CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA SINH HỌC
CÁC PHƯƠNG PHÁP
CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
Lớp: sinh học thực nghiệm
Khoá học: 2012 – 2014
MỞ ĐẦU
Chẩn đoán phân tử giúp phát hiện sự có mặt của virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng, protein và các phân tử nhỏ
đặc biệt trong người, ĐV, TV, nước, đất.
Có hai loại kỹ thuật chẩn đoán phân tử:
- Dựa trên tính đặc hiệu của một kháng thể đối với kháng nguyên.
- Lai axit nucleic hoặc PCR → trình tự axit nucleic đặc hiệu.
1. Các quy trình chẩn đoán miễn dịch
Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)

Kháng thể đơn dòng
2. Các hệ thống chuẩn đoán DNA
- Mẫu dò lai
- Chẩn đoán bệnh sốt rét
- Phát hiện Trypanosoma cruzi
- Quy trình lai không phóng xạ
- Đèn hiệu phân tử
- Xác định dấu vân tay DNA
- Nhân bội ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình
- Thể cảm biến sinh học vi khuẩn
3. Chẩn đoán phân tử các bệnh di truyền
- Sàng lọc bệnh xơ nang
- Thiếu máu tế bào hình liềm
- Quy trình PCR/OLA
- Mẫu dò khóa
- Xác định kiểu gen bằng các mồi PCR đánh dấu huỳnh quang

NỘI DUNG
1. Các quy trình chuẩn đoán miễn dịch
Nhiều hệ thống phát hiện miễn dịch có độ nhạy, đặc hiệu, đơn giản.
Trước đây, các quy trình chẩn đoán dựa trên các đặc điểm của nhân tố gây bệnh.
→ Xác định phân tử chỉ thị bằng các thử nghiệm hóa sinh.
→ Phát hiện phân tử chỉ thị mà không phụ thuộc bản chất hoá học của nó, dựa trên việc
phát hiện phức kháng nguyên - kháng thể.
Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) là một PP phổ biến dùng KT để
xác định KN đích.
Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)
Nguyên lý:
Dùng kháng thể có đánh dấu enzyme để định lượng kháng nguyên trong phản ứng hấp phụ
miễn dịch giữa kháng thể - kháng nguyên.
Quy trình ELISA tổng quát để phát
hiện kháng nguyên đích.
-
Kháng thể sơ cấp thường được
tách ra từ thỏ đã được gây miễn
dịch với kháng nguyên đích.
-
Kháng thể thứ cấp được tách ra từ
dê được gây miễn dịch với kháng
thể của thỏ
-
Enzyme (E) được kết hợp với
kháng thể thứ cấp
Sơ đồ kháng nguyên đích
Kháng thể đa dòng

Bề mặt kháng nguyên có các yếu tố quyết định kháng nguyên

(epitop) khác nhau. Khi kháng nguyên này được dùng để gây đáp
ứng miễn dịch ở một loại động vật, mỗi yếu tố quyết định kháng
nguyên gây tổng hợp một kháng thể khác nhau. Tập hợp các kháng
thể cùng phản ứng với một kháng nguyên cấu thành một kháng thể
đa dòng.

Kháng thể đơn dòng: Chỉ nhận biết một epitop trên một KN cho sẵn.

Mục tiêu cơ bản khi dùng KT làm nhân tố chẩn đoán hoặc điều trị là
tìm cách để tạo một dòng tế bào có thể nuôi cấy được và sản sinh ra các
kháng thể đơn dòng có ái lực cao với KN đích đặc hiệu. Dòng tế bào như
vậy là nguồn cung cấp ổn định, liên tục các phân tử KT giống hệt nhau.
2. Kháng thể đơn dòng
Sản xuất kháng thể đơn dòng

Nguyên lý:
+ Tế bào lympho B: là tế bào sản xuất ra kháng thể khi có đáp ứng miễn dịch, nhưng lại không có khả năng tái sinh
trong nuôi cấy.
+ Tế bào ung thư là những tế bào có khả năng phân chia vô hạn.
+ Người ta cho rằng tế bào lai được tạo ra khi dung hợp tế bào ung thư (u tủy xương) với tế bào B, sẽ có thành phần
di truyền của tế bào B để sinh KT, và có chức năng phân chia của tế bào ung thư để phát triển trong môi trường nuôi cấy.

Ý tưởng này được thực hiện vào những năm 1970
a. Tạo và chọn lọc tế bào lai
Quy trình HAT chọn lọc tế bào u tuỷ - lá lách lai
Tế bào lách Tế bào u tuỷ
Dung hợp
Sinh trưởng trên môi trường HAT
Kiểm tra miễn dịch
Đáp ứng tương đương

Tách dòng TB u tuỷ lai
Tách dòng TB u tuỷ lai
Kiểm tra miễn
dịch
Âm tính
Dương tính
b. Xác định dòng tế bào
lai sinh kháng thể đặc
hiệu
3. Các hệ thống chuẩn đoán DNA

Lai acid nucleic dựa trên cơ sở sự bắt cặp của các bazơ. Đó là liên kết hiđro giữa chuỗi nucleotide này
với chuỗi nucleotide bổ sung.

Quy trình tổng quát của lai acid nucleic:
+ Gắn DNA sợi đơn (đích) lên màng đỡ.
+ Bổ sung các DNA sợi đơn đã được đánh dấu dưới các điều kiện thích hợp để thúc đẩy sợi đơn gắn
với DNA đích.
+ Rửa giá đỡ để loại mẫu dò thừa không gắn.
+ Xác định trình tự lai tạo thành giữa mẫu dò và DNA đích.
3.1 mẫu dò lai
Khái quát về sự phát triển và sử dụng mẫu dò lai
3.2 chuẩn đoán bệnh sốt rét

Ký sinh trùng sốt rét: Plasmodium falciparum.

Chẩn đoán bệnh sốt rét bằng DNA: sự có mặt của KST sốt rét được phát triển bằng cách sử dụng DNA có độ lặp lại
cao (DNA có nhiều bản sao) của P. falciparum.

Đầu tiên, 1 thư viện DNA của KST này được sàng lọc với DNA của toàn bộ bộ gen của KST đó.


Các khuẩn lạc lai đánh dấu mạnh nhất được chọn sẽ được kiểm tra khả năng lai với DNA các loài Plasmodium không
sốt rét.

Đoạn DNA chọn làm mẫu dò đặc hiệu được lai với Plasmodium falciparum nhưng không lai với P. vivax, P.
cynomolgi hoặc DNA người.
3.3 Phát hiện Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi là KST thuộc động vật nguyên sinh gây bệnh trùng mũi khoan.

Hiện nay, chẩn đoán bằng PCR được dùng bổ trợ cho các xét nghiệm truyền thống đang được sử dụng rộng
rãi.
+ Trình tự đích là đoạn DNA 188 bp có mặt trong nhiều bản sao của genome Trypanosoma cruzi nhưng lại
không có mặt trong genome của KST liên quan khác. Mồi được thiết kế dựa trên trình tự đích này.
+ Sau phản ứng PCR, sự có mặt của đoạn DNA 188 bp được phát hiện bằng điện di trên polyacrylamide gel.

Lai phóng xạ thường được dùng cho độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên P
32
có thời gian tồn tại ngắn, nguy hiểm,
quy trình lại đòi hỏi thiết bị an toàn cao.

Quy trình lai DNA không phóng xạ được phát triển để khắc phục các nhược điểm trên.

Ở quy trình lai không phóng xạ, tín hiệu lai được khuếch đại bằng chuyển hóa enzyme hợp chất có màu
hoặc hóa phát quang cơ chất khi cơ chất bị chuyển thành các sản phẩm đặc hiệu bởi enzyme thích hợp.
3.4. Quy trình lai không phóng xạ
Phát hiện DNA đích bằng hoá phát quang
biotin
Mẫu dò
DNA đích

streptavidin
Phosphatse kiềm đánh dấu biotin
Sản phẩm phát
sáng
Cơ chất
A. Mẫu dò gắn biotin được liên kết
với DNA đích
B. Streptavidine được gắn vào phân
tử biotin
C. Phosphatase kiềm đánh dấu biotin
liên kết với Streptavidine
D. Phosphatase kiềm chuyển cơ chất
thành sản phẩm phát sáng

Ưu điểm của quy trình lai không phóng xạ:
+ DNA đánh dấu biotin bền
+ Thiết bị phát hiện quang hóa học nhạy
+ Thời gian phát hiện mẫu dò chỉ trong vài giờ.

Phương pháp hóa phát quang nhạy hơn nhiều so với nhuộm màu.
Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gắn vào mồi để phát hiện sản phẩm được nhân bội bằng PCR. Các mồi được ký
hiệu P1, P2
Xét nghiệm dựa vào PCR
Xanh lam
Xanh lục
Đỏ
Đỏ
3.5 Đèn hiệu phân tử
Mẫu dò đèn hiệu phân tử với các chất phát huỳnh quang khác nhau
DNA đích

Đầu dò đèn hiệu phân tử
lai
Chất dập tắt
Chất có màu phát huỳnh quang
Thể lai DNA đích – mẫu dò
Lai mẫu dò đèn hiệu phân tử với DNA đích
Dùng hai mẫu dò đèn hiệu phân tử khác nhau để phân biệt các kiểu gen khác nhau.
Kiểu dại đồng hợp tử
Thể đột biến đồng hợp tử
Dị hợp tử
3.6 Xác định dấu vân tay DNA
Phân biệt các cá thể bằng sự khác nhau của các trình tự lặp lại. Phổ DNA của các trình tự lặp lại
→ dấu vân tay DNA.
Ứng dụng: Xác định mối quan hệ huyết thống
Nhận dạng nạn nhân các thảm họa…

Nhận dạng tội phạm trong khoa học hình sự

DNA mẫu
RE
Các đoạn DNA
ĐD trên gel agarose
Màng lai
Mẫu dò (1)*
Ảnh tự chụp bằng phóng xạ
Loại mẫu dò (1)*
Màng được lai với mẫu dò (2)*
Ảnh tự chụp bằng phóng xạ
:
Biến tính

Loại mẫu dò (2)*
Thấm tách Southern của một mẫu DNA pháp y
Máu của nạn
nhân
Áo của
bị cáo
Máu của bị cáo
Chuẩn kích thước DNA,
kb