Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ






NGUYỄN THỊ HẠNH CHI
MSHV: 62031105





XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA
ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI
(ETEC) GÂY TIÊU CHẢY TRÊN
HEO CON Ở ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG






LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

NĂM 2015




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ





NGUYỄN THỊ HẠNH CHI
MSHV: 62031105






XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA
ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI
(ETEC) GÂY TIÊU CHẢY TRÊN

HEO CON Ở ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN




PGS.TS. HÀ THANH TOÀN PGS.TS. LÝ THỊ LIÊN KHAI




NĂM 2015
i

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt thời gian học tập thực hiện đề tài và hoàn thành luận án, tôi
luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân. Nhân dịp này, tôi
không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân thành đến những người đã quan
tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ - đấng sinh thành -
cùng anh chị em trong gia đình thân yêu luôn là nguồn động lực thúc đẩy tôi nổ
lực và phấn đấu. Cảm ơn chồng và con gái đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian
học tập thật tốt. Tất cả những người thân yêu nhất đã giành cho tôi tất cả tình
yêu, sự khuyến khích và ủng hộ tôi trong chặng đường học tập và hoàn thành
luận án tiến sĩ.
Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Hà
Thanh Toàn và PGS.TS. Lý Thị Liên Khai, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Đặc biệt,
thầy và cô là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và niềm đam mê khoa học,
khơi dậy trong tôi sự tự tin, nổ lực, cố gắng không ngừng và không chùn bước
trước những khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án tiến sĩ. Tôi cũng
không thể nào quên sự ủng hộ và hướng dẫn tận tình của thầy Hideki
Hayashidan, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp và Kỹ
thuật Tokyo, Nhật Bản, trong suốt thời gian tôi ở Nhật và cả trong quá trình
thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy và cô đã dành nhiều thời
gian, công sức giúp tôi có định hướng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu.
Tôi luôn luôn ghi nhớ công ơn và tình cảm của PGS.TS Trần Đình Từ, PGS.TS
Võ Ái Quấc, những người thầy luôn dõi theo và nâng đỡ tôi trong suốt thời
thực hiện và hoàn thành luận án.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất của tôi đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học luôn quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện
tốt nhất cho tôi hoàn thành tiến trình học tập và nghiên cứu. Xin ghi nhớ công
ơn của quý Thầy, Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học cùng
thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã hết lòng
truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian
học.
Xin cảm ơn:
Các bạn, các em trong phòng E208 Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ và phòng thí nghiệm Vi
ii

khuẩn học của Khoa Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp và Kỹ thuật Tokyo,
Nhật Bản.
Các anh, chị, bạn nghiên cứu sinh, học viên cao học và các em sinh viên
Đại học đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia
sẻ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Các cán bộ Chi cục thú y tỉnh, trạm thú y huyện, ban lãnh đạo và cán bộ
kỹ thuật trại, các hộ chăn nuôi ở tỉnh An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc
Trăng, Vĩnh Long và thành phố Cần Thơ,… đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi
trong việc lấy mẫu.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học An Giang, Ban
Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp – Tài nguyên Thiên nhiên, trường Đại học An
Giang đã tạo điều kiện để tôi được tham gia học tập nâng cao trình độ chuyên
môn, các bạn đồng nghiệp đã không ngừng động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập.
Cuối cùng xin kính chúc tất cả mọi người thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc
và thành công!
Nguyễn Thị Hạnh Chi
iii

TÓM LƯỢC
Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát sự lưu hành và khả năng đề kháng với
kháng sinh của vi khuẩn enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây bệnh tiêu
chảy trên heo con tại 6 tỉnh/ thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).
Phương pháp phân lập và phản ứng huyết thanh học đã được sử dụng để định
danh các chủng E. coli. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli trên heo tiêu chảy, heo
khỏe và môi trường lần lượt là 99,45%, 98,99% và 40,74%. Tỷ lệ phân lập vi
khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở heo con khác nhau không có ý nghĩa thống kê giữa

mùa mưa (100%) và mùa nắng (98,91%), giữa heo con theo mẹ (99,23%) và heo
sau cai sữa (99,52%). Tuy nhiên, E. coli được phân lập trong các mẫu nền chuồng
(64,75%) cao hơn so với mẫu nước uống (11,84%), (p<0,001). Các chủng ETEC
phân lập từ phân heo con tiêu chảy cho thấy tỷ lệ F4 là cao nhất (20,42%), kế đến
F5 (8,41%) và F6 (5,78%). Các chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F5 ở heo
sau cai sữa lần lượt là 20,5% và 7,37% khác nhau không có ý nghĩa thống kê so
với heo con theo mẹ (20,34% và 9,4%); ETEC F6 hiện diện ở heo con theo mẹ
(7,52%) cao hơn heo sau cai sữa (3,96%) (p<0,05). Sự phân bố các chủng F4, F5
và F6 không phụ thuộc vào qui mô đàn và vùng sinh thái. Các chủng ETEC phân
lập từ heo khỏe và môi trường có mang từng loại kháng nguyên bám dính F4, F5
và F6 khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, ETEC tồn lưu trên nền
chuồng và nước uống có thể là một nguồn lây nhiễm vi khuẩn gây tiêu chảy cho
heo con ở ĐBSCL.
Thực hiện kỹ thuật PCR nhằm xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của
330 chủng ETEC phân lập từ phân heo con theo mẹ tiêu chảy, kết quả cho thấy các
chủng mang gene mã hóa kháng nguyên bám dính F4 được phát hiện nhiều nhất
(27,27%); tiếp theo là F18 (20%), F5 (6,67%), F6 (10%), F41 (2,73%), intimin
(6,97%) và AIDA-I (3,64%). Các chủng mang gene mã hóa độc tố EAST1
(55,76%) chiếm tỷ lệ cao nhất, tiếp theo là STb (32,42%), STa (16,06%) và LT
(9,39%). Tương tự, từ 46 chủng ETEC phân lập từ môi trường và 14 chủng được
phân lập từ heo khỏe có mang đầy đủ các gene giống như ở heo tiêu chảy nhưng tỷ
lệ thấp hơn. Đa số các chủng ETEC phân tập từ phân heo con tiêu chảy có khả
năng gây chết chuột bạch ddY sau khi tiêm vào xoang bụng. Có 13/17 chủng gây
chết 100% chuột thí nghiệm sau 6-24 giờ và 4/17 chủng gây chết 50% chuột sau
18-48 giờ. Trong khi đó, 100% chủng ETEC được phân lập từ phân heo con khỏe
không gây chết chuột. Bốn chủng được chọn từ 17 chủng gây chết chuột tiến hành
kiểm tra độc lực trên heo cai sữa, cả 4 chủng đều có khả năng gây tiêu chảy trên
heo sau cai sữa thí nghiệm. Như vậy những chủng ETEC phân lập từ heo con tiêu
chảy ở khu vực ĐBSCL là những chủng gây bệnh ở khu vực này.
iv

Qua kiểm tra sự đề kháng với kháng sinh của 215 chủng ETEC phân lập từ
phân heo con tiêu chảy bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch với 14 loại
kháng sinh, kết quả cho thấy tỷ lệ đề kháng cao nhất ở nhóm 1 (β-lactam)
ampicillin (86,05%), nhóm 3 gồm florfenicol (86,51%), kế đến là tetracycline
(71,16%), neomycin (61,40%), nhóm 4 như trimethoprim/sulphamethoxazole
(79,07%), nalidixic acid (62,79%) và nhóm 2 (polypeptid) như colistin (51,16%).
Các chủng ETEC được phân lập từ 6 tỉnh / thành ở ĐBSCL nhạy cảm cao với
ceftazidime (85,58%), amikacin (92,09%) amoxicillin/clavulanic acid (65,12%).
Bên cạnh đó bằng phương pháp PCR, nhiều genes kháng kháng sinh đã được phát
hiện với tỷ lệ cao như là bla
TEM
(87,44%), floR (92,56%), aadA (95,35%), SulII
(80,93%), qnrS (88,37%), bla
CMY
(73,49%), aph(3’)-Ia (63,72%), tetA (86,98%)
và thấp hơn như các gene tetB (25,12%), tetC (53,02%), qnrA (69,30%), aac(3)-
IV (40,47%), qnrB (42,79%), bla
SHV
(15,35%), và aph(3’)-IIa (2,33%). Hơn nữa
tình trạng đa kháng với kháng sinh của các chủng ETEC ở các tỉnh ngày càng
tăng.
Kết quả giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần
mềm BLAST N cho thấy 11 chủng ETEC mang gene faeG mã hóa kháng nguyên
bám dính F4 và 9 chủng mang gene fedA mã hóa kháng nguyên bám dính F18 có
mức độ tương đồng di truyền rất cao so với các chủng tham chiếu trên ngân hàng
gene (95-100%). Tương tự như các chủng ETEC mang kháng nguyên F4, các
chủng trong nhóm ETEC mang kháng nguyên F18 có mối quan hệ di truyền rất
gần nhau.
Từ khóa: độc tố ruột, ĐBSCL, ETEC, gene kháng kháng sinh, heo con,

kháng nguyên F, tiêu chảy.



v

ABSTRACTS
The study was conducted to determine the prevalence and resistance to
antibiotics of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) which causes diarrhea in
piglets in 6 provinces/cities in the Mekong Delta region.
Method of isolation and serological test was used to differentiate of E. coli
strains. The isolation rate of E. coli from diarrheal, healthy piglets and
environments were 99.45%, 98.99% and 40.74%, respectively. The isolation rate
of E. coli causing diarrhea in piglets was independent of the seasons and ages of
pigs (p>0.05). However, E. coli isolated from piggery floor samples (64.75%) was
significantly higher than that from drinking water samples (11.84%), (p<0,001). In
suckling piglets diarrhea, ETEC F4 was highest (20.42%), following by F5
(8.41%) and F6 (5.78%). In post-weaning pigs, the strains of ETEC F4 and F5
antigen were 20.5% and 7.37%, respectively. These results were not significantly
different to those found in sucking piglets. The F6 ETEC isolated in suckling
piglets was 7.52%, higher than that found in pigs after weaning (3.96%), (p<0.05).
The distributions of ETEC F4, F5 and F6 strains were significantly dependent on
herd size and geography area. There was no significant difference in the rate of
ETEC F4, F5 and F6 which isolated in healthy piglets and environment samples
(p>0.05). Therefore, the ETEC strains existed in piggery floor and drinking waters
could be the diarrhea-causing agent in piglets in the Mekong Delta.
The adhesive and toxins genes of 330 ETEC strains were identified by
Polymerase Chain Reaction (PCR) method from diarrheal piglets. The result
showed that F4 is the predominant strain (27.27%), following by F18 (20%), F5
(6.67%), F6 (10%), F41 (2.73%), intimin (6.97%) and AIDA-I (3.64%). The toxic

genes of EAST1 was highest (55.76%), following by STb (32.42%), STa
(16.06%) and LT (9.39%). The presence of these genes was obtained in 46 ETEC
strains isolated from environment samples and 14 strains from healthy piglets was
found similar in ETEC strains of diarrheal piglets but in a lower percentage. Most
of the ETEC strains isolated from diarrheal piglets had killed mice ddY after
abdominal cavity injection. Thirteen of 17 ETEC strains was noted to kill 100%
affected mice after 6-24 h and 4/17 strains killed 50% mice after 18-48 h.
Whereas, 100% ETEC strains isolated from healthy piglets did not kill any mice.
Four strains sellected from 17 ETEC strains which killed experimental mice were
used to test in post weaning pigs and all of these strains were able to cause
diarrhea. Thus, ETEC strains isolated from diarrheal piglets in the Mekong Delta
are pathogenic strains.
Disc diffusion method was used with 14 antibiotic discs to test the
antimicrobial resistant of 215 ETEC strains.The highest resistant rate was found in
vi

group 1 of β-lactam (ampicillin, 86.05%), group 3 of phenicol (florfenicol,
86.51%; tetracycline, 71.16%; neomycin, 61.40%), group 4 of sulfonamide
(trimethoprim/sulphamethoxazole,79.07%; nalidixic acid, 62.79%) and group 2 of
polypeptide type (colistin, 51.16%). On the other hand, ETEC strains isolated from
6 provinces/cities in the Mekong Delta had high susceptibility to ceftazidime
(85.58%), amikacin (92.09%) and amoxicillin/clavulanic acid (65.12%). By using
PCR method, the resistant genes of many antibiotics were determined in a high
rate, such as bla
TEM
(87.44%), floR (92.56%), aadA (95.35%), SulII (80.93%),
qnrS (88.37%), bla
CMY
(73.49%), aph(3’)-Ia (63.72%), tetA (86.98%) and lower
rate as tetB (25.12%), tetC (53.02%), qnrA (69.30%), aac(3)-IV (40.47%), qnrB

(42.79%), bla
SHV
(15.35%), and aph(3’)-IIa (2.33%). Moreover, the antibiotic
resistance situation of ETEC strains is incerasing in these provinces.
Data of DNA sequencing was compared to GenBank database of NCBI by
BLAST N sorfware and the result showed that, 11 strains ETEC carrying gene
faeG encodings adhesion antigens F4 and 9 strains carrying genes fedA encodings
antigens adhesion F18, levels of genetic similarity very high compared to the
reference strains on GenBank (95-100%). Similar to the strains of ETEC F4
antigen, the strains of ETEC F18 antigen had a close genetic relationship.
Key words: enterotoxin, Mekong Delta, ETEC, antimicrobial resistance
genes, piglet, F antigen, diarrhea.

vii

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Hạnh Chi với sự hướng dẫn của PGS.TS Hà Thanh Toàn và
PGS.TS. Lý Thị Liên Khai. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực và chưa từng được công bố bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình
nào trước đây.

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án


PGS.TS HÀ THANH TOÀN NGUYỄN THỊ HẠNH CHI

PGS.TS. LÝ THỊ LIÊN KHAI

viii

MỤC LỤC

Trang
Lời cảm tạ i
Tóm lược iii
Abstract v
Lời cam đoan vii
Mục lục viii
Danh sách bảng xiii
Danh sách hình xvi
Danh mục từ viết tắt xviii

Chương 1 Giới thiệu 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu 2
1.3 Nội dung nghiên cứu 2
1.3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo con
tiêu chảy và môi trường 2
1.3.2 Phân tích các yếu tố độc lực của ETEC 2
1.3.3 Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của ETEC 2
1.3.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC 3
1.4 Ý nghĩa của luận án 3
1.5 Những điểm mới của luận án 3

Chương 2 Tổng quan tài liệu 4
2.1Vi khuẩn E. coli 4
2.1.1 Đặc điểm hình thái 4
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy 4
2.1.3 Đặc tính sinh hóa 5
2.2 Phân loại vi khuẩn E. coli gây bệnh 5
2.3 Giới thiệu về ETEC ở heo 9
2.3.1 Khả năng sinh bệnh của ETEC 10
2.3.2 Tính miễn dịch 11
2.4 Các yếu tố độc lực của ETEC 12
ix

2.4.1 Kháng nguyên bám dính 13
2.4.1.1 Kháng nguyên F4 (K88) 14
2.4.1.2 Kháng nguyên F5 (K99) 16
2.4.1.3 Kháng nguyên F6 (987P) 16
2.4.1.4 Yếu tố bám dính F18 17
2.4.1.5 Yếu tố bám dính F41 18
2.4.1.6 Yếu tố không bám dính AIDA-I 18
2.4.1.7 Intimin 18
2.4.2 Độc tố ruột 19
2.4.2.1 Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile enterotoxin, LT) 20
2.4.2.2 Độc tố chịu nhiệt (Heat-Stable enterotoxin, ST) 22
2.5 Tính kháng kháng sinh 26
2.5.1 Cơ chế tác động của kháng sinh 26
2.5.2 Cơ chế kháng kháng sinh 28
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về ETEC gây bệnh tiêu chảy
trên heo con 31
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 31

2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 33

Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 36
3.1 Phương tiện nghiên cứu 36
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36
3.1.2 Vật liệu 36
3.2 Phương pháp nghiên cứu 38
3.2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo con
tiêu chảy và môi trường 38
3.2.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của ETEC 44
3.2.2.1 Xác định các gene mã hóa một số kháng nguyên bám dính (F4, F5,
F6, F18) và độc tố ruột (STa, STb, LT, EAST1) của vi khuẩn ETEC 44
3.2.2.2 Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm 47
3.2.3 Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC 51
3.2.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC 55
3.3 Thống kê và xử lý số liệu 55

x

Chương 4 Kết quả và thảo luận 56
4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli 56
4.1.1 Phân lập 56
4.1.1.1 Phân lập vi khuẩn E. coli 56
4.1.1.2 Định danh vi khuẩn E. coli 57
4.1.1.3 Tỷ lệ vi khuẩn E. coli từ phân và môi trường 59
4.1.1.4 Phân lập vi khuẩn E. coli từ phân heo tiêu chảy theo mùa 61
4.1.1.5 Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân heo tiêu chảy theo tuổi 62
4.1.1.6 Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân heo tiêu chảy theo vùng
sinh thái 63
4.1.1.7 Phân lập vi khuẩn E. coli trong môi trường chăn nuôi 64

4.1.2 Phân bố các chủng ETEC F4 (K88), F5 (K99) và F6 (987P) trong
phân heo và môi trường 65
4.1.2.1 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo và môi
trường 65
4.1.2.2 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy
theo tuổi 67
4.1.2.3 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy
theo vùng sinh thái 68
4.1.2.4. Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy
theo quy mô đàn 68
4.1.2.5 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong môi trường 71
4.1.2.6 Phân bố trạng thái và màu sắc phân heo tiêu chảy do các chủng
ETEC F4, F5 và F6 72
4.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của các chủng ETEC 73
4.2.1 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng ETEC 75

4.2.1.1 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng
ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương 75

4.2.1.2 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng
ETEC trong phân heo tiêu chảy theo tuổi 79
4.2.2 Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong phân
heo tiêu chảy 81
4.2.2.1 Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong phân
heo tiêu chảy theo địa phương 81
4.2.2.2 Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong phân
heo tiêu chảy theo tuổi 82
xi

4.2.2.3 Tổ hợp các yếu tố gây bệnh của các chủng ETEC trong phân heo

tiêu chảy 84
4.2.3 Độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền động vật thí nghiệm 89
4.2.3.1 Độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền chuột bạch 89
4.2.3.2 Độc lực của các chủng ETEC trên heo sau cai sữa 96
4.3 Đặc tính đề kháng với kháng sinh của ETEC 99
4.3.1 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu
chảy trên heo 99
4.3.2 Gene đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây tiêu chảy trên heo 104
4.3.3 Đa kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây tiêu chảy trên heo 111
4.4 Đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử của ETEC 118
4.4.1 Quan hệ di truyền của các chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy 118
4.4.2 Trình tự nucleotide và amino acid của các chủng ETEC 124
4.4.2.1 So sánh trình tự nucleotide và amino acid trên gene faeG 124
4.4.2.2 So sánh trình tự nucleotide và amino acid trên gene fedA 128

Chương 5 Kết luận và đề xuất 132
5.1 Kết luận 132
5.2 Đề xuất 133

Tài liệu tham khảo 134
Phụ chương 148
Phụ lục A: Phiếu điều tra 148
Phụ lục B: Thống kê 149
Phụ lục C: Hình ảnh 305




xii

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Những phân nhóm E. coli gây bệnh đường ruột trên người 7
Bảng 2.2: Các thể bệnh, yếu tố độc lực và nhóm huyết thanh học quan trọng
của vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo 13
Bảng 2.3: Các yếu tố bám dính và không bám dính của các chủng ETEC 14
Bảng 2.4: Những chủng E. coli chủ yếu có liên quan đến bệnh đường ruột 19
Bảng 3.1: Trình tự các nucleotide của các cặp mồi và chu trình nhiệt được sử
dụng trong phản ứng PCR 46
Bảng 3.2: Tiêu chuẩn đánh giá khả năng nhạy cảm/ kháng của vi khuẩn ETEC
đối với kháng sinh 52
Bảng 3.3: Trình tự nucleotide các cặp mồi và chu trình nhiệt phản ứng
PCR xác định gene kháng kháng sinh của ETEC 53
Bảng 4.1: Số khuẩn lạc E. coli phân lập được trong phân và môi trường 56
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc E. coli trên môi trường nuôi cấy 57
Bảng 4.3: Đặc điểm tế bào vi khuẩn E. coli 58
Bảng 4.4: Tỷ lệ nhiễm E. coli trong phân và môi trường 60
Bảng 4.5: Tỷ lệ nhiễm E. coli từ phân heo tiêu chảy theo mùa 61
Bảng 4.6: Tỷ lệ nhiễm E. coli từ phân heo tiêu chảy theo tuổi 62
Bảng 4.7: Tỷ lệ nhiễm E. coli trong phân heo tiêu chảy theo vùng sinh thái 63
Bảng 4.8:
Tỷ lệ nhiễm
E. coli

trong môi trường chăn nuôi 64
Bảng 4.9: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo và môi
trường 66
Bảng 4.10: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu
chảy theo tuổi 67
Bảng 4.11: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo theo

vùng sinh thái 68
Bảng 4.12: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu
chảy theo quy mô đàn 69
Bảng 4.13: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong môi trường 71
Bảng 4.14: Phân bố trạng thái và màu sắc phân heo tiêu chảy do các chủng
ETEC F4, F5 và F6 72
Bảng 4.15: Phân bố gene mã hóa độc lực của các chủng ETEC trong phân heo
và môi trường 74
Bảng 4.16: Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng
ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương 76
xiii

Bảng 4.17: Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng
ETEC trong phân heo tiêu chảy theo tuổi 79
Bảng 4.18:
Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC
trong phân
heo tiêu chảy
theo địa phương
81
Bảng 4.19: Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong
phân heo tiêu chảy theo tuổi 82
Bảng 4.20: Tổ hợp gene mã hóa kháng nguyên bám dính và độc tố của các
chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo 85
Bảng 4.21:
Độc lực của các chủng ETEC trên chuột bạch
90
Bảng 4.22: Dấu hiệu lâm sàng của chuột bạch sau tiêm truyền 92
Bảng 4.23: Khả năng gây bệnh của các loại độc tố ruột và các yếu tố
bám dính của các chủng ETEC gây bệnh trên chuột bạch 95

Bảng 4.24: Khả năng gây bệnh của các chủng ETEC trên heo sau cai sữa 97
Bảng 4.25: Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng ETEC gây
bệnh tiêu chảy trên heo 99
Bảng 4.26: Khả năng đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC 102
Bảng 4.27: Gene đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây tiêu chảy
trên heo 105
Bảng 4.28: Đa kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy
trên heo 112
Bảng 4.29: Gene đa kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh
tiêu chảy trên heo 112
Bảng 4.30: Gene đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC theo địa điểm . 115
Bảng 4.31: Kết hợp giữa các gene đề kháng với kháng sinh của các
chủng ETEC 117
Bảng 4.32: Mức độ tương đồng nucleotide gene faeG của các chủng phân
lập với các chủng trong ngân hàng gene 121
Bảng 4.33: Mức độ tương đồng nucleotide gene fedA của các chủng ETEC
phân lập với các chủng trong ngân hàng gene 123

xiv

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Quá trình lây nhiễm và gây bệnh của ETEC 10
Hình 2.2: Cấu trúc các cụm gene mã hóa kháng nguyên bám dính 15
Hình 2.3: Cấu trúc của độc tố LT 20
Hình 2.4: Hoạt động biến dưỡng chính của LT 21
Hình 2.5: Cấu trúc độc tố STa 22
Hình 2.6: Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa 23
Hình 2.7: Cầu nối disulfide (-S-S- ) và các số chỉ vị trí amino acid trong
cấu trúc độc tố STb 24

Hình 2.8: Cơ chế hoạt động của STb 25
Hình 2.9: Những vị trí tác động của các nhóm kháng sinh 27
Hình 2.10: Cơ chế di truyền ngang ở vi khuẩn 29
Hình 2.11: Ba cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 30
Hình 3.1: Đo pH phân heo 39
Hình 3.2: Lấy mẫu phân 39
Hình 3.3: Quy trình nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn E. coli 41
Hình 3.4: Kháng huyết thanh K88, K99 và 987P 43
Hình 3.5: Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng huyết thanh học 43
Hình 3.6: Chuẩn bị chuồng nuôi 48
Hình 3.7: Chuột nuôi trong lồng nhựa 48
Hình 3.8: Tiêm xoang bụng 48
Hình 3.9: Kiểm tra thân nhiệt của chuột 48
Hình 4.1: Hình ảnh khuẩn lạc E. coli phân lập trong phân heo tiêu chảy trên
môi trường MacConkey 57
Hình 4.2: Hình ảnh khuẩn lạc E. coli phân lập trong phân heo tiêu chảy trên
môi trường Eosine Methylene Blue 57
Hình 4.3: Kết quả phản ứng sinh hóa của một khuẩn lạc E. coli phân lập 58
Hình 4.4: Hình ảnh nhuộm Gram của vi khuẩn E. coli nuôi cấy 18-24 giờ trên
môi trường Nutrient Agar 59
Hình 4.5: Chủng vi khuẩn E. coli 585j được chụp dưới kính hiển vi điện tử
quét (JSM) 5500 ở độ phóng đại 8500 lần 59
Hình 4.6: Sản phẩm điện di của phản ứng PCR xác định STb (279bp) 77
Hình 4.7: Sản phẩm điện di của phản ứng PCR xác định EAST1 (125bp) 77
xv

Hình 4.8: Sản phẩm điện di của phản ứng PCR xác định F4 (499bp) 78
Hình 4.9: Sản phẩm điện di của phản ứng PCR xác định F18 (313bp) 78
Hình 4.10: Chuột tiêu chảy với mắt trũng sâu 93
Hình 4.11: Chuột thí nghiệm tiêu chảy , (a): phân lỏng, màu vàng, (b): Phân

sệt, màu xám 93
Hình 4.12: Bụng chuột phình to 93
Hình 4.13: Gan chuột sưng tụ huyết 93
Hình 4.14: Phổi sưng, xuất huyết; lách tụ huyết; dạ dày và ruột chứa đầy
hơi 94
Hình 4.15: Khuẩn lạc E. coli phân lập từ máu tim chuột trên môi trường
MC 94
Hình 4.16: Kết quả thực hiện kháng sinh đồ trên đĩa thạch MHA 100
Hình 4.17: Tỷ lệ các chủng ETEC đề kháng với kháng sinh ở ĐBSCL 103
Hình 4.18: Sản phẩm điện di của phản ứng PCR xác định gene SulII (722bp)
trên thạch agarose. 106
Hình 4.19: Sản phẩm điện di của phản ứng PCR xác định gene tetA (888bp)
trên thạch agarose 107
Hình 4.20: Giản đồ phả hệ thể hiện tương quan giữa 11 chủng ETEC mang
gene faeG mã hóa kháng nguyên bám dính F4 119
Hình 4.21: Giản đồ phả hệ thể hiện tương quan giữa 9 chủng ETEC mang
gene fedA mã hóa kháng nguyên bám dính F18 122
Hình 4.22:
S
ai khác trong trình tự nucleotide trên gene faeG của các chủng
ETEC mang kháng nguyên bám dính F4 125
Hình 4.23: Sai khác trong trình tự amino acid trên gene faeG của các chủng
ETEC mang kháng nguyên bám dính F4 127
Hình 4.24: Sai khác trong trình tự nucleotide trên gene fedA của các chủng
ETEC mang kháng nguyên bám dính F18 129
Hình 4.25: Sai khác trong trình tự amino acid trên gene fedA của các chủng
ETEC mang kháng nguyên bám dính F18 130
xvi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

µl Microlitter
µm Micrometer
µM Micromolar
A Adenine
ABTS 2,2’-azino-di3-ethyl-benzthiazoline 6-
sulphonic acid
cơ chất ABTS
ADP Adenosine 5‘diphosphate
AEEC Attaching - Effacing E. coli
AIDA Ahesin involved in diffuse adherence
BCA Bicinchoninic acid reaction
BHI Brain Heart Infusion
bp base pair
BSA Bovine serum albumin
C Cytosine
cAMP Cyclic adenosine monophosphate
CD Crohn disease bệnh Crohn
CFTR Cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator

cfu Colony-forming unit
cGMP Cyclic guanosine monophosphate
CLSI Clinical and Laboratory Standards
Institute

CRGV
Cutaneous and renal glomerular
vasculopathy
Bệnh lý hệ mạch trên da và

cầu thận
Cys Cystein Amino acid Cystein
DAEC Diffusely adherent Escherichia coli E. coli kết dính phân tán
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EAEC Enteroaggregative Escherichia coli E. coli kết bám đường ruột
EAST1 Enteroaggregative heat-Stable Toxin1 Độc tố chịu nhiệt kết tập của vi
khuẩn E. coli
E. coli Escherichia coli Vi khuẩn E. coli
EHEC Enterohaemorrhagic Escherichia coli

E. coli gây xuất huyết ruột
EIEC Enteroinvasive Escherichia coli

E. coli xâm lấn đường ruột
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay

xvii

EMB Eosine Methylene Blue
EPEC Enteropathogenic Escherichia coli

E. coli gây bệnh lý đường ruột
ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli

E. coli sinh độc tố đường ruột
F Fimbriae Kháng nguyên bám dính
G Guanine
GC-C Guanylyl cyclase C
GMP Guanosine Monophosphate

GTP Guanosine 5'triphosphate
HUS Hemolytic Uremic Syndrome Hội chứng tiểu ra huyết sắc tố

KIA Kligler Ion Agar
LB Luria Broth
LPS Lipopolysaccharide
LT Heat – labile enterotoxin

Độc tố không chịu nhiệt
MC MacConkey
MR Methyl Red
MR
1
Mannose resistant kháng với đường Mannose
MS Mannose sensitive Nhạy cảm với đường manno
NA Nutrient Agar
NAD Nicotinamide adenine dinucleotide
NCBI

National centre for biotechnology
information

NB Nutrient Broth
OD Optical density
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase
PFGE Pulsed- Field Gel Electrophoresis
PKA Protein kinase A
PKG Protein kinase G
ST Heat- Stable enterotoxin

Độc tố chịu nhiệt
STEC Shiga toxin-producing Escherichia coli E. coli sản xuất độc tố Shiga
Stx2e Độc tố Shiga biến thể 2e
T Thymine
TAE Tris-Acetate-EDTA
TE Tris-EDTA buffer
TGE Transmissible Gastroenteritis Viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm

xviii

TSA Tryptone Soya Agar
TSB Tryptone Soya Broth
VTEC Verotoxigenic Escherichia coli E. coli sinh độc tố tế bào vero
VP Voges Proskauer





1

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Bệnh tiêu chảy là một trong những bệnh thường gặp nhất trên heo con,
luôn là mối quan tâm của các nhà chăn nuôi. Bệnh xảy ra ở phần lớn các trang
trại chăn nuôi heo khắp nơi trên thế giới và được cho là nguyên nhân gây tổn
thất kinh tế trầm trọng nhất trong chăn nuôi heo (Fairbrother et al., 2002;
Frydendahl, 2002). Có nhiều tác nhân truyền nhiễm gây tiêu chảy ở heo con

và một trong những tác nhân quan trọng nhất đó là Enterotoxigenic
Escherichia coli (ETEC) (Nagy and Fekete, 1999). ETEC là nhóm vi khuẩn E.
coli đóng vai trò gây bệnh tiêu chảy rất quan trọng ở trẻ em dưới 5 tuổi cũng
như bê non và heo con, nhất là trong các trang trại chăn nuôi tập trung (Gyles
and Fairbrother, 2010 và Black et al., 2010).
Trong thời gian gần đây, chăn nuôi heo ở khu vực Đồng bằng sông Cửu
Long (ĐBSCL) phát triển nhanh chóng. Tiêu chảy là bệnh thường xảy ra trên
heo con và E. coli được xác định là một trong các nguyên nhân gây bệnh này
trên heo con theo mẹ và sau cai sữa (Lý Thị Liên Khai, 2001). Nhưng phần
lớn những nghiên cứu của một số tác giả (Nguyễn Khả Ngự và Lê Văn Tạo,
1996; Lý Thị Liên Khai và ctv., 2003; Bùi Trung Trực và ctv., 2004) chỉ dừng
ở việc thực hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên O và
kháng nguyên F, hoặc một số loại độc tố. Trong khi các nghiên cứu trong và
ngoài nước trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli
gây bệnh nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo từng vùng địa lý,
thời gian lấy mẫu và ngay cả trên những đàn khác nhau. Sự thay đổi này có
ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của các biện pháp phòng chống bệnh cho đàn
heo ở các vùng địa lý - kinh tế khác nhau. Vì vậy, việc kiểm tra thành phần
của chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo con để phát hiện đầy đủ các yếu
tố bám dính và các độc tố ruột là rất cần thiết nhằm khống chế bệnh ở vùng
ĐBSCL.
Bên cạnh đó, người chăn nuôi sử dụng nhiều loại kháng sinh để phòng và
điều trị bệnh cho vật nuôi đã tạo nên những chủng đa kháng với kháng sinh,
những chủng này không những gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu
dùng, mà còn ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh sau này. Ngoài ra, sự tồn
dư kháng sinh trong sản phẩm động vật được ghi nhận là mối nguy hiểm cho
sức khoẻ con người do độc tính hoặc gây dị ứng. Do đó, việc xác định chủng
vi khuẩn gây bệnh mang gene kháng kháng sinh là rất quan trọng để có hướng
2

điều trị, điều đó sẽ làm giảm thiệt hại kinh tế do nhiễm khuẩn E. coli (Choi et
al., 2001). Vì vậy, nghiên cứu này giúp phát hiện các chủng ETEC gây bệnh
trên heo con, sự đề kháng và khả năng mang gene kháng kháng sinh của
chúng, nhằm bảo vệ vật nuôi, nâng cao năng suất và chất lượng thịt theo yêu
cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về súc sản phẩm như là thịt sạch, an
toàn và chất lượng để bảo vệ sức khỏe cho con người.
Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu “Xác định một số yếu tố
độc lực của Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên
heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành.
1.2 Mục tiêu
Xác định sự phân bố của các yếu tố độc lực của các chủng ETEC phân
lập từ heo con ở một số tỉnh/thành thuộc ĐBSCL
Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu
chảy trên heo.
Đánh giá mức độ tương đồng gene faeG mã hóa kháng nguyên bám dính
F4, gene fedA mã hóa kháng nguyên bám dính F18 và một số đặc tính di
truyền phân tử của ETEC phân lập từ heo con.
1.3 Nội dung nghiên cứu
1.3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo
con tiêu chảy và môi trường
Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli từ phân heo khỏe, heo con tiêu
chảy và môi trường
Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
1.3.2 Xác định các yếu tố độc lực của ETEC
Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa kháng nguyên bám dính F4,
F5, F6, F18, Intimin và AIDA-I
Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa độc tố STa, STb, LT và EAST1
Thí nghiệm trên động vật thí nghiệm trên chuột và trên heo sau cai sữa
1.3.3 Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của ETEC
Xác định sự kháng kháng sinh của ETEC

Xác định gene kháng kháng sinh
1.3.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của một số
chủng ETEC
3

Phân tích trình tự nucleotide gene faeG và fedA mã hóa tiểu phân tử
FaeG, FedA của kháng nguyên bám dính F4 và F18.
Xác định quan hệ di truyền của các chủng F4 và F18 của ETEC
1.4 Ý nghĩa của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu một cách có hệ thống về một số gene
mã hóa độc lực của các chủng ETEC từ heo khỏe, heo con tiêu chảy, môi
trường chăn nuôi, đánh giá sự phân bố của các gene mã hóa độc lực theo địa
phương, theo nhóm tuổi của heo con.
Kết quả phân tích sự đề kháng và xác định các chủng ETEC nhạy cảm
với kháng sinh để giúp cán bộ thú y chọn những loại kháng sinh điều trị có
hiệu lực cao cho từng địa phương.
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn
ETEC mang các kháng nguyên phù hợp để sản xuất vaccine phòng bệnh tiêu
chảy do E. coli gây ra ở heo con tại khu vực ĐBSCL.
Những kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học phục vụ cho
những nghiên cứu tiếp theo về các biến thể của kháng nguyên bám dính F4 và
F18 để sản xuất vaccine phòng bệnh do ETEC gây ra, đồng thời có giá trị góp
phần bổ sung kiến thức thực tế, tư liệu tham khảo dùng cho nghiên cứu và
giảng dạy môn Vi sinh vật học Thú y, Bệnh truyền nhiễm, Miễn dịch học
trong các trường Đại học Nông nghiệp.
1.5 Những điểm mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở khu vực ĐBSCL ứng dụng kỹ thuật PCR
để xác định chính xác sự hiện diện của các gene mã hóa kháng nguyên bám
dính F4, F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I, độc tố ruột LT, STa, STb, EAST1 và
gene mã hóa khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu

chảy heo con theo mẹ và heo sau cai sữa ở khu vực ĐBSCL, làm cơ sở để giải
thích tình hình tiêu chảy do E. coli ở heo con và hiệu quả phòng chống bệnh
tại khu vực này.
Kết quả của luận án cung cấp thông tin khoa học về sự phân bố những
gene liên quan đến độc lực và đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC phân
lập từ các trại chăn nuôi heo ở khu vực ĐBSCL.
Phân tích mức độ tương đồng gene faeG, fedA và quan hệ di truyền của
các chủng ETEC F4, F18 gây bệnh tiêu chảy ở heo ở ĐBSCL.
4

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn E. coli được Theodore Escherich - người Đức mô tả lần đầu
tiên vào năm 1885 và sau đó được xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở
người và động vật (Levine, 1987). Đây là vi khuẩn thường trú trong đường
tiêu hóa của động vật và người. Vi khuẩn này thường xuất hiện rất sớm ở
đường tiêu hóa người và động vật sơ sinh (sau khi sinh 2 giờ), chúng thường ở
phần sau của ruột với số lượng khoảng 10
7
-10
9
vi khuẩn/gram phân. Ngoài ra,
vi khuẩn E. coli còn được tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong
cơ thể bị bệnh (Gyles and Fairbrother, 2010). Vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh
cho gia súc mọi lứa tuổi, đặc biệt là gia súc sơ sinh (Hirsh, 2004).
2.1.1 Đặc điểm hình thái
E. coli là trực khuẩn đường ruột, Gram âm, là những vi khuẩn hình que,
2 đầu tròn, kích thước dài ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, đường
kính khoảng 1 µm. Không hình thành bào tử, tạo giáp mô mỏng, có lông

quanh cơ thể, một số có lông bám (pili). Khuẩn lạc trên môi trường đặc phát
triển hoàn toàn sau 1 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc có bìa tròn, hoặc nhăn nheo
hoặc nhầy. Một vài chủng có khả năng gây dung huyết (Fairbrother and Gyles,
2006).
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường,
một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản nên
chúng được chọn làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học.
E. coli thuộc loại trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ thích
hợp cho chúng phát triển là 37
o
C, tuy nhiên có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15-
40
o
C, pH thích hợp là 7,2-7,4. Chúng mọc dễ dàng trong MacConkey (MC),
Eosin Methylene Blue (EMB), có khả năng sản sinh dung huyết α và β. Trên
môi trường EMB, khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi, trơn bóng, có màu tím ánh
kim, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm. Trên môi trường MC, vi khuẩn E.
coli lên men đường Lactose hình thành khuẩn lạc màu hồng sáng, to, tròn đều,
mặt khuẩn lạc hơi lồi, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm
(Quinn et al., 2004).

5

2.1.3 Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, lactose, mannitol, maltose,
mannose, xylose, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men các đường
saccharose, raffinose, salicin, esculin, dunxit, glycerol. Ngược lại, vi khuẩn E.
coli không lên men các đường dextrin, emidon, glycogen, inositol, cellobiose,
Metylglycosit (Quinn et al., 2004).

Theo Quinn et al. (2004), vi khuẩn E. coli được định danh bằng phản
ứng sinh hóa qua các môi trường như: môi trường Kligler Iron Agar (KIA),
môi trường kiểm tra indole, môi trường Methyl Red (MR), môi trường Voges
- Proskauer (VP) và môi trường Simmons’ Citrate (Ci). E. coli sinh indole,
phản ứng MR dương tính, VP âm tính, hoàn nguyên nitrate thành nitrite,
không sử dụng ure. Trên môi trường KIA: E. coli lên men đường glucose và
lactose, phần thạch nghiêng và thạch đứng đều chuyển sang màu vàng, làm
nứt thạch; ngoài ra không sinh H
2
S, không cho kết tủa đen. Kết quả xét
nghiệm IMViC của vi khuẩn E. coli như sau:
Indole: trong môi trường có tryptophane, E. coli nhờ có enzyme
tryptophanase sẽ phân giải tryptophane trong môi trường tạo thành indole. Để
nhận diện indole người ta nhỏ vào vài giọt thuốc thử Kovac’s, indole kết hợp
với paradimethylamino-benzaldehyde trong thuốc thử tạo thành hợp chất
rosindole có màu đỏ: indole dương tính.
Methyl Red (MR): trong môi trường có glucose, E. coli tạo nồng độ H
+
cao (pH < 4,5) cho thuốc thử Methyl Red vào môi trường có màu đỏ: MR
dương tính.
Voges – Proskauer (VP): tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình
lên men glucose sẽ cho sản phẩm cuối cùng khác nhau. Một trong số đó là
aceton, sẽ tạo phức hợp màu đỏ với thuốc thử α- naphthol và KOH. E.coli có
VP âm tính (không có màu đỏ).
Citrate: E. coli không sử dụng được nguồn cacbon duy nhất là citrate có
trong môi trường Simmon’s citrate , do đó không làm tăng pH của môi trường,
không làm thay đổi màu xanh lục của môi trường có chứa chất chỉ thị màu
xanh bromothymol. Vi khuẩn E. coli không mọc và không làm thay đổi màu
xanh lá cây của môi trường.
2.2 Phân loại vi khuẩn E. coli gây bệnh

Vị trí phân loại của vi khuẩn E. coli như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria