Nghiên cứu phối hợp bromelain và anpha chymotrypsin với tỉ lệ thích hợp về hoạt độ enzym và độ bền hoạt tính để làm thuốc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
*1^ •$» «ỉ« «£# •£# *ĩ> «2# «2# %t# *£« *{#
#Ị^ #Ị% #Ị% rj% 0Ị% #J> «Ị% #Ị% •!% rj> #Ị> #J% r fi #J> #J> #J5 #J% ^Ị% ^Ị%
BỘ YTẾ
NGUYỄN ÍCH TUẤN
NGHIÊN CỨU PHỐI HỢP BROMELAIN VÀ a- CHYMOTRYPSIN
VỚI TỈ LỆ THÍCH HỢP VỂ HOẠT ĐỘ ENZYM VÀ ĐỘ BỂN
HOẠT TÍNH ĐỂ LÀM THUỐC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2001- 2006)
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Rư
Noi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh, Đại học Dược HN
Thời gian thực hiện: Tháng 5 năm 2006
ể ^ A e i ẹ v - ;
-r-/Ị^£>
HÀ NÔI. 5.2006
I
§
§
»D
I
MỤC LỤC
ĐẶT VÂN ĐỂ





1
PHẦN 1 TỔNG QUAN

2
1.1 Đại cương chung về protease 2
1.2 Bromelain 4
1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của bromelain 4
1.2.2 Cấu trúc không gian của bromelain



5
1.2.3 Tính chất của bromelain



6
1.2.4 Hoạt tính của bromelain—


7
1.2.5 Tác dụng dược lý của bromelain

9
1.3 a - Chymotrypsin


13
1.3.1 Cấu trúc của Chymotrypsin

13
1.3.2 Tính chất của Chymotrypsin 13
1.3.3 Sự hoạt hoá chymotrypsinogen

14
1.3.4 Cơ chế hoạt động của a - Chymotrypsin

15
1.3.5 Tính đặc hiệu của a - Chymotrypsin

16
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ -

-

18
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu


18
2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

18
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu -


21
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét

- 26
2.2.1 Chiết, tách và tạo chế phẩm bromelain từ Dứa

26
2.2.2 Xác định hoạt độ protease của bromelain tinh


28
2.2.3 Xác định hoạt độ enzyme của a - Chymotrypsin


— 30
2.2.4 Xác định tỉ lê phối hợp thích hợp của bromelain và AC

31
2.2.5 Nghiên cứu độ bền hoạt độ của hỗn hợp enzym



31
2.3 Bàn luận



36
PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 39
3.1 Kết luận


39

3.2 Đề xuất



40
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
AB,
AC
ĐHQGHN
ĐHQGTPHCM
NXB KH & KT
NXB YHHN
PGE,
PGG,
PGHo
Hỗn hợp AC và B3 tỉ lộ AC/B3 = 1 1
a - Chymotrypsin
Đại học quốc gia Hà Nội
Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật
Nhà xuất bản y học Hà Nội
Prostaglandin E2
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
ĐẶT VÂN ĐỂ
Trong những năm gần đây các chế phẩm enzym được dùng làm thuốc
ngày càng nhiều và có nhiều chế phẩm đã phát huy hiệu quả điều trị cao. Viên a-
chymotrypsin là một ví dụ, sản phẩm này đã được sản xuất dưới dạng tiêm và
uống. Số lượng viên a - Chymotrypsin được bán ở trên thị trường Việt Nam đạt tới
hàng chục triệu viên/tháng. Chỉ định chính của viên này là chống viêm và phù nề.

Tuy vậy chúng ta đang phải nhập a- Chymotrypsin ở dạng nguyên liệu và thành
phẩm, do đó không chủ động được trong sản xuất và người bệnh phải chịu giá
thuốc cao. Hơn nữa việc bảo quản a- Chymotrypsin đòi hỏi dưới 10°c, trong khi
đó đa số các hiệu thuốc trong nước không đáp ứng được điều này do vậy chế
phẩm khó có thể đảm bảo về hoạt tính.
Nhằm khắc phục được những đặc điểm trên, một mặt chúng ta tiến
hành nghiên cứu nhiệt đới hoá chế phẩm a- Chymotrypsin. Mặt khác tiến hành
nghiên cứu các chế phẩm enzym khác có tác dụng điều trị tương tự nhưng lại có
độ bền hoạt tính enzym cao phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa của
nước ta. Để có thể thay thế từng phần tiến tới thay thế hoàn toàn a-
chymotiypsin.
Chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cứu phối hợp
brom eỉain và a - Ch ym otrypsin với tỷ lệ thích hợ p về hoạt đ ộ en zy m và độ
bền hoạt tính để làm thuốc” là để nhằm mục đích:
1 Tạo ra một số chế phẩm bromelain từ cây dứa (Ananas comusa).
2 Xác định được tỉ lệ thích hợp về hoạt độ protease khi phối hợp hai
chế phẩm enzym.
3 Đánh giá được độ bền hoạt tính của hỗn hợp enzym.
PHẨN 1 TỔNG QUAN
1.1 Đại cương chung về protease
— Protease là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid trong
phân tử và các cơ chất tương tự.
— Nhiều protease có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển
acid amin.
— Phân loai quốc tế protease được chia làm 4 phân nhóm phụ:
+ Phân nhóm phụ 3.4.1: gồm các aminopeptid do hydrolase
(aminopeptidase) xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid.
+ Phân nhóm 3.4.2: gồm các enzym peptidil aminoacid hydrolase
(cacboxylpeptitdase) xúc tác cho sự thuỷ phân liên kết ở đầu mạch c của
polypeptid.

+ Phân nhóm phụ 3.4.3: gồm các enzym dipeptid - hydrolase xúc tác
cho sự thuỷ phân dipeptid.
+ Phân nhóm phụ 3.4.4: gồm các enzym dipeptidil - peptid hydrolase
các enzym này xúc tác cho sự thuỷ phân các liên kết peptid nội mạch.
— Phân loai dưa trẽn các nhóm chức hoat đổng trong trung tâm hoạt
động người ta chia protease thành 4 nhóm:
+ Nhóm Serinic: có nhóm -OH hoạt động là của serin. Các enzym này
hoạt động mạnh trong khoảng pH € (7; 11).
+ Nhóm Thiolic: có nhóm hoạt động là SH
+ Nhóm chứa kim loại: có các kim loại tham gia vào các phần hoạt
động xúc tác, hoạt động mạnh trong khoảng pH € (6,5;7,5).
+ Nhóm protease - acid: thường có nhóm hoạt động là nhóm cacboxyl,
hoạt động mạnh trong khoảng pH € (1,5;5).
— Phân loai dưa trẽn vùng pH hoat đổng phân ra: protein kiềm, trung
tính, acid. Tuy nhiên nó chỉ có ý nghĩa thực dụng vì pH tối thích của mỗi enzym
phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: bản chất cơ chất
+ Protease acid: renin, pepsin
+ Protease trung tính: amylase, papain
+ Protease kiềm: tiypsin, chymotrypsin
— Phân loai dưa trẽn nguồn gốc chia ra làm 3 loại:
+ Protease thực vật.
+ Protease động vật: được tách ra từ những thành phẩn khác nhau trẽn
cơ thể động vật.
+ Protease vi sinh: hệ thống rất phức tạp gồm nhiều enzym giống nhau
về cấu trúc, trọng lượng và hình dạng phân tử, thường có trọng lượng phân tử
thấp, chủ yếu từ nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn.
— Phân loai dưa vào vi trí tác dung của protease trên liên kết peptid của
phân tử protein [3]:
+ Endopeptidase: chủ yếu phân giải các liên kết peptid nằm trong
protein. Phân cắt những đoạn peptid có khối lượng phân tử nhỏ (polypeptid mạch

ngắn, pepton . . .)• Nhóm các protease tiêu hoá chủ yếu ở người và động vật:
pepsin và renin trong dịch dạ dày, trypsin và chymotrypsin của tuyến tuỵ và niêm
mạc ruột non đều thuộc nhóm này.
+ Exopeptidase: chủ yếu cắt các liên kết peptid ở hai đầu mạch, vd:
nhóm carboxylpeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptid từ hai đầu
mạch polypeptid có nhóm carboxyl và amin tương ứng, ngoài ra còn có
dipeptidase phân giải dipeptid thành các acid amin tự do.
OH
N H -C H -
2 I
R
1
Endopeptidase
H
c o — NH CH

NHCHCO — NHCHCO — NHCHCO"NHCHCOOH
Amino peptidase
HO
HO
R.
H
H
Carboxy peptidase
Exopeptidase
Hình 1: VỊ trí tác dụng của protease trên liên kết peptid của phân tử protein
1.2 Bromelain
1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của bromelain
— Bromelain (EC 3.4.22.3.2) là tên gọi chung cho nhóm enzym thực
vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein, được thu nhận từ họ

Dứa (Bromeliaceae), đặc biệt là ở thân và trái cây dứa.
— Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3
manóse, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrat carbon này dường như
một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử.
— Khi phân tích thành phần aminoacid ở bromelain thân và bromelain
quả thì tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành
phần acid amin thay đổi khác nhau. Bromelain thân có thành phần aminoacid
thay đổi trong khoảng 321 - 144 aminoacid và bromelain quả là 283 - 161
aminoacid.
— Bromelain thân là một chuỗi polypeptid có aminoacid ở đầu là valin
đầu N và Glycin đầu c.
1.2.2 Cấu trúc không gian của bromelain
— Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc một của bromelain và
nhận thấy cách sắp xếp aminoacid trong phân tử bromelain như sau [3]:
Ser- Val - Lys - A sn- P ro- Cys - G ly- A la- C ỵs- T ryp-
-G ly -C y s-L ỵ s-
— Bromelain (EC 3.4.22.3.2) là một protease, trong trung tâm hoạt
động có chứa cystein và hai chuỗi polypeptid liên kết với nhau bằng cầu nối
—s—S—. Phân tử có dạng hình cầu do đó cách sắp xếp phức tạp.
— Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulữiydryl có vai trò
chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfit.
Ngoài ra trong phân tử còn có các ion có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc
không gian của enzym.
1.2.3 Tính chất của bromelain
— Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelain thân dứa được
Murachi và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau [3];
Hằng số sa lắng
s
2,73S
Hằng số khuyếch tán

D
7,77x10-' cm"
Thể tích riêng phần V
0,743ml/g
Độ nhớt bên trong
[1]
0,039dl/g
Tỷ số ma sát
f/fo
1,26
Điểm đẳng điện
pl
9,55
Sự hấp thu
A'^^Ở 280 nm
20,1
Trọng lượng phân tử
33.20*
32.100**
35.500***
tính bằng phương pháp sa lắng khuếch tán
tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
tính bằng phương pháp Archibald
Bảng 1: Những tính chất vật lý của bromelain thân
1.2.4 Hoạt tính của bromelain
1.2.4.1 Hoạt tính enzym của bromelain
— Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.
Bromelain thân có hoạt tính enzym với nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thuỷ
phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp.
Cơ chất

Hoạt tính phân giải casein (Ul/mg)
Bromelain thân Bromelain quả xanh
Bromelain quả chín
Casein 7.4
4.0 3.0
Bảng 2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain [3]
— Đối với cơ chất là casein, hoạt tính enzym của bromelain thân cao
hơn bromelain quả xanh và bromelain quả chín.
— Nước chiết vỏ dứa có chứa nhiều bromelain hơn nước chiết quả dứa,
hoạt tính bromelain trong phần lõi dứa cao gấp 8 - 20 lần ở quả [1].
— Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa, nó có khả năng thuỷ
phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6 - 8 . Bromelain có hoạt tính xúc tác sự
phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc
họ Sung.
— Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzym của bromelain kể từ 3 tháng
trước khi chín và đạt cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín
hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn.[3 ]
— Bromelain còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có thể
thu được 3.6Kg bromelain từ 3781 nước rút ra từ thân cây dứa).
— Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelain chịu ảnh
hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ,
pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp tinh khiết
— Thể thương mại: thể huyền phù trong amoni sulfat 3.2M, pH= 6 [6 ].
— Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản
ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc
vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, thời
gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hoá [3]
+ Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau,
bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng thuỷ
phân của bromelain là mạnh hcm papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính

của bromelain tương tự như papain. Đối với các chất tổng hợp như BAA
(Benzoyl-L-Arginin ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn
papain.
+ Ảnh hưởng bởi nhiêt đỏ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố như: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những
thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ
chất, dạng tồn tại của enzym.
+ Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính
xúc tác của enzym. pH tối thích của enzym không ổn định mà phụ thuộc vào
nhiệt độ, thòi gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của
enzym, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất hoạt hoá.
Khi thu nhận bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium
sulfat thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 - 5,4.
1.2.4.2 Các yếu tô ảnh hưỏng đến hoạt tính của bromelain
Bromelain thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao ở pH 6,0 và 8,0. ổn
định ở pH 3,5 - 5,6 với nhiệt độ 63°c. Enzym đã tinh sạch chỉ còn 60 - 70% hoạt
tính. Bromelain có biên độ pH rộng 3 -1 0 nhưng pH tối thích của enzym là 5 - 8
tuỳ thuộc vào cơ chất.
+ Ảnh hưởng bởi các ion kim loai: các ion kim loại có ảnh hưỏfng đến
hoạt tính của enzym do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của
enzym. Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của bromelain và
mức độ kìm hãm thay đổi tuỳ theo nồng độ muối.
Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelain do chúng kết
hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzym.
+ Ảnh hưởng bởi trang thái và điều kiên bảo quản:
Tình trạng
Hoạt tính (Ul/mg protein)
Dịch chiết
Đông khô
Nguyên liệu tươi

1.600
1.150
Bảo quản ở 4°c trong 5 ngày
830
630
Sấy khô ở 40°c
1.880
1.360
Bảng 3: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính
của bromelain [3]
— Bromelain có vai trò trong y học nên đã được nghiên cứu nhiều.
Bromelain là enzym thuỷ phân protein, thuộc nhóm protease thực vật. Một trong
những lợi ích của nó được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hoá vì nó hoạt
động ở môi trường acid trong dạ dày và cả trong môi trường kiềm của ở ruột non.
Bromelain có thể thay thế được cho những enzym tiêu hoá khác như pepsin và
trypsin. Bromelain có tác dụng kháng viêm rất hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm
thấp khớp, do đó các chuyên gia y tế sử dụng bromelain như chất làm giảm đau
kháng viêm và giảm sưng. Và đến năm 1963 đã được sử dụng như một dược
phẩm dùng trong lâm sàng. Hiệu quả của bromelain là
là m g iả m lư ợ n g
prostaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh
dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm. Bromelain có ảnh
hưởng tích cực trên các prostaglandin hữu dụng[3].
1.2.5 Tác dụng dược lý của bromelain
10
Cell Membrane
Phospholipase ^ & c
Giải phóng acid arachidonic'
từ màng tế bào
Acid arachidonic

Cyclooxygenase-
(NSAIDs và aspirin)
Plasminogen
Hoạt hoá bởi bromelain
ức chế giải phóng acid arachidc
VG(ị
Thromboxane
Thromboxane synthetase
(Có thể bị ức chế bởi bromelain)
PGH2 ► PGE^
Endoperoxide E-somerase
(Bị ức chế bởi bromelain)
PGF,
Hình 2: Ảnh hưởng của bromelain trên quá trình tổng hợp prostaglandin
— Bromelain có tác dụng ức chế quá trình viêm, giảm phù nề và tụ
huyết (papain không có tác dụng chống viêm). Bromelain khi được bôi lên các
vết thương hoặc vết bỏng sẽ có tác dụng làm tiêu các tổ chức chết, mau thành
sẹo.
11
— Quercetin có tác dụng chống viêm do làm giảm lượng histamin giải
phóng ra, mà bromelain làm tăng hấp thu quercetin vì vậy khi dùng kết hợp 2
hoạt chất này sẽ làm tăng tác dụng chống viêm của quercetin.[13]
— Bromelain có tác dụng làm giảm ỉa chảy và mất nước do nhiễm
E.coli, do bromelain tấn công vào cùng một receptor trên thành dạ dày như
E.coli.
— Bromelain là một enzym chống viêm tự nhiên, tác dụng giống như
NSAIDs và các thuốc ức chế COX2, dựa trên các tác dụng:
+ Khoá các sản phẩm của prostaglandin gây đau và sưng.
+ Phá huỷ cục máu đông vốn làm cản trở tuần hoàn máu.
— Bromelain còn được sử dụng điều trị cúm, cảm lạnh và nhiễm trùng

tai, làm loãng đờm giúp dễ khạc đờm ra.
— Bromelain có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật.
Nồng độ cao nhất của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy
nhiên hoạt động thuỷ phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác
động của các protease nội sinh và yếu tố a- 2 - macroglobulin của huyết thanh.
— Liều sử dụng bromelain phụ thuộc vào mục đích sử dụng [14]
+ Giúp tiêu hoá: 500mg/ngày chia liều cùng với bữa ăn.
+ Chấn thương: 500mg/4 lần/ngày, uống khi dạ dày rỗng
+ Chống viêm: 500- 2000mg/ngày chia làm 2 liều
Không dùng quá 8-10 ngày trong một đợt điều trị
— Chú ý khi sử dụng [15]:
+ Khi dùng liều bình thường, bromelain khá an toàn và hầu như không
có các tác dụng ngoài ý muốn
+ Khi dùng liều cao, các tác dụng ngoài ý muốn có thể gặp phải là:
nôn, buồn nôn, ỉa chảy.
12
1.3 a - Chymotrypsin
— Chymotrypsin (EC 3.4.21.1) là một protease được tiết ra từ tuyến
tuỵ. Đây là một protease kiềm tính quan trọng sau trypsin, Chymotrypsin được
tiết ra từ tuyến tuỵ dưới dạng không hoạt động đó là chymotrypsinogen, sau đó
chymotrypsinogen được chuyển sang dạng hoạt động là Chymotrypsin nhờ tác
dụng của trypsin.
1.3.1 Cấu trúc của Chymotrypsin
— Cờu trúc của Chymotrypsin được xác định vào năm 1967, do David
và các cộng sự phân tích tinh thể enzym bằng tia X. Chymotrypsin là protease
đầu tiên được biết rõ cấu trúc. Chymotrypsin được cấu tạo từ 3 chuỗi polypeptid
[3]:
Chuỗi A: Các aminoacid từ 1- 13
Chuỗi B: Các aminoacid từ 16-146
Chuỗi C: Các aminoacid từ 149- 245

— Các sợi này liên kết với nhau bởi cầu nối disulfit. Sự hiện diện của
cầu nối disulfit là một đặc trưng của những protein có thể thể hiện hoạt tính
ngoại bào. Các sợi polypeptid liên kết với nhau tạo thành dạng hình cầu. Cấu trúc
thứ cấp của enzym có dạng beta. Enzym có bộ 3 aminoacid xúc tác phản ứng là
Serl95- His57- Aspl02. Những aminoacid này tạo thành vị trí hoạt động của
protein hỗ trợ cho hoạt động xúc tác.
1.3.3 Tính chất của Chymotrypsin
— ơiymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi
trường kiềm nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự trypsin.
Chymotrypsin hoạt động trong điều kiện pH 7 - 9 và pH tối ưu là 8 - 9, điểm
13
đẳng điện pl= 5,4. pH5 không thuận tiện cho hoạt động của Chymotrypsin nhưng
ở pH này Chymotrypsin lại bền vững hơn trong môi trường pH8 .
— Trong ruột, Chymotrypsin thuỷ phân protein và các sản phẩm đã tiêu
hoá một phần bởi pepsin để tạo ra các peptid ngắn và các aminoacid tự do. Hoạt
tính của Chymotrypsin tưoỉng đối yếu hơn trypsin nhưng nó lại có khả năng thuỷ
phân protein sâu sắc hofn.
1.3.3 Sự hoạt hoá chymotrypsinogen
— Trong quá trình chymotrypsinogen được chuyển hoá thành
Chymotrypsin hoạt động nhờ trypsin có xuất hiện trung tâm hoạt động của
enzym. Khi trypsin phân cắt liên kết giữa 2 aminoacid 15 (Arginin) và 16
(Isoleucin) trong chuỗi polypeptid sẽ tạo thành pi- Chymotrypsin có hoạt tính
thuỷ phân nhưng không bền. Đây là enzym có hoạt động tích cực nhất trong các
dạng khác nhau của Chymotrypsin. Sau đó trypsin tiếp tục cắt đứt liên kết giữa
aminoacid 14(Serin) và 15(Arginin) để tạo ra Chymotrypsin. Sau cùng tách một
đoạn dipeptid của đoạn aminoacid 148 và 149 (Threonin và Asparagin) sẽ hình
thành a- chymotryspin là một cấu trúc được giữ bằng 5 cầu nối disulfur. Sự thay
đổi này tạo lên trung tâm hoạt động của enzym [3].
— Từ dịch tuỵ bò có thể thu nhận được 2 loại chymotrypsinogen A và
B. Hai loại này có số lượng gần bằng nhau và bằng khoảng 16% protein trong

dịch tuỵ.
— Chymotrypsinogen A là một trong những protein đã được biết đến
nhiều nhất. Nó được chiết tách từ tuỵ tạng bò ở pH acid. Sau khi phân đoạn bằng
ammonium Sulfat thì nó bị tinh thể hoá dễ dàng (chymotrypsinogen A bị tinh thể
hoá rất mạnh trong ammonium Sulfat và trong ethanol).
14
— Khi chymotrypsinogen A được hoạt hoá sẽ tạo ra các dạng anpha,
beta, gama, pi Chymotrypsin B được hoạt hoá thành dạng Chymotrypsin B hoạt
động. Các enzym anpha, beta, gama - Chymotrypsin có tính đặc hiệu và có hoạt
tính đối với một số cơ chất rất giống nhau do đó khó phân biệt được chúng về
mặt enzym. Tuy nhiên chúng lại khác nhau về tính chất protein, dạng tinh thể, độ
hoà tan, trọng lượng phân tử
1.3.4 Cơ chê hoạt động của a - Chymotrypsin
— Chymotrypsin xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid của các phân tử
protein. Nó phân cắt chọn lọc những liên kết peptid trong chuỗi polypeptid ở vị
trí đầu — c của aminoacid có nhân thơm (Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin).
Hoạt động xúc tác diễn ra như sau [3];
+ Cơ chất khuyếch tán đến trung tâm hoạt động của enzym, các
aminoacid có nhân thơm gắn vào vị trí liên kết của cơ chất theo kiểu mà liên kết
peptid sẽ bị cắt có mặt tại vị trí gần trên bộ ba xúc tác,
+ Sau khi liên kết với cơ chất, proton của Serl5 bị His57 thu lấy và
kết quả là His57 trở thành điện tích dương và điện tích này được trung hoà bỏd
điện tích âm trên Aspl02. Serl95 mất đi proton nên mang điện tích âm do đó nó
có khả năng tạo vị trí kết nối phân tử trên liên kết peptid.
— Nguyên tử oxy của Serl95 tạo kết nối với c của nhóm carbonyl của
cơ chất tạo thành một liên kết theo kiểu hình tứ diện (một nguyên tử c tạo liên
kết với bốn nguyên tử c khác) đây là một dạng trung gian. Nguyên tử oxy của
cơ chất mang điện âm và được trung hoà bởi các điện tích dưoỉng trên hai nhóm
amin của enzym, như vậy cơ chất tạm thời tạo mối liên kết đẳng tậ với enzym.
+ Trạng thái trung gian này bị phá vỡ khi liên kết peptid (C - N) bị cắt

đứt, phần mang đầu C- của cơ chất khuyếch tán ra khỏi trung tâm hoạt động của
15
enzym và mang theo nó proton của His57. Nhưng đầu N của cơ chất vẫn còn tạo
liên kết đẳng trị và trạng thái này gọi là acyl trung gian.
+ Một phân tử nước khuyếch tán đến trung tâm phản ứng của enzym
và tạo liên kết hydrogen với His57. His lấy một proton và tích điện dương, điện
dương này được trung hoà bởi Aspl02. Nguyên tử oxy của phân tử nước tách ra
và mang điện tích âm.
+ Một liên kết theo kiểu hình tứ diện trung gian thứ hai được tạo thành,
lúc này phân tử nước tấn công vào cơ chất. Một lần nữa cơ chất mang điện tích
âm và được trung hoà bởi điện tích trên enzym (ở vị trí nguyên tử oxy tách ra gọi
là lỗ anion oxy), His57 giữ lại phân tử nước.
+ Liên kết theo kiểu tứ diện trung gian này bị phá vỡ tạo ra đầu C- ở
phần còn lại của cơ chất và cơ chất tách ra. Proton trên His57 chuyển ngược lại
Serl95. Enzym được trở lại trạng thái cũ và chuẩn bị thực hiện phản ứng xúc tác
trên một cơ chất khác.
1.3.5 Tính đặc hiệu của a- Chymotrypsin
— Chymotrypsin hoạt động như một endopeptidase phân cắt mạch
polypeptid thành các peptid ngắn và tác dụng trên những liên kết mà trypsin
không phân cắt. Những liên kết được tạo thành bởi nhóm carboxyl của aminoacid
có nhân thơm như Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin với nhóm amin của
aminoacid khác [3].
16
co
-N H - C H - C O N H -C H

► - C O - N H - C H -
COOH
OH'
R,

¥ •
•C H -
R
2
+ Trong đó: Rj- gốc aminoacid có nhân thơm (Tyr, Trp, Phe)
Rj- gốc aminoacid bất kỳ
Hình 3: Hoạt tính thuỷ phân protein của a - Chymotrypsin
17
ĩ.'
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.1.1 Nguyên liệu
— Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromeliaceae
được Christopher Columbus tìm thấy trên hòn đảo của Guadeloupe năm 1493 và
mang về trồng tại Tây Ban Nha. Đến những năm 1600, cây dứa đã rất phổ biến ở
Châu Âu. Đến thế kỷ 16 - 17, cây dứa đã được phân bố rộng dãi đến các nước Ấi
và ơiâu Phi, các đảo vùng Thái Bình Dương [18]. Hiện nay, ở nước ta loại dứa
được trồng nhiều nhất là Ananas comusa được sử dụng như nguồn thực phẩm
tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzym và ngoài ra còn được sử dụng trong một
số lĩnh vực khác như dược, mỹ phẩm .Phần thân và lá sau khi thu hoạch quả có
thể sử dụng làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón.
— Trong quả dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng nước 80 - 8 6 %,
phần còn lại là carbonhydrat chiếm 10 - 18% (trong đó 60 - 70% saccharose,
glucose và fructose chiếm 30 - 40%), protein 2 - 3%, acid hữu cơ 0.1 - 1.6%
(trong đó acid citric chiếm 87% và còn lại là maleic acid), tro 0.3%, sắc tố 0.03 -
0 .6 % và các hợp chất phenolic (tạo màu), các hợp chất tạo mùi, các vitamin như:
vitamin A (0.3mg caroten/lOOg thịt quả), BI và vitamin c (8.5mg/100g thịt quả).
Ngoài ra ở lá non trên ngọn cây dứa có chứa rất nhiều vitamin c [3].
+ Enzym bromelain (Bj và B3) do Viện nghiên cứu khoa học Việt Nam

cung cấp (B2 là bromelain chưa tinh, B3 là bromelain đã tinh chế).
+ Enzym a - chymotrypsin tinh khiết 1100 USP/lmg (USP 25).
18
2.1.1.2 Hoá chất và thuốc thử
— Dung dich Casein 0,6%: cân chính xác khoảng 0,6g casein tinh khiết
cho vào cốc có mỏ. Thêm dung dịch đệm citro - phosphat pH= 7,2 vừa đủ lOOml.
Đun cách thuỷ trong 60 phút, vừa đun vừa khuấy, sau đó lọc qua gạc.
— Dung dich cvstein Q.Q4M: hoà tan 0,49g cystein vào 90ml dung dịch
đệm citro - phosphat pH= 7,2, sau đó thêm cho vừa đủ lOOml (pha trước khi
dùng).
— Dung dich đêm citro - phosphat pH= 7.2 [10]
Phối họfp 87,0 ml dung dịch Na2HP04 7,15% và 13,0 ml dung dịch
acid citric 2,1% được lOOml dung dịch đệm.
— Dung dich đêm citro - phosphat pH= 6.0 [10]
Phối hợp 63,2ml dung dịch Na2HP04 7,15% và 36,8ml dung dịch acid
citric 2,1% được lOOml dung dịch đệm
— Dung dich đêm acetat pH = 4.8 [5]
+ Dung dịch acid acetaic 0.2M: 11.55ml CH3COOH đặc dẫn nước đến
lOOOml.(a)
+ Dung dịch natri acetat 0.2M: 16.4g CHgCOONa được hoà tan dẫn
đến lOOOml nước.(b)
+ Phối hợp dung dịch (a) 20 ml
dung dịch (b) 30 ml
nước cất vđ 100 ml
— Dung dich trichloroacetic 10%
Acid trichloroacetic lOg
Nước cất vừa đủ lOOml
— Thuốc thử Gomall [9]
19