ 10, chúng ta không nên coi là phần phụ, mà phải nghiêm túc chuẩn bị
nội dung, phương pháp sao cho học sinh thấy đây là những kiến thức hay và có ý nghĩa
thực tiễn rất cao đối với đời sống.
III. NHỮNG HẠN CHẾ VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN TIẾP CỦA ĐỀ TÀI
1. Những hạn chế
Đề tài này mới chỉ tập trung nghiên cứu được 5 nội dung cơ bản của công nghệ
sinh học thực vật trong nông nghiệp : vi nhân giống cây bằng nuôi cấy mô, tạo cây đơn
bội bằng nuôi cấy mô từ hạt phấn, chọn dòng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen ở thực
vật và một số thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp ở Việt Nam.
Do sự hạn chế về nguồn tư liệu và trình độ của bản thân, nên trong đề tài này vẫn
còn có nhiều thiếu sót như: số lượng kênh hình còn ít, số liệu về các ví dụ minh họa cho
từng phần còn chưa nhiều.
2. Hướng phát triển tiếp của đề tài
Tập trung đề cập thêm các nội dung mới của ứng dụng công nghệ sinh học thực
vật trong nông nghiệp như : sử dụng máy PCR và điện di để phát hiện gen, sử dụng máy

giải trình tự ADN, phương pháp tạo đột biến gen bằng tia γ, phương pháp tạo đột biến đa
bội bằng cosixin, chọn giống bằng chỉ thị phân tử
Không chỉ dừng trong lĩnh vực thực vật, mà phải tiếp tục mở rộng sang các đối
tượng mới như : ứng dụng công nghệ sinh học trong chăn nuôi, y học, môi trường ,
Tóm lại, mặc dù tôi đã rất cố gắng và thể hiện hết mình để viết đề tài này, nhưng
do trình độ của mình còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, tôi
rất mong sự đóng góp ý kiến của các đồng chí giáo viên để đề tài này được hoàn chỉnh
hơn.
Tôi xin trân thành cảm ơn !
Tiên Lữ, ngày 5 tháng 4 năm 2013
Người viết
Đỗ Ngọc Thái
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: Công nghệ gen và Công nghệ sinh học ứng
dụng trong y dược học hiện đại, NXB Y học.
2. Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
4. Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
5. Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp.
6. Nguyễn Lân Dũng: Thế kỷ 21- thế kỷ vàng của công nghệ sinh học, Khoa học phổ
thông, Xuân 1997.
7. Phan Hữu Tôn, 2011: Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp.
8. Trần Thế Thông: Công nghệ sinh học với nông nghiệp, Khoa học phổ thông, Xuân 1997.
9. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006: Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục.
10. Genetic IX, xuất bản năm 2008, tại London.
11. Công nghệ sinh học: nghesinhhoc.

GV: Đỗ Ngọc Thái - 24 - Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” …






MỘT SỐ HèNH ẢNH VỀ ỨNG DỤNG CễNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

H1. Nhõn giống hoa Lan H2. Tạo dũng chuối tõy sạch bệnh
(Nguồn. Viện rau quả Trung ương)

H3- Nuụi cấy bao phấn H4. Dũng lỳa thuần
(nguồn: Viện khoa học nụng nghiệp và phỏt triển nụng thụn)

GV: Đỗ Ngọc Thái - 25 - Trường THPT Tiên Lữ