Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bộ giáo dục và đào tạo Bộ Y Tế
Trờng đại học Dợc hà nội


Chử Thị Thanh Huyền


Nghiên cứu định lợng

acid oleanolic trong đinh
lăng bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao


luận văn thạc sỹ dợc học






Hà nội 2012
Bộ giáo dục và đào tạo Bộ Y Tế
Trờng đại học Dợc hà nội

Chử Thị Thanh Huyền


Nghiên cứu định lợng

acid oleanolic trong đinh
lăng bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao

luận văn thạc sỹ dợc học

Chuyên ngành:
Kiểm nghiệm thuốc
Độc chất
mã số: 60 73 15


Ngời hớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh


Hà nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của
mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian qua.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều
Anh, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Huy Văn, ThS. Lâm Thị Bích
Hồng, DS. Nguyễn Thị Vân Anh – cán bộ Công ty cổ phần Traphaco đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà
Nội, các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, Bộ môn Hóa
phân tích – độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người
đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả
như ngày hôm nay.


Hà Nội, ngày 24 tháng 9 năm 2012
Học viên
Chử Thị Thanh Huyền





MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG , BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG І: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về cây đinh lăng và các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật 3
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến 3
1.1.3. Thành phần hóa học 4
1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng của đinh lăng 4
1.1.5. Các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường 5
1.2. Tình hình tiêu chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm đông dược ở Việt Nam và thế giới 6

1.2.1. Về dược điển Việt Nam 6
1.2.2. So sánh với dược điển của một số quốc gia khác trên thế giới 8
1.2.3. Xu hướng nghiên cứu dược liệu và chế phẩm đông dược gần đây tại Việt Nam 8
1.3. Tổng quan nhóm saponin và acid oleanolic 12
1.3.1. Tổng quan về nhóm saponin 12
1.3.2. Tổng quan về acid oleanolic 14
1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và thẩm định quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu
năng cao 20

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 20
1.4.2. Thẩm định quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 20
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu 23
2.1.1. Nguyên vật liệu 23
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 23
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu 24
2.2. Nội dung nghiên cứu 24




2.3. Phương pháp nghiên cứu 25
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29
3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký 29
3.1.1. Lựa chọn dược liệu 29
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29
3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 35
3.1.4. Quy trình phân tích acid oleanolic trong đinh lăng 40
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 42
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch 42

3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký 43
3.2.3. Tính chọn lọc 43
3.2.4. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ 51
3.2.5. Độ lặp lại 53
3.2.6. Độ đúng 54
3.2.7. Độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic 55
3.3. Ứng dụng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng 57
3.3.1. Ứng dụng định tính acid oleanolic trong dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng 57
3.3.2. Ứng dụng định lượng 61

Chương IV: BÀN LUẬN 64
4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ở Việt Nam 64
4.2. Về quy trình xử lý mẫu 67
4.3. Phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng 68
4.4. Bàn luận về kết quả định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng khác nhau 70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71
A. Kết luận 71
B. Kiến nghị 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AR:
Thuốc thử dùng trong phân tích (Analysis Reagent)
BuOH:
Butanol
DAD:
Detector mảng điốt (Diode array detector)
Dd:

Dung dịch
EtOH:
Ethanol
FLD:
Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)
GC:
Sắc ký khí (Gas chromatography)
GC – MS:
Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography – Mass
spectrometry)
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
HPLC –
MS/MS:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance
liquid chromatography – Mass spectrometry)
HPTLC:
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer
chromatography)
IR:
Hồng ngoại (Infrared)
MeCN:
Acetonitril
MeOH:
Methanol
MS:
Khối phổ (Mass spectrometry)
NMR:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RSD:
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
TLC:
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
UV:
Tử ngoại (Ultraviolet)
λ
em
:
Bước sóng phát xạ (emission)
λ
ex
:
Bước sóng kích thích (exitation)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng Nội dung Trang
1.1
Các dược liệu nghiên cứu và phương pháp sử dụng nghiên cứu
phát triển bộ dữ liệu chuẩn
9
1.2 Hoạt tính sinh học của acid oleanolic trong một số dược liệu 15
1.3
Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao
16
3.1
Nồng độ acid oleanolic thu được từ các quy trình xử lý mẫu khác
nhau
31
3.2

Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi nồng độ acid thủy
phân
32
3.3
Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi thời gian chiết và
thủy phân
33
3.4 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 42
3.5 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 43
3.6 Điều kiện khối phổ 47
3.7 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic 52
3.8 Kết quả xác định độ lặp lại tiến hành trên mẫu bột dược liệu 53
3.9
Kết quả xác định độ lặp lại tiến hành trên mẫu cao khô dược liệu
53
3.10
Kết quả xác định độ đúng tiến hành trên mẫu bột dược liệu
54
3.11 Kết quả xác định độ đúng tiến hành trên mẫu cao khô dược liệu 55
3.12 Kết quả độ ổn định của mẫu acid oleanolic 56
3.13
Thời gian lưu và thời gian lưu tương đối của các pic lựa chọn
58
3.14
Bảng định tính các mẫu dược liệu đinh lăng dựa trên thời gian lưu
tương đối của cụm 6 pic so với pic acid oleanolic
59
3.15 Hàm lượng acid oleanolic trong một số mẫu dược liêu đinh lăng 62
3.16 Hàm lượng acid oleanolic trong một số mẫu cao khô đinh lăng 63
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Nội dung Trang
3.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết acid oleanolic 34
3.2
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động

MeOH: H
2
O (95:5)
35
3.3
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động

MeCN: H
3
PO
4
0,1% có tỷ lệ khác nhau
36
3.4
Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN: H
3
PO
4
0,1%
(70:30)
37
3.5
Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN: H
3
PO

4
0,1%
(80:20)
37
3.6
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với tốc độ dòng 0,8
ml/phút
39
3.7 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu đinh lăng 41
3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá tính chọn lọc) 44
3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic nồng độ 5 µg/ml 44
3.10 Sắc ký đồ mẫu cao khô đinh lăng 45
3.11 Sắc ký đồ mẫu dược liệu đinh lăng 45
3.12
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic phân tích
bằng
LC – MS/MS
48
3.13 Sắc ký đồ mẫu cao khô đinh lăng phân tích bằng LC – MS/MS 49
3.14 Sắc ký đồ mẫu dược liệu đinh lăng phân tích bằng LC – MS/MS 50
3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng phân tích bằng LC – MS/MS 51
3.16 Sắc ký đồ các mẫu acid oleanolic chuẩn nồng độ 5 - 35 µg/ml 52
3.17
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid
oleanolic
52
3.18 Sắc ký đồ một số mẫu đinh lăng 58
3.19 Sắc ký đồ HPLC dược liệu ngưu tất 60
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đinh lăng là một cây thuốc đã được đưa vào dược điển Việt Nam, có tác
dụng bổ ngũ tạng, tiêu thực, lợi sữa… Đây là một vị dược liệu có mặt trong
nhiều bài thuốc Đông y để chữa mệt mỏi, sốt lâu ngày, sưng vú, mẩn ngứa do dị
ứng, liệt dương, sốt rét…[1]. Theo GS. Ngô Ứng Long, đinh lăng có nhiều tác
dụng giống nhân sâm, đặc biệt là tác dụng tăng lực, tăng sức đề kháng, tăng khả
năng thích nghi với điều kiện bất lợi [14].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đinh lăng được thực hiện nhiều vào những
năm 70-90 với một các công trình nghiên cứu của Ngô Ứng Long [15], Nguyễn
Khắc Viện [21], Nguyễn Thới Nhâm [11] với các nghiên cứu sâu về tác dụng bổ
chung, tác dụng tăng lực, tác dụng sinh thích nghi, tác dụng trên tim mạch, tiết
niệu, hệ thống máu, hệ thần kinh trung ương, hoạt động sinh dục và hệ thống
enzym. Giai đoạn những năm 90 các nghiên cứu về thành phần hoá học ở mức
độ cao hơn đã được tiến hành, đã xác định cấu trúc phân tử của các hoạt chất
bằng các thiết bị phân tích hiện đại như UV, IR, NMR [20], [29], các nghiên cứu
này đều cho thấy trong đinh lăng có chứa các saponin triterpenoid với một genin
đã được xác định là acid oleanolic.
Trong những năm gần đây, cây đinh lăng cũng trở thành nguồn nguyên liệu
được đưa vào sản xuất thuốc Đông dược với sự ra đời của nhóm các sản phẩm
Hoạt huyết dưỡng não. Xã hội ngày càng phát triển, sức ép về công việc tăng
lên, nhu cầu về thuốc bổ thần kinh, tăng tuần hoàn não, đặc biệt thuốc có nguồn
gốc thảo dược ngày càng tăng. Sự phát triển của nhóm thuốc Đông dược nói
chung và các chế phẩm có chứa đinh lăng nói riêng trên thị trường Việt Nam đã
đặt ra yêu cầu cấp thiết về đảm bảo chất lượng thuốc. Trong điều kiện, xu hướng
2

trên thế giới hiện nay và theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới về nghiên
cứu thuốc từ dược liệu, ngoài các yếu tố như hiệu quả lâm sàng, độ an toàn,
nghiên cứu về cơ chế tác dụng, cần phải có các nghiên cứu về thành phần hóa
học cũng như các phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu một cách khoa học

và đầy đủ. Tiêu chuẩn hóa sản phẩm với các tiêu chí rõ ràng, kiểm soát được các
thành phần hoạt chất cụ thể (định tính, định lượng) là một trong những điều kiện
tiên quyết để sản phẩm có thể hội nhập vào thị trường thế giới.
Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây về đinh lăng chủ yếu mới chỉ đưa ra
các kết quả nghiên cứu về tác dụng dược lý mà chưa đề cập đến việc kiểm soát
chất lượng dược liệu hoặc đi sâu vào nghiên cứu thành phần hóa học, cấu trúc
phân tử mà chưa đưa ra phương pháp định tính, định lượng cụ thể. Trong khi đó,
các nghiên cứu trước đây đã cho thấy trong đinh lăng chứa thành phần hoạt chất
chính là saponin trong đó có một sapogenin đã được xác định là acid oleanolic,
do đó acid oleanolic có thể được coi là “dấu vân tay” của dược liệu đinh lăng.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn acid oleanolic là đối tượng và thực hiện đề tài
“Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao” với 2 mục tiêu chính như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid oleanolic trong
đinh lăng (dược liệu và cao) bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh
lăng (dược liệu và cao).



3

CHƯƠNG І
TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG VÀ CÁC CHẾ PHẨM
CHỨA ĐINH LĂNG TRÊN THỊ TRƯỜNG
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây đinh lăng Polyscias fruticosa, họ Nhân sâm (Araliaceae) là một loại
cây nhỏ, thân nhẵn, không có gai, thường cao 0,8 đến 1,5 m. Lá kép 3 lần xẻ

lông chim dài 20 – 40 cm, không có lá kèm rõ. Lá chét có cuống gầy dài 3-10
mm, phiến lá chét có răng cưa không đều, lá có mùi thơm. Cụm hoa hình chuỳ
ngắn 7-18 mm gồm nhiều tán, mang nhiều hoa nhỏ. Tràng 5, nhị 5 với chỉ nhị
gầy, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt. Quả bẹt dài 3-4 mm, dày 1mm có vòi tồn
tại [13].
Dược liệu là phần dưới mặt đất của cây đinh lăng (rễ củ), được rửa sạch,
thái lát mỏng ngang, phơi sấy khô. Lát cắt ngang hình tròn, màu trắng ngà, trên
mặt vết cắt nhìn rõ gỗ xếp thành tia từ giữa toả ra. Lớp vỏ rễ dày, mặt ngoài vỏ
rễ màu trắng đục, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích
của rễ con còn sót lại. Dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, có mùi thơm, vị ngọt hơi
mặn [5].
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Đinh lăng là một loại cây được trồng phổ biến làm cảnh ở khắp nước ta,
mọc cả ở Lào và miền Nam Trung Quốc [13].
Rễ củ đinh lăng thường được thu hái vào mùa thu hay mùa đông vì lúc này
hoạt chất tập trung ở rễ và rễ mềm hơn. Lượng rễ đinh lăng thu được tùy theo đất
xấu hay tốt, bón phân nhiều hay ít [1], [9].
4

Rễ củ được rửa sạch, rễ nhỏ để nguyên, rễ to chỉ dùng vỏ rễ. Thái mỏng,
phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió để đảm bảo mùi thơm và phẩm chất. Khi dùng,
để nguyên hoặc tẩm rượu gừng 5%. Sao qua, rồi tẩm 5% mật ong, sao thơm
[1], [5], [9], [10].
1.1.3. Thành phần hóa học
Trong đinh lăng đã tìm thấy có các saponin, alcaloid, glucosid,, flavonoid,
tanin, các vitamin tan trong nước (B1, B2, B6, C) và 20 acid amin trong đó có
các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, tryptophan, cystein)
[1], [10], [14].
Một số tài liệu nghiên cứu về saponin trong đinh lăng cho thấy trong đinh
lăng có chứa saponin trong đó có một sapogenin đã được xác định là

acid oleanolic [20], [29].
1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng của đinh lăng
 Tác dụng dược lý
Rễ đinh lăng có vị ngọt, tính bình, lá vị nhạt, hơi đắng, tính bình, có tác
dụng bổ năm tạng, giải độc, bổ huyết, tăng sữa, tiêu thực, tiêu sưng viêm
[1], [9], [10].
Đinh lăng là thuốc tăng lực, nó làm tăng sức chịu đựng của cơ thể đối với
các yếu tố bất lợi như kiệt sức, gia tốc, nóng [10], [14].
Đối với người, đinh lăng làm cho nhịp tim trở lại bình thường sau khi chạy
dai sức và làm cho cơ thể chịu được nóng [10], [14].
Người bệnh bị suy mòn uống đinh lăng chóng phục hồi cơ thể, ăn ngon, ngủ
tốt, tăng cân [1], [10], [14].
Nó cũng làm tăng co bóp tử cung, tăng tiết niệu [1], [13].
5

Ngoài ra, theo GS. Ngô Ứng Long, đinh lăng còn có tác dụng tăng hoạt
động sinh dục. Trong thí nghiệm gây mỏi mệt về sinh dục, ba kích có tác dụng
kích thích hoạt động sinh dục nhưng sớm mệt mỏi và chậm hồi phục. Đinh lăng
kích thích sinh dục yếu hơn nhưng tăng hoạt động sinh dục bền vững và kéo dài,
chậm mệt mỏi và hồi phục nhanh [14].
Đinh lăng ít độc hơn cả nhân sâm và khác với nhân sâm, nó không làm tăng
huyết áp [1], [10], [13], [14].
 Công dụng
Rễ đinh lăng được dùng làm thuốc bổ tăng lực, chữa cơ thể suy nhược, gầy
yếu, mệt mỏi, tiêu hóa kém, phụ nữ sau khi đẻ ít sữa. Có nơi còn dùng chữa ho,
ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ và làm thuốc lợi tiểu, chống độc.
Lá chữa cảm sốt, mụn nhọt, sưng tấy, sưng vú, dị ứng mẩn ngứa, vết
thương. Thân và cành chữa thấp khớp, đau lưng.
Ở Ấn Độ, đinh lăng được dùng làm thuốc làm săn và trị sốt. Rễ và lá sắc
uống có tác dụng lợi tiểu, chữa sỏi thận, sỏi bàng quang, chứng khó tiểu tiện

[1], [9], [10].
1.1.5. Các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường
Trong những năm gần đây, cây đinh lăng cũng trở thành nguồn nguyên liệu
được đưa vào sản xuất thuốc Đông dược với sự ra đời của nhóm các sản phẩm
Hoạt huyết dưỡng não. Một loạt các sản phẩm hoạt huyết dưỡng não trên thị
trường có thể kể đến là:
 Hoạt huyết dưỡng não – Traphaco
 Hoạt huyết dưỡng não – Dopharma (Công ty cổ phần dược phẩm TW2)
 Hoạt huyết dưỡng não – PV (Công ty cổ phần dược thảo Phúc Vinh)
6

 Hoạt huyết dưỡng não – HD (Công ty cổ phần dược vật tư y tế Hải
Dương)
 Hoạt huyết dưỡng não – NDC (Công ty dược phẩm Thiên Nam)
 Trà hoạt huyết dưỡng não (Công ty cổ phần dược phẩm Trang Minh)
 Hoạt huyết dưỡng não – DHG (Công ty cổ phần dược Hậu Giang)
 Hoạt huyết dưỡng não – Sophaco (Công ty cổ phần tập đoàn dược phẩm
và thương mại Sophaco)
 Hoạt huyết dưỡng não (Công ty trách nhiệm hữu hạn Hiệp Phong)
 Hoạt huyết dưỡng não Vinacare 20 (Công ty cổ phần Dược phẩm
Vinacare)
Trong đó, sản phẩm “Hoạt huyết dưỡng não - Traphaco” là một trong những
sản phẩm hàng đầu. Xã hội ngày càng phát triển, sức ép về công việc tăng lên,
nhu cầu về thuốc bổ thần kinh, tăng tuần hoàn não đặc biệt thuốc có nguồn gốc
thảo dược ngày càng tăng. Hàng năm công ty Traphaco sử dụng hàng trăm tấn
dược liệu đinh lăng phục vụ cho sản xuất dòng sản phẩm hoạt huyết dưỡng não
và dự kiến con số này còn tiếp tục tăng trong thời gian tới.
1.2. TÌNH HÌNH TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU VÀ CÁC
CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
1.2.1. Về dược điển Việt Nam

Trong kiểm nghiệm thuốc, Dược điển là Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc,
quy định về tiêu chuẩn chất lượng thuốc và các phương pháp chung về kiểm
nghiệm thuốc. Mỗi nước đều có Dược điển riêng của nước mình với các quy
định riêng.
Dược điển Việt Nam [5] là một văn bản quy phạm kỹ thuật quan trọng của
ngành Y tế trong công tác kiểm tra, giám sát, quản lý, đảm bảo và nâng cao chất
7

lượng thuốc phục vụ sự nghiệp chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Dược
điển Việt Nam IV có 1157 chuyên luận trong đó có 314 chuyên luận dược liệu
và thuốc từ dược liệu.
Trong đó, chỉ tiêu định tính và định lượng thông thường được thực hiện
bằng các phương pháp sau:
 Định tính
- Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học: Là việc quan sát đặc điểm
của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay của bề mặt dược liệu dưới
kính hiển vi.
- Định tính hóa học: Là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng
các phản ứng hóa học.
- Định tính sắc ký: Thông thường sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng:
So sánh sắc ký đồ của mẫu thử với mẫu chuẩn là một mẫu dược liệu
chuẩn, hoặc sử dụng chất đối chiếu làm mẫu chuẩn. Dược điển Việt Nam
IV có khoảng 73 chuyên luận trong tổng số 314 chuyên luận trong đó chỉ
tiêu định tính đã có định hướng sử dụng chất đối chiếu.
 Định lượng
Đa số chuyên luận chưa có chỉ tiêu định lượng. Với các chuyên luận đã có
chỉ tiêu này, các phương pháp định lượng thông thường là:
- Phương pháp cân;
- Phương pháp đo màu;
- Phương pháp quang phổ tử ngoại.

Hoặc đối với một số nhóm hoạt chất, có các phương pháp định lượng riêng:
phương pháp chuẩn độ acid – base với nhóm dược liệu chứa alcaloid, phương
pháp định lượng tinh dầu…
8

Bước đầu đã có một vài chuyên luận sử dụng phương pháp hiện đại như
HPLC có sử dụng chất đối chiếu để định lượng. Ví dụ như chuyên luận “Chè
dây” định lượng bằng phương pháp HPLC – UV sử dụng dung chất đối chiếu là
dihydromyricetin, chuyên luận “Thổ hoàng liên” và chuyên luận “Vàng đắng”
định lượng bằng phương pháp HPLC – UV sử dụng chất đối chiếu là berberin.
1.2.2. So sánh với Dược điển của một số quốc gia khác trên thế giới
Dược điển Hàn Quốc (KP9) [41] có 181 chuyên luận về dược liệu trong
tổng số 1511 chuyên luận. Trong đó, các chỉ tiêu kiểm định chất lượng không có
sự nổi trội so với Dược điển Việt Nam IV [5].
Dược điển Thái Lan [40], cũng giống như Dược điển Hàn Quốc, có rất ít
chuyên luận về dược liệu với các phương pháp thông thường như TLC, phản ứng
hóa học, đo quang… để định tính và định lượng dược liệu và rất ít sử dụng chất
đối chiếu.
Dược điển Mỹ (USP 32) [42] chỉ có hơn 40 chuyên luận về dược liệu. Tuy
nhiên, mỗi chuyên luận hầu như đều sử dụng các phương pháp hiện đại (HPTLC,
HPLC, GC) với các chất đối chiếu để định tính, định lượng.
Dược điển Trung Quốc 2010 [36], cũng giống như Dược điển Mỹ, hầu hết
đều sử dụng các phương pháp hiện đại trong mỗi chuyên luận về dược liệu. Tuy
nhiên, điểm khác biệt so với Dược điển Mỹ là số chuyên luận về dược liệu lớn
hơn rất nhiều với 2165 trên tổng số 4567 chuyên luận.
1.2.3. Xu hướng nghiên cứu dược liệu và chế phẩm đông dược gần đây tại
Việt Nam
1.2.3.1. Nghiên cứu thiết lập “dấu vân tay” của một số dược liệu bằng
phương pháp TLC và HPLC
9

Gần đây, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương thực hiện đề tài “Nghiên
cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công
tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược” [4]. Trong đó, đã
tiến hành xây dựng “dấu vân tay” của một số dược liệu bằng phương pháp TLC
và HPLC. Chỉ tiêu để xây dựng dấu vân tay là phải chọn lựa các pic đặc trưng
cho dược liệu. Trong số các pic đặc trưng này ta chọn ra một “pic đánh dấu”
(thông thường là pic của chất đối chiếu), tính toán thời gian lưu tương đối của
các pic còn lại so với “pic đánh dấu” và đưa ra bảng dữ liệu về các pic đặc trưng
trong sắc ký đồ của dược liệu. Bảng dữ liệu này cùng với sắc ký đồ chuẩn là
“dấu vân tay” của dược liệu theo điều kiện sắc ký đã quy định. Đây là một công
trình nghiên cứu có giá trị để định tính các dược liệu này (30 dược liệu).
Bảng 1.1 – Các dược liệu và phương pháp sử dụng nghiên cứu phát triển
bộ dữ liệu chuẩn [4]
STT Dược liệu Phương pháp sử dụng
1 Bạch thược TLC và HPLC có chất đối chiếu là paeoniflorin
2 Bạch truật TLC và HPLC không có chất chuẩn
3 Bán hạ bắc TLC không có chất chuẩn
4 Cát sâm TLC không có chất chuẩn
5 Chỉ thực TLC và HPLC có chất đối chiếu là hesperidin
6 Chi tử TLC và HPLC có chất đối chiếu là geniposid
7 Diệp hạ châu
TLC (có chất đối chiếu và không có chất đối chiếu)
HPLC không có chất đối chiếu
8 Cúc gai TLC và HPLC với 2 chất đối chiếu (silydianin và silybin)
9 Cây hoa ngũ sắc TLC và GC
10 Đại hoàng TLC và HPLC có chất đối chiếu là emodin
11 Đại hồi
TLC và HPLC với chất đối chiếu anethol
GC – MS

10

STT Dược liệu Phương pháp sử dụng
12 Đan sâm
TLC (có chất đối chiếu danshensu và không có chất đối chiếu)
HPLC không có chất đối chiếu
13 Địa cốt bì TLC và HPLC không có chất đối chiếu
14 Diệp hạ châu đắng TLC và HPLC có chất đối chiếu là phyllanthin
15 Đương quy
TLC (có chất đối chiếu acid ferulic và không có chất đối chiếu)
HPLC không có chất đối chiếu
GC – MS
16 Hạ khô thảo TLC và HPLC có chất đối chiếu là acid ursolic
17 Hoàng đằng TLC và HPLC có chất đối chiếu là palmatins
18 Hương phụ
TLC và HPLC không có chất đối chiếu
GC – MS
19 Kê huyết đằng TLC và HPLC không có chất đối chiếu
20 Kim ngân TLC và HPLC có chất đối chiếu là acid chlorogenic
21 Mã tiền TLC và HPLC có chất đối chiếu là strychnin và brucin
22 Mẫu đơn bì TLC và HPLC có chất đối chiếu là paeoniflorin
23 Mộc thông
TLC với chất đối chiếu là acid oleanolic
HPLC không có chất đối chiếu
24 Nghệ
TLC và HPLC có chất đối chiếu là curcumin
GC – MS
25 Ngưu tất TLC và HPLC có chất đối chiếu là acid oleanolic
26 Quế
TLC và HPLC có chất đối chiếu là aldehyd cinnamic

GC – MS
27 Riềng
TLC không có chất đối chiếu
GC – MS
28 Sa nhân
TLC (không có chất đối chiếu và
có 2 chất đối chiếu là borneol
và camphor)
GC – MS
29 Thăng ma TLC và HPLC với chất đối chiếu acid ferulic
30 Trần bì
TLC và HPLC với chất đối chiếu hesperidin
GC – MS
11

1.2.3.2. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu
Lần đầu tiên ở Việt Nam, năm 2010, viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương
đã thực hiện nghiên cứu thiết lập được 10 chất chuẩn là các hợp chất đặc trưng
chiết từ dược liệu [8]. Trong đó, 10 tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn đã
được xây dựng theo đúng quy định của WHO và ASEAN. Cụ thể, đối với mỗi
chất chuẩn đều được xác định các chỉ tiêu sau đây:
- Định tính: Tiến hành phương pháp IR, NMR hoặc phối hợp thêm phương
pháp HPLC.
- Độ tinh khiết: Sử dụng một trong các phương pháp HPLC, phân tích nhiệt
vi sai (DSC), đo điểm chảy hoặc phối hợp.
- Định lượng và xác định hàm lượng tạp chất liên quan bằng phương pháp
HPLC.

Như vậy có thể thấy rằng việc tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu với việc
sử dụng chất đối chiếu và các phương pháp hiện đại như HPLC, HPTLC trong

định tính, định lượng dược liệu là một xu hướng nghiên cứu mới trong giai đoạn
hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà ở cả các nước khác trên thế giới. Do đó,
nhằm nâng cao khả năng kiểm soát chất lượng dược liệu đinh lăng, chúng tôi dự
định tiến hành xây dựng phương pháp định tính, định lượng dược liệu đinh lăng
sử dụng chất đối chiếu là acid oleanolic để góp phần xây dựng “dấu vân tay
HPLC” cho dược liệu đinh lăng, góp phần thuận lợi cho công tác tiêu chuẩn
hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu này và các chế phẩm từ dược liệu.

12

1.3. TỔNG QUAN NHÓM SAPONIN VÀ ACID OLEANOLIC
1.3.1. Tổng quan về nhóm saponin
Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần hoạt chất
chính của đinh lăng là saponin thuộc nhóm saponin triterpenoid trong đó có một
sapogenin đã được xác định là acid oleanolic.
1.3.1.1. Định nghĩa glycosid và saponin
Glycosid là những hợp chất hữu cơ tạo thành do sự ngưng tụ giữa một
đường với một phân tử hữu cơ khác với điều kiện nhóm hydroxyl bán acetal của
phần đường phải tham gia vào sự ngưng tụ. Phần không phải là đường được gọi
là aglycon hoặc genin, có cấu trúc hóa học rất khác nhau, tác dụng sinh học phụ
thuộc vào phần này.
Saponin là một nhóm glycosid lớn, gặp nhiều trong thực vật. Phần genin
được gọi là sapogenin. Về mặt phân loại, dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia
thành: saponin triterpenoid và saponin steroid.
1.3.1.2. Các phương pháp định tính saponin
a. Dựa trên tính chất tạo bọt
Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có
cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa vào hiện tượng
gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và saponin
triterpenoid.

Có thể dựa vào chỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số
bọt là số ml nước để hòa tan saponin trong 1 gam nguyên liệu cho một cột bọt
cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định).

13

b. Dựa trên tính chất phá huyết
Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa vào chỉ số phá
huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có trong 1 gam
nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với thứ máu đã chọn
(tiến hành trong điều kiện quy định).
c. Các phản ứng màu
Saponin triterpenoid cho tác dụng với vanilin 1% trong dung dịch HCl và
hơ nóng (phản ứng Rosenthaler) sẽ có màu hoa cà.
Phản ứng Liebermann – Burchardt hay dùng để phân biệt hai loại saponin:
Lấy vài miligram sapogenin hòa nóng vào 1 ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt
H
2
SO
4
đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ – xanh lá, còn dẫn chất
triterpenoid thì có màu hồng đến tía.
d. Sắc ký lớp mỏng
Một vài dung môi khai triển dùng để định tính saponin triterpenoid là:
 Cloroform – methanol – nước (65:35:10)
 Ethyl acetat – acid acetic – nước (8:2:1)
 n-butanol – ethanol (8:2)
Các thuốc thử hiện màu có thể dùng là: Thuốc thử Liebermann – Burchard,
thuốc thử Salkowski, dung dịch acid phosphomolybdic 10% trong ethanol,…
e. Định lượng

Có thể định lượng saponin bằng nhiều phương pháp khác nhau:
 Phương pháp cân
 Phương pháp đo quang
 Phương pháp HPLC

14

1.3.2. Tổng quan về acid oleanolic
1.3.2.1. Công thức hóa học [34
]

Tên khoa học: acid
(3β) – 3 – Hydroxyolean – 12 – en – 28 – oic
Phân tử lượng: 456,7 g/mol.
1.3.2.2. Tính chất hóa lý [34]
Bột kết tinh màu trắng, không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108
phần alcol 95%, 35 phần alcol 95% sôi, 118 phần cloroform, 118 phần aceton,
235 phần methanol. Nhiệt độ nóng chảy 310
о
C, góc quay cực bằng + 83,3
о
,
pK
a
= 2,52.
1.3.2.3. Tác dụng sinh học của acid oleanolic
Nhân sâm (ginseng), rễ của cây nhân sâm Panax ginseng (họ Nhân sâm
Araliaceae), đã được sử dụng từ rất lâu đời bởi người dân ở các nước Đông Á
như là thuốc chữa bách bệnh và kéo dài tuổi thọ. Trong đó, người ta biết rằng,
tác dụng của nhân sâm là do thành phần hóa học saponin quyết định, với

20-S-protopanaxadiol, 20-S-protopanaxtriol và acid oleanolic là các aglycon
chính. Acid oleanolic, aglycon của nhiều saponin triterpenoid trong dược liệu,
được biết đến như là thành phần có hoạt tính, quyết định các tác dụng sinh học
và được trình bày ở bảng sau.

15

Bảng 1.2 – Hoạt tính sinh học của acid oleanolic trong một số dược liệu
Tài liệu Dược liệu Hoạt tính sinh học
[25] Calendula officinalis (Arteraceae) Chống nấm
[44] Panax japonicus (Araliaceae) Chống ung thư
[27] Oleandra neriifolia L. Chống viêm
[39] Sapindus mukorossi (Sapindaceae) Chống viêm
[28] Tetrapanax papyriferum (Araliaceae) Bảo vệ gan
[35] Carissa macrocarpa (Apocynaceae) Kháng khuẩn và chống bám dính
1.3.2.4. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao
16

Bảng 1.3 – Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tài
liệu
Mẫu thử Pha động Cột Detector
Thể
tích
tiêm
mẫu
( µl )
Đường chuẩn Độ đúng Độ lặp lại

[43]
Bột quả cây
Macrocarpium
officinalis
- Methanol:dd H
3
PO
4
:H
2
O
(88:0,05:11,95)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Kromosil C
18

(250 × 4,6mm; 5 μm)
UV
(210nm)

0,51–2,55 μg/ml
r = 0,9998
97,9%
RSD = 4,83%
(n=5)
[46] Vi nhũ tương
- Methanol:H
2
O (95:5)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Diamonsil
TM
C
18

(150 × 4,6mm; 5 μm)
- Tiền cộ
t: Agilent
Zorbax SB- C
18

(12,5 × 4,6 mm; 5
μm)
- Nhiệt độ cột:

35 ± 1
0
C
UV
(210nm)
20
2–100 µg/ml
r = 0,999
99,88 - 100,28%
[45]
Lá cây Mã đề
(Plantago major)
MeOH–H
2
O–THF (94:5:1), chỉnh

pH 5 bằng acid acetic băng

- LiChrosorb RP
18

(250 mm x 4,6 mm,
5 μm)
- Nhiệt độ phòng
(22°C)
DAD
(220 nm)
20
2,5-100 µg/ml
r
2
= 0,9997
98,9 -101,6%
[26]
Phần trên mặt đất
của cây
Mitracarpus
scaber
- MeCN–H
2
O (85:15)
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

- SPHERISORB®
ODS (250× 4,6 mm,
5 μm)

- Nhiệt độ cột: 25
℃

UV
(215nm)
20
0,5 - 10 µg/ml
r
2
= 0,98 – 0,99

97,4%
RSD = 1,49%
(n=5)



17

Tài
liệu
Mẫu thử Pha động Cột Detector
Thể
tích
tiêm
mẫu
( µl )
Đường chuẩn Độ đúng Độ lặp lại
[33]
Cây bách hoa xà

thiệt thảo
(Oldenlandia
diffusa)
- MeOH: H
2
O (83:17 chứa 0,2%
NH
4
OAc, pH 6,74)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Cột: Zorbax Eclipse
XDB- C
18
(250 × 4,6
mm, 5 μm)
- Tiền cột: C
18
(7,5 ×
4,6 mm, 5 μm)
- Nhiệt độ phòng
UV
(210 nm)

20
5,03-201,2 μg/ml
r
2
= 0,9998
99,8%

RSD = 3,44%
(n = 9)

RSD = 1,81%
(n=6)
[32]
Lá, rễ, thân các
loài Swertia



- A : MeCN:H
2
O (20:80)
- B: 100% MeCN
- Chương trình gradient:
0 phút: 75% B
15 phút: 85% B
- Cân bằng cột trước khi tiêm mẫu
tiếp theo với pha động ban đầu
trong 10 phút
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút





- Hypersil BDS C
8
(200 mm × 4,6 mm,

5μm)
- Nhiệt độ cột: 30
0
C



FLD:
λ
ex
= 272 nm
λ
em
=505 nm

32 – 640 ng/ml
r = 0,9999

98,23 - 101,35%