Nghiên cứu biện pháp bảo tồn quỹ gen virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 dạng tươi ở - 86 độ C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM







TRẦN THỊ THU HẰNG



NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP BẢO TỒN QUỸ GEN
VIRUS VIÊM GAN VỊT NHƯỢC ĐỘC DH - EG - 2000
DẠNG TƯƠI Ở -86
0
C



CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y
MÃ SỐ : 60.64.01.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN

HÀ NỘI - 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kì công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được
chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn


Trần Thị Thu Hằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin nói lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Nguyễn
Bá Hiên - người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực tập và hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ sự biết on đến các Thầy, Cô trong Bộ môn
Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và
các cán bộ phòng Thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo
điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài một cách tốt nhất.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn Cơ quan, những người thân trong
gia đình, bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và

thực hiện đề tài nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên


Trần Thị Thu Hằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan I
Lời cảm ơn II
Mục lục III
Danh mục chữ viết tắt VII
Danh mục bảng biểu VIII
Danh mục hình X
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Bệnh viêm gan vịt 3
1.1.1 Tình hình bệnh viêm gan vịt trên thế giới và tại Việt Nam 3
1.1.2 Đường xâm nhập và cách lây lan 4
1.1.3 Cơ chế gây bệnh 6
1.1.4 Triệu chứng và bệnh tích 6
1.1.5 Chẩn đoán 8
1.1.6 Biện pháp can thiệp và phòng bệnh viêm gan vịt 9
1.2 Một số đặc tính sinh học của virus gây bệnh viêm gan vịt 11
1.2.1 Hình thái, kích thước và phân loại virus viêm gan vịt 11
1.2.2 Cấu trúc virus viêm gan vịt 11

1.2.3 Sức đề kháng 14
1.2.4 Đặc tính nuôi cấy 15
1.3 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 17
1.3.1 Miễn dịch thụ động 18
1.3.2 Miễn dịch chủ động 19
1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử 19
1.4.1 Phản ứng RT - PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain
Reaction) 19
1.4.2 Kỹ thuật điện di 21
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 22
2.1 Nội dung nghiên cứu. 22
2.1.1 Kiểm tra một số đặc tính sinh học của chủng gốc virus viêm gan vịt
nhược độc DH - EG - 2000 22
2.1.2 Giám định chủng gốc virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000
bằng RT - PCR 22
2.1.3 Nghiên cứu đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của
chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 22
2.1.4 Nghiên cứu các điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH
- EG - 2000 22
2.2 Nguyên liệu: 23
2.2.1 Chủng virus: 23
2.2.2 Phôi trứng 23
2.2.3 Động vật thí nghiệm 23
2.2.4 Dụng cụ và hóa chất phòng thí nghiệm 23
2.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu. 24
2.4 Phương pháp nghiên cứu. 24

2.4.1 Phương pháp xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng
virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 24
2.4.2 Phương pháp xác định chỉ số ELD
50
(liều gây chết 50% phôi) của
chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 24
2.4.3 Phương pháp xác định chỉ số EID
50
(liều gây nhiễm 50% phôi) của
chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 25
2.4.4 Phương pháp giám định chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH -
EG - 2000 bằng kỹ thuật RT - PCR 26
2.4.5 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT - PCR bằng điện di trên thạch
agarose 27
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v

2.4.6 Qui trình sản xuất hỗn dịch kháng nguyên từ chủng virus viêm gan
vịt nhược độc DH - EG - 2000 (vacxin) 27
2.4.7 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng 28
2.4.8 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn 29
2.4.9 Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực và khả năng đáp ứng miễn dịch của hỗn
dịch kháng nguyên bằng phương pháp công cường độc. 30
2.4.10 Kiểm tra hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên bằng phản ứng trung hòa
trên phôi gà 30
2.4.11 Nghiên cứu các điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH
- EG - 2000 33
2.4.12 Phương pháp xử lý số liệu 34
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35
3.1 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh học của chủng virus viêm gan

vịt nhược độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo tồn 3 năm ở -86
0
C. 35
3.1.1 Khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus viêm gan vịt nhược
độc DH - EG - 2000 trên phôi gà sau thời gian bảo tồn. 35
3.1.2 Xác định chỉ số ELD
50
của chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH
- EG - 2000. 37
3.1.3 Xác định chỉ số EID
50
của chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH
- EG - 2000. 39
3.2 Kết quả phản ứng RT - PCR 41
3.3 Kết quả kiểm tra vô trùng hỗn dịch kháng nguyên 42
3.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên 43
3.5 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực và khả năng đáp ứng miễn dịch
của virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 44
3.6 Kết quả xác định khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm
hỗn dịch kháng nguyên viêm gan vịt 48
3.7 Nghiên cứu điều kiện bảo tồn virus viêm gan vịt nhược độc DH
- EG - 2000 50
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

3.7.1 Nghiên cứu chọn lọc môi trường thích hợp để bảo quản virus viêm
gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 50
3.7.2 Nghiên cứu chọn lọc phương pháp thích hợp để bảo quản virus
viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 51
3.7.3 Nghiên cứu xác định thời gian bảo quản hỗn dịch kháng nguyên của

virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 53
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
Kết luận 55
Kiến nghị 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
PHỤ LỤC 61
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA complementary DNA
BEI Binary Ethylenimine
B
p

Base pair (s)

DNA Acid DeoxyriboNucleic
DVH Duck Virus Hepatitis
ĐVTH Đơn vị trung hòa
E. coli Escherichia coli
EID
50
50 percent Embryo Infectious Dose
ELD
50
50 percent Embryo Lethal Dose
GOT Glutamate - Oxaloacetate - Transaminase
GPT Glutamate - Pyruvat - Transaminase

IRES Internal Ribosome Entry Site
Kb Kilobase
LD
50
50 percent Lethal Dose
Ml Mililit
Mg Miligam
N
m

Nanomet

ORF Open Reading Frame
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Axít Ribonucleic
RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction
UI Unit Interval
UTR Untranslated Region
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

STT Tên bảng Trang

2.1 Thành phần phản ứng RT - PCR và chu trình nhiệt trong nghiên
cứu phân tử virus viêm gan vịt 26
3.1 Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000
trên phôi gà 35
3.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể trên phôi sau khi gây nhiễm virus

viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 36
3.3 Kết quả xác định chỉ số ELD
50
của chủng virus viêm gan vịt nhược
độc DH - EG - 2000 38
3.4 Kết quả xác định chỉ số EID
50
của chủng virus viêm gan vịt nhược
độc DH - EG - 2000 40
3.5 Kết quả kiểm tra vô trùng hỗn dịch kháng nguyên virus viêm gan
vịt nhược độc DH - EG - 2000 43
3.6 Kết quả kiểm tra trong phòng thí nghiệm về chỉ tiêu an toàn của
hỗn dịch kháng nguyên chế từ virus viêm gan vịt nhược độc DH -
EG - 2000 44
3.7 Kết quả xác định hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên chế từ virus
viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bằng phương pháp công
cường độc 47
3.8 Kết quả kiểm tra hiệu lực hỗn dịch kháng nguyên bằng phản ứng
trung hòa trên phôi gà 48
3.9 Kết quả kiểm tra chỉ số ELD
50
của chủng virus viêm gan vịt nhược
độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản bằng những môi
trường khác nhau ở -86
0
C 51
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ix

3.10 Kết quả kiểm tra chỉ số ELD

50
của chủng virus viêm gan vịt nhược
độc DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản bằng các phương pháp
khác nhau ở -86
0
C 52
3.11 Kết quả kiểm tra chỉ số EID
50
của virus viêm gan vịt nhược độc
DH - EG - 2000 sau thời gian bảo quản khác nhau 53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page x

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc không gian của picornavirus 12
1.2 Sơ đồ hệ gen và chuỗi polypeptide của virus viêm gan vịt 13
1.3 Phản ứng RT - PCR 20
3.1 Phôi gà nhiễm virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000: phôi
xuất huyết, còi cọc, gan sưng và xuất huyết (trái) và phôi gà đối
chứng (phải) 37
3.2 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của virus viêm gan vịt nhược
độc DH - EG - 2000 trên thạch agarose 1%. 41
3.3 Tư thế nằm chết của vịt 46
3.4 Gan vịt xuất huyết khi nhiễm virus viêm gan vịt cường độc 46

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan do virus ở vịt (Duck Viral Hepatitis) là bệnh truyền nhiễm
cấp tính, lây lan mạnh, xảy ra chủ yếu ở vịt con dưới 3 tuần tuổi và nặng nhất
ở vịt con từ 1 - 7 ngày tuổi, gây tử vong 80 - 90% đàn vịt.
Trên thế giới bệnh viêm gan virus ở vịt đã gây nhiều thiệt hại cho đàn
vịt nuôi. Năm 1949, ở Long Island (Mỹ), Levine và Fabricant đã phát hiện
bệnh trên đàn vịt Bắc Kinh ở 70 trại vịt lớn. Tổng số vịt con chết trong vụ
dịch lên đến 750.000 con (Levine và Fabricant, 1950). Sau đó bệnh được phát
hiện trên thế giới.
Ở Việt Nam, năm 1978, Trần Minh Châu và cộng sự đã ghi nhận có
bệnh viêm gan virus ở vịt. Kể từ đó đến nay, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương
gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ chăn nuôi vịt. Theo quyết định số
63/2002/QĐ-BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn, bệnh viêm gan virus ở vịt được xếp vào danh mục các bệnh
nguy hiểm của động vật.
Để phòng chống bệnh hiệu quả, việc thu thập và lưu giữ nguồn gen của
các virus gây bệnh với mục đích cung cấp giống cho việc chế tạo kháng
nguyên, kháng huyết thanh dùng trong chẩn đoán nhanh bệnh; lựa chọn các
chủng cường độc tiêu chuẩn phục vụ cho nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin và
đặc biệt là tạo ra các chủng tiêu chuẩn, có đặc tính sinh học đặc trưng và ổn
định để tạo ra chủng giống sản xuất vacxin là việc làm cần thiết.
Hiện nay, bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam đang bảo quản giống virus viêm gan vịt nhược độc
DH - EG - 2000 phục vụ cho việc nghiên cứu và sản xuất vacxin viêm gan vịt.
Các chủng virus nếu không được bảo quản tốt có thể bị biến tính, làm
thay đổi các đặc tính sinh học, nhất là tính kháng nguyên, không ổn định độc
lực dẫn đến không ổn định chất lượng cho việc sản xuất vacxin và các chế

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

phẩm sinh học khác. Do đó, chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000
đã được tuyển chọn cần được lưu giữ và bảo tồn trong điều kiện tối ưu nhất,
đảm bảo sự ổn định lâu dài của các đặc tính sinh học.
Xuất phát từ tình hình thực tế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu biện pháp bảo tồn quỹ gen virus viêm gan vịt nhược độc
DH - EG - 2000 dạng tươi ở -86
0
C”
MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
- Đánh giá được tính ổn định đặc tính sinh học, sinh học phân tử của
chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000.
- Bảo tồn được nguồn gen virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh viêm gan vịt
Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một bệnh
truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1 - 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con
dưới 3 tuần tuổi. Bệnh lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao, có khi lên đến
95 - 100% toàn đàn.
1.1.1. Tình hình bệnh viêm gan vịt trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1.1. Tình hình bệnh viêm gan vịt trên thế giới
Bệnh viêm gan do virus ở vịt được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945
tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine và Hofstad, 1945), nhưng chưa

phân lập được mầm bệnh. Năm 1949, Levine và Fabricant theo dõi được bệnh
này trên đàn vịt trắng Bắc Kinh ở đảo Long (Mỹ). Năm 1950, bằng phương
pháp nuôi cấy trên phôi gà, Levine và Fabricant đã phân lập được virus viêm
gan vịt serotype 1, khác hẳn với virus dịch tả vịt (Levine và Fabricant, 1950).
Năm 1956, bệnh tiếp tục được phát hiện ở bang Massachuset, Illinois và
Michigan; sau đó bệnh xảy ra trên khắp cả nước Mỹ.
Năm 1965, ở Norfolk (Anh) thấy có hiện tượng bệnh viêm gan vịt vẫn
xảy ra trên những đàn vịt con đã được tiêm phòng vacxin nhược độc viêm gan
vịt serotype 1. Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên vịt, đã phân lập được virus
viêm gan vịt serotype 2 khác hẳn với virus viêm gan serotype 1. Virus viêm
gan vịt serotype 2 chỉ gây bệnh ở Anh.
Theo các báo cáo gần đây nhất, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở khắp nơi
trên thế giới, trong đó có cả Trung Quốc và Triều Tiên.
1.1.1.2. Tình hình bệnh viêm gan vịt tại Việt Nam
Tại Việt Nam, năm 1978 đã ghi nhận có bệnh viêm gan vịt, nhưng chưa
phân lập được virus tại thời điểm đó. Năm 1979 - 1983, bệnh xảy ra ở nhiều
địa phương làm chết nhiều vịt con (Lê Thanh Hòa, Nguyễn Như Thanh và
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

Nguyễn Bá Hiên, 1984).
Qua điều tra cho biết từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2001 khi điều tra 20 ổ
dịch tại các địa phương: Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang
kết luận đó chính là bệnh viêm gan vịt do virus với tỷ lệ nhiễm trong đàn lên
tới 100%, lứa tuổi mắc bệnh từ 1 - 21 ngày tuổi, tỷ lệ chết từ 48,57 - 90%
(Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thu Hà và Nguyễn Khánh Ly, 2001). Gần đây
nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta chưa thích nghi với điều kiện
môi trường nên bệnh viêm gan vịt càng xảy ra nhiều hơn, đặc biệt ở các địa
phương như Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình và các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu
Long gây tổn thất rất lớn (Nguyễn Đức Lưu, Nguyễn Hữu Vũ và cs, 2001).

Theo thông báo của cục Thú y, tại Nam Định tháng 5 năm 2001 đã xảy
ra một ổ dịch lớn tại xã Hồng Quang, huyện Nam Trực, đàn vịt 10.000 con mới nở
đã mắc bệnh viêm gan vịt và đến 5 ngày tuổi chết 7.000 con, những ngày sau đó số
chết giảm dần nhưng tổng số chết lên tới 80% tổng đàn.
Năm 2004, qua điều tra 10 huyện thuộc 4 tỉnh và thành phố là Hà Nội,
Hưng Yên, Bắc Ninh và Hà Tây thấy bệnh xảy ra ở vịt con dưới 40 ngày tuổi,
đặc biệt bệnh xảy ra nhiều và có tỷ lệ chết cao ở lứa tuổi 1 - 7 ngày tuổi. Hàng
năm bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra thường xuyên, tùy từng thời điểm mà bệnh
xuất hiện ở các vùng địa lý khác nhau (Nguyễn Phục Hưng, 2004).
Theo thống kê gần đây của OIE, Việt Nam là một trong những nước bị
bệnh viêm gan vịt gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 1997, bệnh đã làm chết
24.037 con trong tổng số 32.784 con vịt. Năm 2001, có 10.276 con vịt chết vì
bệnh viêm gan vịt trong tổng số 68.995 con vịt (OIE, 2006)
1.1.2. Đường xâm nhập và cách lây lan
* Loài mắc bệnh:
Trong tự nhiên, bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan type I gây ra chỉ
xảy ra ở vịt con (Nguyễn Xuân Bình,1995). Ở những đàn vịt bị bệnh, tỷ lệ
nhiễm bệnh là 100%, tỷ lệ chết tuỳ theo lứa tuổi: vịt dưới 1 tuần tuổi chết
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

khoảng 95%; vịt 1 - 3 tuần tuổi chết ít hơn, khoảng 50%; 4 - 5 tuần tuổi tỷ lệ chết
không đáng kể.
Vịt trưởng thành bị nhiễm virus không có triệu chứng lâm sàng, không
ảnh hưởng đến sản lượng trứng. Gà, gà tây và các động vật khác không mắc
bệnh. Asplin (1961), cho biết gà con có thể bị nhiễm bệnh, bệnh thể hiện
không điển hình và có thể truyền virus sang con khác.
Theo Rahn (1962), gia cầm non một vài ngày hay một vài tuần tuổi vẫn
có thể bị nhiễm bệnh, con vật có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích và có kháng
thể trung hòa trong máu. Trong phòng thí nghiệm, dùng virus viêm gan vịt

gây bệnh cho vịt con bằng cách tiêm phúc mạc hoặc cho uống. Vịt chết có
bệnh tích: gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng và
có thể phân lập được virus. Các loài vật khác như thỏ, chuột lang, chuột nhắt
trắng, chó… đều không cảm thụ với bệnh.
* Đường xâm nhập và cách lây lan:
Virus viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ
nhiễm bệnh rất cao (100%). Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá,
hô hấp hoặc qua vết thương (Levine và Fabricant, 1950; Reuss, 1959; Priz,
1973). Đường lây nhiễm qua không khí của bệnh viêm gan vịt giống với bệnh
dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con. Có sự xâm nhập của
virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp. Những vịt chưa bị nhiễm virus,
nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày.
Bệnh viêm gan vịt không lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ
trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958). Ở những vịt
khỏi bệnh, virus được bài xuất ra ngoài theo phân sau 8 tuần (Reuss, 1959). Các
loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo
phương thức cơ học, đây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở
nơi xa (Asplin, 1961).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

1.1.3. Cơ chế gây bệnh
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hoá, hô hấp hoặc
vết thương rồi vào máu. Theo máu, virus đến các cơ quan phủ tạng đặc biệt là
gan, đây là cơ quan thích hợp nhất đối với virus.
Ở giai đoạn đầu, do tác dụng của virus đã khiến trao đổi chất ở gan bị
rối loạn. Kiểm tra tổ chức học cho thấy lượng glycogen trong gan giảm mạnh
nhưng lượng lipid lại tăng cao do trao đổi lipid ở gan, đặc biệt là trao đổi
cholesterol bị ức chế. Vì vậy, vịt con ở thời kỳ sau bào thai thiếu năng lượng
dẫn đến sức đề kháng của chúng bị giảm sút. Giai đoạn thứ hai, virus trực tiếp

phá hoại tế bào gan, tế bào nội mô huyết quản, gây xuất huyết đặc trưng.
Virus nhân lên trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội
mô như tế bào Kuffer. Khi kiểm tra cho thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể
không được giải độc làm con vật chết do ngộ độc (Bùi Thanh Khiết, 2007).
1.1.4. Triệu chứng và bệnh tích
Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau 1 - 2 giờ mắc bệnh, gây chứng xanh
tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt,
nghiêng sườn và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng
hoặc ngoẹo sang bên sườn, vịt con chết ở tư thế này.
Vịt chết do nhiễm virus viêm gan vịt có bệnh tích chủ yếu tập trung ở
gan. Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ. Trong một số trường hợp
gan bị nhũn có hình thái như gelatin. Bề mặt loang lổ do có nhiều điểm xuất
huyết, xuất huyết lan rộng không có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ
khác nhau. Xuất huyết trên bề mặt gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh
viêm gan virus. (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002; Nguyễn Văn Cảm
và cs, 2001).
* Bệnh tích đại thể:
Bệnh tích do virus viêm gan gây ra chủ yếu tập trung ở gan, gan sưng to
xuất huyết lấm chấm đỏ sẫm hay xuất huyết thành mảng trên bề mặt gan, lách
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

đôi khi sưng tụ máu hoặc lấm tấm xuất huyết, thận sưng màu nhợt nhạt, tĩnh
mạch thận xung huyết (Nguyễn Thát, 1975).
Theo Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà và Nguyễn Khánh Ly
(2001), khi mổ khám 751 con vịt chết trong các ổ dịch tự nhiên thấy bệnh tích
ở gan biểu hiện ở 691 con (92,01%), ở thận 141 con (18,77%), ở lách 97 con
(12,91%).
* Bệnh tích vi thể:
Các tác giả Fabricant.J., C.G.Richard và P.P.Levin (1957), cho biết: các

biến đổi vi thể rất phức tạp, những biến đổi nguyên thuỷ trong thể cấp tính bao
gồm thay đổi đầu tiên là hoại tử tế bào gan, tăng sinh ống mật cùng với tăng
sinh tế bào viêm và xuất huyết ở các mức độ khác nhau. Ở vịt con không chết
có sự tái sinh các tế bào nhu mô gan (Fabrcant, 1957).
Sau khi tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 - 14 ngày
tuổi, khoảng 19 - 72 giờ phôi chết, ở phôi chết có biểu hiện xuất huyết dưới da
nhất là vùng đầu, lưng, rìa lách, phôi còi cọc, màng nhung niệu sưng dày, gan
phôi xuất huyết lốm đốm từng đám (Ngô Đình Long, 2005).
Ở vịt 6 ngày tuổi bị nhiễm virus viêm gan vịt bằng đường nhỏ mũi hoặc
tiêm, vào thời điểm 14 - 24 giờ sau khi kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử cho
thấy: glucogen của gan giảm, trong tế bào có tiểu thể hình cầu đường kính 100
- 300 nm. Trong trường hợp vịt bị bệnh ở thể cấp tính, 24 giờ sau khi nhiễm
virus, tế bào gan thoái hoá, hoại tử, trong tế bào có các tiểu phần virus
(Adamiker, 1969).
Theo Adamiker (1970), sau khi gây nhiễm tế bào lách bị biến đổi sau 6
giờ, bị hoại tử sau 24 giờ, thoái hoá nhân, tương bào, không tìm thấy tiểu thể
virus, tế bào cơ có thể biến đổi nhẹ.
Woolcock và Fabricant (1997) không tìm thấy thể bao hàm trong tế bào
gan vịt bệnh, đây là một đặc điểm khác biệt đối với bệnh dịch tả vịt.
* Chỉ tiêu lâm sàng:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt kiểm tra các chỉ tiêu huyết học cho thấy
hàm lượng protein tổng số giảm, Ampoulin giảm, men glutamate - pyruvat -
transaminase (GPT) tăng, bilirubin tăng. Hàm lượng GPT, GOT tăng có liên
quan đến quá trình nhiễm bệnh. Nghiên cứu vấn đề này Mennalla và Mandelli
(1977), cho biết vịt trời bị nhiễm bệnh, mặc dù triệu chứng bệnh không biểu
hiện rõ nhưng hàm lượng men GPT, GOT của gan có thay đổi.
1.1.5. Chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh viêm gan do virus ở vịt con có một số khó khăn vì
bệnh xuất hiện đột ngột và chấm dứt nhanh nên bệnh thường bị giải thích sai
lầm là do thức ăn và do chuồng trại vệ sinh kém. Trong bệnh viêm gan vịt
thường quan sát có vi trùng gây bênh phó thương hàn và trực khuẩn E.coli và
người ta cho nó là nguyên nhân gây chết. Khi chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do
virus cần chú ý đến những điểm sau:
+ Bệnh xuất hiện đột ngột và diễn ra cấp tính.
+ Chỉ gây tổn thương cho vịt con trước 2 tháng tuổi.
+ Gan có nhiều điểm xuất huyết.
1.1.5.1. Chẩn đoán phân biệt
Để chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác cần dựa vào các đặc điểm:
dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích và kiểm tra virus.
Bệnh phó thương hàn vịt (Patatyphus aratum): có thể chữa khỏi bằng
kháng huyết thanh hoặc kháng sinh. Trái lại bệnh viêm gan vịt do virus thì không
có kết quả.
Bệnh dịch tả vịt: hiện tượng xuất huyết không chỉ thấy ở gan mà còn ở
các tổ chức khác: da, bao tim màng ngực, niêm mạc dạ dày, ruột… bệnh còn
xảy ra ở mọi lứa tuổi.
Bệnh ngộ độc Aflatoxin: có triệu chứng gần giống với bệnh viêm gan
vịt nhưng kiểm tra tổ chức học thấy tế bào gan bị phá huỷ rất nghiêm trọng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

1.1.5.2. Chẩn đoán virus học
Đây là phương pháp hữu hiệu nhất, lấy bệnh phẩm là gan, lách, não
nghiền thành huyễn dịch 10 - 20% rồi tiêm cho phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, phôi
gà 8 - 10 ngày tuổi hoặc có thể dùng huyễn dịch tiêm cho vịt 1 - 7 ngày tuổi, mỗi
bệnh phẩm tiêm từ 6 - 10 vịt, mỗi con 0,2 ml, tiêm dưới da hoặc nhỏ mũi.
Sau thời gian nung bệnh ngắn vịt sẽ phát bệnh với triệu chứng, bệnh
tích giống như bệnh trong tự nhiên. Mổ khám vịt sẽ thấy có điểm xuất huyết

đặc trưng ở gan.
1.1.5.3. Chẩn đoán huyết thanh học
Trong chẩn đoán huyết thanh học có nhiều phương pháp: phương pháp
làm phản ứng trung hòa, phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng kết tủa khuếch
tán trong thạch. Nhưng trong chẩn đoán bệnh viêm gan vịt người ta thường sử
dụng phản ứng trung hòa. Nguyên tắc của phản ứng trung hòa dựa trên nguyên
tắc chung của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, phản ứng
trung hòa có thể thực hiện trên phôi gà hoặc phôi vịt hay trên vịt con.
Lấy huyết thanh nghi bệnh từ máu của vịt con đã bị bệnh điển hình
hoặc ở những vịt con sống sót sau khi đàn vịt khỏi bệnh 2 tuần. Phản ứng thực
hiện trên phôi vịt hoặc phôi gà với chủng virus đã được làm thích nghi trong
phòng thí nghiệm tuy nhiên nếu phản ứng làm trên phôi vịt, theo tài liệu thì
xác định liều ELD
50
thường dễ dàng hơn, nhưng phôi gà có ưu điểm là đảm
bảo chắc chắn không có mặt của virus cũng như kháng thể của bệnh tự nhiên.
1.1.6. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh viêm gan vịt
Biện pháp quan trọng nhất để khống chế dịch bệnh là dùng vacxin tạo
miễn dịch cho đàn vịt (Davis và cs, 1987).
Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại: vacxin nhược độc và vacxin
vô hoạt.
- Vacxin nhược độc:
Virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh học: tiêm truyền
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi.
Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh
nên được dùng để làm vacxin. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng virus
viêm gan vịt cường độc sau khi đã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng

gây bệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với
chủng virus viêm gan vịt cường độc thì mức độ nhân lên của virus này là thấp
hơn (Hwang, 1965)
Bằng phương pháp giảm độc trên phôi đã tạo ra nhiều chủng virus viêm
gan vịt nhược độc. Hiện nay vacxin viêm gan vịt nhược độc type I - loại dùng
chủ yếu ở Châu Âu là loại đã được giảm độc sau 53 - 55 lần truyền đời qua
phôi gà 8 - 10 ngày tuổi, ở Mỹ là loại giảm độc sau 84 - 89 lần cấy truyền.
Vacxin được bảo quản ở nhiệt độ -70
0
C trong vài năm.
Vacxin viêm gan vịt được giảm độc trên phôi khi sử dụng cho vịt rất an
toàn, độc lực của chủng virus ổn định và không trở lại độc lực với vịt mẫn cảm.
Khi sử dụng phương pháp tiêm vacxin nhắc lại có khả năng tạo miễn
dịch cao cho đàn vịt.
- Vacxin vô hoạt:
Ngoài vacxin nhược độc còn có vacxin vô hoạt. Vacxin viêm gan vịt vô
hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt type 1 bằng cách nuôi cấy virus trên
phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEI (Binary Ethylenimine),
dùng bổ trợ dạng nhũ dầu (ES - STA (Lipid Emulsion System - Salmonella
typhimurium) và có lympho B phân bào (Woolcok, 1991). Bảo quản ở 4
0
C
trong thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực của vacxin.
Nghiên cứu hiệu lực của vacxin viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả đều
cho biết vacxin có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt (Gough, 1981). Sử
dụng 3 lần vacxin viêm gan vịt type 1 vô hoạt nhũ dầu cho đàn vịt giống sẽ
tạo được miễn dịch thụ động cho đàn vịt con. Hiện nay, trên thế giới mới có
vacxin viêm gan vịt nhược độc và vô hoạt type 1.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

Trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi một loại vacxin nhược
độc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất. Qua khảo sát
sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được sử dụng làm
vacxin có nguồn gốc từ Hàn Quốc. Ngoài ra, chủng virus viêm gan vịt
nhược độc DH - EG - 2000 của Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng đã
được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004;
Nguyễn Bá Hiên, 2007), qui trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết, 2007; Nguyễn
Bá Hiên, 2007), đặc tính phân tử và đã bước đầu được ứng dụng vào thực tế.
Sử dụng vacxin viêm gan vịt nhược độc kết hợp với vacxin vô hoạt
cũng tạo được miễn dịch cao ở đàn vịt giống. Sử dụng vacxin viêm gan vịt
nhược độc type I sau tiêm bắp một lần vacxin vô hoạt cho vịt sẽ tạo được
miễn dịch thụ động tốt ở đàn vịt con trong suốt chu kỳ đẻ trứng.
1.2. Một số đặc tính sinh học của virus gây bệnh viêm gan vịt
1.2.1. Hình thái, kích thước và phân loại virus viêm gan vịt
Virus viêm gan vịt nhóm A (Duck Hepatitis Virus A - DHAV) thuộc họ
Picornaviridae, có kích thước rất nhỏ, xuyên qua được màng lọc Beckefeld và
Seitz (Levine và Fabricant, 1950); Theo Reuss (1959) dưới kính hiển vi điện
tử virus là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, kích thước từ 20 –
40 nm, có 32 capxome.
Virus viêm gan vịt cho đến gần đây được phân loại gồm 3 genotype:
genotype I (DHAV - 1), genotype II (DHAV - 2) và genotype III (DHAV - 3)
(Wang và cs, 2008) khác với trước đây phân loại chỉ căn cứ vào kết quả huyết
thanh học (Woolcock, 2003; OIE, 2008).
DHAV - 1 phát hiện ở hầu hết các nước trên thế giới; DHAV - 2 ở Đài
Loan và DHAV - 3 mới phát hiện gần đây ở Hàn Quốc, Trung Quốc và Việt
Nam (Kim và cs, 2007; 2009; Đoàn Thị Thanh Hương, 2010).
1.2.2. Cấu trúc virus viêm gan vịt
Hệ gen của virus viêm gan vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi đơn
dương có độ dài khoảng 7.600 – 7.700 nucleotide và đuôi poly A gồm 18

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

nucleotide ở đầu 3
’
, chứa duy nhất một khung đọc mở ORF (open reading
frame) mã hóa cho một protein chung (polyprotein). Protein này, sau khi tổng
hợp trải qua nhiều lần phân cắt để tạo nên các protein sản phẩm độc lập
(Tseng và cs, 2007a).

(
Hình 1.1. Cấu trúc không gian của picornavirus
Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm ngay trên bề mặt vỏ kháng nguyên;
còn protein VP4 lặn vào sâu bên trong.
Sắp xếp hệ gen của virus viêm gan vịt, bao gồm:
- Tại đầu 5
’
có một vùng gen có độ dài khoảng 625 nucleotide không mã
hóa gọi là vùng không mã hóa đầu 5
’
(untranslate region, 5
’
UTR) nhưng có vai
trò quan trọng trong sao mã, tăng cường độc lực, tạo khung vỏ capsid. DHV-1 bị
thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5
’
mà thay vào đó là một protein nhỏ gọi là VPg. Ở đầu
5
’
của hệ gen DHV-1 có bộ mã khởi đầu để bắt đầu cho quá trình dịch mã, bộ mã

này được đặt ở vị trí nucleotide thứ 627 của hệ gen. Vùng đầu 5
’
UTR cuốn lại
tạo nên một gấp khúc có cấu trúc bậc 2 trông giống như hình lá sồi (clover leaf),
chứa vùng gen làm vị trí cho ribosome đi vào dịch mã nội bào gọi là cấu trúc
IRES (Internal Ribosome Entry Site).
- Tại đầu 3
’
, tương tự, cũng có một vùng gen không mã hóa có độ dài
314 nucleotide gọi là 3
’
UTR (Ding và Zhang, 2007). Vùng 3
’
UTR có vai trò
rất quan trọng trong quá trình nhân lên, trung chuyển qua giai đoạn tạo nên sợi
RNA sợi âm trung gian.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

DHV-1
3D3C3B3A2C2B2A32A22A1VP1VP3VP0
5’UTR 3’UTR
AAAn
TỔ HỢP GEN
P1
TỔ HỢP GEN
P2
TỔ HỢP GEN
P3
VPg

NH – (L)–VP0 (VP4 –VP2) –VP3–VP1–2A–2B–2C–3A–3B–3C–3D – COOH
Protein chung
(1A) (1B)
(1C) (1D)
Dịch
mã
2
- Đầu tận cùng 5’ của sợi RNA hệ gen có dính một mẩu protein gọi là
protein dẫn (L) (30 amino acid). Trong họ Picornaviridae, protein L xuất hiện
trong 5 chi là Teschovirus, Aphthovirus, Erbovirus, Cadiovirus và Kobuvirus.
Protein L này sở hữu một motif GxCG, có chức năng như enzyme protease -
trypsin. (Tseng và Tsai, 2007b).
- Giữa hai vùng không mã hóa 5
’
UTR và 3
’
UTR là vùng gen mã hóa
tống hợp protein. Vùng này bao gồm ba tổ hợp gen: tổ hợp gen P1 mã hóa cho
ba loại protein cấu trúc là VP0, VP3 và VP1; tiếp theo là tổ hợp gen P2 mã
hóa cho các protein không cấu trúc là 2A, 2B, 2C; nằm cuối cùng là tổ hợp
gen P3 mã hóa cho các loại protein không cấu trúc là 3A, 3B, 3C, 3D.








Hình 1.2 Sơ đồ hệ gen và chuỗi polypeptide của virus viêm gan vịt

(Tseng và cs, 2007)
- Protein 2A: Protein này có 3 phân đoạn protein là protein 2A1, 2A2,
2A3. Đây là một trong những đặc điểm đặc trưng của DHV-1 (Johanson và cs,
2003; Tseng và Tsai, 2007b).
- Protein cấu trúc:
Có 3 protein cấu trúc gồm protein VP0, VP3 và protein VP1. Trong đó,
vùng VP1 có tính ổn định cao và có tính sinh miễn dịch, nằm trên bề mặt
ngoài cùng của các picornavirus, chứa đựng hầu hết những motif mà có chức
năng tương tác với thụ thể của tế bào và kháng thể trung hòa đơn dòng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

(Oberste và cs, 1999). Trình tự protein VP1 này là khác nhau trong giữa các
chi virus (Tseng và Tsai, 2007c).
- Protein phi cấu trúc :
Một số protein phi cấu trúc như protein 2C, 3C và 3D, chứa đựng
những motif đặc trưng khác hẳn với những motif trong các protein đã biết ở
các picornavirus khác, gồm có motif GxxGxGK (S/T) - kéo dài từ amino acid
thứ 145 đến 152 và motif DDLxQ - từ amino acid thứ 192 đến 196 trong
protein 2C, những motif này có chức năng như enzyme helicase (Ghazi và cs,
1998). Motif GxxGxGK cũng xuất hiện trong protein 2A2 (GksGsGKS;
amino acid thứ 6 - 13). Trong motif DDLxQ ở protein 2C, leucine được thay
thế bởi phenyalamine.
- Trong cấu trúc hệ gen viêm gan vịt, được quan tâm nghiên cứu nhiều
nhất là vùng gen mã hóa cho protein VP1. Vùng gen VP1 có độ dài 714
nucleotide. Gen này đã được chứng minh là gen kháng nguyên, nó quyết định
tính kháng nguyên và tính độc lực của virus. Đột biến trong gen VP1 dễ dẫn
đến thay đổi thành phần amino acid, thay đổi tính kháng nguyên và tính độc
lực của virus, từ đó có thể hình thành nên các biến chủng mới.
1.2.3. Sức đề kháng

Virus thuộc loại không có vỏ bọc nên không mẫn cảm với ete, chloroform.
Virus có sức đề kháng cao với nhiệt: ở nhiệt độ 50
0
C, virus chết trong
vòng 1 giờ. Với nhiệt độ 37
0
C ở trong dịch phôi, virus có thể sống hơn 35
ngày. Trong chuồng trại virus sống đến 70 ngày, còn trong đất ao hồ có thể
sống 100 ngày. Thức ăn với nhiệt độ 12,5
0
C virus sống đến 155 ngày. Virus
viêm gan vịt tương đối ổn định ở nhiệt độ dưới 40 - 45
0
C nhưng bị vô hoạt
một cách nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn.
Các chất sát trùng dễ dàng tiêu diệt virus Các dung dịch muối NaCl,
Na
2
SO
4
, MgCl
2
, MgSO
4
có thể bảo quản virus chống lại sự tác động của nhiệt
độ ở 50
0
C. Virus cũng có thể sống ở pH từ 3 - 9 trong vòng 48 giờ. Những
thuộc tính này phù hợp với nhóm enterovirus. (Davis và Hannant, 1987).