Thiết kế vector mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng chống chịu ở cây đậu xanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC











THIẾT KẾ

ẬU XANH






LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2011


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong
bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả


Võ Thị Minh Hòa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Vũ Thanh Thanh, Khoa Khoa học Sự sống, trƣờng Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên và TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công
nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những ngƣời đã tận
tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện
và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình,
PGS.TS. Chu Hoàng Hà, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ
Sinh học, là những ngƣời đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu
cho tôi trong suốt thời gian thự .
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới CN. Hoàng Hà, Phòng Công nghệ tế
bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn tốt nghiệp này. Trong thời gian thực tập nghiên cứu, tôi cũng đã nhận đƣợc
sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị
và các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin cảm ơn chân thành các thầy cô giáo trong khoa Khoa học sự sống-
trƣờng Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân
trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu.

, ngày 06 tháng 10 năm 2011
Học viên

Võ Thị Minh Hòa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


MỤC LỤC








MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
2. Mục tiêu nghiên cứu
3. Nội dung nghiên cứu
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
……………


1.1.2.2. T
1.2. HẠN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH CHỊU HẠN

1.2.1. đối với cây trồng ………………….
1.2.2. Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn
1.3. GEN VÀ PROTEIN LTP (Lipid Transfer Protein)
1.3.1. Gen LTP …………………………………………………………
1.3.2. Protein (LTP) ……………………………………
1.4. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA A.tumefaciens …….
1.4.1. Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen vào thực vật
1.4.2.
1.4.3. Các ……
Trang



i
ii
iii
iv
1
1
2
2
3
4
4
4
6
6
8

10

10
11
15
15
17
18
18
19
20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


1.4.4. Thành tựu chuyển gen ở thực vật ………………………………
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. V …………………………………


2.2. P ……………………………………
2.2.1. ………………………………………
2.2.2. ………………………
2.2.3. en LTP ………………………
2.2.4. …………………………


A. tumefaciens CV58C1
A.
tumefaciens CV58C1

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN LTP ……………………………………………
3.1.1. Thiết kế mồi ……………………………………………………
3.1.2. Tách RNA tổng số tổng hợp cDNA …
3.1.3. Kết quả PCR LTP …………………………………
3.1.4.
3.1.5. Kết quả xác định trình tự nucleotide
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
3.2.1. Ghép nối đoạn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3
3.2.2. Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen LTP
3.2.3. Kết quả biến nạp pCB301-LTP vào vi khuẩn A. tumefaciens
3.2.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong các dòng
khuẩn lạc bằng colony-PCR
3.3. CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở
21
24
24
24
25
26
27
27
27
28
29
33
34

35
36

37
38
38
38
38
39
40
41
43
43
43
46

46


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


CÂY THUỐC LÁ
3.3.1. Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá
3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
TRÌNH TỰ GEN ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN EMBL
TÀI LIỆU THAM KHẢO

48
48
50

51
52
52
53



















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin)

bp Base pair
cDNA Complementary DNA
cs Cộng sự
DEPC Diethyl pyrocarbonat
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate)
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EtBr Ethiium bromide
E.coli Escherichia coli
Gus β-glucuronidase
IBA Indole-3-Butyric Acid
Kb kilo base
LB Luria and Bertani
MS Murashige và Skoog
NAA Naphthalene Acetic Acid
OD Optical density (Giá trị mật độ quang)
PCR Polymerase Chaine Reaction
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR
SDS Sodium dodecylsulfat
TAE Tris-acetate-EDTA
Taq Thermus aquaticus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG ĐỀ TÀI

Bảng

Tên các bảng
Trang
2.1

25
2.2
Thành phần phản ứng PCR nhân gen LTP
29
2.3
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen LTP
29
2.4
Thành phần phản ứng ghép nối gen LTP vào vector
31
2.5
Thành phần
34
2.6

34
3.1
Trình tự mồi nhân gen LTP
39
3.2
Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá trên môi trƣờng chọn lọc
51


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG ĐỀ TÀI

Hình
Tên các hình
Trang
3.1
Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen LTP
41
3.2
Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBT-LTP bằng BamHI
42
3.3
So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh HN2 và
trình tự đã công bố AY300807

44
3.4
So sánh trình tự amino acid trong protein LTP của giống đậu xanh
HN2 và AY300807

44
3.5
điện di sản phẩm PCR colony pCB301-LTP
46
3.6
Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCB301-LTP bằng NcoI và NotI
47
3.7
Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp

pCB301-LTP vào A. tumefaciens chủng CV58C1
48
3.8
Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
49
3.9
Quy trình chuyển gen-LTP vào cây thuốc lá K326 invitro từ mô lá
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

50
3.10
Hình ảnh điện di PCR nhân đoạn gen LTP ở cây thuốc lá bằng cặp
mồi đặc hiệu

52


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



1.
Đậu xanh có tên khoa học Vigna radiata L.Wilczek, là cây đậu đỗ
. Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và
Trung Á, phân bổ chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng
khá quen thuộc ở Châu Á và rất phổ biến ở nƣớc ta [11], [13]. Trồng đậu xanh
không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu về dinh
dƣỡng của con ngƣời và vật nuôi mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dƣỡng đất
do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng
sinh [4], [5].

Những năm gần đây tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến đậu xanh
ở nƣớc ta đang có chiều hƣớng gia tăng do khai thác đƣợc một số ƣu điểm
quan trọng của đậu xanh nhƣ: là cây trồng có giá trị kinh tế cao vì là nguồn
thực phẩm có nhiều dinh dƣỡng, đa dạng trong đời sống, thích hợp với tiêu
dùng trong nƣớc và xuất khẩu. Ngoài ra, đậu xanh là loại cây trồng ngắn
ngày, dễ luân canh, xen canh, gối vụ và có khả năng cải tạo đất tốt [14].
Hạn hán đang là một trong những vấn đề gây ảnh hƣởng nghiêm trọng
đến năng suất của cây đậu xanh. , các giống đậu xanh trồng ở
Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém. Chính vì vậy,
nghiên cứu cây đậu xanh có khả năng chịu hạn đang là một trong những đòi
hỏi của thực tiễn. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới và tại Việt Nam
đã đạt đƣợc những kết quả nhất định đối với việc tạo ra các giống đậu xanh
mới bằng các phƣơng pháp chọn giống truyền thống nhƣ chọn dòng tế bào
hay sử dụng phƣơng pháp gây đột biến thực nghiệm. Tuy nhiên, những
phƣơng pháp này vẫn còn có nhƣợc điểm nhƣ thời gian chọn tạo lâu, thí
nghiệm đòi hỏi lƣợng cá thể lớn… Vì vậy, áp dụng các tiến bộ của sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


hiện đại vào cải tiến tính chống chịu của đậu xanh là cần thiết và phù hợp với
xu hƣớng nghiên cứu chung của thế giới [3].
, các nghiên cứu
sinh học phân tử, di truyền và hóa sinh liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật
đã đƣợc làm sáng tỏ ới đã đƣợ ứu chức
năng trên các đối tƣợ (Lipid
Transfer Protein) [1], [2].
LTP tham gia vào quá trình sinh tổng hợp biểu bì ở thực vật giúp hạn
chế sự mất nƣớc trong điều kiện khô hạn. Gen LTP điều khiển và tổng hợp
nên các sản phẩm protein tƣơng ứng tham gia xúc tác sự vận chuyển

phospholipid giữa các lớp màng tế bào, hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp
biểu bì giúp cây hạn chế mất nƣớc [27]. ọng cho việ
. Những kết quả này sẽ
rất có ý nghĩa không chỉ đối với thực tế sản xuất cây đậu xanh mà còn đối với
sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong điều kiện tại
Việt Nam.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế vector
chuyển gen mang gen LTP phân lập từ đậu xanh” nhằm phục vụ việc tạo
cây đậu xanh chuyển gen chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- T vector mang gen LTP liên quan đến khả năng chịu hạn nhằm
tạo cây đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt
- cây mang gen LTP.
3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập gen LTP từ giống đậu xanh đị Mỹ Đức – Hà
Nội

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



n gen mang gen LTP
Biến nạ ổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyể )
Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá bằng PCR
4. Ý nghĩa khoa học :
Là cơ sở cho việc chuyển gen LTP nhằm tạo cây đậu xanh chuyển gen
có khả năng chống chịu với điều kiện môi trƣờng khô hạn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY ĐẬU XANH
1.1.1. Sơ lƣợc về cây đậu xanh
Cây đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) là loại cây đậu ăn hạt, thân
thảo. V. radiata thuộc ngành Magnoliopyta, lớp Magnoliopsida, bộ
Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna. Chi Vigna là một trong những chi
lớn của họ đậu bao gồm khoảng 150 loài thuộc 7 chi phụ là: Vigna,
Haydonia, Ceratotropic, Macrohynchus, Plectropic, Lasionspron,
Sigmoidotrotopis [5].
Cây đậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt bao gồm các bộ
phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt.
Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ
chính thƣờng ăn sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm. Rễ
phụ có khoảng 30 – 40 cái và có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi
thành. Hạn chế của bộ rễ cây đậu xanh là khả năng chịu hạn và chịu úng
tƣơng đối kém. Nếu bộ rễ phát triển tốt thì bộ lá xanh lâu, cây ra nhiều hoa
quả, hạt mẩy [11]. Đặc biệt, rễ đậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi
khuẩn cố định đạm Rhizobium. Ngƣời ta nhận thấy rằng những nốt sần chứa
vi khuẩn hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnh hơn
loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trƣởng. Trung bình mỗi vụ, một ha
đậu xanh có thể tổng hợp 85 – 107 kg nitơ bù lại cho đất làm đất tơi xốp hơn
[9], [10].
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng
40 – 70 cm, đƣờng kính trung bình từ 8 – 12 mm, mọc thẳng đứng hoặc hơi
nghiêng. Thân đậu xanh có màu xanh hoặc màu tím, có một lớp lông màu nâu
sáng bao bọc. Trên thân chia 7 – 8 đốt, và có trung bình từ 10 -12 cành, thân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


phân cành muộn, có từ 1 – 5 cành mọc ra từ các đốt còn lại các cành mọc ra
từ nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh hơn.
Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thùy với các hình dạng
ovan, thuôn dài, lƣỡi mác, chẻ thùy. Trên thân chính có 7 – 8 lá, cả hai mặt
trên và dƣới của lá đều có lông bao phủ. Diện tích của các lá tăng dần từ các
lá mọc phía dƣới lên các lá mọc ở giữa thân rồi giảm dần lên các lá mọc ở
phía ngọn. Số lƣợng lá, kích thƣớc, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi
tùy thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ [5], [13].
Hoa đậu xanh là hoa lƣỡng tính tự thụ phấn, mọc thành chùm xếp xen
kẽ nhau ở trên cuống từ các mắt thứ ba thứ tƣ ở trên thân cây, còn các cành thì
tất cả các mắt đều có khả năng ra hoa. Sau khi cây mọc 35 – 40 ngày thì nở
hoa và kéo dài từ 10 – 15 ngày thì nở hết. Hoa đậu xanh thƣờng nở rải rác,
các hoa ở thân nở trƣớc, hoa ở cành nở sau, có khi còn chậm hơn các hoa nở ở
ngọn cây. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bƣớm, có màu xanh tím hoặc
vàng nhạt. Hoa đậu xanh nở sau 24 giờ là tàn, tràng hoa rụng, quả hình thành
và sau đó 20 ngày là quả chín.
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp hình trụ, dạng tròn, hơi dẹt, dài từ 8 -
14 cm. đƣờng kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả,
đa số quả thẳng, có một số hơi cong , khi còn non quả có màu xanh, khi chín
quả có màu vàng, nâu hoặc đen. Mỗi cây có từ 8 – 35 quả, mỗi quả có từ 5 –
15 hạt. Cũng nhƣ các bộ phận khác trên cây đậu xanh (thân, cành, cuống, lá)
trên lớp vỏ quả đậu xanh thƣờng bao phủ một lớp lông mịn dài khoảng 0,3 –
0,4 mm. Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống
chịu của cây. Những giống đậu xanh thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm
vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, màu trắng, vào thời kỳ
chín hoàn toàn lông trên quả thƣờng rụng đi hoặc tự tiêu biến [4], [5]. Quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


đậu xanh chín rải rác, các quả sinh ra từ các chùm hoa nở trên thân thƣờng
nhiều, to, hạt mẩy hơn quả của các chùm hoa nở ở cành cây.
Hạt đậu xanh có hình trụ, hình trụ hơi cạnh, hình ovan, hình tròn, hình
thoi, Màu sắc vỏ hạt có thể là xanh mốc, xanh bóng (xanh sáng), xanh nâu,
xanh lục, vàng mốc, vàng bóng (vàng rơm),… Ruột hạt màu vàng, xanh hoặc
xanh nhạt. Trọng lƣợng 1000 hạt từ 50 – 70 gam [4]. Hạt đậu xanh chứa 56 –
60% glucid, 23 – 28% protein, 1,3% lipid, 12% nƣớc, các vitamin B1, B2,
C,… và các muối khoáng nhƣ Ca, Na, Fe, K,… [13]
Trong những năm gần đây cây đậu xanh đƣợc xem là loại cây trồng có
giá trị kinh tế cao, không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nƣớc mà
còn là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Protein đậu xanh đƣợc đánh giá là
có chất lƣợng tốt do có chứa đầy đủ các amino acid không thay thế nhƣ
leucine, isoleucine, lysine, methionine, valine,… và hàm lƣợng của chúng
tƣơng đối trùng với tiêu chuẩn dinh dƣỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông
lƣơng thế giới (FAO) và tổ chứ thế giới (WHO) đƣa ra [24]. Hạt đậu
xanh không những đƣợc dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon
miệng và bổ dƣỡng mà còn có giá trị trong y học để giải nhiệt, giải độc.
Ngoài ra, cây đậu xanh còn là loại cây trồng ngắn ngày, có thể luân
canh, xen canh gối vụ. Trồng đậu xanh có tác dụng cải tạo và bồi dƣỡng đất
do rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi
Rhizobium có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạ
đã để lại một lƣợng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch làm cho
đất tơi xốp và giàu dinh dƣỡng hơn [13].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu xanh
1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu đậu xanh
Gần đây, công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

đƣợc nghiên cứu theo hƣớng tạo giống cho năng suất, chất lƣợng cao, tạo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


giống có khả năng kháng sâu, bệnh hại, tạo giống có khả năng chống chịu tốt
với điều kiện ngoại cảnh bất lợi [1], [12].
Ở Việt Nam các nghiên cứu tập trung đi sâu vào hai hƣớng nghiên cứu
cơ bản trong sản xuất đậu đỗ nói chung và đậu xanh nói riêng đó là:
Giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu với
điều kiện ngoại cảnh bất lợi.
Đƣa cây đậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống trồng
độc canh hóa ở các vùng và cải tạo các vùng đất bị thoái hóa [4], [5].
Vì vậy, công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ở nƣớc ta đã
đƣợc quan tâm phát triển và đã đạt đƣợc một số thành tựu đáng ghi nhận nhƣ:
Lê Khả Tƣờng và cs (2000) nghiên cứu đực điểm hình thái, sinh lí, khả
năng chống chịu sâu bệnh hại và thử nghiệm giống đậu xanh KP11. Kết quả
đã đƣợc hội đồng khoa học công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2001 áp
dụng cho vùng Bắc Trung Bộ [10].
Chu Hoàng Mậu (2001), đã tạo đƣợc hai dòng đậu xanh MX1103 và
TX16012 có năng suất cao và có khả năng chịu hạn tốt bằng phƣơng pháp
thực nghiệm [15].
Chu Hoàng Mậu (2001), đã tiến hành nghiên cứu hàm lƣợng protein,
thành phần và hàm lƣợng các amino acid trong hạt các giống đậu xanh đột
biến và giống gốc để đánh giá chất lƣợng hạt của các giống đậu xanh. Kết quả
cho thấy hạt của các giống đậu đột biến MX103 có hàm lƣợng protein là
20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lƣợng amino acid của các
giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng [16].
Cùng với sự phát triển ngày càng cao của Công nghệ Sinh học với việc
áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật gen, các nhà khoa học đã

thành công trong công việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


chịu nhƣ gen chịu hạn, chịu muối, chịu lạnh,… và đánh giá quan hệ di truyền
của một số giống đậu xanh.
Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di
truyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006) đã phân lập và xác định trình tự gen
PLC3 (Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống
đậu xanh KP11 và MN93 [22].
Cây đậu xanh vốn là loại cây trồng chịu hạn kém do đó việc nghiên cứu
về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen chịu hạn của cây đậu
xanh cũng đã đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo
ra các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt.
Liu K.H và cs (2003) đã phân lập và xác định trình tự gen LTP ở đậu
xanh có liên quan đên tính chịu hạn, đặt tên Vrltpl và Vrltpl2 [39].
Kim Y.J và cs (2003) đã phân lập và xác định trình tự gen PLC3 hay
Chen Y. J và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh là
VrHsc70 – 1, VrHsc70 – 2, VrHsc70 – 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn tạo
giống đậu xanh có khả năng chịu khô hạn [32].
Malgorzata G. và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hóa cystatin ở
đậu xanh nhằm nghiên cứu, chọn tạo giống đậu xanh chóng chịu tốt [40].
Sonia và cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế
enzym α-amylase vào đậu xanh nhờ vi khuẩn A. tumefaciens [50].
1.1.2.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam.
Trong những năm gần đây, do nhu cầu của con ngƣời về dinh dƣỡng
protein thực vật cũng nhƣ việc khai thác đƣợc những ƣu điểm của cây đậu
xanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh trên thế giới cũng nhƣ ở Việt

Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nƣớc sản xuất đậu xanh, trong
Thái Lan, Ấn Độ, Philipin, Srilanca, Pakistan, Trung Quốc,…đƣợc coi là
những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lƣợng đậu xanh. Tại trung
tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á đóng tại Đài Loan có một bộ sƣu
tập giống đậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống.
Ở Việt Nam, cây đậu xanh đƣợc trồng từ rất lâu và ở nhiều địa phƣơng
trong cả nƣớc. Trong những năm trƣớc, đậu xanh chỉ đƣợc xem nhƣ một loại
cây trồng phụ, trồng xen với các loại cây khác nhằm tận dụng đất thừa và
không đƣợc quan tâm đúng mức nên năng suất đậu xanh thấp. Ở nƣớc ta, có
thể phân chia các vùng trồng đậu xanh nhƣ sau:
Vùng núi phía Bắc tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình,
Bắc Kạn, Tuyên Quang. Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng
suất thấp.
Vùng đồng bằng và trung du Bắc bộ gồm các tỉnh Hà Nội, Vĩnh Phúc,
Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Hải Phòng,
Hà Nam, Ninh Bình, Thái Bình Và Thanh Hóa. Do xu hƣớng thâm canh tăng
vụ vì có hệ thống tƣới tiêu và đầu tƣ khá hoàn chỉnh nên năng suất vùng này
cao. Việc trồng thí đểm và tiếp nhận mô hình giống đậu xanh cải tiến khả thi
hơn. Đây là điều kiện cơ bản trong phát triển sản xuất.
Vùng duyên hải Trung Bộ Và Tây Nguyên. Đây là vùng có diện tích và
sản lƣợng đậu xanh lớn do khí hậu thuận lợi để trồng đậu xanh quanh năm.
Tuy nhiên, hàng năm tại thời điểm thu hoạch vụ hè thu thƣờng gặp mƣa bão
nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lƣợng.
Vùng Đông Nam bộ. Đây là vùng sản xuất đậu xanh có quy mô lớn
chiếm 26% diện tích gieo trồng cả nƣớc. Tuy nhiên, năng suất trung bình của

vùng này còn thấp do không có thâm canh và việc sử dụng giống đậu xanh
năng suất thấp, khả năng chống chịu kém [5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Hiện nay, do nhu cầu sử dụng đậu xanh ngày càng cao, do đó diện tích
trồng đậu xanh có xu hƣớng tăng, chất lƣợng giống cũng nhƣ phƣơng pháp
canh tác cũng đã đƣợc quan tâm nhiều hơn.
Cùng với sự biến đổi khí hậu toàn cầu là sự nóng lên của trái đất và hạn
hán đang là mối đe dọa rất lớn cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và nền
nông nghiệp của Việt Nam nói riêng. Vì vậy, bên cạnh sự nỗ lực cải thiện khí
hậu toàn cầu nhằm bảo vệ môi trƣờng thì việc nghiên cứu chọn tạo các giống
mới có năng suất cao, chống chịu đƣợc với các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng ngoại cảnh là xu hƣớng của thời đại.
ỊU HẠ TRỒNG
1.2.1. Hạn hán và tác động của hạn hán đối với cây trồng
Hạn hán là hiện tƣợng thƣờng xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên
quan trực tiếp đến vấn đề nƣớc trong thực vật. Khái niệm hạn dùng để chỉ tình
trạng thiếu nƣớc của thực vật do môi trƣờng gây nên, làm ảnh hƣởng đến sự
sinh trƣởng và phát triển của thực vật, từ đó ảnh hƣởng đến năng suất và sản
lƣợng cây trồng
Hạn hán làm cho hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi, quá trình
trao đổi chất bị đảo lộn, hoạt động sinh lý bị kìm hãm, quá trình sinh trƣởng
và phát triển bị ức chế [12]. Khi hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi
:
Thay đổi các tính chất lý hóa của chất nguyên sinh, làm tăng độ nhớt
của chất nguyên sinh làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán,
khả năng thủy hóa và tính đàn hồi của keo nguyên sinh.
Thay đổi đặc tính hóa keo từ trạng thái sol rất linh động thuận lợi cho

các hoạt động sống sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trở
các hoạt động sống.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nƣớc sẽ bị đảo lộn từ hoạt động tổng
hợp là chủ yếu khi đủ nƣớc chuyển sang hƣớng phân giải khi thiếu nƣớc. Quá
trình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và acid nucleic, kết quả là
giải phóng và giải phóng NH3 gây độc cho cây và có thể làm cây chết.
c chế hoạt động quang hợp. Do khí khổng đóng nên
thiếu CO2, lục lạp thể bị phân hủy, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo và
khô chết, diện tích quang hợp giảm, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp
ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn.
Thiếu nƣớc ban đầu sẽ làm tăng hô hấp, về sau giảm hô hấp nhanh,
hiệu quả sử dụng của năng lƣợng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt
là chính.
Hạn làm mất cân bằng nƣớc trong cây: lƣợng nƣớc thoát ra lớn hơn
lƣợng nƣớc hấp thu vào cây làm cho cây bị héo. Dòng vận chuyển vật chất
trong cây bị ức chế rất mạnh: sự hút chất khoáng giảm do tốc độ dòng hút
chất khoáng giảm. Thiếu nƣớc kìm hãm tốc độ vận chuyển chất đồng hóa về
các cơ quan dự trữ và có thể có hiện tƣợng “chảy ngƣợc dòng‟‟ các chất dự
trữ về các cơ quan dinh dƣỡng. Kết quả làm giảm năng suấ của cây
trồng. Quá trình sinh trƣởng và phát triển bị kìm hãm
Ức chế sinh trƣởng: thiếu nƣớc thì đỉnh sinh trƣởng không tiến hành
phân chia đƣợc, quá trình dãn của tế bào bị ức chế làm cho cây sinh trƣởng
chậm nên nƣớc đƣợc xem là yếu tố nhạy cảm trong sự sinh trƣởng của tế bào.
Ức chế ra hoa, kết quả: thiếu nƣớc ảnh hƣởng đến quá trình phân hóa
hoa và đặc biệt là quá trình thụ tinh. Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm,
ống phấn không sinh trƣởng đƣợc, sự thụ tinh không xảy ra và hạt sẽ bị lép

dẫn đến giảm năng suất cấy trồng [23].
1.2.2. Cơ sở hó ủa tính chịu hạn ở cây trồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Thực vật có khả năng ngăn ngừa thƣơng tổn khi bị tổn thƣơng gọi là
tính chống chịu. Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố
sinh thái của môi trƣờng nhƣ hạn, nóng, lạnh, sƣơng,…Khi các nhân tố này
vƣợt quá giới hạn sẽ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây
trồng, dẫn đến năng suất giảm. Phản ứng chủ yếu của cây đối với hạn là sự
đóng khí khổng, giảm sự thoát hơi nƣớc, giảm quang hợp tăng tích lũy ABA,
prolin, manitol, sorbitol… Nhờ vậy mà thực vật có thể thích nghi với các điều
kiện khắc nghiệt của môi trƣờng ngoại cảnh.
Một trong những xu hƣớng để thực vật chống lại hạn là dựa vào khả
năng làm tăng áp lực nội tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào cũng nhƣ
giảm kích thƣớc tế bào. Trên phƣơng diện hóa sinh, thực vật xảy ra nhiều biến
đổi nhằm chống lại hạn hán nhƣ giảm phức hợp CO
2
, giảm tổng hợp protein
và các acid nucleic, tăng hoạt tính RNase và hàm lƣợng prolin, tăng nồng độ
các chất hòa tan. Ngoài ra, thực vật còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữ
không để t nƣớc hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nƣớc thông qua những
sự biến đ i về cấu trúc và hình thái nhƣ: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyên
sâu, giảm diện tích lá…[22].
Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của thực vật nói chung và của
đậu xanh nói riêng rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý hóa sinh và do
nhiều gen quy định. Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn
của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật đã
đƣợc biết đến nhƣ: vai trò của bộ rễ: khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu,

abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease, các gen điều
khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC…) [12].
Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nƣớc của cây phụ thuộc vào bộ rễ.
Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khỏe, to thì có khả năng hút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


nƣớc ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấy
đƣợc nhiều nƣớc.
Ở cây đậu xanh, hình thái rễ rất đa dạng. Các giống đậu xanh địa
phƣơng thƣờng có bộ rễ dài hơn các giống khác.
Khả năng điều chỉnh áp suất thảm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị
mất nƣớc do hạn, nóng, lạnh… Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng
lên giúp rễ cây nhận đƣợc một lƣợng nƣớc rất nhỏ còn lại trong đất. Các chất
và gen tƣơng ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh
tranh nƣớc với môi trƣờng xung quanh bao gồm: ion K
+
; các amino acid nhƣ
prolin, estonine; các chất đƣờng nhƣ sucarose, fructant, manitol, pinitol và các
chất khác nhƣ glycine betain, β- alanin betain. Các chất này có khả năng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nƣớc và giữ nƣớc vào tế bào hoặc
ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na
+
[22].
Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh
sinh lý, sinh trƣởng và phát triển đáp ứng với môi trƣờng của thực vật bậc
cao. ABA chủ yếu đƣợc tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-
epoxycarotenoids với sự tham gia của enzym 9-cis-epoxycarotenoid
dioxygenase [42]. ABA đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình của tế

bào thực vật nhƣ: sự phát triển củ hạt, sự ngủ, sự nẩy mầm, sinh trƣởng phát
triển và đáp ứng với stress của môi trƣờng. Đối với stress hạn, ABA có vai trò
điều chỉnh sự trao đổi nƣớc trong cây, hạn chế sự mất nƣớc làm cây thích
nghi với điều kiện khô hạn. Về cơ chế tác động ngƣời ta cho rằng ABA làm
biến đổi điện thế hóa qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K
+
[37].
Các nhân tố gây ức chế protease: khi stress hạn xẩy ra, các protein bị
biến tính và bị tổn thƣơng. Cystein protease tham gia loại bỏ các protein biến
tính. Quá trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cystein protease gọi là
cystatin [40].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Các gen phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các
gen chức năng thông qua việc bám vào đoạn DNA điều khiển (cis acting
element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tƣơng tác với RNA
polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức
năng. Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn đã đƣợc
quan tâm nghiên cứu nhƣ: DREB, ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY.
Mỗi nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn có trật tự cis
acting element riêng biệt và promotor trên mỗi gen chức năng chứa một hay
nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã.
Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn đƣợc biết đến
là: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein – HSP), môi giới phân tử (Molecular
chaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C
(PLC), protein vận chuyển lipid (LTP).
HSP đƣợc tổng hợp trong qua trình sinh trƣởng, các giai đoạn biệt hóa
các mô, thời kỳ sinh sản, đặc biệt đƣợc tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực

đoan nhƣ hạn, nhiệt độ cao, muối cao. Sự xuất hiện của HSP có chức năng
ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy của stress. Dựa vào khối lƣợng phân tử
ngƣời ta chia HSP thực vật thành 6 nhóm khác nhau: 8.5, 20, 60, 70, 90,
11kDa. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử
(MGPT), (HSP70), (HSP60) nhƣng cũng có những HSP không phải là môi
giới phân tử, ví dụ HSP 8,5 kDa (Ubiquitin).
Các MGPT là yếu tố chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các
điều kiện sinh trƣởng cực thuận và đối lập. Chức năng chính của MGPT là
tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới đƣợc tổng hợp,
chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự
hủy hoại biến tính [12]. MGPT có 5 họ chính là HSP70 (Dank), HSP 60
(Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


giới phân tử đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70. HSP70 đã
đƣợc phân lập ở đậu xanh [32].
Protein LEA cũng đƣợc chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nƣớc [34], [44], [48]. Protein LEA đƣợc phân chia làm 5 nhóm chính trên cơ
sở chuỗi trình tự amino acid của nó: nhóm 1-D19, nhóm 2-D11 (dehydrin),
nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5D29 [33]. Protein LEA thực hiện chức
năng nhƣ: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính,
điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Nó không những chỉ đƣợc phát hiện trong hạt
mà còn trong các mô tăng trƣởng khi cây bị stress do thiếu nƣớc, do mặn, và
do lạnh. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của
nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự mất nƣớc [47].
Protein LEA đƣợc tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của quá trình hình
thành phôi.
Gen PLC liên quan đến sự huy động canxi. Canxi hòa tan đƣợc xem

nhƣ chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào có
phản ứng bảo vệ. Sự truyền tín hiệu canxi trong suốt quá trình stress hạn và
muối đã đƣợc nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao [48]. Gen LTP liên quan
đến quá trình sinh tổng hợp biểu bì. Khi bị stress hạn, LTP đƣợc kích thích
tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nƣớc nhờ tăng độ dày
của lớp vỏ ngoài. Ở đậu xanh, gen LTP cũng đã đƣợc phân lập và công bố
trên ngân hàng gen quốc tế [51].
1.3. GEN LTP
1.3.1. Gen LTP
Gen LTP thuộc họ gen pathogensis relate, có khả năng tổng hợp ra
protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Các
nghiên cứu đã cho thấy, LTP có khả năng tạo phức với một số axit béo và xúc
tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào. LTP đƣợc gắn tại một vị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm nhƣ một receptor
vận chuyển axit béo qua màng tế bào. LTP đã đƣợc chiết ra từ protein ở các
loài thực vật khác nhau và hàm lƣợng cao nhất LTP đã đƣợc tìm thấy ở lớp
biểu bì bên ngoài cũng nhƣ xung quanh các gân lá [29]. Hiện nay, LTP ở thực
vật đƣợc biết có 4 nhóm lớn:
Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hóa protein đã đƣợc cô
lập và biểu hiện ở trong quả.
Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein đã đƣợc cô lập
và biểu hiện trong hạt.
Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein đƣợc biểu hiện
trong mô lá. Chúng đƣợc tạo ra khi có những ảnh hƣởng của môi trƣờng nhƣ
tình trạng khô hạn và các tác nhân có thể gây bệnh.
Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptid

đƣợc cô lập và biểu hiện trong hoa [35], [31].
Ở cây đậu xanh, Liu K.H và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạng
khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [39]. Trình tự các
amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang
tính bảo thủ cao ở thực vật. Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm
nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dƣỡng thì
mRNA của Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ.
Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi nhƣ stress hạn hay muối
hoặc khi hàm lƣợng ABA ngoại bào tăng cao sẽ làm tốc độ phiên mã của
mRNA Vrltp1 và Vrltp2. Từ đó đƣa ra giả thuyết ràng gen LTP có ảnh hƣởng
rõ rệt tới sự phát triển của các mô non và rất có thể đóng vai trò quan trọng
trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn.
Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trƣờng, các nhân tố nhƣ
hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đƣờng truyền tín hiệu, … sẽ điều