Chế kháng nguyên và kháng thể kháng Vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp dùng trong chẩn đoán huyết thanh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
*


ðỖ THỊ HOA



CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ
KHÁNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN
SINH SẢN VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG CHẨN
ðOÁN HUYẾT THANH HỌC



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP




HÀ NỘI – 2012




BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

*


ðỖ THỊ HOA

CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG
VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG CHẨN ðOÁN HUYẾT
THANH HỌC

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60640101

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS Tô Long Thành


HÀ NỘI – 2012


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i

Lêi c¶m ¬n
Lêi c¶m ¬nLêi c¶m ¬n
Lêi c¶m ¬n

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương -
Cục Thú Y ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tô Long Thành Giám
ñốc trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục Thú Y là giáo viên trực tiếp
hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng tới Ths. Nguyễn Tùng, phó Giám
ñốc trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục Thú Y ñã dành nhiều thời
gian, công sức giúp ñỡ tôi trong suốt quá hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn những y kiến ñóng góp quý báu của thầy
giáo, cô giáo trong ban ðào tạo sau ðại học – Viện Khoa học Nông nghiệp
Việt Nam trong quá trình học tập, hoàn thiện và bảo vệ luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ nhân viên trong phòng Vi rút,
phòng Giải phẫu bệnh thuộc trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục Thú
Y ñã tạo ñiều kiện, giúp ñỡ trong các thí nghiệm thực hiên ñề tài.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sựu giúp ñỡ nhiệt tình của các bạn
ñồng nghiệp, gia ñình và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012
ðỗ Thị Hoa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii

LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả thu ñược trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố
trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu có gì sai tôi xin hoàn toàn

chịu trách nhiệm.

Tác giả luận văn


ðỗ Thị Hoa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn i

Lời cam ñoan ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

MỞ ðẦU 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung về PRRS 5

1.1.1 Khái quát về PRRS 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

1.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam 16

1.2 Các kiến thức về chẩn ñoán 22

1.2.1 Chẩn ñoán qua các dấu hiệu lâm sàng 22

1.2.2 Chẩn ñoán dựa vào bệnh tích 22

1.2.3 Chẩn ñoán vi rút học 23

1.2.4 Phương pháp huyết thanh học 24

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Ổn ñịnh giống vi rút PRRS ñể chế kháng nguyên 26

2.2.2 Chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, ELISA 26

2.2.3 Sử dụng vi rút ñể chế kháng huyết thanh trên Lợn 26

2.2.4 Chuẩn ñộ kháng nguyên và kháng huyết thanh chế ñược 27


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv

2.2.5 Kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu chẩn ñoán ñối với kháng nguyên
và kháng huyết thanh tự chế.
27

2.3. Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phân lập vi rút trên môi trường tế bào MARC145 27

2.3.2 Phương pháp phát hiện, giám ñịnh vi rút bằng phương pháp
realtime
28

2.3.3 Phương pháp chế kháng nguyên và kháng huyết thanh 32

2.3.4 Phương pháp ELISA 34

2.3.5 Phương pháp IPMA 36

2.3.6 Phương pháp kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên
và kháng thể tự chế
38

2.3.7 Phương pháp tính TCID50 theo công thức Karber 40

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 40

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Nhân giống và chuẩn ñộ vi rút 41

3.2 Chế kháng nguyên cho kít ELISA 43

3.3 Chuẩn ñộ kháng nguyên tự chế bằng phương pháp IPMA, ELISA 45

3.3.1 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên bằng phản ứng IPMA 45

3.3.2 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên trên kít ELISA 49

3.4 Theo dõi sự hình thành kháng huyết thanh bằng phản ứng ELISA 52

3.5 Kết quả chuẩn ñộ kháng huyết thanh 54

3.5.1 Chuẩn ñộ kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA 54

3.5.2 Chuẩn ñộ kháng thể bằng phương pháp IPMA 56

3.6 Kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu bằng phản ứng ELISA 59

3.7 Kết quả kiểm tra chế phẩm sau khi chế 61

3.7.1 Tính tinh khiết của kháng nguyên và kháng thể sau khi chế 61

3.7.2 Kết quả kiểm tra tính ổn ñịnh của kháng nguyên và kháng thể
băng phương pháp ELISA.

62

3.8 Kết quả so sánh mẫu huyết thanh chẩn ñoán bằng kháng nguyên và
kháng th
ể tự chế với kít Herdcheck 3X

64


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

3.9 Kết quả so sánh 343 mẫu bằng 2 phương pháp ELISA và IPMA 66

3.10 Mỗi tương quan giữa nguyên liệu tự chế và kít Herdcheck 3X 69

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC 77

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Diễn giải Ký hiệu
chữ viết tắt
Tiếng Anh Tiếng Việt
PRRS Porcine reproductive and
respiratory syndrome
Hội chứng rối loạn sinh sản hô
hấp lợn.
ELISA Enzyme linked
immunosorbent assay
Phản ứng ELISA
IPMA Immuno-Peroxidase
Monolayer Assay
Phản ứng miễn dịch có gắn men
peroxidase trên tế bào 1 lớp
rRT-PCR Phản ứng Realtime-RT PCR real-time Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction
MARC-145 Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi
CPE Cytopathic pathogene effect Bệnh tích tế bào
FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bê
BSC II Bio-safety cabinet Buồng an toàn sinh học cấp II
MEM Modified Eagles medium Môi trường nuôi cấy tế bào
AEC 3-Amino-9-ethylcarbazole Chất phát màu - IPMA
DMSO Dimethylsulfoxide
Thành phần trong bảo quản tế

bào

PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối ñệm phốt phát
TCID50
50 % tissue culture infective
dose
Liều gây nhiễm 50 % tế bào



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1
Sự tương ñồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so
sánh với chủng Bắc Mỹ VR2332
7

Bảng 1.2 Một số tên gọi của bệnh 8

Bảng 1.3 Các ñoạn gen mã ñọc mở của vi rút PRRS 9

Bảng 2.1 Danh mục các cặp mồi và mẫu dò 30

Bảng 2.2
Công thức áp dụng cho kít realtime RT-PCR (hãng
Invitrogen)
31

Bảng 2.3 Chu kì nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR 31

Bảng 2.4
Các bước tiến hành chế kháng nguyên cho phản ứng
ELISA
32

Bảng 2.5 Các bước chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, FAT 33

Bảng 2.6 Các bước thực hiện phản ứng ELISA 35

Bảng 2.7 Bảng công thức dịch tễ 2x2 39

Bảng 3.1 Kết quả sau 3 lần chuẩn ñộ vi rút 07196 trên tế bào MARC 42

Bảng 3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào sau 3 ngày 46

Bảng 3.3 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên 07196 49

Bảng 3.4 Tóm tắt kết quả S/P của kháng nguyên pha loãng 51

Bảng 3.5 Hàm lượng Kháng thể trung bình sau khi công 53

Bảng 3.6 Kết quả chuẩn ñộ kháng huyết thanh bằng 2 kháng nguyên 55

Bảng 3.7
ðộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể tự
chế
60

Bảng 3.8 Sự tinh khiết của sản phẩm sau 14 ngày theo dõi nuôi cấy 62

Bảng 3.9 Sự tính ổn ñịnh của KN, KT 07196 trong 6 tháng bảo quản 63

Bảng 3.10

Kết quả so sánh của 343 mẫu huyết thanh trên 2 phản ứng 65

Bảng 3.11

Kết quả so sánh của 2 phương pháp ELISA và IPMA 66

Bảng 3.12

So sánh của phương pháp ELISA và IPMA 67



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1
ðại thực bào khi bị PRRS xâm nhập

6

Hình 1.2
ðại thực bào chưa bị PRRS xâm nhập

6

Hình 1.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS 10

Hình 1.4 Hệ phả của 5 chủng virus PRRS từ các nước khác nhau 10

Hình 2.1
Mô tả phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể
PRRS
36

Hình 3.1 Hình ảnh 10 chai tế bào trước khi nhiễm 43

Hình 3.2 Ảnh tế bào bình thường 44

Hình 3.3 Tế bào phá hủy 100% 44

Hình 3.4 Xử lý RIPA trên chai tế bào bị phá hủy 44

Hình 3.5 Ảnh chiết tách protein vi rút bằng RIPA 45

Hình 3.6 Hình ảnh dương tính trong phản ứng IPMA 48

Hình 3.7 Hình ảnh âm tính trong phản ứng IPMA 48

Hình 3.8 Biểu ñồ hàm lượng kháng nguyên tự chế 52

Hình 3.9
Biểu ñồ hàm lượng kháng thể tăng theo các tuần sau khi

công
54

Hình 3.10 Biểu ñồ kết quả chuẩn ñộ kháng thể sau khi chế 56

Hình 3.11 Kháng huyết thanh pha loãng 1/80 trong phản ứng IPMA 57

Hình 3.12 Kháng huyết thanh pha loãng 1/320 trong phản ứng IPMA 57

Hình 3.13
Kháng huyết thanh pha loãng 1/1280 trong phản ứng
IPMA
58

Hình 3.14
Kháng huyết thanh pha loãng 1/5120 trong phản ứng
IPMA
58

Hình 3.15
Kháng huyết thanh pha loãng 1/10240 trong phản ứng
IPMA
58

Hình 3.16
ðồ thị so sánh 2 phương pháp chuẩn ñoán kháng thể
PRRS
68

Hình 3.17

Mối tương quang giữa kháng nguyên, kháng thể tự chế và
kít Herdcheck 3X
69



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1

MỞ ðẦU

1. Khái niệm và lý do chọn ñề tài

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở Lợn (PRRS - Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome), còn gọi là bệnh Tai xanh là bệnh
rất quan trọng ñối với ngành chăn nuôi lợn. Bệnh này ñã xuất hiện nhiều nơi
trên thế giới, là một bệnh luôn gắn liền với chăn nuôi lợn công nghiệp và cho
ñến nay vẫn chưa có vắc xin phòng bệnh thực sự hiệu quả ñối với bệnh này.
PRRS ñã và ñang trở thành dịch ñịa phương ở nhiều nước trên thế giới,
gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. Hội chứng này lần ñầu ñược ghi nhận ở
Hà Lan vào năm 1986 và ở Mỹ giữa năm 1987 và ñược ñặt tên là “Bệnh bí
hiểm” hay bệnh Tai xanh. Bệnh gây ra triệu chứng ở hầu hết các loại lợn,
nhưng 2 nhóm triệu chứng cơ bản thường thấy là hội chứng rối loạn sinh sản
bao gồm sảy thai, thai chết lưu và hội chứng hô hấp biểu hiện các dấu hiệu bỏ
ăn, sốt và ho. Căn bệnh xuất hiện gần ñây ở Trung Quốc (2005) và Việt nam
(2007) này có ñặc ñiểm là xảy ra ở tất cả các tính biệt và lứa tuổi lợn có thể
gây lợn chết với tỷ lệ cao khi có bội nhiễm vi khuẩn. Thể bệnh mới này ñược
cho là vi rút tai xanh thể ñộc lực cao (HP-PRRS) gây ra và khác biệt với vi rút
PRRS thể cổ ñiển chủ yếu tấn công lợn nái, lợn con và tỷ lệ chết do bệnh

thấp. Sau khi xuất hiện ở Việt Nam vi rút này ñã lây lan rất nhanh chóng ñến
nhiều tỉnh ở phía Bắc và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Theo ñiều tra
thấy sự bùng phát xảy ra ở trại nhỏ dưới 50 nái, những trại này không chích
vắc xin PRRS tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên ñến 70%, tỉ lệ chết > 30% Trong
khi ñó, với trại qui mô lớn là 48/100 trại có phản ứng sốt không xác ñịnh. Tỷ
lệ nhiễm bệnh và tỷ lệ chết với từng loại trang trại là khác nhau.
Vi rút PRRS có tính thích ứng rất cao ñối với các ñại thực bào ở phổi.
Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi ñơn dương, cấu trúc tương tự các


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

khung ñọc mở (open reading frame, ORF) của Coronavirus, gồm 7 khung ñọc
mở gối lên nhau, mã hóa cho 7 protein của vi rút gồm: GP1, GP2, GP3, GP4,
GP5, M và N. Protein GP5 cùng với protein N là ñích chủ yếu của các kháng
thể trung hoà, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” ñáp ứng miễn dịch cơ thể vật
chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tượng trình diện kháng nguyên vi rút của
các ñại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả ñáp ứng
miễn dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated
immunity). Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ
phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có
cơ hội phát triển.
Ở Việt Nam bệnh PRRS ñã ñược phát hiện thấy kháng thể trong huyết
thanh của một ñàn lợn giống ngoại nhập ở một số trại lợn phía Nam vào năm
1997. Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật bản kết hợp với Trường
ðại học Cần Thơ cũng ñã tiến hành ñiều tra một số trường hợp bệnh ở lợn có
hiện tượng lợn con chết, lợn nái sảy thai, và ñiều trị kháng sinh không có hiệu
quả. Trong nghiên cứu này, người ta ñiều tra một số nguyên nhân gây bệnh

trong ñó có hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn.
Tháng 3 năm 2007, một căn bệnh lạ ñã xuất hiện trên nhiều ñàn lợn ở
một số tỉnh phía Bắc Việt Nam như Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà
Nội, Quảng Nam. Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương ñã xác ñịnh ñược
nguyên nhân chính gây nên căn bệnh lạ ñó là Hội chứng rối loạn sinh sản và
hô hấp ở lợn (PRRS). Căn bệnh này có ñặc ñiểm là xảy ra ở tất cả các lứa tuổi
lợn và khác biệt với vi rút PRRS thể cổ ñiển chủ yếu tấn công lợn nái và lợn
con. Sau ñó căn bệnh này ñã lây lan rất nhanh chóng ñến nhiều tỉnh ở phía
Bắc và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi.
Hiện nay dịch PRRS, ñặc biệt
là thể ñộc lực cao ñã xảy ra ở các nước lân cận như Trung Quốc, Lào và
Campuchia, và Việt Nam.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

Việt Nam ñã ra nhập tổ chức Thương mại Thế giới (WTO) việc giao
lưu buôn bán ngày càng ñược ñẩy mạnh, trong ñó có trao ñổi ñộng vật và các
sản phẩm nguồn gốc từ ñộng vật. Trong quá trình giao lưu buôn bán, việc
nhập khẩu con giống cũng như các sản phẩm làm thức ăn chăn nuôi với mục
ñích nâng cao năng suất chăn nuôi cũng khó tránh khỏi nguy cơ làm cho dịch
bệnh gia súc có ñiều kiện xâm nhập. Vi rút lưu hành rộng rãi trên ñàn lợn mắc
bệnh ñã khỏi về triệu chứng lâm sàng và tiếp tục ñược bài thải, phát tán ở
nhiều ñịa phương. Việc phòng bệnh bằng vắc xin là một biện pháp giúp giảm
bớt thiệt hại do lợn ốm chết. Tuy nhiên ñể ñánh vắc xin có tạo ñược ñáp ứng
miễn dịch hay không, cần phải ñánh giá bằng phản ứng phát hiện kháng thể.
Phương pháp ELISA, IPMA là phương pháp ñơn giản dùng ñể chẩn ñoán
huyết thanh học bệnh PRRS, hai phương pháp này có ñộ nhạy tương ñối cao,

có thể sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên ñể xét nghiệm sự tương
ñồng giữa kháng nguyên và kháng thể kiểm tra thì vai trò của kháng nguyên
ñóng vai trò quan trọng trong phản ứng, mặt khác ñể ñánh giá ñược mẫu
huyết thanh là dương tính thì phục thuộc rất nhiều và mẫu huyết thanh ñối
chứng của phản ứng. Do ñó ñể phục vụ công tác xét nghiệm huyết thanh học
của bệnh PRRS chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài
“
Chế kháng nguyên và
kháng thể kháng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp dùng
trong chẩn ñoán huyết thanh học”.
2. Mục tiêu của ñề tài:
- Chế ñược kháng nguyên và kháng thể cho phản ứng huyết thanh học.
- Xác ñịnh một số tính chất cơ bản của kháng nguyên kháng thể, ñảm
bảo ñộ tin cậy khi ñưa vào chẩn ñoán huyết thanh học bệnh PRRS bằng phản
ứng ELISA, IPMA.

3. ðịa ñiểm, ñối tượng nghiên cứu và ý nghĩa khoa học của ñề tài
[ơ
 ðịa ñiểm: Phòng Vi rút - Trung tâm Chẩn ñoán Thú Y Trung ương –


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

Cục Thú Y.
 ðối tượng nghiên cứu:
+ Mẫu phủ tạng mắc bệnh PRRS: Tập trung nghiên cứu giống 07196 từ
ổ dịch năm 2007 ñã ñược giải trình tự gen NSP2, ORF5.
+ Mẫu huyết thanh Lợn với dung lượng mẫu từ 70 ñến 500 mẫu.

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài:
Bệnh tai xanh ñã và ñang rất phổ biến ở Việt Nam, việc chẩn ñoán bằng
phương pháp dịch tễ, lâm sàng và bệnh lý học có thể kết luận ñược. Tuy nhiên
ñể khẳng ñịnh chắc chắn bệnh, không có cách nào khác là phải tiến thành
phân lập, giám ñịnh vi rút gây bệnh mà ñể kết luận bệnh nhanh hơn mà vẫn
ñảm bảo tính chính xác thì phải dùng các phương pháp huyết thanh học.
Do ñó ñể tiến hành nghiên cứu chế kháng nguyên và kháng thể vi rút
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, dùng trong chẩn ñoán huyết
thanh học là hướng ñi ñúng ñắn và hết sức cần thiết. Việc chế ñược chế phẩm
này có ý nghĩa khoa học cao và nó khẳng ñịnh trình ñộ khoa học của nghành
thú y Việt Nam ñối với thế giới, ñồng thời sẽ bớt ñược ngoại tệ, có sẵn nguồn
nguyên liệu ñể chủ ñộng dùng trong công tác chẩn ñoán huyết thanh học bệnh
PRRS.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về PRRS

1.1.1 Khái quát về PRRS

Bệnh tai xanh xảy ra lần ñầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này
ñược tìm thấy ở Châu Âu, và xuất hiện ở Châu Á vào ñầu những năm 1990.
Bệnh xảy ra trên lợn với ñặc ñiểm gây sảy thai ở lợn nái và rối loạn ñường hô
hấp trên ở lợn sơ sinh, lợn choai Cho ñến nay, bệnh Tai xanh ñã lan rộng
trên khắp thế giới với những ñặc trưng của từng chủng khác nhau gây ra

những thiệt hại nặng nề về kinh tế. Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp
xúc trực tiếp giữa lợn bệnh và lợn khỏe mạnh. Vi rút cũng lây lan qua không
khí, ñiều ñó giải thích cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật
ñộ cao.
Vi rút PRRS do họ arterivirus gây nên, vi rút này ñược phân lập và ñịnh
loại vào năm 1991. Nó là một vi rút có vỏ bọc và thuộc loại ARN vi rút, có
kích thước vào khoảng 45 ÷ 80µm, chịu ñược nhiệt ñộ thấp (tồn tại 4 tháng
dưới nhiệt ñộ -70
0
C). Những con vật mang bệnh là vật gieo rắc mầm bệnh
nguy hiểm cho môi trường, không khí cũng phát tán vi rút một cách nhanh
chóng ñặc biệt khi ẩm ñộ cao, nhiệt ñộ thấp và tốc ñộ gió mạnh. Các trang
thiết bị, dụng cụ chăn nuôi, các phương tiện vận chuyển… cũng là nguồn phát
tán vi rút. Ngoài ra, các loài côn trùng như muỗi (Aedes vexans) và ruồi
(Musca domestica); vịt trời… cũng có thể là trung gian truyền bệnh. Một ñặc
trưng của Arteriviruses là phương pháp và vị trí sao bản sơ cấp, chúng sinh
sản trong bào chất quanh nhân của các tế bào chủ.
Những virion mới ñược giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào.
Tế bào ñích sơ cấp của vi rút là ñại thực bào túi phôi của lợn, vi rút rất thích


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

hoạt ñộng ở vùng phổi.


Hình 1.1.
ðại thực bào khi bị PRRS

xâm nhập

Hình 1.2.
ðại thực bào chưa bị PRRS
xâm nhập



Bình thường, ñại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, vi rút xâm nhập
vào cơ thể nhưng riêng ñối với vi rút PRRS nó không những không bị tiêu
diệt mà còn có thể nhân lên trong ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết
ñại thực bào.
Vi rút PRRS có 1 ái lực ñặc biệt với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào
ở phổi, ñại thực bào này còn gọi là ñại thực bào phế nang. Chúng có tác dụng
tiêu hoá và loại bỏ các vi khuẩn và vi rút thâm nhập vào phổi, ngoại trừ
trường hợp vi rút PRRS. Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào
làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi
rút khác có cơ hội phát triển và gây bệnh. Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại
thực bào chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào. Lúc ñầu vi rút PRRS
kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày vi rút sẽ giết chết chúng,
các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác. Ở giai
ñoạn ñầu quá trình xâm nhiễm do vi rút PRRS dường như hiệu giá kháng thể
kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của
lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch. ðiều


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với
các bệnh truyền nhiễm trên cơ thể lợn.
Bệnh lần ñầu tiên ñược báo cáo ở Mỹ năm 1987 và sau ñó ở châu Âu vào
năm 1990. Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn
bệnh và lợn khỏe mạnh. Vi rút cũng lây lan qua không khí, ñiều ñó giải thích
cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật ñộ cao. Cũng có ý
kiến rằng sự lan truyền của vi rút có thể qua tinh dịch.
Hiện nay có 2 kiểu gen của vi rút PRRS chính ñược công nhận là Châu
Âu (Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là
VR2332. Khi so sánh về di truyền ñã thấy sự khác nhau rõ rệt (khoảng 40%)
giữa 2 kiểu gen này. Ở Châu Á và Nam Mỹ người ta ñã phân lập ñược cả 2
kiểu gen, trong mỗi kiểu gen các chủng khác nhau có mức ñộ tương ñồng
khác nhau.


Bảng 1.1. Sự tương ñồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so sánh
với chủng Bắc Mỹ VR2332

Chủng Nước phát hiện Tỷ lệ % tương ñồng
VR2332 Hoa Kỳ 100
Taiwan ðài Loan 97
807/94 Canada 92
Olot Tây Ban Nha 66
l10 Hà lan 66


Châu Á dịch ñã xuất hiện từ rất sớm, năm 1989 tại Nhật Bản. Châu Âu
bệnh bắt ñầu xuất hiện năm 1990 ở ðức, sau ñó lan ra rộng khắp (Shimizu và
cs, 1994). Bệnh xuất hiện lúc ñầu với rất nhiều tên gọi khác nhau như bệnh
thần bí ở lợn, bệnh lợn PRRS, hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn, Bệnh Heko

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8

– Heko, Hội chứng sảy thai và bệnh ñường hô hấp (Porcine epidemic abortion
and respiratory syndrome), Lan er bing… ðiều này ñược tổng hợp tại bảng
một số tên gọi của bệnh.
Bảng 1.2. Một số tên gọi của bệnh

Tên Bệnh Nguồn gốc
Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery swine disease)
Khi chưa biết rõ nguyên
nhân bệnh (ñược sử dụng
Bệnh PRRS
Tai một số lợn nái mắc
bệnh có màu xanh
Bệnh Heko - Heko Nhật Bản
Lan er bing Trung Quốc
Hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn (Swine
infertility and abortion syndrome)
Lợn nái bị bệnh thường
vô sinh và sảy thai
Hội chứng sảy thai và bệnh ñường hô hấp (Porcine
epidemic abortion and respiratory syndrome)
Lợn bị sảy thai và bệnh
ñường hô hấp
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
(Porcine reproductive and respiratory syndrome)

Lợn bị rối loạn sinh sản
và bệnh ñường hô hấp

ðến năm 1991 khi bệnh lây lan ra nhiều nước trên thế giới với triệu
chứng hô hấp và sinh sản ñặc trưng, nên tại uỷ ban Châu Âu bệnh có tên
chính thức là “Porcine reproductive and respiratory syndrome”- viết tắt là
PRRS bên cạnh các tên như nêu trong bảng trên (Zimmermen và cs, 1999).
Năm 1992 Tổ chức thú y thế giới công nhận tên PRRS như một tên gọi quốc


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9

tế cho bệnh này. Ngày nay tên PRRS ñã ñược sử dụng rộng rãi.

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước


Bệnh PRRS gây ra triệu chứng ở hầu hết các loại lợn, nhưng 2 nhóm
triệu chứng cơ bản thường thấy là hội chứng rối loạn sinh sản bao gồm sảy
thai, thai chết và chết lưu và hội chứng hô hấp biểu hiện bởi các dấu hiệu bỏ
ăn, sốt và ho.
Vi rút PRRS là một loại vi rút có vỏ bọc và là virus RNA chuỗi ñơn. Vi
rút này thuộc họ Arteviridae, giống Nidovirales. Hệ gen của vi rút gồm có 7
ñoạn ñọc mở mã hóa (Open Reading Frames - ORF) cho các protein khác
nhau. ORF 1a và 1b chiếm 80% hệ gen và mã hóa cho RNA polymerase và 6
ORF khác nhỏ hơn (2-7) mã hóa cho các protein cấu trúc của vi rút.

Bảng 1.3. Các ñoạn gen mã ñọc mở của vi rút PRRS

ORF 1 RNA replicase ORF1a and ORF1b
Protein không
cấu trúc
ORF 2 Minor membrane glycoprotein GP2a, GP2b
ORF 2-7 Nucleocapsid protein N, nucleolar localization
ORF 3 Membrane glycoprotein GP3
ORF 4 Membrane glycoprotein GP4
ORF 5 Major membrane glycoprotein GP5
ORF 6 Membrane associated protein - M
Protein cấu trúc


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

ORF 7 Nucleocapsid protein - N

Protein GP5 là protein cấu trúc biến ñổi nhiều nhất, chỉ có 51-55% axit
amin ñồng nhất giữa các chủng Bắc Mỹ và châu Âu, ngược lại protein M là
protein ổn ñịnh nhất với sự ñồng nhất axit amin là 78-80%.
Hiện nay có 2 kiểu gen PRRS chính ñược công nhận là Châu Âu
(Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là VR2332.
Khi so sánh về di truyền ñã thấy sự khác nhau rõ rệt (khoảng 40%) giữa 2
kiểu gen này.

Hình 1.3. Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11


Hình 1.4. Hệ phả của 5 chủng vi rút PRRS từ các nước khác nhau
(tương ứng với bảng 1.4 bên trên)

Ở Châu Á và Nam Mỹ người ta ñã phân lập ñược cả 2 kiểu gen. Trong
mỗi kiểu gen cũng có các chủng khác nhau, thể hiện sự tương ñồng về các
nucleotide.
Hai ñoạn gen không cấu trúc là NSP2 và gen mã hóa khung ñọc mở
ORF5, là 2 vùng gen có ñộ ñồng nhất cao và thường ñược giải mã trình từ
amino acide ñể phân loại di truyền ñối với vi rút PRRS.
Bệnh lần ñầu tiên ñược báo cáo ở Mỹ năm 1987 và sau ñó ở châu Âu
vào năm 1990. Trong hơn 2 năm bệnh ñã lan ra khắp các nước chăn nuôi lợn
công nghiệp ở châu Âu. Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực
tiếp giữa lợn bệnh và lợn khỏe mạnh. Vi rút cũng lây lan qua không khí, ñiều
ñó giải thích cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật ñộ cao.
Cũng có ý kiến rằng sự lan truyền của vi rút có thể xảy ra qua tinh dịch.
Wenvoort (1991), Collins (1990), áp dụng ñịnh ñề Koch ñã khẳng ñịnh
nguyên nhân cuả PRRS là do vi rút, khẳng ñịnh có hai dòng vi rút nguyên
mẫu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ gây ra PRRS. Tác giả ñã ñặt tên cho


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12

vi rút gây ra PRRS ở Châu Âu là Lelystad.
Benfield (1992), Cozelman (1993), Dea (1992), Saito (1996), ñã khẳng
ñịnh vi rút gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với vi rút viêm ñộng mạch
ngựa, vi rút tăng enzyme lactate dehydrogenase ở chuột, vi rút gây sốt xuất
huyết ở khỉ. Cũng như ñưa ra những ñặc tính quan trọng của họ Arteriviridae,
bộ Nidovirales.
Benfield (1992), ñã mô tả, ñặt tên cho virus gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR-
2332 và ñưa ra ñặc tính của PRRSV như sức ñề kháng của PRRSV. Tác giả
khẳng ñịnh PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5- 7,5.
Mengeling và cs (1996), Mengeling và cs (1998), nghiên cứu về vắc xin
chống lại PRRSV. Khẳng ñịnh virus vắc xin kích thích ñáp ứng miễn dịch
chậm, vi rút vắc xin có thể truyền qua nhau thai, truyền từ con ñược tiêm vắc
xin sang con không tiêm vắc xin.
Vezina và cs (1996), Yoon và cs (1995), ñã nghiên cứu về quá trình ñáp
ứng miễn dịch của lợn khi cơ thể lợn nhiễm PRRSV. Các tác giả ñã khẳng
ñịnh kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện
sau khi nhiễm PRRSV. Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4-5 tuần sau nhiễm
PRRSV và ñạt tối ña vào lúc 10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm.
Zimmermen và cs (1999) ñã nghiên cứu một cách ñầy ñủ và sâu sắc về
Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn. Các tác giả ñã giải thích về nguồn gốc
tên gọi PRRS, cũng như cung cấp cho ñộc giả một bảng danh sách tên gọi
trước khi có tên PRRS.
Jun Han, Yue Wang, Kay S.Faaberg (2006) ñã khẳng ñịnh, về mặt di
truyền học và tính kháng nguyên hai loại vi rút Lelystad và VR- 2332 hoàn
toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng ñược tiến hoá
theo hai hướng khác nhau. Hai vi rút này ñã trở thành hai dòng vi rút nguyên
mẫu, dòng Châu Âu (vi rút Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR2332).
Tại Trung Quốc, một căn bệnh bí hiểm ñã xảy ra còn ñược gọi là bệnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13

sốt cao vào năm 2006 và người ta thấy có dấu hiệu của PRRS. Căn bệnh này
ñã lan rộng ra hơn 10 tỉnh và tấn công 2.000.000 lợn, gây chết 400.000 lợn.
Không giống với PRRS ñiển hình, căn bệnh bí hiểm này xảy nhiều trên lợn
lớn với dấu hiệu sốt cao, và một số triệu chứng như Dịch tả lợn. Khi phân tích
hệ gen, người ta thấy các vi rút PRRS phân lập ñược thuộc nhóm II và tương
ñồng rất cao với chủng HB-1, một chủng PRRS của Trung quốc (96,5%).
Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn
hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có cơ hội phát
triển và gây bệnh. Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào chúng nhân lên
và phá huỷ rất nhanh tế bào bảo vệ cơ thể. Vì thế vi rút hấp thụ và thực hiện
quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó. Một tỷ lệ lớn tế bào ñại
thực bào trong phế nang phổi bị vi rút xâm nhiễm rất sớm.
Lúc ñầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3
ngày vi rút sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm
sang các tế bào khác. Ở giai ñoạn ñầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV,
dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác
không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực
bào trong hệ thống miễn dịch. ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc
ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn.
Vi rút tương ñối mẫn cảm và dễ dàng bị tiêu huỷ bởi các yếu tố vật lý
và hoá học. Cụ thể, vi rút bị tiêu huỷ nhanh chóng khi môi trường có pH<5.5
hoặc pH>6.5 và tính gây bệnh cũng giảm ñi ñến 90% ở những môi trường
như vậy; ñối với tác ñộng của nhiệt ñộ, vi rút có thể tồn tại khoảng 120 giờ
khi ở nhiệt ñộ 40
0
C, 20 giờ ở nhiệt ñộ 20

0
C, 3 giờ ở nhiệt ñộ 37
0
C và 6 phút ở
nhiệt ñộ 56
0
C. Vi rút cũng bị vô hoạt nhanh chóng khi bị tác ñộng bởi các loại
hoá chất thông thường như chloroform hoặc ether.

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14

Năm 1997 Việt Nam nhập 104 lợn giống từ Mỹ và ñưa ra công ty giống
gia súc Hà Nội 51 con

lợn, khi kiểm tra có 10/51 con có huyết thanh dương
tính với PRRS. Từ năm 1997 ñến 2006 có rất nhiều tác giả trong nước nghiên
cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở ñiều tra, giám sát tỷ lệ lưu hành
huyết thanh. Bắt ñầu từ tháng 3 năm 2007, khi các ổ dịch lâm sàng PRRS
bùng nổ thì việc nghiên cứu về bệnh ở Việt Nam mới ñược triển khai toàn
diện trên cả nước dưới nhiều hình thức cả về dịch tễ học và các biện pháp
chẩn ñoán xét nghiệm, phòng chống dịch bệnh.
Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật Bản kết hợp với
Trường ðại học Cần Thơ cũng ñã tiến hành ñiều tra một số trường hợp bệnh
ở lợn có hiện tượng lợn con chết và lợn nái sảy thai và ñiều trị kháng sinh

không hiệu quả. Trong nghiên cứu này, người ta ñiều tra một số nguyên nhân
gây bệnh trong ñó có hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. ðiều tra
ñược tiến hành ở các ñàn lợn gia ñình, một số trại giống của Nhà nước và một
số lò mổ.
Các nhà khoa học ñã phát hiện thấy kháng thể PRRS trong huyết thanh
ở các ñàn lợn nuôi gia ñình và có tỷ lệ lưu hành cao ở các trại lợn của Nhà
nước cùng với hiện tượng tỷ lệ lợn con chết cao. Ngoài ra, cũng phát hiện
thấy virus giả dại và virus Dịch tả lợn.
Tô Long Thành (2007), ñã trình bày một cách tổng hợp về hội chứng
PRRS nói chung, khẳng ñịnh lợn các lứa tuổi ñều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn
nái và lợn con. Tác giả ñã ñưa ra biện pháp phòng hội chứng PRRS, trong ñó
nhấn mạnh việc phòng bệnh PRRS bằng vắc xin.
Khi lợn mắc PRRS không chỉ có những bệnh tích ñặc trưng nhất của
PRRS là ở phổi và hạch lâm ba, mà còn có những bệnh tích khác do vi khuẩn
kế phát gây ra. Những vi khuẩn kế phát ở ñường phổi thường gặp là
Mycoplasma hyopneumoniae (suyễn lợn), Pasteurella multocida (Tụ huyết
trùng), Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn type 2), Bordetella


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

15

bronchiseptica (viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (viêm ñường hô
hấp)… Bùi Quang Anh và cs (2007). Theo kết quả nghiên cứu của Viện Thú
y Quốc gia do tác giả Cù Hữu Phú thực hiện cho thấy, các bệnh nhiễm trùng
kế phát thường gặp ở lợn mắc bệnh Tai xanh gồm: Tụ huyết trùng, Liên cầu
khuẩn và Viêm phổi do vi khuẩn ở lợn.
Phạm Ngọc Thạch và cs (2007), nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng
và chỉ tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên ñã cho thấy,

khi lợn mắc PRRS tần số hô hấp, tim mạch, thân nhiệt ñều cao hơn sinh lý
bình thường, chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá máu thay ñổi ñặc biệt là số lượng bạch
cầu, ñộ dự trữ kiềm tron máu tăng cao. Trong khi hàm lượng protêin tổng số,
hàm lượng ñường huyết lại giảm rõ rệt.
Lê Văn Năm (2007), khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích
ñại thể ở lợn mắc PRRS tại một số ñịa phương thuộc ðồng bằng Bắc Bộ- Việt
Nam ñã thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích ñại thể của lợn mắc
PRRS tương tự như các tài liệu trong và ngoài nước công bố. Nhưng ñiểm
khác ñó là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo
bón ở lợn lớn hơn
Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên và cs (2007), ñã sử dụng kỹ
thuật RT- PCR ñể phát hiện vi rút PRRS trong các mẫu huyết thanh, tinh dịch,
mô của lợn có kết quả dương tính và âm tính với kháng thể PRRS khi dùng
phương pháp ELISA. Tác giả ñã không ghi nhận ñược mối tương quan giữa
sự liên hệ của kháng thể kháng PRRS và kết quả dương tính với virus PRRS
chẩn ñoán bằng kỹ thuật RT- PCR.
Tô Long Thành, Nguyễn Văn Long và cs (2008) ñã cho biết năm 2008
số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi ñến Trung tâm chẩn ñoán thú y TW
nhiều hơn năm 2007, khẳng ñịnh những mẫu bệnh phẩm dương tính với
PRRS có sự bội nhiễm vi khuẩn. Chủng vi rút ñộc lực cao của Việt Nam có
sự tương ñồng về cấu trúc gen với chủng vi rút ñộc lực cao của Trung Quốc