Nghiên cứu ảnh hưởng của saponin kim ngân đối với hoạt độ anpha chymotrysin trong quá trình chống viêm

BỘ Y TẼ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

socjgCOsoüg

PHẠM KHUÊ TÂM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA SAPONIN KIM NGÂN
ĐỐI VỚI HOẠT Đ ộ a- CHYMOTRYPSIN TRONG Q
TRÌNH CHĨNG VIÊM

( KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHÓA 2001- 2006 )

Giảng viên hướng dẫn :Ths. Lê Thị Diễm Hồng
Nơi thực hiện

: Bộ mơn Hố sinh

Thời gian thực hiện

: 02 - 05/2006

Hà Nội, 05- 2006


sềđ%ẮẨ(ểJr
xùt

ủàụ
n /iíê m

^ỈIA. ỉ£ ê f /u iđ}iễm

t ¿ ừ in ỹ

ể i ế t ổ tt

ếđu

iắ r

Ỉứỉ ^ßff. ÍĨỈJ{ fL yfyn ỹễit ^ ^ u ãn

ấâ n w ti /if iả ế in /t h rừ ĩn ự ( ề a ỉ h o e ÍJ'rứừ‘

’} ( à t/irỵf, tĩầ

ờ /u ỉự cơ íu ơ tt ẹ n a )! tã m , fa n ũ n /i ầ ư đ n ọ f/ẫ it I‘à

/ t ế f id n ọ Ỹ Ì(ự t đ ữ tơ i /to à n f /ià n /i /tả n ỉtiđ n lĩă n n át^ ‘

^ôf xin cỉiărt f/iàn/i cảm iỉn, eắr tỉià ỹ ỸỈáũ, m ựiáo ùtiừỉnỹ Q'ai /ưi{'
i i f û f r ^‘ Cà
Ỉ

d a r /íỉ ê t c ắ e t h ầ y ựỉá<ì, cô ự iá o , c á c c ỉd Ẩ'f t / u ì đ t m ên, Ổ )ê

m ồH >'J(<ìả u n h , đ ã Ỹ Ìú ịi đ ĩi' tô i n / ù ê t ù n /t h o n ụ íìn ơ t (fim ỉ t ì t i ỉ i í w e tã ịt nà
t/tffc ỉừ ê n đ ê ừ ii.

x in c ả m (ĩn c /ia m e, n ỉiĩù K Ị n ỹ fừ U th â n /ỉà ẫ a n á è đ ã ỉu ũ it e ể tm

đ S n /ỵ m ề n n à ỸÙ ựi đ ĩỉ tũ i ầ O ỉ i ỹ caS e ếSÍưỵ -nà /ư .itự /to e tâfi,

'"Jía jV h i, H ỹ à y J8

ỉ/u ín ọ 05 H ầm 200(ì

ffin J i lũ ê n ^ ả a m J i/u f é


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN Đ Ề ..................................... ...........................................

1

Chương 1 : TổNG QUAN ................................................................

3

1.1.

Cơ sở lý thuyết về viêm ............................................................

3

1.2.

Các thuốc chống viêm.............................................................

7

1.3.

Enzym được sử dụng làm thuốc chống viêm .........................

8

1.4.

Dược liệu có tác dụng chống viêm .........................................

10

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

13

2.1.

Nguyên liệ u .............................................................................

13

2.2.

Súc vật thí nghiêm....................................................................

16

2.3.

Thiết bị dụng cụ ........................ ..............................................

16

2.4.

Hóa chất thí nghiệm................................................................

16

2.5.

Phương pháp nghiên cứu........................................................

17

Chương 3: THựC NGHIỆM VẦ KẾr QUẢ..................................

21

3.1.

Định tính Saponin Kim ngân tồn phần.................................

21

3.2.

Sắc kí lớp m ỏng......................................................................

21

3.3.

Ảnh hưởng của dịch chiết Saponin Kim ngân cuộng toàn
phần đối với hoạt tính của a -Chymotrypsin.........................

22

Kết quả thử tác dụng chống viêm cấp trong nghiên cứ u.....

27

Chương 4ĩ BÀN LUẬN.................................................................

33

3.4.

4.1.

Dịch chiết Saponin Kim ngân cuộng toàn phần...................

33

4.2.

Tác dụng của Saponin Kim ngân cuộng đối với hoạt tính
của a -Chymotrypsin trên in vitro..........................................

33

Tác dụng chống viêm của dịch chiết Saponin Kim ngân
cuộng tồn phần và a -Chymotrypsin trên mơ hình gây
viêm cấp...................................................................................

34

4.3.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................
TÀI LIÊU THAM KHẢO..............................................................

37


KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

a-CT

a - chymotrypsin

cox

Cyclooxygenase

SKNC

Saponin kim ngân cuộng

IL

Interleukin

INF

Interferon

NSAID

Non-steroid anti-inflammatory drug(Thuốc chống viêm phi steroid )

PAF

platelet activating factor ( yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

TNF

Tumor necrosis factor ( yếu tố hoại tử khối u )

NOS

nitric oxide synthetase ( enzym xúc tác tổng hợp NO)

)


ĐẶT VÂN ĐỂ
Viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một quá trình bệnh lý chung
gặp, nhiều bệnh khác nhau. Do đó viêm là một q trình bệnh lý rất phổ biến,

do nhiều nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản úng bảo vệ cơ
thể giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm. Tuy nhiên, nếu viêm nặng
kéo dài dẫn đến tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng các cơ quan ... có thể
ở mức độ rất nghiêm trọng, nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân. Vì vậy, việc
phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các ảnh hưởng có hại của viêm là rất
cần thiết.
Việc nghiên cứu, ứng dụng các loại thuốc chống viêm đã được tiến hành
từ rất lâu và đã đạt được các thành tựu to lớn với sự ra đời của thuốc chống
viêm có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid (NSAID). Các thuốc
này đã được sử dụng nhiều năm nay, có hiệu quả chống viêm rất tốt. Tuy
nhiên bên cạnh tác dụng chống viêm hiệu quả và đa dạng, chúng còn chứa
đựng những yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp
xương, kích ứng đường tiêu hố, ảnh hưởng tới q trình đơng máu...
Chính vì vậy, cùng với sự phát triển của khoa học con người tiến hành
nghiên cứu tạo ra những thuốc chống viêm có chứa các enzym như protease
(papain, a-chymotrypsin, a-amylase ) gần gũi với cơ thể con người. Các
protease này phần nào khắc phục được những nhược điểm của những nhóm
thuốc trên.
Ngồi ra, nước ta lại có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, trong đó
có những dược liệu có tác dụng chống viêm rất tốt. Nhiều cơng trình nghiên
cứu về tác dụng của dược liệu cho thấy nhóm hoạt chất xuất hiện nhiều trong
dược liệu có khả năng chống viêm là saponin. Cây kim ngân là một trong
những cây thuốc phổ biến ở Việt Nam, có thành phần saponin, dược dùng iàm


thuốc chống viêm, chống dị ứng và giải độc. Trên cơ sở đó chúng tơi tiến hành
dề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của saponin kim ngân đối vối hoạt độ của
a-chymotrypsin trong quá trình chống viêm.
Đê tài được thực hiện nhằm một sơ mục tiêu sau:
1. Tìm hiểu tác dụng của saponin trong cây kim ngân đối với achymotrypsin trên in vitro.

2. Tim hiểu tác dụng chống viêm của dịch chiết saponin cây kim ngân khi
kết hợp với a-chymotrypsin trên in vivo.


Chương 1

TỔNG QUAN
1.1.

Cơ s ở LÝ THUYẾT VỂ VIÊM
Theo Aldo (1973). Viêm là một phản ứng tại chỗ của các mạch máu, tổ

chức liên kết và hệ thần kinh đối với tác nhân gây bệnh và có liên hệ với tính
p h ả n ứ n g c ủ a c ơ th ể .

Theo Vũ Triệu An và một số tác giả khác thì viêm là một phản ứng bảo
vệ cơ thể mà nền tảng của nó là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình
thành và phát triển phức tạp dần trong q trình tiến hố của sinh vật [4, 68].
1.1.1. Nguyên nhân gây viêm
• Nguyên nhân bên ngoài
- Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn,

v iru s ,

ký sinh trùng.

- Tác nhân lý hoá học: Chấn thương, nhiệt ( bỏng nóng hoặc bỏng lạnh), bức
xạ ion, tác dụng của acid, kiềm, các hố chất [4, 68].
• Ngun nhân bên trong.
- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡnơ.

- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất gian bào[10,6- 8]
1.1.2. Phân loại viêm.
- Theo nguyên nhân: viêm nhiễm trùng và viêm vơ trùng.
- Theo vị trí; viêm nơng, viêm sâu hoặc viêm bên ngoài và viêm bên trong.
- Theo thành phần dịch rỉ viêm: viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ.
- Theo tính chất:


+ Viêm không đặc hiệu, thường là viêm cấp.
+ Viêm đặc hiệu, thường là viêm mạn tính, do hậu quả của phản ứng kháng
nguyên - kháng thể.[ 4, 204]
- Theo diễn biến: viêm cấp và viêm mạn
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm
** Rối loạn vận mạch : Ngay khi yếu tố gây viêm tác động, tại chỗ lần lượt
1
xảy ra các hiện tượng:
•

Co mạch chớp nhống: Xảy ra ngay khi có tác nhân kích thích, do

thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại.[4, 204]
•

Sau co mạch chớp nhống trong vịng vài giây là hiện

tư ợ n g

giãn

mạch. Đầu tiên là giãn tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch, ở giai

đoạn này, có sự tăng lưu lượng lẫn áp lực máu, làm cho các mao mạch nghỉ
trở lại hoạt động, chứa đầy máu giàu oxy cung cấp năng lượng cho các tế bào
thực bào hoạt động tại ổ viêm, gây ra hiện tượng nóng và đỏ. [4,205], [10, 53]
•

Phản ứng tuần hoàn mạnh quá dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng như

giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây táng tính thấm thành mạch
làm cho thốt dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản. Do sự
chèn ép của dịch rỉ viêm và do một số yếu tố mạch máu như tê liệt thần kinh
vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt của m áu... gây ứ máu làm mất
dần tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu oxy, gây rối loạn chuyển
hoá nghiêm trọng, làm tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện ( với
triệu chứng phù và đau).[4, 205-206]
♦♦ Phản ứng tế bào:
♦
Phản ứng tế bào là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ
thể chống viêm, và trong phản ứng này bạch cầu đóng vai trị quan trọng nhất.


Hoạt động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai giai đoạn kế tiếp nhau:
•

Bạch cầu thốt mạch:

Dịng máu chảy chậm, tính thấm thành mạch tăng, có sự thốt mạch,
bạch cầu rời khỏi dịng trục, tiến về phía ngoại vi tới bề mặt nội mô thành
mạch. Tại đây chúng trườn theo vách mạch ( hiện tượng lăn) rồi dừng lại ở
một điểm gọi là vách tụ bạch cầu, bám dính và xun mạch. Sau đó chúng di
chuyển trong mơ kẽ về phía các kích thích hố ứng động. Q trình này có sự

tham gia của các chất trung gian hố học như interleukin_l ( IL-1), yếu tố
hoại tử khối u ( TNF), yếu tố giãn mạch prostacyclin (PGI2), yếu tố cơ nguồn
gốc nội mơ; và các chất gây hố ứng động như: các sản phẩm của vi khuẩn,
các thành phần của bổ thể hoạt hoá, các sản phẩm chuyển hoá của acid
arachidonic theo đường lipoxygenase hoá, các cytokin, các mảnh vụn sợi tạo
keo và các sản phẩm phân huỷ tế bào, fibrin và các sản phẩm phân huỷ của
fibrin.[ 10, 70]
•

Thực bào và mất hạt:

Thực bào là hiện tượng bạch cầu nuốt và tiêu huỷ đối tượng thực bào. Tại
ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hố, khi đó khả năng thực bào của chúng tăng
lên rõ rệt. Quá trình thực bào khởi đầu bằng việc dính các tiểu phần bị thực
bào vào bề mặt bạch cầu nhờ sự nhận biết của bạch cầu. Sau đó bào tương của
đại thực bào tạo thành một màn bao quanh đối tượng hình thành khơng bào
thực bào và lysosom tiến tới hồ màng, giải phóng vào đó các chất để tiêu huỷ
đối tượng, đại thực bào mất hạt dần. Đối tượng thực bào có các khả năng sau:
Đối tượng thự bào bị tiêu đi nhờ các men hydrolase acid; nó khơng bị tiêu huỷ
mà tồn tại lâu trong tế bào hoặc theo đại thực bào đi đến nơi khác gây ra
những ổ viêrn mới; nó bị nhả ra; nó làm chết thực bào[ 4, 211- 212]


1.1.4. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm
Sau tác động ban đầu của viêm, nhiều chất trung gian hố học được giải
phóng ra, duy trì và khuếch đại phản úng viêm. Những chất này có nguồn gốc
huyết tương, tế bào và tổn thương mô. Các chất trung gian hố học gồm có:
•

Các amin hoạt mạch

Histamin đựoc giải phóng ra do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp
ứng với các kích thích: Tổn thương vật lý ( chấn thương, bỏng), phản ứng
miễn dịch gắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các
độc tố gây phản vệ, các protein giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu, các
cytokin. Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch
của các tiểu tĩnh mạch. Serotonin giải phóng từ tiểu cầu bị kích thích khi kết
dính với sợi tạo keo, phức hợp kháng nguyên kháng thể, yếu tố hoạt hoá tiểu
cầu. Nồng độ serotonin tăng trong máu khi viêm. Serotonin có tác động tương
tự như histamin.[10, 82- 83], [7, 9]
•

Các protease của huyết tương

Hệ thống bổ thể, trong đó đặc biệt có C5a và C3a làm tăng tính thấm
thành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin bởi các dưỡng
bào. [10, 84],
Hệ thống đông máu và tiêu fibrin, bradykinin: đều bị hoạt hoá bởi yếu tố
Hageman.[10, 85 - 86]
•

Các chất chuyển hố

c ủ a a c id

arachidonic: prostacyclin, thromboxan,

prostaglandin Ẽ2, leucotrien. Trong đó prostsglandin Ej đóng vai trị quan
trọng trong q trình viêm, làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu
tố khác làm tăng tính thấm thành mạch và gây đau. Leucotrien là chất trung

gian tiền viêm mạch, có tác dụng hố ứng động bạch cầu.[10, 87-88]


•

Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu( PAF) : Được gải phóng cùng với các chất

c h u y ể n h o á c ủ a a c id a r a c h id o n ic , c ó tá c d ụ n g h o ạ t h o á b ạ c h c ầ u Ga n h â n tru n g

tính, kích thích sự dính và xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các enzym
tiêu thể, sinh oxy phản ứng và các eicosanoid.[7, 10]
•

Các cytokin; gồm yếu tố h o ạ i tử khối u ( TNF-a và p) và interleukin (

IL-1, IL-6, IL-8...), là các polypeptid do đại thực bào và các lympho bào tiết
ra tham gia vào phản ứng miễn dịch tế bào, đồng thời giữ vai trò quan trọng
trong phản ứng viêm. Trong phản ứng viêm, các cytokin tác động trên tế bào
nội mô, bạch cầu và gây phản ứng hệ thống. [10, 96-101]
•

Các gốc dẫn xuất oxy tự do: hình thành trong ty thể đại tực bào đã

hoạt hoá. Trong phản ứng viêm, đại thực bào bị ly giải gây tràn gốc tự do ra
ngoài tạo điều kiện cho q trình peroxyd hố màng tế bào, gây tăng tính
thấm thành mạch, tạo thuận lợi cho sự giải phóng acid arachidonic từ
phospholipid màng tế bào để tổng hợp các chất trung gian hố học. [10, 93]
•

Oxyd nitơ : chất trung gian hố học mới được phát hiện. Nó là chất

khí gốc tự do hồ tan, được sản sinh ra không chỉ bởi tế bào nội mô từ Larginin, oxy phân tử và NADH bởi men NOS ( men xúc tác tổng hợp nitơ
oxid). NO gắn với nửa hem trên guanilyl cyclase và hoạt hoá enzym, dẫn đến
tăng guanosin phosphate vòng gây nên giãn cơ và hậu quả là giãn mạch. Nó
cịn có vai trị khác trong viêm, nó làm giảm tụ tập và kết dính tiểu cầu, là vếu
tố gây độc tế bào với một số vi khuẩn và tế bào u.[ 10, 95]
1.2.

CÁC THUỐC CHỐNG VIÊM.

1.2.1. Thuốc chống viêm steroid.
Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon của tuyến vỏ thượng
thận. Cơ chế chống viêm là do ức chế phospholipase Aj. Do đó ức chế sự tạo
thành acid arachidonic từ màng phospholipid, dẫn tới ức chế tổng hợp

7


prostaglandin và làm giảm hoạt tính của nhiều chất trung gian hoá học của
viêm như histamin, serotonin, bradykinin. Bằng thực nghiộíii chứng minh rằng
các thuốc chống viêm Steroid làm giảm giải phóng các enzym tiêu thể, các ion
Superoxyd, làm giảm hoạt tính của các chất hố hướng động [12, 632]. Tuy

nhiên, trong sử dụng lâm sàng nhóm thuốc này bộc lộ khá nhiều tác dụng phụ
như ức chế miễn dịch, xốp xương, hội chứng suy thượng thận khi ngừng
thuốc, bệnh về cơ, giảm phát triển chiều cao ở trẻ em. ]
[2
1.2.2. Thuốc chống viêm phi Steroid.
Thuốc có tác dụng chống viêm nhưng khơng có cấu trúc

S te r o i d ,

ngồi ra

cịn có tác dụng giảm đau ngoại vi và hạ nhiệt. Cơ chế chống viêm của nhóm
thuốc này là ức chế enzym cyclooxygenase (COX), do đó làm giảm quá trình
tổng hợp các prostaglandin và thromboxan từ acid arachidonic. Gần đây,
người ta nhận thấy cyclooxygenase có các isoenzym (COXl, C0X2). COXl
là enzym cấu tạo, tham gia tổng hợp các PG E2 và 12 có tác dụng bảo vệ : bảo
vệ niêm mạc dạ dày, chống ngưng kết tiểu cầu, giữ cho hoạt động sinh lý của
thận được bình thường. C0X2 là enzym cảm ứng, nhất là trong các phản ứng
viêm, tham gia tổng hợp các PG gây ra các triệu chứng viêm. Các thuốc chống
viêm phisteroid không chọn lọc ức chế cả COXl nên gây ra các tác dụng phụ
như loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài.[15, 617-655]
1.3.

ENZYM ĐƯỢC s ử DỤNG LÀM THƯỐC CHỐNG VIÊM.
Ngày nay các enzym chống viêm được sử dụng rộng rãi bên cạnh các

thuốc chống viêm Steroid và phi Steroid. Các protease chống viêm có bản chất

tự nhiên hơn, có ưu điểm gần gũi với cơ thể người hơn nên đã phần nào giúp
trá n h

được tác dụng không mong muốn. Các enzym thường sử dụng là:

C h y m o tr y p s in ,

bromelain, seưatiopeptidase, amylase... Mặc dù có nguồn gốc

khác nhau nhưng chúng dều có khả năng chống viêm trên động vật thực
nghiệm cũng như người.

8


1.3.1. a -Chymotrypsin.
a - C h y m o try p sin là e n z y m th u ỷ p h â n p ro te in , th u đ ư ợ c d o h o ạ t h o á

chymotrypsinogen chiết xuất từ tuỵ bò. Hoạt tính của thuốc khơng ít hơn 5
m ic ro k a ta l tro n g

Img.

a - C h y m o tr y p s in ở d ạ n g b ộ t k ế t tin h h a y b ộ t v ơ

định

hình màu vàng hay trắng vàng, tan trong nước.[16, 1689]
a- Chymotrypsin có trọng lượng phân tử 21.600, các tạo bởi ba chuỗi
peptid, số lượng acid amin là 241. Nó thuộc loại serin-protease ưu tiên cắt các
liên kết tyrosin, tryptophan, phenylananin, leucin.[9, 282-283’
ở dung

dịch

a - C h y m o tr y p s in c ó

hoạt t í n h

m ạnh nhất ở

pH=8. Độ

ổ n đ ịn h

tốt nhất ở pH=3 và hoạt tính bị ức chế có thể phục hồi được.[16, 1689]
1.3.2. Tác dụng của a-chymotrypsin.
a- Chymotrypsin thuỷ phân các kinin, được giải phóng bởi kininogen
thơng qua yếu tố Hageman. a- Chymotrypsin kìm hãm tiết chế leucotrien từ
bạch cầu đơn nhân trung tính, a- Chymotrypsin thuỷ phân fibrin, q trình này
được tăng cường bởi tác dụng của heparin, dextran Sulfat, polyvinyl Sulfat
trong dung dịch NaCl 0,1M.[18, 181-191]
lon

đóng vai trị là chất ổn định cấu trúc và tăng cường hoạt tính

thuỷ phân protein este hoá của

a - C h y m o tr y p s in .

a- Chymotrypsin có tác dụng của một enzym phân giải protein, tác dụng
này phụ thuộc vào trạng thái cơ chất, a- Chymotrypsin chỉ thuỷ phân những
protein bị biến tính mà khơng tác động tới protein vẫn giữ nguyên được cấu
trúc không gian từ bậc 2 trở lên.[7, 15]
a- Chymotrypsin được dùng uống tiêm bắp hoặc dùng tại chỗ để chống
viêm và điều trị một số chấn thương. Ngoài ra, a-

C h y m o tr y p s in

còn được chỉ

định trong các trường hợp chống phù nề, kháng viêm trong chấn thương, viêm


nhiễm, dùng tại chỗ, hoặc tiêm bắp trong các khoa: nội, tai mũi họng, phụ,
ngoại ( chấn thương chỉnh hình), da liễu...[13, 138]
1.4.

DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM.

1.4.1.Vài nét về dược liệu chống viêm và saponin.
Từ thời xa xưa dân tộc Việt Nam đã biết dùng các nguồn thuốc từ động
vật và thực vật. Trong đó việc sử dụng thuốc từ cây cỏ với mục đích chống
viêm có hiệu quả rất tốt. Những cây thuốc có khả năng chống viêm cho cơ thể
thường thuộc nhóm thanh nhiệt giải độc. Nhiều vị thuốc sử dụng với mục đích
trên như : kim ngân, ké đầu ngựa, bồ công anh, rau má...các vị thuốc này
được dùng để chữa một số bệnh như mụn nhọt, mẩn ngứa, dị ứng...Ngoài ra
một số cây cỏ còn được dùng để chữa thấp khớp nhờ tác dụng chống viêm. Cơ
chế tác dụng của chúng còn chưa được biết rõ, song các nghiên cứu đã cho
thấy nhưng kết quả khả quan và ít tác dụng phụ. Các thuốc này mặc dù thuộc
các nhóm thực vật khác nhau, nhưng chúns có chứa nhom saponin. Do đó, có
thể giả thiết nhóm saponin là chất có hoạt tính sinh học và chính chúng tạo
nên tác dụng chống viêm, giải độc.
Nhiều tài liệu nghiên cứu về saponin cho thấy saponin là nhóm hợp chất
phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây ( rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt, vỏ cây...)- Đây là một nhóm có nhiều tác dụng quan
trọng:[12, 173- 181]
tác dụng long

đ ờ m chữa h o .

-

s a p o n in c ó

-

Một số dược liệu chứa saponin có tác

-

Saponin làm tăng tính thấm tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các
hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu

10

dụng

thông tiểu


- Một số saponin có tác dụng chống viêm, một số các tác dụng kháng
khuẩn, kháng nấm, ức chế virus
- Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm.
1.4.2.Cây kim ngân.
- Tên

khoa học:

Lonicera japónica Thunb.,

th u ộ c

họ kim

ngân

Caprifoliaceae.
- Tên gọi khác : Dây nhẫn đông.
- Bộ phận dùng: cây kim ngân cho các vị

th u ố c :

+ Cành và lá kim ngân (Caulis cum folium Lonicera ) là cành và lá phơi sấy
k h ô c ủ a k im n g â n .

+ Hoa kim ngân ( Flos Lonicera ) là hoa phơi hay sấy khơ của kim ngân
- Thành phần hố học:
+ h o a c h ứ a m ộ t fla v o n o id .

+ Lá chứa loganin
+ Cây chứa saponin : lonicerosid A, lonicerosid B, lonicerosid c

CH2OH

—o o
/' \ '\J
: OH
HO

CH2OH

CH2OH

..i '
/

OH

/

ĩ k ... í
/ \O H ^'"77
HO ^---- \
-

K OH

Loniceroside

c

HO

^

.ự
OH

0 !
HO ,V.... 0. i /

i'
OH

11

OH


- Tác dụng dược lý.
+ Tác dụng kháng khuẩn; Kim ngân có tác dụng k h á n g khuẩn rộng. Nước
sắc hoa kim ngân có tác dụng ức chế mạnh đối với liên cầu khuẩn, tụ cầu, tụ
cầu khuẩn, vi khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shigella, trực khuẩn lỵ coli,
phế cầu khuẩn. Nước sắc lá kim ngân có tác dụng ức chế trực khuẩn lỵ
shigella, vi trùng phó thương hàn A, tụ cầu khuẩn
+ Tác dụng trên chuyển hố chất béo: Kim ngân có tác dụng tăng cường
chuyển hoá chất béo.
+ Tác dụng trên đường huyết: Nước sắc hoa kim ngân làm tăng lượng đường
huyết trên thỏ trong vài giờ[ 8, 77]
+ Tác dụng chống choáng phản vệ; Nước sắc hoa kim ngân cho uống có tác
dụng ngăn chặn choáng phản

vệ ở

c h u ộ t la n g .

+ Độc tính: Chuột chắt trắng, sau khi được uống nước sắc kim ngân liên tục
7 ngày với liều gấp 150 lần liều điều trị cho người, vẫn sống bình thường, giải

phẫu các bộ phận khơng thấy có gì đặc biệt. Điều đó chứng tỏ rằng, nước sắc
kim ngân không độc. [8,77]
- Công dụng và liều dùng:
+Công dụng: Thường dùng trị mụn nhọt, ban sởi, mày đay, lở ngứa, nhiệt
độc, tả lỵ, ho do phế nhiệt. Người ta con dùng kim ngân trị dị ứng( viêm mũi
dị ứng và một số trường hợp dị ứng khác) và trị thấp khớp.
+ Liều dùng: Ngày dùng 14 -15g hoa hay 10 -16g cành lá dưới dạng thuốc
sắc, hãm, cao, rưọoi thuốc hoặc hồn tán. Có thể dùng riêng kim ngân hay phối
hợp với nhiều vị thuốc khác[ 8, 75- 77].

12


Chương 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1.

NGUYÊN LIỆU.

2.1.1. Kim ngân cuộng.
Là thân, cành lá phoi sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japónica
Thunb, thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae.
Thân, cành lá cây kim ngân( Lonicera japonicaThmih,Caprifoliaceae.)
được thu hái ở thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng
Yên và được Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa
học. Nguyên liệu sau khi thu hái được nhặt bỏ tạp chất, phơi trong râm mát và
sấy ở nhiệt độ 50-60®C đến khơ.

13

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách saponin tồn phần từ kim ngân cuộng

14


2.1.2. Saponin kim ngân cuộng tồn phần.
Để có được saponin tồn phần trong nghiên cứu, chúng tơi tiến hành
chiết tách saponin toàn phần từ thân, cành lá kim ngân theo quy trình tóm tắt
như sau; Dược liệu được sấy 60-65” c trong tủ sấy một giờ, đem tán nhỏ thành
bột. Sau đó cân 600g bột dựơc liệu, chiết bằng phương pháp ngâm lạnh bằng
cồn 80° (31ần). Gộp dịch chiết thu được, cất thu hồi dung mơi đến khi cịn
khoảng 50% thì đem cơ cách thuỷ đến 400 ml, tiếp tục cho vào bình gạn lắc
với cloroform. Tiến hành loại tạp bằng clororm trong bình gạn cho đến khi
dịch chiết clororm không màu. Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để
loại hết clororm. Dịch nước cho vào bình gạn, chiết bằng n-butanol, gộp
dịch chiết n-butanol, cô cách thuỷ hết dung mơi n-butanol thu được cắn
saponin tồn phần. Quy trình thực hiện có thể mơ tả như sơ đồ ở hình 2.1
2.1.3. a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin dạng ống tiêm, mỗi ống chứa 5 mg a-chymotrypsin /
5ml. Biệt dược hãng Shanghai No.l Biochemical & Pharmaceutical Co, Trung
Quốc.
2.1.4. Cơ chất casein.
Casein hộp lOOg hoá chất của Budapest Hungary.
Cân chính xác l,2g casein cho vào cốc có mỏ, thêm dung dịch đệm
phosphat 0,03M ( pH=7,5) vừa đủ lOOml. Đun cách thuỷ trong 60 phút, vừa
đun vừa khuấy, lọc qua gạc, pH cuối cùng của dung dịch bằng 7,2.
Chú ý: Dung dịch casein chỉ pha đủ dùng trong 1-2 ngày và phải được
bảo quản trong tủ lạnh, trước khi dùng phải lắc đều.

15


2.2.

SÚC VẬT THÍ NGHIỆM.

Chuột cống trắng đực và cái, nitrong cùng điều kiện, cân nặng lOOg
130g do trại chăn nuôi súc vật thí nghiệmHọc viện 103 cung
2.3.

THIẾT BỊ DỤNG c ụ .

-

Máy đo quang trung quốc 752.

-

Máy ly tâm Hettich.

- Tủ lạnh.
- Tủ sấy.
- Máy điều nhiệt Mtakutesz.
- Dụng cụ đo thể tích chân chuột.
- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius.
2.4.

HỐ CHẤT THÍ NGHIỆM.

- Thuốc thử Gornall
- Dung dịch acid tricloacetic 10%:
Acid tricloacetic

lOg

Nước cất vừa đủ

1OOml

- Dung dịch đệm phosphat 0,03M( pH= 7,5 )
Na2HP04.12H20

10,745 Ig

KH2PO4

4,0827g

Nước cất vừa đủ

1000,0ml

16

cấp.


2.5.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .

2.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzym.
a)

Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của enzym, protein bị thuỷ phân gải phóng ra các peptid

có các acid amin. Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid
tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall tạo màu tím hồng. Đo
quang phổ hấp thụ, ở bước sóng X =530nm, cuvet 1 cm.
b)

Tiến hành:
Pha lo ã n g a - C h y m o try p sin tro n g d u n g d ịc h NaCl 0,9% đ ế n độ p h a lo ã n g

thích hợp.
Tiến hành định lượng enzym theo bảng sau:
Bảng 2.1: Thể tích các thuốc thử đem dùng để xác định hoạt tính enzym.
Thuốc thử

Ống cơ chất ( ml)

Ống thử ( ml)

Dung dịch casein 1,2%

2,0

2,0

Dung dịch acid tricloaceticlO%

2,5

0

Dung dịch NaHCƠ3 2%

2,0

1,9

0

0,1

Dung dịch enzym pha loãng

Lắc đều các ống, ủ ấm ở nhiệt độ 40^^ c trong thời gian theo dõi thích
hợp. Sau thời gian ủ ấm cần thiết, thêm vào ống thử 2,5ml dung dịch acid
tricloacetic 10%. Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm các ồng lấy
tủa. Thêm vào mỗi ống 4ml thuốc thử Gornall, khuấy đều cho tan tủa. Để yên
ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng ?L=530 nm, cuvet
Icm.

17

Chú ý: Xác định khả

năng

thuỷ phân protein của a-chymotrypsin khi kết

hợp với Gich chiết saponin của thân cành lá kim ngân : cắn saponin tồn phần
được pha lỗng với nước cất thành các nồng độ thích hợp tạo thành dịch chiết
saponin kim ngân toàn phần.
Ống cơ c h ất: cho 2ml NaHCOj 2%
Ống thử : cho l,8ml NaHCOj 2% và 0,1 ml dịch chiết saponin.
Đơn vị hoạt động của enzym được tính là Katal hoặc ỊiKatal (1 ịikatal =
10 K atal). Katal là lượng enzym (a -chymotrypsin ) xúc tác thuỷ phân 1 mol
cơ chất ( casein) trong thời gian 1 giây.
Cơng thức tính kết quả như sau;
uK ^ A ..Ì06 g09 , B
ata.
y
"23600.103 . t . m
A

: Lượng casein bị thuỷ phân, tính bằng mg

B

: Hệ số pha lỗng của dịch enzym

23600 X 10^ : trọng lượng phân tử của casein, tính bằng mg.
209

: Số dây nối của một phân tử casein,

t

: thời gian thực hiện phản ứng, tính băng giây,

m

: Số lượng enzym đem thử, tính bằng mg.

2.5.2. Phưong pháp gây viêm.
Phương pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [20 ]: Tiêm 0.1 ml
d u n g d ịc h c a ư a g e n in 1 % v ào d ư ớ i b ề m ặ t g a n b à n c h â n p h ả i sau c ủ a c h u ộ t.

2.5.3. Phưofng pháp thử tác dụng chống viêm.
Sử dụng phương pháp đo độ phù chân chuột theo mơ hình của Winter [20]

18


Đo thể tích bàn chân sau của chuột tới khớp cổ chân vào thời điểm trước
khi ãêm thuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc.
- Lô chứng: chuột uống NaCl 0,9%
- Lô chuột thử dược liệu: Chuột được uống dịch chiết dược liệu bằng một
kim cong đầu tù vào các thời điểm thích hợp so với thời điểm gây viêm.
-

Lô

chuột

th ử

với

a-

C h y m o tr y p s in

: chuột

được

tiê m

m àng

bụng

a-chymotrypsin cùng thời điểm cho uống dịch chiết dược liệu.
- Lô thử tác dụng kết hợp: chuột được uống dịch chiết dược liệu và tiêm
m à n g b ụ n g a - C h y m o try p sin v ào

các th ờ i đ iể m n h ư c h u ộ t ở c á c lô c h u ộ t th ử

d ư ợ c liệ u và lô c h u ộ t th ử a - C h y m o try p sin

- Lô so sánh: chuột được uống indomethacin vào thời điểm 1 giờ trước
khi gây viêm.
Tính kết quả:

Tỷ lệ phần trăm độ tăng thể tích chân chuột so với thời điểm chưa gâv
viêm được tính theo cơng thức:
^ 100%

A v%
Trong đó:

A v% : phần trăm độ tăng thể tích chân chuột.
V,

: thể tích chân chuột trước khi gây viêm.

V,

: thể tích chân chuột sau khi gây viêm.

Từ đó tính ra trị số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột
trong cùng một lô và sai số chuẩn của nó: A v% ± SE.
Tính tỷ lệ % ức chế phù để đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính của
thuốc theo công thức:

19


AFc%-AFt%
1%

Trong đó:

=

.

t

7~ õ 7

A V c%

1% : Tỷ lệ ức chế phù.

AVcVo : Số trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lơ chứng.
AVt%

; Số trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lơ thử.

2.5.4. Phương pháp xử lý sô liệu.
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thơng kê tốn học với sự trợ giúp
của chương trình Exel.

20


Chương 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1.

ĐỊNH TÍNH SAPONIN KIM NGÂN TOÀN PHẦN

- Phản ứng tạo bọt: Cao đặc kim ngân cuộns thu được theo quy trình như
hình 2.1, hồ tan trong cồn ethylic, thành dung dịch đậm đặc ( dung dịch A).
+ Nhỏ vài giọt dung dịch A vào ống nghiệm đã chứa sẩn nước, lắc mạnh và
để yên. Sau 15 phút quan sát thấy cột bọt cao khoảng Icm.
+ Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N (
pH=l) và ống thứ hai 5 ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 5
giọt dung dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống trong một
phút và để yên. Quan sát thấy cột bọt trong hai ống cao ngang nhau và bền
như nhau. Từ đó sơ bộ xác định đây là saponin triterpenoid.
- Phản ứng phá huyết: 4-5g gelatin ngâm trong lOOml dung dịch NaCl 0,9%
rồi hâm nóng 50-60°C trên nồi cách thuỷ cho tan. Sau khi để nguội khoảng
40”c, thêm 8ml máu bò đã loại fibrin, trộn đều rồi đổ lên đĩa petri. Khi thạch
đã nguội và đông, dùng miệng ống nghiệm nhỏ đục thành lỗ trên đĩa thạch.
Sau đó rót vào các lỗ những dung dịch có chứa saponin . Để yên và quan sát
thấy vòng phá huyết xung quanh các lỗ.
Từ kết quả của các thí nghiệm trên chúng tơi có thể kết luận trong dịch
chiết butanol từ kim ngân cuộng theo quy trình hình 2.1 có chứa saponin.
3.2.

SẮC KÍ LỚP MỎNG:

- Dung dịch chấm sắc kí: cao đặc saponin hòa tan trong methylic để làm
dung dịch chấm sắc kí.
- Hệ dung mơi khai

triể n :

ethylacetat : m e th a n o l : nước ( 100: 23 :7)

21