Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Đồ án tốt nghiệp -1- SVTH: Nguyễn Văn Thân
LỜI MỞ ĐẦU
Trong vài thập kỹ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh
học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết
trong các lĩnh vực kinh tế. Enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các
quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế đáp ứng
nhu cầu ngày càng tăng của xã hội.
Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng với nhiều mục
đích và tác động với nhiều mức độ khác nhau. Enzym có thể tham gia cải thiện hoặc
tiêu chuẩn hóa các quá trình chuyển hóa, từ đó cho phép nhận các sản phẩm mới hay
các sản phẩm có chất lượng cao hơn. Đặc biệt enzym cũng có thể can thiệp chính vào
quá trình chế biến và đóng vai trò công cụ công nghệ.
Hàng năm lượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn
với giá trị trên 500 triệu USD được phân bố trong các lĩnh vực khác nhau.
Ngành công nghệ enzym trên thế giới phát triển khá mạnh, đặc biệt là ở các nước
Châu Âu, ở Châu Á có nước Nhật Bản với các chế phẩm enzym khá đa dạng chiếm
khoảng 12-15% thị trường thế giới. Việt Nam ngành công nghiệp sản xuất enzym phát
triển chưa mạnh lắm. Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym là một hướng
đi đầy triển vọng cho ngành công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta.
Thông thường sản xuất chế phẩm enzym đi từ ba nguồn: động vật, thực vật, và vi
sinh vật. Đối với nguồn enzym từ động vật và thực vật ở cuối thế kỷ 19 và 20, người ta
thường chỉ khai thác những gì có sẵn trong thiên nhiên, chưa đưa ra một quy trình
công nghệ theo mô hình công nghiệp hoàn chỉnh. Và còn nhiều yếu tố rủi ro, khó khăn
về trang thiết bị.
Ngày nay ngành công nghiệp sản xuất enzym từ vi sinh vật rất phát triển. Các
proteaza là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay, tiếp đến là các enzym amylaza,
glucoizomeraza, cellulaza, pectinaza Trong vi sinh vật, để sản xuất enzym proteaza
và amylaza thì vi khuẩn và nấm mốc là hay dùng nhất. Tuy nhiên ở nấm mốc thì trong
cùng điều kiện có thể tổng hợp nhiều enzym cùng một lúc và enzym tạo thành được sử
dụng với nhiều mục đích khác nhau.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và

amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -2- SVTH: Nguyễn Văn Thân
Xuất phát từ tầm quan trọng đó của chế phẩm enzym và được sự hướng dẫn của
cô giáo Th.S Phan Thị Bích Ngọc tôi chọn đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình sinh tổng hợp hai enzym proteaza và amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae”. Sở dĩ tôi chọn chủng Aspergillus oryzae này là do ở chủng nấm mốc này khả
năng sinh tổng hợp hai enzym amylaza và proteaza đều rất mạnh. Hơn nữa enzym
proteaza và amylza từ nấm mốc được sử dụng rất nhiều vào ngành công nghiệp thực
phẩm. Và trong dân gian đã dùng nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất nước chấm.
Và ngày nay một số công trình nghiên cứu đang hoàn thiện công nghệ lên men nước
chấm nhờ enzym của nấm mốc. Đề tài nghiên cứu của tôi được tiến hành theo hướng
sau:
1. Tiến hành phân lập lại chủng nấm mốc Aspergillus oryzae từ Viện Công
Nghiệp Thực Phẩm Hồ Chí Minh.
2. Khảo sát khả năng sinh hai enzym proteaza và amylaza của chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae.
3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Do thời gian làm đề tài có hạn và sự hiểu biết về enzym còn hạn chế. Cho nên đề
tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, vướng mắc. Tôi rất mong được sự góp ý rất
chân thành của các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -3- SVTH: Nguyễn Văn Thân
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vi sinh vật sinh tổng hợp enzym.
Người ta thường khai thác enzym amylaza, bromelin, papain từ thực vật, pepsin,
chimotripsin, renin từ động vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới thực vật hay giới
động vật là mỗi loài chỉ có thể cho ta một loại enzym nào đó, ví dụ như malt cho

enzym amylaza, dứa cho enzym bromelin, đu đủ cho enzym papain
Riêng thế giới vi sinh vật cho ta tất cả các enzym đã được biết còn lại. Vi sinh vật
là giới sinh vật được xem như nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong
thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác enzym nhiều từ vi sinh vật và được
ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất.
So với nguồn enzym khai thác từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh
vật có những ưu điểm quan trọng sau đây:
1- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh. Do dó chỉ trong một thời gian ngắn
ta có thể thu được một lượng enzym rất lớn.
2- Enzym từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa một khối
lượng vật chất rất lớn. Người ta đã làm thí nghiệm và cho biết rằng chúng có khả năng
chuyển hóa một khối lượng vật chất lớn hơn 30-40 lần khối lượng của tế bào vi sinh
vật tạo ra chúng.
3- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzym rẻ tiền và dễ kiếm.
4- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết, điều kiện địa lý như nuôi,
trồng động vật và thực vật.
5- Hoàn toàn có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp và hoàn toàn kiểm soát
được quá trình sản xuất. [5, tr 197].
1.1.1. Vi sinh vật tham gia tổng hợp enzym amylaza.
Các nhà khoa học cho biết enzym amylaza được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp
nhiều nhất. Ở các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn.
Các loại enzym amylaza thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm:
α
-amylaza,
β
-amylaza, glucoamylaza. Hệ enzym amylaza là một trong những hệ enzym được
nghiên cứu sớm nhất và có nhiều công trình nghiên cứu được công bố nhất.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -4- SVTH: Nguyễn Văn Thân

Các giống được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzym amylaza bao
gồm: Aspergillus oryzae, Asp. usami, Asp. awamori, Asp. batatae;
1.1.2 Vi sinh vật tham gia tổng hợp enzym proteaza.
Proteaza là một loại enzym tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit
ngắn và cuối cùng tạo thành các axit amin và NH
3
.
Enzym proteaza đầu tiên được nghiên cứu không phải là các proteaza của vi sinh
vật mà là các proteaza của động vật (chủ yếu là proteaza trong bộ tiêu hóa của động
vật).
Từ những năm 1950 sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch protein,
người ta đã thu nhận được những chế phẩm proteaza tinh khiết hơn. Cũng từ đây các
nhà khoa học cũng bắt đầu những nghiên cứu proteaza của vi sinh vật. Tuy nhiên trước
đó vào năm 1918 - 1919, Wakman đã phát hiện khả năng phân giải protein của xạ
khuẩn. Từ đó đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố theo chiều hướng này.
Ngày nay các loại enzym proteaza từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và được
sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, y học và nông nghiệp.
Ưu điểm lớn nhất của proteaza từ vi sinh vật là chúng rất phong phú về chủng
loại. [5, tr 201].
1.2. Nấm mốc và enzym.
1.2.1. Nấm mốc.
1.2.1.1. Đặc điểm chung của nấm mốc.
Nấm mốc là tên chung để chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men cũng không
phải là các nấm lớn có quả thể. Đây là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ,
sợi bông, tạo khuẩn ty ở dạng bột Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào
tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu
Trong thực phẩm nấm mốc xuất hiện trên bề mặt nước chấm, bánh mỳ để lâu
ngày. Mặt khác nấm mốc có thể tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác như là tác
nhân quan trọng của quá trình sản xuất nước chấm, tương, chao, đường, axit hữu cơ.
Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển trên một số môi trường mà nấm

men và vi khuẩn không thể phát triển được như ở môi trường có áp suất thẩm thấu, độ
ẩm và độ axit lớn. [7, tr 57].
1.2.1.2. Cấu tạo của nấm mốc.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -5- SVTH: Nguyễn Văn Thân
Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh, có cấu tạo đơn
bào hoặc đa bào. Sợi nấm có kích thước bề dày đường kính từ 1- 10
µ
m hoặc 20
µ
m,
chiều dài có thể lên đến vài chục cm. Khi nấm mốc phát triển sẽ tạo thành hệ sợi nấm
phát triển trên bề mặt môi trường thì gọi là khuẩn ty ký sinh và ăn sâu vào môi trường
thì gọi là khuẩn ty dinh dưỡng hay khuẩn ty cơ chất. Đến giai đoạn trưởng thành từ các
khuẩn ty ký sinh sẽ hình thành các cơ quan sinh sản gọi là bào tử. Một số loại nấm
mốc đơn bào, bậc thấp như lớp Phycomycetes trong đó điển hình là Mucor, Rhizopus,
khuẩn ty thường không có vách ngăn, toàn bộ khuẩn ty được coi là một tế bào phân
nhánh, đa nhân. Còn các khuẩn ty có vách ngăn thì tạo nên cơ thể đa bào như
Penicillium, Aspergillus.
Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục tố, do đó không có khả năng tiến
hành quang hợp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các thức ăn
có sẵn qua bề mặt của các khuẩn ty, đó là các cơ thể ký sinh hoặc hoại sinh. Cấu tạo
bên trong của tế bào nấm tương tự vi khuẩn, nấm men có nghĩa là chúng cũng được
cấu tạo từ ba phần cơ bản của tế bào sống: Thành tế bào, nguyên sinh chất và nhân.[7,
tr 57].
1.2.1.3. Sinh sản của nấm mốc.
Nấm mốc có hai hình thức sinh sản chính đó là: Sinh sản vô tính và sinh sản hữu
tính.
Sinh sản vô tính gồm:

- Sinh sản bằng khuẩn ty: Tức là bằng sợi nấm. Từ một khuẩn ty riêng rẽ gặp
điều kiện thuận lợi dễ dàng phát triển tạo thành một khuẩn ty thể.
- Sinh sản bằng bào tử: Sinh sản bằng bào tử nội sinh và bào tử ngoại sinh.
+ Sinh sản bằng bào tử ngoại sinh gồm ba hình thức chính: Sinh sản bằng bào
tử dày, sinh sản bằng bào tử trứng, sinh sản bằng bào tử chồi.
+ Sinh sản bằng bào tử nội sinh.
+ Sinh sản bằng bào tử đỉnh.
Sinh sản hữu tính gồm các hình thức sau:
Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp, sinh sản bằng bào tử noãn hay bào tử trứng, sinh
sản bằng bào tử túi.[7, tr 58]
1.2.1.4. Phân loại nấm.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -6- SVTH: Nguyễn Văn Thân
Ngành nấm chia làm 5 lớp:
1- Lớp cổ khuẩn: bao gồm các nấm nguyên thủy nhất, có cấu tạo hình sợi và sinh
sản chủ yếu bằng động bào tử.
2- Lớp tảo khuẩn: Gồm nấm hạ đẳng có hình sợi đơn bào. Sinh sản hữu tính bằng
noãn giao hay tiếp hợp. Dựa vào đặc tính ấy mà người ta chia thành hai lớp phụ:
-Lớp phụ nang khuẩn: Sinh sản tiếp hợp bằng hai tế bào khác giới tính vì thế
bào tử của chúng gọi là hợp tử.
-Lớp phụ tiếp hợp khuẩn: Sinh sản hữu tính theo lối tiếp hợp, từ hai sợi nấm
khác giới tính xích lại gần nhau và tạo thành hợp tử. Tiếp hợp tử này sau một thời gian
nảy mầm sẽ tạo thành bào tử nang. Lớp phụ tiếp hợp khuẩn bao gồm nhiều họ. Họ
Mucoracea là họ nấm mốc có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Họ
này gồm hai giống: Mucor và Rhizopus.
3- Lớp nang khuẩn Ascomycetes
-Bộ nguyên nang khuẩn: Quan trọng nhất là họ nấm men đường, họ nấm men
phi đường.
-Bộ cúc khuẩn Plectascales: Gồm các loại nấm mốc thuộc nấm đa bào. Sinh sản

chủ yếu bằng đính bào tử, rất ít thấy trường hợp bằng nang bào tử. Những loài thuộc
bộ này rất khác nhau về hình dáng, màu sắc, cấu tạo đính bào tử. Bộ cúc khuẩn phân
bố trong tự nhiên, thường gặp trong đất, cây cối và thực phẩm. Trong bộ này ta chỉ xét
họ Aspergillaceae. Các loại nấm mốc thuộc họ này có ứng dụng rất nhiều trong thực
phẩm. Nỗi bật là hai gống Aspergillus và Penicillium.
-Họ Aspergillaceae gồm:
+Giống Aspergillus: là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả
hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế
bào lớn. Các nang quả phình to ở bên trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu
dục, hình chùy được gọi là túi định. Từ túi định có vô vàng những mầm nhỏ gọi là thể
bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này là các bào tử đính. Cơ sở
phân loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus là đặc điểm cấu tạo, màu sắc của cuống
bào tử đính.
Ví dụ: Aspergillus niger có bào tử màu đen.
Aspergillus oryzae có bào tử màu vàng hoa cau.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -7- SVTH: Nguyễn Văn Thân
Aspergillus awamori có bào tử màu đen.
Aspergillus flavus có bào tử màu xanh.
Aspergillus usami có bào tử màu đen nâu.
Giống Penicillim: Là nấm mốc có rất rộng rãi trong tự nhiên, gây hư hỏng nhiều
quả chín, nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau.
4- Lớp đảm khuẩn.
5- Lớp nấm bất toàn. [7, tr 62].
1.2.1.5. Giới thiệu chủng Aspergillus oryzae.
Hình 1.1: Bào tử của Aspergillus oryzae.
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang
khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều
ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào

(nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là
cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.
oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính
bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn,
dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào
tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đặc điểm của giống Asp. oryzae giàu các
enzym thủy phân nội bào và ngoại bào (amylaza, proteaaza, pectinaza,…), ta rất hay
gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng
không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn…Chúng mọc và phát
triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng…Màu do các bào tử già có màu sắc.
Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ
mọc thành mốc mới.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -8- SVTH: Nguyễn Văn Thân
1.2.2. Enzym amylaza.
Amylaza là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzym này
thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm
polysaccharide với sự tham gia của nước.
R.R’ + H - OH  RH + R’OH
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylaza (enzym nội bào) và
exoamylaza (enzyme ngoại bào).
Endoamylaza gồm có α-amylaza và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzym
khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6 -
glucosidase); Khử gián tiếp là Transglucosylaza (hay oligo-1,6-glucosidaza) và maylo-
1,6-glucosidaza. Các enzym này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi
polysaccharide.
Exoamylaza gồm có β-amylaza và γ-amylaza. Đây là những enzym thủy phân
tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Cơ chất tác dụng của amylaza là tinh bột và glycogen.

Hệ enzym amylaza là một trong số các hệ enzym được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân. Các enzym amylaza có
trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi,
xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Bây giờ người ta thu chủ yếu từ canh trường vi
khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men. [4, tr 317].
1. Đặc tính của enzym α-amylaza.
α-amylaza từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylaza có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylaza là một protein giàu
tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid
chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzym:
- α-amylaza có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Trọng lượng phân tử của α-amylaza nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir 1956;
Fisher, Stein, 1960).
- Amylaza dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các α-amylaza có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951).
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -9- SVTH: Nguyễn Văn Thân
- α-amylaza là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylaza đều có chứa 1- 30
nguyên tử gam canxi/mol, nhưng không ít hơn 1- 6 nguyên tử gam/mol canxi tham gia
vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzym, duy trì hoạt động của enzym
(Modolova,1965). Do đó, canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzym khi bị tác
động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzym phân giải protein. Nếu
phân tử α-amylaza bị loại bỏ hết canxi thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy
phân cơ chất. α-amylaza bền với nhiệt độ hơn các enzym khác. Đặc tính này có lẽ liên
quan đến hàm lượng canxi trong phân tử và nồng độ Mg
2+
. Tất cả các amylaza đều bị
kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu

2+
, Ag
+
, Hg
2+
. Một số kim loại như: Li
+
, Na
+
,
Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
, Co
2+
, Sn
2+
, Cr
3+
, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylaza.
Hình 1.2: Sơ đồ tác dụng của enzym amylaza lên cơ chất tinh bột.
Điều kiện hoạt động của α-amylaza từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylaza từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 (có thể
hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5- 5,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho
hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylaza từ Asp. oryzae trong vùng
5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của
nó là 6,0 - 7,0.

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylaza của Asp.
oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylaza của malt và vi khuẩn Bac. subtilis.
Ở pH = 3,6 và 0
0
C, α-amylaza của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-
amylaza vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylaza của nấm
sợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α-
amylaza nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0-5,5; α-amylaza dextrin hóa của nấm sợi đen
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -10- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 0
o
C và pH = 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1
giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylaza từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α-amylaza của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động của
nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50
0
C và bị vô hoạt ở 70
0
C (Kozmina, 1991).
Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α-amylaza của Asp. oryzae rất nhạy với tác
động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40
0
C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn
22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 50
0
C trong 2 giờ, α-amylaza của nấm

sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).[4, tr 157].
2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylaza.
α-amylaza (1,4-α-glucan-glucanhydrolaza). α-amylaza từ các nguồn khác nhau
có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylaza có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-
glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách
ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylaza không chỉ thủy phân hồ tinh bột
mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylaza là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột
giảm nhanh (các amyloza và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị
thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltoza không cho màu với iot. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi α-amylaza cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác
dụng của α-amylaza, amyloza bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7
gốc glucoza (vì vậy, người ta cho rằng α-amylaza luôn phân cắt amyloza thành từng
đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1).
+ Sau đó, các polyglucoza này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetroza và maltotrioza
và maltoza. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amyloza chứa
13% glucoza và 87% maltoza. Tác dụng của α-amylaza lên amylopectin cũng xảy ra
tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -11- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài
các đường nói trên (72% maltoza và 19% glucoza) còn có dextrin phân tử thấp và
isomaltoza 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylaza, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetroza, maltoza, glucoza và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-
amylaza chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu
với iot và một ít maltoza. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylaza là tính chất đặc
trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại α-amylaza này là α-amylaza dextrin hóa
hay α-amylaza dịch hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylaza:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp.
+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltoza di & monosaccharide.
Amyloza oligosacharide poliglucoza.
Maltoza maltotrioza maltotetroza.[3, tr 321].
Phức hệ enzym amylaza từ các nguồn khác nhau đều có đặc điểm riêng. Đối với
nấm sợi Aspergillus, trong canh trường của chúng có các enzym sau: α-amylaza,
glucoamylaza, glucoziltransferaza. Đa số các chủng của loài Asp. oryzae tạo nhiều α-
amylaza song tạo ít glucoziltransferaza, ngoài amylaza canh trường bề mặt của Asp.
oryzae còn proteaza axit và trung tính (Oresenko 1963).[4, tr 320].
1.2.3. Enzym proteaza.
Proteaza là loại enzym tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và
cuối cùng tạo thành các axit amin và NH
3
.
Enzym proteaza đầu tiên được nghiên cứu không phải là các proteaza của vi sinh
vật mà là các proteaza của động vật.
Ngày nay các loại enzym proteaza từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và được
sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, y học và nông nghiệp.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
α-amylaza
Đồ án tốt nghiệp -12- SVTH: Nguyễn Văn

Thân
Ưu điểm lớn nhất của enzym proteaza từ vi sinh vật là chúng rất phong phú về
chủng loại. Năm 1960, Hartley chia proteaza ra bốn nhóm dựa trên thành phần cấu tạo
của trung tâm hoạt động trong enzym này.
-Proteaza nhóm 1: Nhóm này bao gồm các loại proteaza có serin trong trung
tâm hoạt động (bao gồm các loại enzym tripsin; kimotripsin; eslastase; subtilizi; các
enzym xúc tác làm đông máu; acrozin).
-Proteaza nhóm 2: Bao gồm các proteaza có nhóm SH trong trung tâm hoạt
động (bao gồm bromelin, papain, fixin).
-Proteaza nhóm 3: Bao gồm các proteaza có kim loại trong trung tâm hoạt động
và trực tiếp tham gia các quá trình xúc tác (bao gồm các proteza trung tính của
Bacillus hoặc colagenase).
-Proteaza nhóm 4: Bao gồm các proteaza có nhóm α-cacboxil trong trung tâm
hoạt động. Nhóm này gồm pepsin, renin, proteaza axit của vi sinh vật.
Như vậy tùy theo từng vùng hoạt động pH của enzym proteaza mà các proteaza
tồn tại ở dạng proteaza axit, proteaza trung tính, proteaza kiềm.
Khác với thực vật và động vật vi sinh vật vừa rất giàu proteaza, vừa có nhiều loại
proteaza. Ngoài ra đối với sinh lý vi sinh vật, proteaza đóng vai trò rất quan trọng. Đối
với thực tiễn sản xuất và đời sống, proteaza được ứng dụng rất rộng rãi, từ công nghệ
thực phẩm đến công nghệ làm sạch môi trường, từ công nghệ làm sạch da thú đến các
loại tẩy rửa, từ công nghệ lên men truyền thống (làm tương chao, nước mắm, nước
chấm) đến công nghệ sản xuất bia, phomat [5, tr 201].
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza và
proteaza.
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym amylaza.
1.3.1.1. Ảnh hưởng các nguồn nitơ dinh dưỡng.
Nguồn dinh dưỡng nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh
dưỡng để nuôi nấm mốc Asp. oryzae để tạo enzym α-amylaza, người ta dùng muối vô
cơ Natri nitrat là nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylaza.
Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari nitrat và Amoni nitrat có hiệu quả hơn so

với các loại muối khác (Kali nitrat, Magie nitrat, Amoni sunfat…). Cho nguồn nitơ
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -13- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylaza này và ức chế tổng hợp
amylaza khác.Ví dụ: Kết quả thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụng
các nguồn nitơ từ những muối khác nhau.
Bảng 1.3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzym. [4].
Nguồn Nitơ
Liều lượng
muối, % theo
N
Hoạt động enzyme sau 6 ngày
nuôi đối với 100ml.
α-amylaza Glucomylaza
NaNO
3
0,30 145 8000
NaNO
3
0,15 26 3300
(NH
4
)
2
SO
4
0,15 - -
NH

4
NO
3
0,15 98 4100
NH
4
NO
3
0,30 45 4900
NH
4
H
2
PO
4
0,30 5,5 8000
Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn cacbon và nitơ trong môi
trường phù hợp cho mốc Asp. oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi trường dinh
dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp sinh khối của nấm
Asp. oryzae và sự tạo thành amylaza.
1.3.1.2. Ảnh hưởng của Amino acid.
Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số các
amino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ
có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới.
Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như việc sinh tổng
hợp enzym amylaza do những nguyên nhân sau:
-Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ vừa là nguồn
năng lượng.
-Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid, Aspatic acid….) đóng vai trò vô
cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid

khác trong quá trình chuyển amin hóa.
Nhờ một số amino acid trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiện
đồng hóa dị dưỡng CO
2
(Araiet al,1968).
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -14- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
-Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước
như: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …Các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn.
Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh
vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi (Kurland, Marloe,
1962).
-Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp
enzym. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzym
amylaza, một số lại có tác dụng ức chế ngược lại và một số khác thì không có ảnh
hưởng gì cả.
1.3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng.
Các yếu tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp
các enzym, α-amylaza ở nấm mốc Asp. oryzae.
-Mg
2+
có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO
4
sẽ có ảnh hưởng
xấu đến sự tổng hợp mọi amylaza bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α-amylaza bị ức
chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng
hợp α-amylaza là 0,05%.
-Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic

phospholipide acid) và nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá
trình oxy hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy
mà tăng cường tổng hợp enzym. Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ
cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylaza tăng cao khi có 0,1% KH
2
PO
4
.
-Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylaza hoạt động vì nó là cấu tử không
thể thiếu được của enzym này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylaza khỏi tác động
của proteaza (Hsiu et amiloza, 1964). Muốn tích lũy nhiều α-amylaza cấn có lượng
Canxi trong môi trường là 0,01-0,05%.
-Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylaza (S có trong thành phần của các amino
acid quan trọng: Methionine, cystein, cystine). Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml
môi trường là thích hợp nhất cho Asp. oryzae tạo amylaza.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -15- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi
lượng. Chẳng hạn như: Coban, kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym
amylaza như: đồng, thủy ngân,…[4, tr 340].
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ
vi sinh vật.
Quá trình sinh tổng hợp enzym nói chung cũng như quá trình tổng hợp proteaza
của vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, pH,
độ thông khí, thành phần môi trường, Do đó sự sinh tổng hợp enzym proteaza của
nấm mốc cũng không nằm ngoài quy luật chung đó.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh
tổng hợp enzym của vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Tùy

theo loại vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp khác nhau: Các loài nấm mốc t
opt
= 22 - 32
0
C
còn vi khuẩn thì thích hợp ở nhiệt độ cao hơn t
opt
= 35- 55
0
C. Nói chung, đa số các vi
sinh vật tổng hợp enzym không bền với nhiệt và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ thích hợp.
- Ảnh hưởng của pH môi trường: Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH
môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym ở vi sinh vật. Hơn nữa pH
môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật, với các
nấm mốc pH
opt
= 6 - 6,5, với vi khuẩn thì pH
opt
= 6,6 - 7,4.
Khi ta dùng phương pháp bề sâu thì pH có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò
quyết định đối với sự tích lũy proteaza trong môi trường. pH môi trường có thể thay
đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH ban đầu của môi
trường thích hợp cho nấm mốc là pH = 3,8 - 5,6.
- Độ thông khí: Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng
hợp proteaza. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo vi sinh vật. Trong một
số trường hợp, thiếu oxy tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm
tăng quá trình sinh tổng hợp proteaza. Lượng oxy thích hợp cho quá trình sinh tổng
hợp ở các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất
định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau. Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lại

kiềm hãm mạnh sự sinh tổng hợp.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -16- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
- Đối với nấm nốc, chế độ sục khí thích hợp 10-12 m
3
không khí vô trùng (có
nhiệt độ không cao quá 40
0
C) trên 1m
3
môi trường trong 1h với thời gian nuôi 68 -
73h. Với thời gian nuôi ngắn hơn trong các thùng lên men giống (48h) và trong các
thùng lên men sản xuất (48-52h) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi
Asp. oryzae phải là 30m
3
/m
3
môi trường/giờ đối với thùng nhân giống và 40m
3
/m
3
môi
trường/giờ cho thùng sản xuất.
- Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym.
Để tăng lượng enzym trong môi trường cần lựa chọn nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng
thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng chất cảm ứng. Đối với
một vi sinh vật nhất định, điều kiện cho quá trình tổng hợp các enzym khác nhau

không giống nhau. Nắm vững các quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều
khiển vi sinh vật tổng hợp định hướng một enzym xác định.
-Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác
là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzym proteaza có hoạt lực cao.
Nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc là: Glucoza, fructoza, maltoza và kém nhất
là lactoza, galactoza. Tinh bột cũng là nguồn cabon tốt cho nấm mốc để sinh tổng hợp
proteaza nhưng hiệu quả này cũng phụ thuộc vào chủng mốc có hoạt lực amylaza để
thủy phân sâu xa tinh bột.
-Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá
trình sinh tổng hợp proteaza vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này.
Các nguồn nitơ thường dùng là: Các loại bột khác nhau (có gluten, nước chiết của
cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein v.v đối với các loài Aspergillus (Asp.
oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus) dạng hữu cơ là thành phần quan trọng
nhất của môi trường đối với quá trình sinh tổng hợp proteaza acid. Khi thay NaNO
3
trong môi trường Czapek bằng casein sẽ làm tăng đáng kể lượng proteaza acid trong
môi trường nuôi cấy. Protein và pepton là nguồn dinh dưỡng nitơ tốt nhất đối với loài
Aspergillus nói trên. Theo một số tác giả khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và
vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp proteaza. Ví dụ khi thêm vào HNO
3
hoặc
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -17- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
NH
4
với lượng 0,6-3,8% vào môi trường có chứa nguồn nitơ hữu cơ có thể làm tăng
140-190% proteaza acid trong môi trường nuôi cấy của nhiều loài thuộc Aspergillus.
Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon và nitơ thích hợp cần phải chọn tỷ lệ

thích hợp. Có như vậy mới đảm bảo cho việc sinh proteaza là lớn nhất. Theo Iulius
(1969), tỷ lệ C : N thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp proteaza ở Asp. oryzae là 8:1
đến 2:1.
Ngoài ra còn có các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin và các yếu tố khác nữa
cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp.[10, tr 428].
1.4. Công nghệ sản xuất enzym từ vi sinh vật, và ứng dụng.
Phần lớn các loại enzym là protein hòa tan. Các enzym được sản xuất theo quy
mô công nghiệp là những enzym hòa tan. Khái niệm ‘‘enzym hòa tan” cũng không
hoàn toàn chính xác vì trong nhiều trường hợp enzym hoàn toàn không hòa tan, ví dụ
như khi enzym còn trong tế bào vi sinh vật thì chúng ở trạng thái không hòa tan. Khái
niệm này dùng để phân biệt loại enzym không hòa tan được tạo ra từ enzym loại hòa
tan này.
Trong công nghiệp sản xuất enzym, trên thế giới đang tiến hành hai phương pháp
nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. [4, tr 216].
1.4.1. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Sau đó
phương pháp nuôi cấy chìm được thay thế vào những năm 56-60 của thế kỷ trước.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển
trên bề mặt môi trường, phương pháp này lại được phục hồi rất mạnh vào những năm
1970 cho đến nay.
*Ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt:
- Nuôi cấy bề mặt dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp.
- Lượng enzym được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so
với nuôi cấy chìm.
Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng, giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy
bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -18- SVTH: Nguyễn Văn

Thân
- Chế phẩm enzym thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật,
enzym và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận
hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý.
Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị
nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác
sẽ hoàn toàn được an toàn.
*Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những nhược điểm cần quan tâm để khắc
phục và hoàn thiện dần phương pháp này.
- Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn
diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường nên rất cần nhiều diện tích. Trong những năm gần đây, người ta đã cải tiến các
thiết bị để vi sinh vật có thể phát triển ở 4 mặt (nơi tiếp xúc giữa môi trường và không
khí). Những thiết bị này được thiết kế như một hình hộp đứng có kích thước trung bình
như sau:
Chiều cao 1,2m - 1,4m; Chiều ngang 0,8m - 1m; Chiều dày 0,1m - 0,2m.
Môi trường sau khi thanh trùng được trộn giống vi sinh vật và cho vào những
hộp này. Cả bốn phía mặt ngoài của bốn hộp này phải có độ thoáng khí nhất định, nhờ
đó giống vi sinh vật, nhất là nấm sợi, sẽ phát triển rất mạnh ở bốn phía của hộp. Bằng
cách cải tiến này, vi sinh vật phát triển rất mạnh và ta đã tiết kiệm được ít nhất 1/2 diện
tích nuôi cấy.
Tuy nhiên phương pháp này khó cơ giới hóa, tự động hóa.[5, tr 217].
1.4.2. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm).
Phương pháp nuôi cấy chìm để thu nhận emzym là phương pháp ở đó vi sinh vật
phát triển hẳn trong lòng môi trường. Chính vì thế trong môi trường nuôi cấy chìm
người ta thường sử dụng môi trường lỏng.
Phương pháp này có những ưu điểm cơ bản sau:
-Phương pháp nuôi cấy chìm tốn ít diện tích. Trong quá trình nuôi cấy thường

được thực hiện trong các thiết bị lên men rất gọn.
-Phương pháp nuôi cấy chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao.
Trong nuôi cấy chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí.
Kiểm soát quá trình thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể thực hiện được
với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men. Ngoài ra, ta còn có thể kiểm soát được
nhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiển tự động.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -19- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
-Phương pháp nuôi cấy chìm có thể thực hiện liên tục bằng nhiều thiết bị lên men
nối tiếp nhau. Do đó việc kiểm soát chất lượng lên men rất dễ dàng.
*Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm cần khắc phục:
-Hoạt tính enzym trong nuôi cấy chìm thường thấp hơn hoạt tính enzym trong
nuôi cấy bề mặt.
-Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xảy ra sẽ gây ra sự nhiễm
toàn bộ hệ thống trong một thời gian rất ngắn. Dung dịch lên men trong thiết bị lên
men luôn luôn trong trạng thái động nhờ hoạt động của cánh khuấy và hệ thống thổi
khí. Do đó chỉ cần một điểm nào đó của môi trường bị nhiễm ngay lập tức toàn bộ hệ
thống bị nhiễm, khi đó ta rất khó kiểm soát và giải quyết những hậu quả do sự nhiễm
vi sinh vật lạ gây nên.
-Phương pháp nuôi cấy chìm thường đòi hỏi chi phí rất lớn. Những chi phí này
chủ yếu bao gồm: Chi phí cho hệ thống lên men, cánh khuấy [5, tr 227].
1.5.Tình hình sản xuất và ứng dụng chế phẩm enzym proteaza và amylaza
trong nước và trên thế giới.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh
học, các chế phẩm enzym được sản xuất càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các
lĩnh vực kinh tế. Enzym đã từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá trình
công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế đáp ứng nhu cầu
ngày càng tăng của xã hội. Hàng năm lượng enzym được sản xuất ra trên thế giới đạt

khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD được phân bổ trong các lĩnh
vực khác nhau.
Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất enzym chính. Châu Âu với
hai hãng sản xuất lớn nhất trên thế giới là Novo Nordisk và Gist Brocades chiếm trên
60% lượng enzym thị trường, các chế phẩm enzym của Mỹ chỉ chiếm 15% trong số
2/3 lượng enzym được sử dụng nội địa. Nhật Bản với các chế phẩm enzym khá đa
dạng chiếm khoảng 12% đến 15% thị trường thế giới.
Các proteaza là các enzym dược sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt ), sản xuất
các chất tẩy rửa, thuộc da tiếp đến là các hydratcacbonat dược ứng dụng nhiều trong
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -20- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
kỹ nghệ chế biến thực phẩm, trong công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp giấy và bột
giấy, chế biến thức ăn gia súc như các enzym amylaza, glucoizomeraza.[9, tr 221].
1.5.1. Chế phẩm enzym amylaza.
Amylaza với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylaza đã được dùng phổ biến
trong một số lĩnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucoza,
rượu, bia Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylaza đã làm thay đổi hoàn toàn chất
lượng của bánh mì cả hương vị, màu sắc, độ xốp
Chế phẩm amylaza sạch cho chất lượng bánh mì tốt hơn ở dạng phức hợp với
proteaza. Chính glucoamylaza, là yếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu.
Giai đoạn từ năm 2000, Viện Công nghiệp giấy và xenlulose đã đầu tư nghiên
cứu một cách tích cực về sử dụng enzym trong công nghệ khử mực giấy loại, trong đó
đặc biệt chú trọng đối với enzym α-amylaza. Kết quả đã nghiên cứu thành công và
thiết lập quy trình công nghệ sử dụng enzym α-amylaza để khử mực giấy loại có gia
keo tinh bột.[11].
1.5.2. Chế phẩm enzym proteaza.
Các chất giặt rửa chứa enzym là ví dụ điển hình của những xu hướng công nghệ

mới trên ngưỡng cửa thế kỷ 21. Đó là sự kết hợp giữa các ngành hóa học và sinh học,
mà kết quả là những sản phẩm được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Hiện nay
những sản phẩm của enzym có tiềm năng giống như những chất phụ gia trong thức ăn
của lợn ở Tây Canada bao gồm: Xylanaza, b-glucanaza, proteaza và phytaza. Người ta
còn khai thác tính đông tụ của renin, pepsin vào công nghiệp thực phẩm như trong sản
xuất phomat.
Theo tạp chí Phát Triển Khoa Học Và Công Nghệ, tập 9, số 5 năm 2006 của Lê
Văn Việt Mẫn và Trần Thị Ánh Tuyết đã ứng dụng chế phẩm enzym proteaza từ nấm
mốc trong phương pháp lên men bề mặt vào công nghệ chế biến nước mắm, nhằm rút
ngắn thời gian thủy phân protein.
Sản xuất sản phẩm thủy phân dùng thay sữa mẹ nhờ chế phẩm enzym
Flavouenzym. Sản xuất nước chấm magi, hình thành chất tạo hương cho sản phẩm
thủy phân đậu tương.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -21- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
CHƯƠNG II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và môi trường.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -22- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
2.1.1. Nguyên liệu.
Cám gạo, bột bắp được chọn là loại mới, không bị mốc. Độ ẩm đảm bảo từ 10 -
12%. Khô dầu đậu phụng chọn bánh tốt, phơi khô, làm nhỏ rồi bảo quản để làm thí
nghiệm. Bột đậu tương chọn mua loại tốt, mùi thơm, không bị nhiễm mốc.
2.1.2 Môi trường.
Môi trường phân lập nấm mốc.

Theo mục 1 phụ lục.
Môi trường nhân giống nấm mốc.
Theo mục 2 phụ lục.
Môi trường nuôi cấy thu enzym.
Theo mục 3 phụ lục.
Môi trường kiểm tra khả năng sinh enzym amylaza.
Theo mục 4 phụ lục.
Môi trường để kiểm tra khả năng sinh enzym proteaza.
Theo mục 5 phụ lục.
2.2. Dụng cụ, máy móc thiết bị và hóa chất.
2.2.1. Dụng cụ, máy móc thiết bị.
Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hóa chất.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Phòng vô trùng, tủ cấy vô trùng.
Tủ lạnh.
Tủ sấy.
Tủ ấm.
Nồi thanh trùng.
Máy đo pH.
Máy sấy nhanh.
Bếp điện.
Cân kỹ thuật.
Máy đo mật độ quang.
Kính hiển vi Motic 3.0.
Dung dịch Iot.
HCl 0,1N.
NaOH 0,1N.
NaNO

3
.
NH
4
SO
4
.
MgSO
4
.
KCl.
FeSO
4
.
CH
3
COONa.
CH
3
COOH.
KH
2
HPO
4
.
Na
2
HPO
4
Đồ án tốt nghiệp -23- SVTH: Nguyễn Văn

Thân
2.2.3. Các phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp vi sinh.
2.3.1.1. Phương pháp phân lập tuyển chọn nấm mốc.
Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại
ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lí, sinh
hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần
khiết.
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban
đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu quan trọng trong việc nghiên cứu và
ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ
một tế bào ban đầu.
Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật.
Nuôi cấy các tế bào trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc
mọc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Cách tiến hành: Theo mục 6 phụ lục.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái tế bào nấm mốc.
Để quan sát tế bào nấm mốc ta tiến hành 2 bước.
1. Quan sát đại thể.
Gieo cấy nấm mốc thuần khiết lên môi trường đặc và chọn lọc trong hộp pêtri,
có thể cấy thành đường hoặc thành 1- 3 chấm trong mỗi hộp, để quan sát khuẩn lạc.
Nuôi cấy ở 30
0
C, sau 3 - 5 ngày đem quan sát với kính hiển vi.
2. Quan sát vi thể.
Để nghiên cứu rõ ràng hơn ta nên tiến hành quan sát vi thể.
*Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu: Dùng que cấy hình móc câu lấy một
ít hệ sợi nấm dàn mỏng trên phiến kính. Cho vài giọt cồn 95% để một lúc, rồi dùng
giấy thấm khô sau đó cho vài giọt NaOH 10% đậy lá kính lên và đem soi. Hoặc cho
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và

amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -24- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
vài giọt cồn 60
0
có vết amoniac, thấm khô rồi cho vài giọt glyxerin loãng. Đậy kín lá
kính lên và đem soi.
Mục đích của các tác dụng trên đây là tăng cường khả năng thấm nước của sợi
nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, và làm sợi nấm nở to ra để quan sát.
Phương pháp tốt nhất là dùng dung dịch lacto-phenol.
*Làm tiêu bản nhuộm màu nấm mốc: Nói chung nấm mốc rất khó nhuộm màu.
Lúc còn trẻ sợi nấm, bắt màu nhưng khi già nó bắt màu rất kém. Có thể nhuộm màu
bằng các dung dịch thuốc nhuộm sau:
-Erythrosin hoặc rose bengal 1% trong nước, nhuộm 15 phút.
-Gentian violet 1/4 trong nước, trong 2-3 phút.
-Tốt nhất là dùng xanh cotton hòa trong 100 ml lacto-phenol.
2.3.2. Phương pháp hóa sinh.
2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt lực enzym bằng vòng thủy phân.
*Nguyên tắc:
Chủng vi sinh vật vừa phân lập được nuôi cấy trên môi trường thích hợp để
chúng phát triển thành khuẩn lạc.
Các enzym đặc trưng được chúng tiết ra môi trường xung quanh dưới dạng vòng
trong suốt bao quanh khuẩn lạc gọi là vòng thủy phân. Căn cứ tỉ lệ đường kính vòng
thủy phân và đường kính của khuẩn lạc để đánh giá khả năng hình thành emzym của
chủng vi sinh vật (còn gọi là hoạt tính enzym của chủng vi sinh vật đó).
*Cách tiến hành:
1. Enzym amylaza.
Theo mục 7 phục lục.
2. Enzym proteaza.
Theo mục 8 phục lục.

2.3.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzym.
1.Xác định hoạt độ enzym
α
- Amylaza Theo Rukhliadeva.
*Nguyên tắc của phương pháp:
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
Đồ án tốt nghiệp -25- SVTH: Nguyễn Văn
Thân
Dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzym có trong dịch chế phẩm nghiên cứu
tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột
và các sản phẩm thủy phân của nó với iot bằng máy so màu quang điện sẽ tính được
hoạt độ enzym.
Đơn vị hoạt độ amylaza là lượng enzym chuyển hóa được 1 gam tinh bột tạo
thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30
0
C trong thời gian 1h ở pH = 4,7.
* Cách tiến hành: theo mục 9 phụ lục.
2.Xác định hoạt độ enzym proteaza theo VILTESTE.
*Nguyên tắc của phương pháp:
Hoạt độ proteaza là hoạt độ của các enzym xúc tác phản ứng thủy phân protein
thành polypeptit và các axit amin. HđP của các chế phẩm enzym được biểu thị bằng số
đơn vị hoạt độ proteaza có trong 1 gam hoặc 1ml chế phẩm.
Một đơn vị HđP là một lượng enzym có khả năng xúc tác thủy phân protein để
tạo thành được 1mg nitơ amin sau 1 giờ ở 40
0
C và pH thích hợp.
Phương pháp dựa vào sự tăng nồng độ nitơ amin trong quá trình thủy phân với cơ
chất là gelatin. Nitơ amin được định lượng bằng cách chuẩn độ các nhóm cacbonxyl tự
do của axit amin và polypepetit trong dung dịch rượu bằng NaOH với chỉ thị

thimolphlatein 1%.
Cách tiến hành: Theo mục 10 phụ lục.
2.3.3. Phương pháp vật lý.
Xác định độ ẩm của nguyên liệu:
Xác định độ ẩm của bột cám, bột bắp, trấu, khô dầu, bột đậu tương bằng phương
pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi.
*Nguyên tắc: Làm bay hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng trước và sau sấy,
tính ra phần trăm nước có trong mẫu theo công thức:
X =
GG
GG
−
×−
1
21
100)(
(%).
Trong đó: G: Là trọng lượng cốc. (gam).
G
1
: Là trọng lượng cốc và mẫu trước khi sấy.(gam).
G
2
: Trọng lượng cốc và mẫu sau khi sấy.(gam).
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza và
amylaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.