Tổng quan về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
TẠ THỊ NGỌC HOAN
TỔNG QUAN VỀ CHẤT ứ c CHÊ PROTEASE
ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG ĐIỂU TRỊ
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001- 2006)
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Rư
Nơi thực hiện; Bộ môn Hoá sinh
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 1/2006- 5/2006
Hà nội, tháng 5 năm 2006
LỜI CẢM ƠN
Đ ể CÓ kết quả báo cáo ngày hôm nay, tôi xỉn được bày tỏ lònẹ biết ơn sâu
sắc tới TS. Nguyễn Văn R ư - Bộ môn Hoá sinh - Đại học Dược Hà Nội, là
người thầy trực tiếp dìu dắt, tận tình hướnĩĩ dẫn tồi hoàn thảnh luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong các hộ môn, đặc hiệt là
các thầy cô trong Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi, truyền thụ cho tôi nhữn^ kiến thức vồ CÌUĨÍỊ quý háu tron^
suốt quá trình học tập và làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Thư viện- Trường Đại học Dược Hà
Nội, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trono quá trình tìm tài liệu và các phươnĩ’ tiện
hỗ trợ làm luận văn.
Tôi vô cùng biết ơn gia đình, hạn hè đã luôn độnẹ viên, qiítp đỡ tôi tron»
suốt quá trình học tập cũnẹ như tronẹ cuộc sống.
Hà Nội 5/2006
Sinh viên: Tạ Thị Ngọc Hoan
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT ứ c CHẾ PROTEASE

2
1.1. Chất ức chế enzym (Enzym inhibitor- EI) 2
1.1.1 Khái niệm 2
1.1.2. Phân loại chất ức chế enzym

3
1.2 Protease 5
1.2.1. Khái niệm 5
1.2.2. Phân loại protease 6
1.2.3. Đặc điểm một số protease có nguồn gốc động vật

7
1.2.4. Đặc điểm của một số protease có nguồn gốc thực vật

10
1.2.5. Ví dụ về protease có nguồn gốc vi sinh vật
11
1.2.6. Một số ứng dụng của protease trong thực tiễn 12
1.3. Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI)

13
1.3.1. Khái niệm 13
1.3.2. Phân loại chất ức chế protease

13
1.3.3. Cấu trúc và tính chất của chất ức chế protease 15
1.3.4. Cơ chế tác động của chất ức chế protease

16
1.3.5. Một số ứng dụng của chất ức chế protease

18
2 SỬDỤNG CHẤT ứ c CHẾ PROTEASE TRONG ĐlÊU TRỊ

19
2.1. Chất ức chế protease ứng dụng trong điều trị virus 19
2.1.1. Vài nét về virus và thuốc điều trị
19
2.1.2. HIV/AIDS và thuốc điều trị hiện nay 21
2.1.3. Protease inhibitor sử dụng trong điều trị HIV/AIDS 25
2.1.4. PI trong điều trị nhiễm một số virus khác 32
2.2 Chất ức chế protease trong điều trị kí sinh trùng 33
2.2.1. Bệnh sốt rét 33
2.2.2. Bệnh Chagas (Chagas’disease)

36
2.3. Sử dụng chất ức chế protease trong điều trị ung thư 37
2.3.1. Bệnh ung thư và thuốc điều trị
.

37
2.3.2. Mối liên quan giữa PI và bệnh ung thư

39
2.3.3. Cơ chế tác dụng chống ung thư của các PI

40
2.3.4. Một số PI sử dụng trong điều trị ung thư

42

2.4. Chất ức chế protease với quá trình đông máu- chảy máu

44
2.4.1 .Những chất ức chế protease sinh lý

44
2.4.2. Bệnh thiếu alpha 2-antiplasmin di truyền (Miyasato)

46
2.4.3.Chất ức chế protease điều trị xuất huyết

47
2.5. Sử dụng chất ức chế protease trong chống viêm

51
3 NHẬN ĐỊNH TỔNG QUÁT VÀ BÀN LUẬN 53
3.1. Về cơ chế tác dụng của chất ức chế protease

53
3.2. Về những lưu ý khi sử dụng PI trong điều trị

55
3.3. Về tác dụng không mong muốn khi sử dụng PI

55
3.4. Lợi ích của việc sử dụng PI trong điều trị 56
3.5. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu PI

56
3.6. Nguồn gốc của chất ức chế protease

57
3.7. Phương hướng nghiên cứu và ứng dụng PI trong điều trị

57
4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59
4.1. Kết luận 59
4.2. Đề xuất 60
Phụ lục
Tài liệu tham khảo
CÁC CHỮVIẾT TẲT
908, APV
AAT
AIDS
ARD
ATV
Boosted PI
El
FDA
H5N1
HAART
HCV
HIV
HIV PR
HNE
KSTSR
KTI
LPV
MMP
PI

RT
Fosamprenavir
Alpha- 1 antitrysin
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(Acquired Immuno Defciency Syndrom)
Thuốc kháng retrovirus (Anti Retrovirus Drug)
Atazanavir
PI đã được tăng cường tác dụng (PI with boost)
Chất ức chế enzym (Enzym inhibitor)
Cục quản lý Dược và Thực phẩm Mỹ
(the US Food and Drug Administration)
Virus gây đại dịch cúm ở gia cầm và người
Liệu pháp kháng retrovirus cực mạnh
(Highly Active Anti Retrovirus Therapy)
Virus viêm gan c (Hepatitis c virus)
Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch
(Human Immunodeficiency Virus)
Protease của HIV
Eslastase bạch cầu tmng tính của người
(Human Neutrophil Eslatase)
Ký sinh trùng sốt rét
Kunitz trypsin inhibitor
Lopinavir
Matrix metalloprotease
Chất ức chế protease (Protease inhibitor)
Enzym sao chép ngược (Reverse transcriptase)
RTV
SARS
TPV
TTHĐ

TTPƯ
Unboosted PI
UTI
Ritonavir
Virus gây viêm đường hô hấp cấp
Tipranavir
Trung tâm hoạt động
Trung tâm phản ứng
PI không được tăng cường tác dụng (PI without boost)
Urinary trypsin inhibitor
ĐẶT VÂN ĐỂ
Đến cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21, nền khoa học công nghệ của thế giói phát
triển rất mạnh mẽ, giao lưu quốc tế được tăng cường trong mọi lĩnh vực, đời sống
con người được nâng cao. Công tác y tế, khám chữa bệnh cũng đạt được bước tiến
vưọft bậc, nghiên CÚII thành công nhữrm phác đồ điều trị có hiệu CỊLUỈ, đẩy lùi được
nhiều dịch bệnh. Song bên cạnh đó, mô hình bệnh tật trên thế giới lại trở nên phức
tạp hơn với nhiều loại bệnh mới khó chữa trị, có khả năng lan tràn nhanh, ảnh hưỏfng
đến nhiều mặt của xã hội, đe dọa tới sự tồn vong của nhân loại như HIV, cúm
H5N1,SARS,
Để đảm bảo cho sự phát triển bền vững của toàn cầu, công tác y tế và chăm sóc
sức khoẻ là vấn đề hết sức quan trọng. Đặc biệt là việc không ngừng nghiên cún tìm
ra các loại thuốc có khả năng điều trị cao, thanh toán được nhiều dịch bệnh, có hiệu
quả trong điều trị một số bệnh nan y như HIV, ung thư Nghiên cứu về các hợp chất
có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào sinh vật- chất ức chế protease là một
trong những hướng nghiên cún đã và đang thu được nhiều thành tụii to lón đáp ứng
được mong muốn như trên. Năm 1996, ứng dụng các chất ức chế protease trong điều
trị HIV đã giảm tỷ lệ tử vong và kéo dài tuổi thọ cho bệnh nhân. Những thành công
này đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giói không ngừng tìm hiểu, thử nghiệm PI
trong điều trị và ngày càng thu được kết quả khả quan, hứa hẹn cho ra đời các loại
thuốc mới trong điều trị ung thư, chống viêm, vi sinh vạt gây bệnh

Tại Việt Nam, chất ức chế protease gần đây mới được chú ý. Những nghiên
cứu ứng dụng PI trong điều trị mới bắt đầu. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài “Tổng quan
về chất ức chế protease được ứng dụng trong điều trị” nhằm:
- Thu thập các thông tin, căn cứ đã được nghiên cứu về nguồn gốc, cấu trúc,
các tính chất cơ bản và cơ chế tác dụng của chất ức chế protease đã ứng dụng trong
điều trị một số bệnh cụ thể.
- Phân tích, làm rõ vai trò của PI trong điều trị các bệnh này. Từ đó đề xuất
một số uiải pháp nghiên cứu và ứng dụng các PI ở Việt Nam.
1 ĐẠI CƯƠNG VỂ CHẤT ức CHÊ PROTEASE
Chất ức chế protease là những chất có khả năng ức chế đặc hiệu enzym
protease.
1.1. Chất ức chê enzym (Enzym inhibitor- EI)
1.1.1 Khái niệm
Trước đây, chất ức chế enzym ít được quan tâm chú ý, hầu như nó chỉ là
một phần nhỏ trong việc nghiên cứu động học enzym. Tuy nhiên, thực tế đã
cho thấy có rất nhiều quá trình liên quan đến sự ức chế hoạt động của enzym,
đặc biệt là những vấn đề trong nhiễm độc tế bào. Chính vì vậy, EI đã thu hút
được nhiều nhà khoa học tham gia nghiên cứu về nó. Từ đó, chất ức chế
enzym trở thành một phần riêng biệt liên quan đến nhiều ngành khác, đặc biệt
là ngành y tế.
Chất ức chế enzym có nguồn gốc tự nhiên hay tổng họfp, tác dụng kìm
hãm hoặc làm mất hoạt tính của enzym thông qua hoạt động hoá học. Một sự
ức chế theo nghĩa thông thường có thể là ức chế thuận nghịch hoặc không
thuận nghịch.
ức chế thuận nghịch được biểu hiện bằng sự hoạt động trở lại của enzym
khi chất ức chế ở dạng tự do trong máu (việc loại bỏ nhóm ức chế ra khỏi
enzym bằng tác động hoá học mặc dù chất ức chế không tự ý phân tách), được
mô tả bằng phản ứng cân bằng giữa enzym và chất ức chế, thông qua hằng số
cân bằng của phản ứng thể hiện sự thuận nghịch của ái lực giữa enzym và chất
ức chế. Loại ức chế này thể hiện mức độ phụ thuộc của chất ức chế vào trung

tâm ức chế, không phụ thuộc vào thời gian và đạt đến một sự ức chế bền vững.
Ngược lại, ức chế không thuận nghịch không có chiều hướnơ cân bằng và
không có sự tác động trở lại trong máu (tất cả những cố gắng loại bỏ nhóm ức
chế bằng cách này hay cách khác đều không thành công), được mô tả bằng sự
tiến triển theo thời gian, cuối cùng là sự ức chế hoàn toàn ngay cả khi nồng độ
chất ức chế rất loãng. Tác dụng của chất ức chế không được thể hiện bằng
hằng số cân bằng mà thông qua vận tốc cân bằng[44],
1.1.2. Phản loại chất ức ch ếenzym
"^Dựa vào cơ chếtcic dụng của chcít ức chế
- ưc chế cạnh tranh (Competitive inhibitors)
Chất ức chế cạnh tranh là những chất kết hợp với enzym ngăn chặn
enzym kết hợp với cơ chất. Thông thường, chất ức chế cạnh tranh là những
chất tương tự không chuyển hoá được hoặc là dẫn chất của cơ chất. Chất ức
chế có cấu trúc giống như cơ chất nên nó có thể kết hợp với enzym ở vị trí
trung tâm hoạt động của enzym làm cho cơ chất không thể gắn vào trung tâm
hoạt động được. Do vậy, sẽ làm cho tốc độ xúc tác của enzym giảm đi.
Ví dụ: Leupeptin ức chế cạnh tranh với serin.
Trong một số trưòỉng hợp, chất ức chế được sản sinh ra không liên quan
đến cấu trúc của cơ chất, thưcmg là sản phẩm cuối hay gần cuối của quá trình
chuyển hoá tác động lên một men hay một phản ứng nhánh của quá trình
chuyển hoá. Hiện tượng này gọi là ức chế ngược “feedback”. Chất kìm hãm
“hiệu ứng” hay điều hoà kết hợp với enzym ở một vị trí có thể khác so với vị
trí xúc tác của cơ chế gây ra sự thay đổi hình dạng enzym như cấu trúc bậc 3
hay bậc 4 dẫn đến làm giảm ái lực đối vói cơ chất. Dựa trên những nghiên CÚII
về động học enzym, chúng ta thấy được rằng tốc độ và mức kìm hãm của phản
ứng xúc tác bằng enzym trong sự có mặt của chất ức chế cạnh tranh phụ thuộc
vào nồng độ cơ chất, chất ức chế; liên quan đến ái lực của cơ chất(S) và chất
kìm hãm đối với enzym(E). Trong sự có mặt của chất kìm hãm(I), tốc độ lớn
nhất của phản ứng không thay đổi khi nồng độ cơ chất rất cao yêu cầu cần đạt
đến tốc độ của phản ứng.

Quá trình ức chế cạnh tranh có thể được biểu diễn như sau:
Ks Kp
E + S ^ E S ^ e + p
+
ỊịK,
EI
- ức chế không cạnh tranh (Non- competitive inhibitors)
Úc chế không cạnh tranh là sự ức chế thể hiện qua sự liên kết chất ức chế
với enzym tự do hay phức họfp enzym và cơ chất. Thông thường, chất ức chế
không cạnh tranh thường kết hợp với enzym ngoài vị trí xúc tác của trung tâm
hoạt động, mức độ kìm hãm không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Tốc độ
phản ứng của enzym ở bất kì nồng độ cơ chất nào trong sự có mặt của chất ức
chế tỷ lệ với nồng độ của enzym mà nó không gắn với chất ức chế, mức độ
kìm hãm chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế và Ki (hằng số cân bằng của
chất ức chế và enzym)[4 .
Quá trình ức chế kliông cạnh tranh được biểu diễn như sau:
E + s ES-> E + p
+ +
I I
if, ị|K,
EI + s ESI
- Loại kết hợp của hai ức chê': một ức chế có thể tác động trên cả vận tốc,
và hằng số cân bằng, là sự kết hợp của cả tác động cạnh tranh và không cạnh
tranh [44 .
* Dưa vào nhóm E hi ức chế
4
- Chất ức chế enzym thuỷ phân (Hydrolase inhibitor): như chất ức chế
protease, chất ức chế glycosidase,
- Chất ức chếenzym vận chuyển nhóm (Transferase inhibitor).
- Chất ức chếem ym oxy hoá khử (Oxydoreductase inhibitor).

- Chất ức chếem ym phân cắt (Lyase inhibitor).
- Chổít ức chếenzym đồn^phán (Isomerase inhibitor).
- Chất ức chếenzym tổn^ hợp (Ligase inhibitor).
* Dưa vào nsuồn sốc của chất ức chế:
- Chất ức chế từ động vật.
- Chất ức chế từ thực vật.
- Chất ức chế từ vi sinh vật.
- Chcít ức chế từ nấm men.
- Chát ức chế nhân tạo.
Nẹầy nay, những chất ức chế enzym đang được phát triển rộng rãi. Các
nhà khoa học không ngừng nghiên cứu tìm ra những ưu việt và hạn chế của nó
để ứng dụng vào thực tế. Trong đó, chất ức chế protease cũng giành được
nhiều sự quan tâm đặc biệt trong lĩnh VỊĨC y học.
1.2 Protease
1.2.1. Khái niệm
Protease còn được gọi là các proteolytic enzym, là các enzym có khả
năng thuỷ phân các liên kết peptid của protein thành các đoạn peptid ngắn hơn
và các acid amin. Hoạt động của chúng có thể được phân vào hai loại khác
nhau như:
- Sự thuỷ phân có giới hạn: Protease chỉ phân tách một hoặc một số lượng
nhất định liên kết peptid.
- Sự thuỷ phân không giới hạn: Protease phân tách nhiều liên kết peptid
thành các acid amin.
1.2.2. Phân loại protease
a. Dựa vào nhóm hoá học tham gia vào quá trình xúc tác có thể chia
protease thành 4 loại sau[9]:
- Protease serin: như trypsin, Chymotrypsin,
- Protease cystein; như papain, bromelain,
- Protease aspartic: như pepsin, renin,
- Protease chứa kim loại(Metalloprotease): như carboxypeptidase,

aminopeptidase,
b. Dựa vào nguồn thu enzym:
- Protease từ động vật.
- Protease từ thực vật.
- Protease từ vi sinh vật.
- Protease từ nấm men.
- Protease tổng họfp.
c. Dựa vào PH tối lai, người ta chia protease thành 3 loại:
- Protease trung tính: như papain, bromelain, ficin,
- Protease acid: như pepsin, renin,
- Protease kiềm: như trypsin,
d. Dựa vào vị trí tác dụng đặc hiệu vói cơ chất, protease cũng có thể được
chia thành hai loại:
- Endopeptidase; enzym thuỷ phân liên kết peptid ở phần giữa mạch
polypeptid.
- Exopeptidase: enzym phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid.
e. Dựa vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia protease thành 2 nhóm;
- Protease nội bào (enzym ở trong tế bào) như cathepsin chứa trong bào
quan (lysosom).
- Protease nsoại bào (enzym được xuất tiết khỏi tế bào vào môi trườim
xung quanh) như các enzym của đưcmg tiêu hoá (pepsin, trypsin, )[11].
1.2.3. Đặc điểm một sô protease có nguồn gốc động vật
Protease nguồn gốc từ động vật bao gồm: nhóm protease serin như
trypsin, Chymotrypsin; nhóm protease aspartic như pepsin, renin; nhóm
protease chứa kim loại như carboxypeptidase, aminopeptidase. Protease độns
vật có cả hai loại endopeptidase và exopeptidase[l 1], Sau đây là một số ví dụ:
a. Nhóm serin protease
Nhóm này gồm hai loại khác nhau là[55]:
-Nhóm Chymotrypsin; gồm các enzym của loài động vật có vú như
Chymotrypsin, trypsin, elastase, hoặc kallikrein.

- Nhóm substilisin: gồm các enzym của vi khuẩn như subtilisin.
Tuy cấu trúc không gian khác nhau nhưng cả hai nhóm này đều có vị trí
hoạt động hình học và xúc tác theo cơ chế giống nhau. Những serin protease
biểu lộ sự đặc hiệu cơ chất khác nhau, được liên hệ với sự thay thế acid amin
trong vị trí thay thế nhiều enzym, tương tác với những đoạn cơ chất. Một vài
enzym có vị trí tương tác kéo dài, ngược lại cũng có những enzym khác có
một sự đặc hiệu giới hạn tới P1 đoạn cơ chất.
Ba đoạn trong cấu trúc xúc tác bộ ba là cần thiết trong quá trình xúc tác
như His 57, Asp 102, Ser 195 (sự đánh số của chymotrypsinogen). Bước đầu
tiên trong sự xúc tác là hình thành của một acyl enzym trung gian giữa cơ chất
và serin tương ứng. Bước thứ hai (sự loại bỏ acyl hoá) là trung gian acyl-
enzym bị thuỷ phân bởi một phân tử nước dẫn đến sự phân tách peptid và phục
hồi ser- hydroxyl của enzym[l 1][55].
Môt số ví du về emym nhóm serỉn proteơsel 11
- Chymotrypsin-, được tổng hợp ở tuyến tuỵ dưới dạng tiền enzym
(chymotrypsino2:en).
Cơ chế hoạt động xúc tác của a- Chymotrypsin là tạo phức enzym- cơ
chất. Enzym tấn công vào nguyên tử cacbon của nhóm carboxyl của cơ chất.
Sự thế ái nhàn xảy ra tạo thành liên kết este với serin và giải phóng amin bậc
7
nhất vốn mang một proton của histidin. Phức acyl- enzym này có sự thay đổi
đồng hoá trị tạm thời ở enzym. Liên kết este bị thuỷ phân giải phóng acid
carboxylic và enzym lại về thời điểm xuất phát.
Enzym này có khả năng thuỷ phân các liên kết peptid trong đó sự tham
gia của nhóm carboxyl của acid amin là tyrosin, phenylalanin, trytophan,
methionin và leucin.
- Trypsin: được tổng hợp ở tuyến tuỵ dưới dạng tiền enzym là
trypsinogen.
Trung tâm hoạt động của trypsin có chứa một serin và hai histidin, các
nhóm này gần nhau trong không gian nhờ cấu trúc bậc ba của phân tử. Trypsin

phân cắt chọn lọc liên kết peptid trong đó nhóm carboxyl là của lysin hoặc
arginin. Ngoài ra trypsin còn có thể thuỷ phân các liên kết este và amid có
mạch bên cation nhưng im tiên các liên kết este hơn, chẳng hạn như benzoyl-
L-Lysinetyleste (một este của lysin) bị thuỷ phân rất nhanh bởi trypsin. Điều
đáng quan tâm nữa là trypsin có thể thuỷ phân các este cũng như có thể tổng
hơp được các polypeptid.
b. Nhóm aspartic protease
Phần ló’n aspartic protease thuộc họ pepsin. Họ pepsin bao gồm những
enzym tiêu hoá như pepsin, Chymotrypsin CLin? như enzym cathepsin D nội
bào những enzym được phân lập như renin, protease nấm như penicillopepsin,
rhizopuspepsin, endothiapepsin. Họ thứ hai của nhóm này gồm những
protease của virus như protease của virus HIV. Sự nghiên cứu về hình thái tinh
thể cho phép chỉ ra rằng những enzym này là những phân tử hai thuỳ với vị trí
hoạt động nằm giữa hai thuỳ tương đồng. Mỗi thuỳ góp một đoạn aspartat
trong hoạt động xúc tác bộ đôi của aspartat. Hai đoạn aspartyl này gần với
trạng thái hình học trong phân tử hoạt động và một aspartat được ion hoá còn
aspartat thứ hai thì không bị ion hoá ở khoảng pH 2-3.
Khác với serrín và cystein protease, sự xúc tác bởi aspartic protease
không bao gồm một trung gian liên kết hoá trị dù vãn có trung gian
tetrahedran. Sự tấn công nucleophilic được hoàn thành nhờ hai sự vận chuyển
proton đồng thời; một từ phân tử nước tới bộ đôi hai nhóm carboxyl và hai là
từ bộ đôi đến carboxyl oxygen của cơ chất với sự phá vỡ liên kết CO-NH đồns:
thời[55].
Ví du về aspartic protease
Pepsin: là một protease acid điển hình, hoạt động mạnh trong môi trường
acid. Pepsin được tổng hợp trong màng nhầy dạ dày dưới dạng một tiền enzym
là pepsinogen. Pepsinogen được hoạt hoá bởi ion hoặc tự xúc tác để chuyển
thành pepsin.
Trung tâm hoạt động của pepsin có nhóm carboxyl của acid aspartic
tham gia. Nhân phenol của tyrosin chỉ tham gia vào việc kiên kết với cơ chất,

còn tryptophan tham gia duy trì cấu trúc không gian của phân tử enzym.
Pepsin có nhiều loại (A, B). Pepsin có khả năng tác dụng được trên các protein
nguyên thể cũng như trên các protein đã biến tính. Pepsin thuỷ phân đặc hiệu
trên các liên kết peptid trong đó có gốc acid là của các amin vòng (Phe, Tyr,
Trp). Pepsin cũng thuỷ phân các liên kết peptid có chứa gốc acid amin khác
như Leu hoặc Val nhưng vói tốc độ chậm hơn[l 1],
c. Nhóm metalloprotease
Metalloprotease có thể coi là nhóm lâu đời của protease và được tìm thấy
trong vi khuẩn, nấm và tổ chức cao hơn. Sự liên kết chuỗi và cấu trúc giữa các
metalloprotease có sự khác biệt lớn nhưng chúng có một điểm chung nhất đó
là đều có chứa kẽm trong trung tâm hoạt động. Trong một số trường họp, kẽm
có thê bị thay thế bởi một kim loại khác như coban hay niken vẫn không 2,iảm
tác dụng xúc tác. Thermolysin của vi khuẩn đã được mô tả và hình thái tinh
thể của nó đã cho thấy kẽm được gắn kết nhờ hai histidin và một acid
glutamic. Cơ chế xúc tác là sự hình thành trung gian tetrahedra liên kết khônc
hoá trị sau sự tấn công của liên kết kẽm với phân tử nước vào nhóm carboxyl
của liên kết phân cắt được. Trung gian này nhanh chóng bị phân ly do sự
chuyển dịch của proton acid glutamic ra khỏi nhóm[55].
Ví du về metalloprotease
Carboxypeptidase A là enzym được nghiên cứu nhiều, được tiết ra dưới
dạng tiền enzym procarboxypeptidase A ở tuỵ bò và lợn. Cơ chế hoạt động
của carboxypeptidase A đòi hỏi nhóm carboxyl của acid amin đầu tận được tự
do và cả hai enzym có chứa Zir^ ở trung tâm hoạt động. Carboxypeptidase A
tác động lên peptid mà vị trí acid amin đầu tận carboxyl không phải là arginin,
ly sin hoặc prolin[l 1].
J.2.4. Đặc điểm của một sốprotease có nguồn gốc thực vật
Protease thực vật hay được gọi là cystein protease vì chúng chứa nhóm
thiol của cystein trong trung tâm hoạt động.
Cystein protease có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tử enzym vì
có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều loại biến đổi hoá học như acid hoá,

phosphoryl hóa, oxy hoá và ankyl hoá. Vai trò của nhóm thiol trong phân tử
enzym đa dạng; tạo phức chất trung gian enzym- cơ chất; phức họp cơ chất với
cofactor; hoặc duy trì ổn định các cấu dạng hoạt động của enzym.
Cystein protease có tínli đặc hiệu rộng, chỉ hoạt động được klii nhóm thiol
trong trung tâm hoạt động kliông bị bao vây. Do đó, các chất như cystein, acid
ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền và hoạt hoá enzym này.
Flotease cystein bị ức chế bởi một số muối kim loại nặng, đặc biệt là các muối thuỷ
ngân như p- chloromercuribenzoat và các chất khác như iodoacetamid. Các protease
này còn bị oxy hoá dưód tác dụng của các chất oxy hoá như hydrogen peroxyd, iod.
Acid ethylen diaminotetraacetic (EDTA) có khả năng kết họp vói các ion kim loại
trong dung dịch, vì vậy thường làm tăng độ bền của cystein protease. Nlióm
protease này gồm các enzym ở thực vật bậc cao là papain tìĩ cây đu đủ; ficin từ cây
sung;
10
V í du v ề cystein P rotease
Papain', là một polypeptid có đầu tận amin là isoleucin, đầu tận carboxyl là
asparagin, có ba cầu disulfit (do 6 gốc cystein tạo thành) và một nhóm thiol tir do.
Papain chưa hoạt hoá có thành phần là hỗn hợp protein cystein disulfit.
Phân tử papain có dạng gần giống hình cầu gồm hai phần phân cách nhau
bằng một “vết nút” mà bề mặt của nó là phần chính của truníĩ tâm hoạt động.
Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử được tạo thành bởi
các nhóm guanidin của gốc arginin với nhóm carboxyl. Một cầu nối bên trong
và bốn cầu nối phân bố ở bên ngoài phân tử. Tính đặc hiệu cơ chất của papain
rất rộng[l 1].
1.2.5. Ví dụ vềprotease có nguồn gốc vi sinh vật
Protease của HIV (HIV PR): thuộc nhóm protease aspartic vì trung tâm
hoạt động chứa acid aspartic.
HIV PR có cấu tmc dimer chứa hai phần tương tự nhau, nhĩmg tiểu đon vị
liên kết không hoá trị gồm 99 acid amin gắn kết vào cấu trúc hai phần đối xứng.
Cấu tiíic gồm hai phần phân cách nhau bẳng một “klie nút” mà bề mặt của nó

chính là trung tâm hoạt động. Klie gắn kết cơ chất gồm nhũng đoạn tưong đồng tCr
mỗi tiểu đon vị và được gắn lên một bề mặt từ vị trí hoạt động của acid
aspartic [3 6 .
Qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc và vai
trò của HIV PR trong vòng đời virus HIV. Đó là việc tạo ra các acid amin cho
quá trình tổng hợp protein tạo virus mới. Cấu trúc cơ sỏ' của HIV PR được tìm
ra là chìa khoá để hình thành nên cấu trúc nền của chất ức chế HIV chất ức
chế protease. Điều này đã cho phép tạo ra nhóm thuốc điều trị HIV có bản
chất là ức chế HIV PR mang hiệu quả cao.
Cùng với việc phân tích protease của HIV, các nhà khoa học đã tìm hiểu
cấu trúc và vai trò trong vòns đời vi sinh vật của protease.
11
Bảng 1.1. Protease của một vài vi sinh Vứí[20][27][36][37][39][63]
Vi sinh vật
Tên protease
Thuộc nhóm cơ chế
Virus HIV HIVPR
Aspartic protease
Virus Herpes HSV- protease,
CMV- protease,
Serin protease
Virus viêm gan c (HCV)
NS2, NS2-NS3,
Cystein protease
Metalloprotease
Kí sinh trùng sốt rét
{Plasmodium falciparum)
Falcipain
Cystein protease
Plasmepsin I

Aspartic protease
Plasmepsin II
Aspartic protease
Kí sinh trùng
Trypanosoma cruzi
Cruzain
Cystein protease
Nấm Candida albicans SAPs (Secreted Aspartic
Proteases)
Aspartic protease
1.2.6. Một số ứng dụng của protease trong thực tiễn
Nghiên cứu protease là rất cần thiết, đặc biệt trong lĩnh vực y, dược và có
rất nhiều ứng dụng trong thực tế:
- Trực tiếp sử dụng protease trong các chế phẩm thuốc điều trị.
- Dùng protease là chất trung gian để nghiên cứu, phát hiện các chất ức
chế protease.
Nsoài ra, protease còn được ứng dụng trong các lĩnh VỊIC khác như: làm
thuốc bảo vệ thực vật,
12
1.3. Chất ức chếprotease (Protease ỉnhibitor-PI)
1.3.1. Khái niệm
Chất ức chế protease những chất có tác dụng ức chế hoạt động của
protease ở những mức độ khác nhau.
Chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên vào năm
1894 bởi Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính
chống trypsin trong huyết thanh người. Đến nay, các PI đã được tìm thấy rộng
rãi trong tự nhiên từ nguồn gốc động vật, thực vật, vi khuẩn. Có thể nói không
ở tổ chức sống nào là không tồn tại PI và nhiều PI đã được tổng hợp nhân tạo.
Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu chất ức chế chỉ thực sự được bắt
đầu vói những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về chất ức chế

trypsin tuỵ bò. Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã được sử dụng
để phát hiện PI như Chymotrypsin, elastase, subtilisin và các protease tinh chế
từ nấm. Từ cấu trúc nền của protease, các nhà khoa học cũng đã hình thành
nên rất nhiều cấu trúc chất ức chế protease ứng dụng trong thực tế phác đồ
điều trị [10].
1.3.2. Phán loại chất ức chếprotease
a.Dựa vào nguồn gốc của chất ức chế protease
- Chất ức chế Protease tổng hợp như FOY- 305[48], các chất tương tự
pepstatin[58],
- Chất ức chế Protease có nguồn gốc động vật như aprotinin, hirustasin,
- Chất ức chế Protease thực vật như chất ức chế loại Kunitz trypsin (trong
đậu tương)[41],
- Chất ức chế Protease vi sinh vật như amastatin, E-64, bestatin,[58]
b. Dựa vào các nhóm Protease bị ức chế[10][34][58]
- Serin protease inhibitor như leupeptin, antipain, chymostatin,
elastatina,
- CyStein protease inhibitor như E-64,
13
- Aspartic protease inhibitor như pepstatin, hydropeptatin,
- Metallo protease inhibitor như bestatin, amastatin, actinonin, histagin,
Trong đó các chất ức chế loại serin protease được chú ý nghiên cíai nhiều
nhất.
Bảng ì.l.M ột số chất ức chếprotease\2][9][36][4ì][5S]
Tên chất ức chế
Nguồn gốc
Nhóm enzym bị ức chế
A. PI động vật
Aprotinin Tuỵ, mang tai, phổi,
gan của động vật
Chymostrypsin,

trypsin
Hirustasin Nước bọt của đỉa
Serin protease
Alpha 1- antitrypsin
Máu người
Trypsin
B. PI thực vật
Kunitz trypsin
inhibitor
Đậu tương
Serin protease
C. PI vi sinh vật
Bestatin
s.
olivoìeticuỉi
Aminopeptidase
Chymostatin
s.
testaceus
Serin protease
E-64
Aspergillus japonicus
Cystein protease
D. PI tổng hợp
Saquinavir Nhân cấu trúc:
HIV protease
NHCH(R)CH(OH)CạNR %
(aspartic protease)
Benzoxazinones Herpesvirus protease
(serin protease)

14
1.3.3. Cấu trúc và tính chất của chất ức chếprotease
PI là chất ức chế đặc hiệu có nhiều bản chất khác nhau nhưng các PI có
bản chất là protein được nghiên cúìa ứng dụng nhiều hơn cả. Trong phân tử của
chất ức chế protease có một phần tương tác đặc hiệu, kết hợp trực tiếp với
trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease bị nó ức chế, gọi là trung tâm phản
ứng (TTPƯ). Gốc acid amin có vai trò quan trọng nhất trong tương tác đặc
hiệu với enzym gọi là acid amin của TTPƯ, ký hiệu là acid amin Pl, liên kết
peptid tương ứng -P l-P’l- gọi là liên kết peptid của TTPƯ thường nằm trên bề
mặt của phân tử PI trong víing có cầu disulfua. Bản chất gốc P1 phản ánh tính
đặc hiệu của PI. Acid amin P1 của chất ức chế trypsin thường là ly sin hoặc
arginin, của Chymotrypsin là methionin hoặc leucin. Ngoài acid amin Pl, các
acid amin lân cận cũng có ảnh hưởng quan trọng đến tính đặc hiệu của chất írc
chế.
Phân tử PI có thể có 1, 2, 3 hay nhiều trung tâm phản ứng. Nếu chỉ có
một TTPƯ gọi là chất ức chế một đầu hay đầu đơn; nếu có hai TTPƯ- chất ức
chế hai đầu hay đầu kép; và nếu có nhiều TTPƯ- chất ức chế nhiều đầu. Các
PI hai đầu hay nhiều đầu có thể kết hợp đồng thời hai hay nhiều phân tử
protease, các enzym này có thể có tính đặc hiệu giống hoặc khác nhau[13].
Mỗi một chất ức chế protease thường có tác dụng ức chế đặc hiệu một
hoặc một số protease.
Cho đến nay, chúng ta đã tìm ra hơn 100 chất ức chế protease trong tự
nhiên được tách ra từ nhiều tổ chức khác nhau của vi khuẩn, thực vật, động
vật. Những PI này ức chế thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, ngăn cản cơ
chất tiếp cận với vị trí xúc tác tại trung tâm hoạt động của enzym suốt quá
trình diễn ra sự cản trở. Kích cỡ của chúng cũng đa dạng từ 50 đoạn acid amin
(như chất ức chế trypsin ở thận bò) tới 400 đoạn acid amin (như chất ức chế
alpha-lproteinase). Những chất ức chế serin được nghiên cứu và biết đến
nhiều nhất. Gần đây, một bước tiến lófn lao là đã hình thành nghiên cứu ức chế
15

tự nhiên của cysteine (cystatine). Trong khi đó, những hiểu biết về chất ức chế
cả aspatyl và métallo đều rất hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu chất ức chế protease
vẫn còn nhiều vấn đề cần được quan tâm tìm hiểu, đặc biệt đối với chất ức chế
aspartyl protease và metalloprotease[57 Ị.
1.3.4. Cơ chế tác động của chất ức chê protease
Tất cả các chất ức chế protease đều hoạt động theo cơ chế gần ciống
nhau. Chúng ngăn cản hoạt động của enzym protease trong phạm vi tế bào
người hay những phần vi sinh vật mới. Protease vi sinh vật cần thiết cho quá
trình trưcmg thành và sinh sản tạo vi sinh vật mới cũng như giải phóng chúng
lây truyền sang tế bào khác. Khi các PI gắn kết vào enzym này, những vi sinh
vật mới vẫn có thể rời tế bào nhưng chúng không thể lây nhiễm sang tế bào
khác được. Vì vậy sẽ ngăn cản được sự lây lan vi sinh vật trong cơ thể[54].
Chất ức chế protease tác dụng theo hai cách sau [10]:
- ức chế (khoá) hoạt động của các protease bởi phản ứng tương tác
protein- protein.
- Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào tmng tâm
hoạt động của các protease.
Quá trình ức chế protease của các chất ức chế cũng chính là sự tương tác
giữa enzym và chất ức chế theo một cơ chế phổ biến- cơ chế chuẩn giốnc cơ
chất. Chất ức chế (I) kết hợp với enzym (E) theo cách tưofng tự như cơ chất kết
hợp với enzym, nghĩa là có sự tương ứng về cấu trúc không gian của TTPƯ
chất ức chế và TTHĐ enzym theo kiểu “ổ khoá và chìa khoá”. Có thể biểu
diễn sự tương tác theo sơ đồ sau:
E + I ^ E-I ^ E + r
Phức hợp E-I được hình thành rất nhanh và thường phân ly rất chậm
thành enzym tự do cùng chất ức chế dạim ban đầu hoặc dạng hiệu chỉnh I*.
16
Trong dạng hiệu chỉnh, liên kết -Pl-P’l- bị thuỷ phân. Phức E-I khá bền ở pH
trung tính nhưng dễ bị phân ly ở pH acid, ở pH thích hợp cho hoạt động của
protease trong phức E-I, nó lại có thể xúc tác cho sự tái tổng hợp liên kết -Pl-

P’l- . Dùng phương pháp đặc hiệu có thể xác định bản chất acid amin đầu N
và đầu c , từ đó biết được bản chất acid amin P1 của PI[13].
Việc nghiên cứu về chất ức chế protease rất cần thiết cho việc tìm ra
những thuốc mới ứng dụng điều trị.
Tác động của PI trong từng bệnh sẽ theo những cơ chế khác nhau. Việc
nghiên cứu và xác định rõ vai trò của PI trong việc phát triển của bệnh là rất
cần thiết. Nhìn chung, PI ứng dụng trong điều trị hoạt động theo ba cơ chế
chính là;
- Úc chế sự thuỷ phân protein thành các acid amin, ngăn cản sự tổng hợp
nên protein mới, cơ chế này được thấy rõ nhất trong điều trị virus (phần 2.1).
- ức chế hoạt động của protease mà có vai trò trong phát triển bệnh hay
là nguyên nhân gây bệnh như trong sự di căn ung tế bào ung thư (phần 2.3)
- Chất ức chế protease có vai trò ảnh hưỏng đến các quá trình sinh học
trong cơ thể (các PI sinh lý) như trong quá trình cầm máu, đông máu , từ đó
đưa ra thuốc aprotinin trong điều trị xuất huyết (phẩn 2.4)
PI có mặt trong hầu hết các tổ chú'c trong tự nhiên và ở bất kì tổ chức nào
nó cũng đóng một vai trò nhất định. Tìm hiểu rõ vai trò đó của PI sẽ là rất cần
thiết để phục vụ trong điều trị[10][57].
A^IẲOÍOÌ'
U- ịASV
17
1.3.5. M ột số ứng dụng của chất ức chếprotease
- úhg dụng của PI trong bảo vệ thực vật chống một số tác nhân gây hại
như nấm mốc, côn trùng
- úhg dụng PI trons y dược học.
- Dùng PI đê thử hoạt tính và nhận dạng protease.
Hiện nay, trên thế giới, các chất ức chế protease đang được nghiên CÚII và sử
dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực của đòi sống. Nghiên cứu, ứng dụng PI được
các nhà khoa học quan tâm chú ý[21][32]. Từ khi ra đòi, PI đã đem lại rất nhiều lợi
ích, đặc biệt trong lĩnli vực bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ con người, úhg dụng PI

trong y học là một thành tựu đáng ghi nhớ. Đó chính là phác đồ điều trị HIV với PI
đã tạo ra một cuộc cách mạng, giảm tỷ lệ tử vong và đem lại nhiều hy vọng cho
nhĩmg bệnh nhân phải hứng chịu căn bệnli này[17][25]. ơiính từ nliũng thàiili
công vód PI đã thu hút các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu, PI hiện nay
đang đi sâu vào hầu như mọi loại bệnh từ điều trị bệnh lây nhiễm vi sinh vật như
vữus đến nlìũng bệnh liên quan đến điều hoà cơ thể nliư ung thư, viêm, Các chế
phẩm PI làm thuốc đang ngày càng phát triển (phụ lục 1).
Tại Việt Nam, vấn đề nghiên cứu thuốc mới của chúng ta còn gặp nhiều
khó khăn với nhiều nguyên nhân khách quan như kinh phí, nhân lực, việc tìm
hiểu và nghiên cứLi về chất ức chế protease cũng chỉ mói bắt đầu. Để có thể
phát triển được nền y học nước nhà, phục vụ tốt cho người bệnh, chúng ta cần
có những quan tâm đúng đắn theo kịp với sự phát triển của thế giới không chỉ
về chất ức chế protease trong điều trị mà còn về vấn đề sản xuất thuốc nói
chung. Việt Nam có nguồn tài nguyên cây thuốc hết sức phong phú, có thể là
nguồn tạo PI[15]; kết hợp giữa y học hiện đại và cổ truyền sẽ mang lại một
nền y học phát triển và phù hợp vói đất nước.
18
2 SỬ DỤNG CHẤT ức CHÊ PROTEASE TRONG ĐlỂư TRỊ
Ngày nay, chất ức chế protease được nghiên cím nsày càng nhiều và nó
cũng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các nhà khoa học đã
nghiên cúii tìm ra cấu trúc vai trò của protease đối với sự phát triển của vi sinh
vật, qua đó tổng hợp ra các PI đặc hiệu ức chế sự nhân lên của vi sinh vật. Họ
đã thành công với phác đồ điều trị virus, đặc biệt là chống lại căn bệnh thế kỷ
HIV, mở ra hướng nghiên cứu thuốc điều trị ký sinh trùng, ung thư, nấm cũng
như nhiều căn bệnh khác.
2.1. Chất ức chếprotease ứng dụng trong điều trị virus
2.1.1. Vài nét về virus và thuốc điều trị
* Sơ lươc về virus
Một vài đặc điểm nổi bật trong sự lây nhiễm virus[33][2][3]:
- Sự lây nhiễm được khởi đầu bằng sự gắn kết đặc hiệu của virus vào hề

mặt tế bào vật chủ. Điều này cần đến protein trên bề mặt virus đó có thể là
một phần của capsid hoặc mấu protein trên envelope virus. Protein bề mặt
phải tiếp xúc với một thành phần của tế bào vật chủ được hoạt động như là
virus receptor. Chỉ những tế bào chiếm được virus receptor mới có thể lây
nhiễm. Trong cơ thể ngưòi, sự lây nhiễm virus thường có thể bị chống lại bởi
kháng thể bao phủ lên protein bề mặt của virus, vì vậy ngăn cản sự gắn chúng
vào tế bào vật chủ.
- T4 và một số thực khuẩn thể khác được cấu tạo như nhữn^ kim tiêm để
tiêm a. nucleic của clĩúníĩ vào hên trong tế hào vật chủ. Virus trong trong
động vật và trong cơ thể con người sử dụng những cách khác nhau. Một vài
trong số chúng khởi động một phản ứng bên trong tế bào sau khi gắn kết lên
bề mặt tế bào; một số envelope virus tự hoà tan với màng plasma của tế bào
vật chủ, giải phóng nucleocapsid vào trong tế bào chất của vật chủ. Trong
19