Định danh vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG PHƢƠNG
PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ




SVTH : LÊ THỊ THANH NGỌC
MSSV : 60501840
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG



TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2011
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG ii
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin trân trọng gửi lời biết ơn chân thành nhất đến Cha Mẹ, và Anh
Chị cùng những ngƣời thân đã luôn ủng hộ và động viên em.
Em xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thúy Hƣơng, ngƣời đã tận tình dìu dắt, hết
lòng truyền đạt kinh nghiệm đồng thời tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt bài luận văn
này. Cùng các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Bách
Khoa Tp.HCM, những ngƣời đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ bản.

Em xin cảm ơn:
 Ban Giám Hiệu trƣờng ĐH Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô
Khoa Công Nghệ Hóa Học, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi để em hoàn thành đề tài.
 Tập thể lớp HC05BSH luôn chia sẻ động viên tôi trong suốt quá trình học và thực
hiện đề tài.
Trong quá trình thực hiện đề tài do còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tế nên không
tránh khỏi những sai sót. Em mong các Thầy Cô chỉ bảo thêm, giúp em hoàn thiện bản
thân và đạt kết quả tốt hơn trong tƣơng lai.
Cuối cùng, xin kính chúc Cha Mẹ, quý Thầy Cô dồi dào sức khỏe và gặt hái thật
nhiều thành công trong công việc và cuộc sống!

Sinh viên thực hiện
Lê Thị Thanh Ngọc

Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG iii
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC


TÓM TẮT

Trƣớc tiên đƣa ra các nguyên lý, mục đích hƣớng đến và quy trình của việc định
danh vi sinh vật trên lý thuyết. Dựa vào đó so sánh và phân tích ƣu điểm, nhƣợc điểm
giữa các phƣơng pháp định danh vi sinh vật. Sau dó nghiên cứu tình huống giải trình tự
gen 16s rDNA định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong các mẫu probiotic L-
bio, Biolac, Probio, Antibio, Sau khi chọn sản phẩm là 4 mẫu probiotic trên, chuẩn bị hóa
chất và các thiết bị cần thiết, tiến hành bằng cách thực hiện phƣơng pháp PCR khuếch đại
đoạn 550 bp của 16S, kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng phƣơng pháp điện di, thu nhận
kết quả, đƣa ra các nhận xét khách quan dựa trên thực tế. Đƣa ra kết luận và các nhận xét

cuối về các phƣơng pháp định danh vi sinh vật theo lý thuyết và dựa trên thực tế.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG iv
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

MỤC LỤC
CÁC TỪ VIẾT TẮT ………………………………………….………………… vi
DANH MỤC HÌNH …………… …………… ……………….……………… vii
DANH MỤC BẢNG ………………….……… ……………….……………… ix
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1
1.1 Giới thiệu về vi sinh vật 1
1.1.1 Lịch sử phát hiện của vi sinh vật 1
1.1.2 Phân loại các loại vi sinh vật 1
1.1.3 Ứng dụng của vi sinh vật 1
1.2 Giới thiệu chung về định danh vi sinh vật 2
1.2.1 Nguyên lý cơ bản 2
1.2.2 Mục đích của việc định danh 3
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP 4
2.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống 4
2.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen 5
2.2.1 Phân tích acid nucleic 5
2.2.2 Phân tích ADN plasmid 5
2.2.3 Phân tích ADN nhiễm sắc thể 10
2.3 Phƣơng pháp lai ADN 14
2.3.1 Các phƣơng pháp đánh dấu 15
2.3.2 Quá trình lai: 19
2.3.3 Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. 24
2.4 Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN 28
2.4.1 Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction) 28
2.4.2 Giải trình tự ADN 36

CHƢƠNG 3: NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN
16S rDNA ĐỊNH DANH VI KHUẨN LACTOBACILLUS
ACIDOPHILUS TRONG CÁC MẪU PROBIOTIC DÙNG CHO
NGƢỜI 51
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG v
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

3.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: 51
3.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: 51
3.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong Probiotic: 54
3.2 Chọn sản phẩm 56
3.3 Hóa chất 57
3.4 Dụng cụ và thiết bị 59
3.5 Phƣơng pháp tiến hành 62
3.5.1 Phƣơng pháp chạy PCR 64
3.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rDNA 67
3.6 Kết quả và nhận xét 72
3.6.1 Kết quả phân lập 72
3.6.2 Kết quả chạy PCR và giải trình tự 76
CHƢƠNG 4: TỔNG KẾT 91
4.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống 91
4.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen 91
4.2.1 Phân tích acid nucleic, Phân tích ADN plasmid, Tách plasmid 91
4.2.2 Phân tích ADN nhiễm sắc thể 92
4.2.3 Các phƣơng pháp đánh dấu: 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG vi

SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

CÁC TỪ VIẾT TẮT
A : Adenin
AND : Acid desoxyribonucleic
ARN : Acid ribonucleic
Bp : Base pair
TBE : Tris – borate EDTA
TE : Tris – EDTA
tRNA : Transfer ribonucleic acid
PCR : Polymerase Chain Reaction
RPM : Revolutions per minute
MDS : Multy drug resistant
MRS : Man Rogosa Sharpe
MMDB : Molecular Modeling database
dATP : deoxyadenosin – triphosphate
dCTP : deoxycytidin – triphosphate
ddNTP : dideoxynucleoside – triphosphate
dGTP : dideoxyguanosin – triphosphate
dNTP : deoxynicleoside – triphosphate
dTTP : deoxythymidin – triphosphate
MBS : Membrane binding solution
MWS : Mambrane wash solution

Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG vii
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Plasmid vòng 6

Hình 2.2: Streptomyces và Borrelia 6
Hình 2.3: Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di 8
Hình 2.4: Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể 11
Hình 2.5: Kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH phát hiện vi khuẩn Helicobacter
pylori 20
Hình 2.6: Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trƣờng dịch thể 21
Hình 2.7: Mô tả phƣơng pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot 23
Hình 2.8: Minh hoạ bƣớc chuyển ADN lên màng 24
Hình 2.9: Vị trí đặt lƣợc sau khi đổ gel 43
Hình 2.10: Tra mẫu trên thiết bị chạy gel 48
Hình 2.11: Thiết bị giải trình tự ADN tự động, (3100-Avant Genetic Analyzer) 50
Hình 3.1: Cấu trúc vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 52
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus trên môi trƣờng MRS 52
Hình 3.3: Tủ cấy, dụng cụ nuôi cấy và kính hiển vi 59
Hình 3.4: Máy ly tâm và bếp điện từ 60
Hình 3.5: Máy chạy PCR 60
Hình 3.6: Bộ điện di Agarose 61
Hình 3.7: Máy chụp hình gel CHEMI Doc-Biorad 61
Hình 3.8: Máy ABI 3130 XL của Applied Biosystem 62
Hình 3.9: Các bƣớc tinh sạch DNA 69
Hình 3.10: Hình khuẩn lạc chủng A1 trên MT MRS ở nồng độ 10
-5
, 10
-6
. 72
Hình 3.11: Hình khuẩn lạc chủng A2 trên MT MRS ở nồng độ 10
-5
, 10
-6
73

Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG viii
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Hình 3.12: Hình dạng chủng A2 dƣới kính hiển vi 73
Hình 3.13: Hình hai loại khuẩn lạc trên MT MRS ở nồng độ 10
-6
. 74
Hình 3.14: Hình ảnh khuẩn lạc chủng A3 và A4 trên MT MRS 74
Hình 3.15: Hình dạng chủng A3 dƣới kính hiển vi 75
Hình 3.16: Hình dạng chủng A4 dƣới kính hiển vi 75
Hình 3.17: Hình khuẩn lạc chủng A5 trên MT MRS ở nồng độ 10
-2
, 10
-3
. 76
Hình 3.18: Hình dạng chủng A2 dƣới kính hiển vi 76
Hình 3.19: Kết quả điện di phát hiện sản phẩm khuếch đại 77
Hình 3.20: Kết quả điện di phát hiện sản phẩm khuếch đại sau khi tinh sạch 77
Hình 3.21: Tín hiệu huỳnh quang chủng A1 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 79
Hình 3.22: Mạng Nucleotide chủng A1 79
Hình 3.23: Tín hiệu huỳnh quang chủng A2 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 81
Hình 3.24: Mạng Nucleotide chủng A2 81
Hình 3.25: Tín hiệu huỳnh quang chủng A3 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 83
Hình 3.26: Mạng Nucleotide chủng A3 83
Hình 3.27: Tín hiệu huỳnh quang chủng A4 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 85
Hình 3.28: Mạng Nucleotide chủng A4 85
Hình 3.29: Tín hiệu huỳnh quang chủng A5 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 87
Hình 3.30: Mạng Nucleotide chủng A5 87
Luận văn tốt nghiệp

GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG ix
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Nồng độ agarose và kích thƣớc mẫu ADN tƣơng ứng 9
Bảng 2.2: Một số enzyme cắt hạn chế đƣợc dùng cho kỹ thuật PFGE. 13
Bảng 2.3: Một số cơ chất dùng cho đánh dấu trực tiếp 16
Bảng 2.4: Liệt kê một số hệ thống đánh dấu gián tiếp. 17
Bảng 2.5: Một số ví dụ về ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vật. 30
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR 34
Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa định danh Lactobacillus 54
Bảng 3.2: Cách pha PCR mix 65
Bảng 3.3: Kết quả cấy phân lập chế phẩm Anti bio trên môi trƣờng MRS. 72
Bảng 3.4: Kết quả cấy phân lập chế phẩm Probio trên môi trƣờng MRS. 73
Bảng 3.5: Kết quả cấy phân lập chế phẩm Biolac trên môi trƣờng MRS. 74
Bảng 3.6: Kết quả cấy phân lập chế phẩm L-bio trên môi trƣờng MRS. 76
Bảng 3.7: Nồng độ sản phẩm PCR sau khi tinh sạch 78
Bảng 3.8: Kết quả tra trình tự mẫu A1 từ trang web NCBI BLAST 80
Bảng 3.9: Kết quả tra trình tự mẫu A2 từ trang web NCBI BLAST 82
Bảng 3.10: Kết quả tra trình tự mẫu A3 từ trang web NCBI BLAST 84
Bảng 3.11: Kết quả tra trình tự mẫu A4 từ trang web NCBI BLAST 86
Bảng 3.12: Kết quả tra trình tự mẫu A5 từ trang web NCBI BLAST 88
Bảng 3.13: Kết quả định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong Probiotic 88
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 1
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG
1.1 Giới thiệu về vi sinh vật
1.1.1 Lịch sử phát hiện của vi sinh vật

Vi sinh vật không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả
các sinh vật có kích thƣớc hiển vi, không thấy rõ đƣợc bằng mắt thƣờng, do đó phải sử
dụng kính hiển vi thƣờng hoặc kính hiển vi điện tử. Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật
ngƣời ta phải sử dụng tới phƣơng pháp nuôi cấy vô khuẩn.
Mô tả hình thái nhiều loại vi sinh vật là một ngƣời Hà Lan vốn là ngƣời học nghề
trong một hiệu buôn vải, đó là Antonie van Leeuwenhoek (1632 – 1723). Ông đã tự chế
tạo ra trên 400 kính hiển vi cầm tay, có gƣơng hội tụ ánh sáng, có ốc điều chỉnh
Leerwenhoek đã lần lƣợt quan sát mọi thứ có xung quanh mình. Năm 1674, ông nhìn thấy
các vi khuẩn và động vật nguyên sinh, ông gọi là các “động vật vô cùng nhỏ bé”.
1.1.2 Phân loại các loại vi sinh vật
Phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên sinh. Trong
giới Nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous Fungi) và dạng sợi (mycelia) của
mọi nấm lớn đều đƣợc coi là vi sinh vật. Nhƣ vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai
giới Động vật và Thực vật. Ngƣời ta ƣớc tính trong số 1.5 triệu loài sinh vật có khoảng
200.000 vi sinh vật (100.000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90.000 loài nấm, 2.500
loài vi khuẩn lam và 1.500 loài vi khuẩn). Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài
sinh vật mới đƣợc phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật.
Virus là một dạng đặc biệt chƣa có cấu trúc cơ thể cho nên chƣa đƣợc kể đến trong
số 200.000 loài vi sinh vật nói trên. Số virus đã đƣợc đặt tên là khoảng 4000 loài.
1.1.3 Ứng dụng của vi sinh vật
Vi sinh vật sống trong đất và trong nƣớc tham gia tích cực vào quá trình phân giải
các xác hữu cơ trong tự nhiên, phân giải các chất thải công nghiệp và sinh hoạt.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 2
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong năng lƣợng (sinh khối hoá thạch nhƣ dầu hoả,
khí đốt, than đá).
Vi sinh vật là lực lƣợng sản xuất trực tiếp của ngành công nghiệp lên men bởi chúng
có thể sản sinh ra rất nhiều sản phẩm trao đổi chất khác nhau nhƣ acid, enzyme, cồn, các

chất kháng sinh, các acid amine, các vitamin…
Ứng dụng vào di truyền học nhƣ chuyển gen, DNA tái tổ hợp,…
Hòa tan các kim loại quý từ các quặng nghèo hoặc từ các bãi chứa xỉ quặng.
1.2 Giới thiệu chung về định danh vi sinh vật
1.2.1 Nguyên lý cơ bản
Việc định danh vi sinh vật sử dụng công nghệ phân tử để đánh giá cụ thể vùng trong
hệ gen và xác định vi sinh vật thuộc giống, loài duy nhất nào. Công nghệ này tƣơng tự với
các kỹ thuật đƣợc áp dụng rất thành công trong việc nhận dạng con ngƣời. Vì vậy, việc
nhận dạng – định danh vi sinh vật đƣợc đƣợc nhắc đến nhƣ kỹ thuật xác định dấu vân tay
vi sinh vật.
Việc định danh vi sinh vật trên cơ bản là sử dụng phƣơng pháp so sánh. Để xác định
một vi sinh vật chƣa biết, ta so sanh một chuỗi của nó tƣơng ứng với chuỗi đã đƣợc xác
đinh. Sự tƣơng đồng giữa hai chuỗi sẽ cho chúng ta kết quả dƣơng tính. Các cá thể họ
hàng có thể giống nhau ở một số vùng nhƣng sẽ có khác biệt những vị trí khác. Các cá thể
không liên quan sẽ có những khác biệt rõ rệt trong chuỗi đƣợc phân tích. Việc xây dựng
cơ sở dữ liệu cho các chuỗi then chốt và tính độc nhất của nó sẽ bộc lộ đặc tính của vi
sinh vật chính là phƣơng tiện cho phƣơng pháp phân tích này. Chuỗi đƣợc sử dụng sẽ rơi
vào hai trƣờng hợp:
- Đoạn mẫu đƣợc trích từ một bản sao chủ động, thể hiện đƣợc mã vùng của hệ gen.
- Đoạn mẫu không hoạt động không giải đƣợc mã vùng của hệ gen.
Trong hai trƣờng hợp trên, bộ gen không hoạt động có khả năng thích tốt hơn nên có
khả năng thể hiện sự biến thiên cao hơn.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 3
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Tùy vào mức yêu cầu cụ thể, xét nghiệm có thể cung cấp thông tin về giống, loài, và
/ hoặc nòi vi sinh vật. Hình thức cơ bản nhất của định danh là phân loại giống. Mặc dù
nhận dạng tổng quát này không phân biệt giữa loài liên quan đó bao gồm giống, nó có thể
hữu ích trong nhiều tình huống. Ví dụ, nếu ngƣời đƣợc cho là có bệnh lao, kiểm tra để xác

định nếu tế bào Mycobacterium (giống bao gồm bệnh lao gây ra bởi vi sinh vật) có mặt
trong mẫu đàm sẽ rất có khả năng xác nhận chẩn đoán.
1.2.2 Mục đích của việc định danh
Việc định danh vi sinh vật nhằm xác định nhanh chủng loài của nó, đánh giá mức độ
nguy hiểm, khả năng lây truyền của vi sinh vật, nắm đƣợc các hình thái phát triển của vi
sinh vật nhằm đƣa ra giải pháp hợp lý. Ví dụ khi chúng ta xác định vi khuẩn gây bệnh lao,
chúng ta có thể nhanh chóng cách ly ngƣời bệnh, thực hiện các quy trình vệ sinh, tiêm
chủng giúp ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn. Việc này là hết sức cần thiết nhằm tránh
sự lây lan đặc biệt khi ngƣời bệnh sinh hoạt trong môi trƣờng tập thể.
Bên cạnh đó, việc định danh vi sinh vật còn đóng góp cho việc xây dựng cơ sở dữ
liệu quan trọng, giúp các nhà nghiên cứu vacxin, các nhà sản xuất thực phẩm đánh giá
chất lƣợng sản phẩm với chi phí hợp lý mà vẫn đạt yêu cầu an toàn vi sinh ngày một khắc
khe của các tổ chức vệ sinh an toàn và phòng dịch.
Định danh vi sinh vật ngày nay đƣợc đánh giá là một ngành kỹ thuật then chốt hỗ trợ
cho các ngành sản xuất nhƣ: nông nghiệp, lâm nghiệp, y tế, dƣợc phẩm…v…v.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 4
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống
Trƣớc đây việc phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh
lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh
dƣỡng, khả năng sinh acid trong môi trƣờng cũng nhƣ sắc tố tạo thành
Các phƣơng pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:
 API20E KIT:
Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Tuy nhiên phƣơng pháp này nhìn
chung kết quả còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trƣờng
hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất (do nhiều nguyên
nhân khác nhau nhƣ: tuổi tế bào, lƣợng giống cấy hay các thay đổi trong quá trình nuôi

cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả).
 Phân biệt bằng thực khuẩn thể:
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm
nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong
tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhƣng lại
không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác
biệt này mà ngƣời ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tƣợng vi
khuẩn nghiên cứu.
 Phân biệt theo Typ huyết thanh:
Đây là phƣơng pháp đƣợc dùng khá lâu nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc
sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên
trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ).
 Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin):
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 5
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi
khuẩn khác. Nhƣ vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại
chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã đƣợc phân loại dựa vào kiểu
bacteriocin.
2.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen
Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu
hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu nhƣ các phƣơng pháp
truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tƣợng vi sinh vật thì phƣơng pháp sinh học
phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tƣợng vi sinh vật.
Nói chung các phƣơng pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là:
+ Phân tích acid nucleic.
+ Phân tích protein.
+ Phân tích lipopolysaccharid.

+ Hóa phân loại học.
2.2.1 Phân tích acid nucleic
Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thƣớc, cấu trúc
acid nucleic, mối tƣơng quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai
ADN.
2.2.2 Phân tích ADN plasmid
Phƣơng pháp phân tích bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kích
thƣớc, sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng enzyme cắt hạn chế, sau đó điện di trên gel
agarose và so sánh sự đa hình của các mảnh cắt để phân biệt các chủng vi sinh vật với
nhau.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 6
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC


Hình 2.1: Plasmid vòng

Hình 2.2: Streptomyces và Borrelia
Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc thể. Cấu
trúc plasmid là sợi đôi ADN khép kín theo vòng. Tuy nhiên, có nhiều trƣờng hợp ngoại lệ
là sợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia và Streptomyces). Plasmid đƣợc
tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi sinh vật nhân thực bậc thấp nhƣ nấm
men.
+ Tách plasmid:
Thông thƣờng lƣợng plasmid có trong tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic của tế
bào. Nhƣ vậy, ta phải thực hiện phép tách plasmid ra khỏi ADN của nhiễm sắc thể. Có
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 7
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

nhiều phƣơng pháp tách plasmid từ vi khuẩn nhƣng nguyên tắc chung là phá tế bào vi
khuẩn dùng enzyme, siêu âm hay trong dung dịch kiềm có chất tẩy rửa là SDS hoặc
TritonX-100, sau đó là việc loại ADN của nhiễm sắc thể và protein. Thông thƣờng dùng
phƣơng pháp kết tủa với axetat. Lúc này phần lớn các thành phần ADN nhiễm sắc thể và
protein của tế bào đã bị kết tủa bị loại bằng ly tâm và plasmid nằm trong dịch trên tủa
đƣợc tách khi kết tủa với ethanol hay isopropanol.
Ta còn có thể tách theo các phƣơng pháp nhƣ:
- Tách bằng Caeseium chloride.
- Tách bằng KIT QIAGENE.
- Tách bằng kỹ thuật khác.
+ Điện di plasmid trên gel agarose:
Sau khi thu đƣợc plasmid thì phải tiến hành kiểm tra trƣớc khi phân tích kết quả
điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid và kích thƣớc của chúng. Khi tiến hành điện
di thì nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với một trong các đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat
1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0)
và TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH 8.0). Sau khi điện di, gel đƣợc nhuộm
với ethidium bromide và phát hiện dƣới tia UV (310 nm). Nồng độ ethidium bromide
khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm là 10 phút. Sau đó đƣợc rửa một lần nhanh bằng nƣớc
loại ion trƣớc khi đƣợc nhìn dƣới UV và chụp ảnh làm tài liệu.
Một số vấn đề cần lƣu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông thƣờng plasmid đƣợc
thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi
endonuclease. Dạng di chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn (Hình 2.3).
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 8
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC


Hình 2.3: Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di
Khi tiến hành phân biệt giữa các chủng vi khuẩn, thì đƣơng nhiên là chỉ có thể thực
hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid với nhau. Cần chú ý rằng không phải các

chủng đều giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết quả phân tích plasmid nhƣ
nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu quả trong các mẫu có nhiều loại plasmid, tuy nhiên, cũng
phải tính đến việc các plasmid cũng có thể bị mất trong quá trình bảo quản.
+ Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzyme cắt hạn chế:
Cho đến nay, ngƣời ta đã tìm thấy hơn 400 enzyme cắt hạn chế. Mục đích của kỹ
thuật này bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thƣớc plasmid ở trên. Tức là ngƣời ta có
thể phân biệt đƣợc sự khác nhau của các plasmid có cùng kích thƣớc. Nhƣ vậy, khi xử lý
plasmid với một hay kết hợp một số enzyme cắt hạn chế thì kết quả sẽ thu đƣợc là các
đoạn ADN đƣợc cắt có kích thƣớc khác nhau. Kết quả này có độ lặp lại cao, do đó dễ sử
dụng khi so sánh các mẫu khác nhau.
Hiện nay, có nhiều enzyme cắt hạn chế đƣợc sản xuất và tiêu thụ trên thị trƣờng, các
enzyme này có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid. Thông thƣờng xử lý enzyme
trong 1 giờ sau đó mẫu đƣợc phát hiện trên gel agarose hoặc polyacrylamid Tuỳ thuộc
vào kích thƣớc của các mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau:

Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 9
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Bảng 2.1: Nồng độ agarose và kích thƣớc mẫu ADN tƣơng ứng
Nồng độ agarose (%)
Kích thƣớc ADN (kb)
0.3
1-7
0.5
0.7-45
0.8
0.4-20
1.0
0.3-10

1.2
0.2-8
1.5
0.2-6
2.0
0.1-5
Theo kinh nghiệm của nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ các băng ADN có ý nghĩa
cho so sánh không nên dƣới 10 băng và nên có cả băng kích thƣớc nhỏ và kích thƣớc lớn.
Tuy nhiên, các băng lớn không nên vƣợt quá 10 do băng có kích thƣớc lớn nhƣ vậy khó di
chuyển trên gel. Trong các trƣờng hợp so sánh thì nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh
kích thƣớc và phép phân tích dấu vân tay cho các lần phân tích khác nhau. Ngƣời ta đã
ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm
(Hamburger). Các plasmid từ các chủng khác nhau thì có phổ khác nhau về các đặc điểm
cắt bởi enzyme cắt hạn chế, kết quả tạo ra các mảnh ADN đặc trƣng cho cá thể làm cơ sở
cho phép so sánh.
Tuy nhiên khó có thể so sánh kết quả thu đƣợc từ các phòng thí nghiệm khác nhau,
sở dĩ nhƣ vậy là do không dùng cùng một loại enzyme cắt hạn chế. Một lý do nữa cũng
cần đƣợc đề cập đến là sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên tại vị trí enzyme cắt, kết quả
này tạo ra sự khác biệt về phổ thu đƣợc từ các mảnh cắt.
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 10
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

2.2.3 Phân tích ADN nhiễm sắc thể
Phƣơng pháp phân tích ở đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm sắc thể và cắt bằng
enzyme cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật với nhau. Một chú ý khi tách ADN
nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyên nhân cơ học. Các mảnh
cắt nên có kích thƣớc nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách các mảnh cắt đó đƣợc thực
hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trƣờng xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel
Electrophoresis). Nhƣ vậy kỹ thuật dấu vân tay không chỉ áp dụng trong trƣờng hợp trên

tế bào mang plasmid mà kỹ thuật này còn đƣợc sử dụng với nhiễm sắc thể cho mọi trƣờng
hợp.
Liên quan đến vấn đề này phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết quả xử lý
enzyme cắt hạn chế với vi sinh vật. Ở đây cách chọn loại enzyme cắt hạn chế vô cùng
quan trọng, theo cách chọn này có thể tạo ra quá nhiều mảnh cắt nên không thể phân biệt
đƣợc các băng riêng rẽ trong khi đó đối với các trƣờng hợp khác lại tạo ra quá ít mảnh cắt
có kích thƣớc lớn khó tách theo các kỹ thuật điện di hiện có. Các vi sinh vật khác nhau có
tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ 25-75%) các mảnh cắt thu đƣợc sau khi xử lý enzyme
cắt hạn chế rất khác nhau. Theo Nei M. và Li W. H. (1979) thì số mảnh cắt có thể thu
đƣợc tính trên lý thuyết là:
a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2
Trong đó: g - tỷ lệ GC của ADN
r1 - số cặp GC
r2 - số cặp AT trong vị trí cắt của enzyme giới hạn sử dụng
a - số vị trí cắt khi sử dụng enzyme cắt hạn chế
Mặt khác, ngƣời ta cũng căn cứ vào kết quả nghiên cứu các vị trí cắt của bộ gene vi
sinh vật làm cơ sở cho cách chọn enzyme cắt. Thông thƣờng cho mỗi phép phân tích
ngƣời ta ghi đƣợc số các băng cắt bởi enzyme và tính toán kích thƣớc các mảnh tạo thành
làm cơ sở cho các phép phân tích về sau.
+ Kỹ thuật điện di trong trƣờng xung điện (điện di trong trƣờng điện thay đổi, PFGE)
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 11
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

- Nguyên tắc: Trƣớc tiên các mẫu đƣa vào phân tích phải đƣợc xử lý trƣớc bằng loại
enzyme cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kết quả phải tạo ra đƣợc các mảnh có kích
thƣớc lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thƣớc này không thể điện di theo phƣơng pháp thông
thƣờng mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis).
Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên đƣợc Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu. Mục đích
của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh ADN có kích thƣớc lớn trong

điện trƣờng, do đó các thành phần gel và đệm hầu nhƣ không thay đổi theo nhƣ thông
thƣờng. Tuy nhiên, theo phƣơng pháp thông thƣờng thì sự điện di liên quan đến sự di
động của các mảnh ADN có kích thƣớc khác nhau trên gel agarose trong một trƣờng điện
không đổi. Kết quả là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo
ra sự tách biệt trong trƣờng điện di. Trong trƣờng hợp PFGE lực làm thay đổi khả năng di
động lại là trƣờng điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh ADN có kích thƣớc khác
nhau thay đổi hƣớng di động. Kích thƣớc càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di
động khác nhau của ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thƣớc chứ không phải do gel
agarose nhƣ ở phƣơng pháp điện di thông thƣờng, hình 2.4.

Hình 2.4: Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể
Ngoài ra sự di chuyển của các mảnh ADN khác nhau là hàm số tuyến tính với kích
thƣớc của chúng. Trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện trƣờng. Tuy
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 12
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

nhiên còn có các nhân tố khác nhƣ: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose¸ nồng độ ion trong
đệm.
Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giống nhƣ các
phƣơng pháp chuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đề thƣờng xảy ra là sự đứt gãy ngẫu nhiên
ADN dẫn đến sai khác trong kết quả phân tích. Để hạn chế điều này ngƣời ta phải thực
hiện kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT
(Schwartz va Cantor – 1984 và Smith, Klco 1988).
Sau khi thu đƣợc ADN NST trong mẫu LMT agarose thì tiến hành xử lý với enzyme
giới hạn loại có ít điểm cắt. Tuy nhiên mẫu đầu tiên phải đƣợc xử lý với PMSF để bất
hoạt protein K sau đó PMSF lại phải loại bỏ sau một số lần rửa với chất tẩy rửa và EDTA.
Sau đó chỉ cần phân nhỏ mẫu trong agarose đƣợc xử lý với đệm và enzyme cắt hạn chế
qua đêm trong tube và sau đó toàn bộ mẫu này đƣợc sử dụng để tách trong trƣờng xung
điện. Bảng 1.2 dƣới đây liệt kê các enzyme cắt hạn chế đƣợc dùng cho phân tích PFGE.

Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 13
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Bảng 2.2: Một số enzyme cắt hạn chế đƣợc dùng cho kỹ thuật PFGE.
Enzyme
Vị trí cắt
AatII
GACGT/C
ApaI
GGGCC/C
ClaI
AT/CGAT
MluI
A/CGCGT
NarI
GG/CGCC
NheI
G/CTAGC
NotI
GC/GGCCGC
NruI
TCG/CGA
PvuI
CGAT/CG
SacII
CCGC/GG
SalI
C/TCGAC

SfiI
GGCC(N)4/NGGCC
SmaI
CCC/GGG
XhoI
C/TCGAG
Ứng dụng kỹ thuật PFGE:
Kỹ thuật PFGE đã đƣợc sử dụng cho nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng khác nhau.
Mỗi một đối tƣợng có đặc trƣng riêng về kết quả phân tích PFGE và đƣợc dùng cho
nghiên cứu so sánh với nhau về sự tƣơng đồng. Đối với nhiều đối tƣợng có nhiễm sắc thể
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 14
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

thì không nhất thiết phải thực hiện đối với mọi nhiễm sắc thể mà chỉ cần trên một số
nhiễm sắc thể mà thôi Cho dù theo các cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác nhau thì kết
quả của phép phân tích PFGE đều giống nhau. Phép phân tích PFGE đƣợc ứng dụng cho
các nghiên cứu ở mức độ loài với loài.
Một số điểm cần lƣu ý khi sử dụng kỹ thuật PFGE:
+ Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật cũng nhƣ kinh
nghiệm.
+ Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa các mẫu,
đặc biệt khi thực hiện với một enzyme thì kết quả có thể giống nhau nhƣng không chắc
chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn. Điều đó có nghĩa là kỹ thuật này nên dùng để xác
định sự khác nhau còn việc xác định sự giống nhau thì không đủ tin cậy.
+ Sự khác biệt giữa các mẫu có thể phát hiện đƣợc khi dùng các enzyme cắt hạn chế
khác nhau.
2.3 Phƣơng pháp lai ADN
Nguyên tắc: ADN tổng số đƣợc tách ra và xử lý với enzyme cắt hạn chế (có trƣờng
hợp không cần xử lý với enzyme cắt hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển

lên màng lai. Mẫu dò (probe) đƣợc chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên. Kết quả phép
lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau.
Phép lai đƣợc tiến hành ở đây dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với các
cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung. Bắt đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene
do hoá chất (kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc này hai sợi đơn ADN tách nhau đƣợc gọi là
trạng thái biến tính ADN (denature). Nếu tại thời điểm này ngƣời ta cho vào một ADN
đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạo điều kiện hồi biến xuất hiện (renature), lúc đó sẽ
cho phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các sợi đơn của mẫu ADN ban đầu (target
ADN). Mức độ lai sẽ phụ thuộc vào tính đặc hiệu (sự tƣơng đồng) giữa mẫu dò và mẫu
gốc cũng nhƣ điều kiện cho phép lai thực hiện (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lệ mẫu dò,
kích thƣớc mẫu dò).
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 15
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

Nhƣ vậy, việc chọn điều kiện chính xác cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho
tính đặc hiệu của kết quả phép lai. Sau khi lai, bƣớc tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp
để loại mẫu dò dƣ và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu (tuỳ theo phƣơng pháp đánh
dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang) để đánh giá mức độ tƣơng đồng của
phép lai.
Nói tóm lại một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai là: mẫu dò ADN,
phƣơng pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai và điều kiện tiến hành và phƣơng pháp đánh
giá kết quả phép lai.
+ Chọn mẫu dò:
Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai. Nhìn chung các nhà phân loại
học vi sinh vật thƣờng không trực tiếp thiết kế mẫu dò. Về mặt này có một số nội dung
chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl và Amann (1991) nhƣ sau: Mẫu dò sẽ lai với
ADN đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai. Khi phân
tích các mẫu vi sinh vật với nhau thì mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trƣng cho các mẫu
phân tích để phân biệt với các sinh vật khác.

Tuy việc chọn mẫu dò cũng mang tính kinh nghiệm, mẫu dò đôi khi không cần phải
là toàn bộ gene mà chỉ là một đoạn gene mã hoá cho một đặc tính đặc trƣng cho đối tƣợng
nghiên cứu (có thể là yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng nào đó
trên plasmid). Với cách chọn mẫu dò có kích thƣớc nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi là các
mẫu dò đƣợc tổng hợp nhân tạo và phép lai thực hiện nhanh (dƣới 30 phút) trong khi đó
với các mẫu dò lớn thời gian kéo dài hơn (khoảng 16 giờ).
Một cách thƣờng đƣợc sử dụng là thiết kế các mẫu dò từ các chuỗi ARN thông tin
16S. Cách chọn có thể căn cứ vào đoạn ADN có mặt trong các đại diện mức độ dƣới loài,
trong loài hay thuộc chi nghiên cứu.
2.3.1 Các phƣơng pháp đánh dấu
Các kỹ thuật đánh dấu ADN đƣợc xem là lĩnh vực phát triển mạnh nhất trong sinh
học phân tử. Nói chung kỹ thuật đánh dấu đƣợc chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp và
gián tiếp. Trong phƣơng pháp trực tiếp thì phần đánh dấu để phát hiện đƣợc gắn vào acid
Luận văn tốt nghiệp
GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 16
SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC

nucleic. Đối với phƣơng pháp gián tiếp thì có một phần chức năng đƣợc gắn vào acid
nucleic và phần này lại đƣợc phát hiện gián tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu đƣợc phát
hiện bằng kỹ thuật miễn dịch. Sau đây là chi tiết các phƣơng pháp đánh dấu.
 Đánh dấu trực tiếp:
- Bảng dƣới đây đƣa ra các loại cơ chất dùng cho phƣơng pháp đánh dấu trực tiếp
dựa vào việc nhân ADN đƣợc đánh dấu lên sẽ tăng độ nhạy so với phƣơng pháp đánh dấu
chỉ đƣợc thực hiện với các mồi đơn lẻ. Đối với các phƣơng pháp đánh dấu trực tiếp thì
các nhóm tạo tín hiệu đƣợc gắn trực tiếp bằng liên kết hoá trị với nucleic của mẫu dò.
- Đánh dấu trực tiếp bao gồm 2 bƣớc chính: tạo tín hiệu dựa vào liên kết hoá trị của
nhóm tín hiệu với mẫu dò và thực hiện phép lai giữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò.
Bảng 2.3: Một số cơ chất dùng cho đánh dấu trực tiếp
Nguồn tạo tín hiệu
Tài liệu

32 P
35S
Alkaline phophatase
Ethidium
Fluorescein
Horseradish peroxidase
Microperoxidase
Nitrobenzofuran
Tetramethylorhodamine
Southern (1975)
Collins& Hunsaker (1985)
Renz&Kurz (1984)
Albarella & ADNerson(1986)
Amman & ctv (1988)
Urdea ctv(1988)
Heller& Shneider(1983)
Draper (1984)
Amman&ctv(1990)
 Đánh dấu gián tiếp:
Đánh dấu gián tiếp đƣợc thực hiện theo 3 bƣớc: thực hiện phép lai giữa mẫu dò và
mẫu ADN đích, phản ứng giữa nhóm chức năng và protein bám đặc hiệu với nhóm chức
tín hiệu thông báo (reporter) và cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu.