Khóa luận tốt nghiệp_Nghiên cứu chế tạo chitosan từ vỏ tôm đạt một số tiêu chuẩn thương mại

MỞ ĐẦU
 Lý do chọn đề tài
Chitosan (CTS) là polysacaric có nguồn gốc tự nhiên, được tách chiết từ vỏ
các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ, CTS được ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh
vực khác nhau. Trong y dược, CTS được dùng để sản xuất glucosamin, một dược
chất dùng để chữa bệnh khớp đang phải nhập khẩu ở nước ta. Trong công nghiệp,
CTS được dùng để chế tạo nhiều sản phẩm có giá trị cao như: vải CTS dùng trong y
tế, vải chịu nhiệt, vải chống thấm. Ngoài ra CTS còn dùng để sản xuất sơn chống
thấm và mốc. Trong nông nghiệp, CTS được sử dụng để bảo quản quả, hạt giống
mang lại hiệu quả cao, dùng làm vacxin thực vật, thuốc kích thích sinh trưởng.
Trong công nghệ in ấn, CTS được ứng dụng làm mực in cao cấp, tăng cường độ
bám dính của mực in. Trong công nghệ môi trường, CTS được ứng dụng trong xử
lý nước thải công nghiệp. Trong công nghệ sinh học, CTS được dùng làm chất
mang cố định enzyme và cố định tế bào. Trong công nghệ thực phẩm, CTS được sử
dụng để sản xuất ra màng mỏng để bao gói thực phẩm… [12].
Ở Việt Nam, giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào, chiếm một
lượng lớn tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản. Hằng năm, các nhà máy chế biến đã
thải bỏ một lượng lớn phế liệu giáp xác. Chính vì vậy nguyên liệu ban đầu để sản
xuất CTS luôn sẵn có và rất rẻ.
Với mục đích tận dụng được lượng phế thải rắn là vỏ tôm trong ngành chế
biến thủy sản để sản xuất CTS có chú ý đến một số tiêu chuẩn thương mại, chúng
tôi chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế tạo chitosan từ vỏ tôm đạt một số
tiêu chuẩn thương mại” làm khóa luận tốt nghiệp.
 Mục đích nghiên cứu
Chế tạo chitosan đạt một số tiêu chuẩn thương mại từ vỏ tôm.
 Đối tượng nghiên cứu
Chitin, CTS có trong vỏ tôm.
 Phạm vi nghiên cứu
Chế tạo chitosan từ vỏ tôm đạt một số tiêu chuẩn thương mại.
 Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết

- Nghiên cứu lấy mẫu
- Phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC)
- Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
 Giới thiệu về chitin, chitosan
 Giới thiệu về chitin
Chitin có tên khoa học là poly (2, 4) – 2 – acetamido – 2 – desoxy – β – D –
glucose, còn có tên gọi khác là N – acetyl – D – glucose. Chitin là một
polysaccharide được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối
β (1–4) glycosit.
Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật. Trong động vật,
chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ của một số động vật không
xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc
cao, monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong tế bào da, nó giúp cho sự
tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật, chitin có ở thành tế bào nấm
họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo Trong thủy sản đặc biệt
là tôm, cua, ghẹ hàm lượng chitin chiếm tỉ lệ khá cao, từ 17 – 36% về khối lượng
[14].
Hình 1.1. Chitin và nguồn nguyên liệu sản xuất
 Giới thiệu về chitosan
CTS có tên khoa học là poly (1, 4) – 2 – amino – 2 – deoxy – β – D –
glucose. Chitosan là sản phẩm deaxetyl hóa chitin. Do quá trình đề axetyl xảy ra
không hoàn toàn nên người ta quy ước độ đề axetyl (ĐĐA) > 50% thì gọi là
chitosan, còn ĐĐA < 50% thì gọi là chitin.
 Cấu tạo của chitin và chitosan
 Cấu tạo của chitin
Công thức phân tử của chitin: (C
8

H
13
O
5
N)
n

Phân tử khối: M
chitin
= (203,09)
n
O
OH
OH
O
O
OH
NHCOCH
3
O
OH
NHCOCH
3
O
OH
NHCOCH
3
O
OH
O

OH
NHCOCH
3
O
OH
Chitin là polysaccharide thiên nhiên không nhánh, giống cellulose, có cấu trúc như
sau:
Hình 1.2. Cấu tạo phân tử chitin
Cấu trúc hóa học của chitin rất giống của cellulose, chỉ khác là nhóm –OH ở
vị trí C
2
trong mỗi đơn vị D – Glucose cellulose được thay bằng nhóm –NHCOCH
3
ở chitin. Một cách đơn giản, chúng ta có thể xem chitin là sản phẩm trùng ngưng
của nhiều phân tử N – acetyl – D – glucosamine.
Bằng phương pháp phổ nhiễu xạ tia X, người ta đã chứng minh được chitin
tồn tại được trong tự nhiên có cấu trúc tinh thể gồm 3 dạng: α, β và γ.
- α – chitin: Các mắt xích được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn.
- β – chitin: Các mắt xích được sắp xếp song song.
- γ – chitin: Hai mắt xích song song rồi đến 1 mạch ngược chiều.
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc mạng tinh thể của chitin
Từ ,  – Chitin có thể chuyển hóa về dạng  – Chitin

Hình 1.4. Sự chuyển đổi các dạng chitin
Trong ba dạng tinh thể của chitin thì α – chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt
chẽ nhất, có liên kết hydrogen giữa các mạch phân tử và giữa các lớp trong mạng
tinh thể. Ở β – chitin không có loại liên kết thứ hai này chính vì thế nó dễ bị trương
trong nước và cũng dễ tham gia phản ứng hơn α – chitin [2].
 Cấu tạo của chitosan
Công thức phân tử của CTS: [C

6
H
11
O
4
N]
n
Phân tử khối: M
chitosan
= (161,07)
n
CTS là polymer sinh học tự phân hủy, có cấu tạo gồm các đơn vị
D – glucosamine và N – acetyl – D – glucosamine liên kết với nhau qua cầu nối
β (1–4) glycosit như hình 1.5.
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của chitosan
- Liên kết β – glycosit mỗi mắt xích lệch nhau một góc 180
0
tạo lên mạch xoắn.
- Tương tác Vander Wall (d = 0,3 – 0,6μm).
- Khi khoảng cách giữa các mắt xích quá nhỏ (0,3µm) giữa chúng xuất hiện liên kết
hydro, do tương tác giữa nhóm –OH, –NH
2
trong phân tử.
Hình 1.5 mô tả cấu trúc CTS trên lý thuyết. Thực tế, mạch phân tử CTS vẫn
tồn tại nhóm axetyl đan xen do sự deaxetyl hóa chưa hoàn toàn. Do vậy, công thức
cấu tạo chính xác của mạch CTS có thể biểu diễn như hình 1.6.

Hình 1.6. Công thức cấu tạo chính xác của CTS
 Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý
 Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý của chitin

Trong thiên nhiên, trữ lượng của chitin chỉ đứng thứ hai sau cellulose. Chitin
là thành phần chủ yếu trong vỏ của các loại vật chất “xương ngoài” như: cua, tôm,
mực, nhện, bọ cạp và vỏ của các loại giáp xác, Chitin cũng được tìm thấy trong
vách tế bào của một vài loài nấm hay của một số loài sinh vật khác.
Trong tự nhiên, α – chitin là dạng chitin phổ biến nhất thường được tách ra
từ vỏ tôm, vỏ cua, β – chitin thường được tách ra từ mai mực ống còn γ – chitin
hay gặp ở sợi kén của bọ cánh cứng, tăm mực. So với α – chitin thì trữ lượng β –
chitin ít hơn nhiều, còn γ – chitin thì rất ít. Dạng β – chitin cũng có thể chuyển sang
dạng α – chitin là nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn.
Chitin là chất rắn, dạng bột xốp, rất nhẹ, hình vảy, có màu trắng hoặc vàng
nhạt, không mùi, không vị, có khối lượng riêng là 100 – 200 kg/m
3
và phân tử
lượng trung bình là 1.10
5
÷ 5.10
5
.
Chitin không tan trong nước, dung dịch kiềm, axit loãng, ancol và hầu hết
các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong axit vô cơ đặc như HCl, H
2
SO
4
, H
3
PO
4
và
thường kèm theo sự giảm cấp. Điều này được giải thích là do chitin có cấu trúc chặt
chẽ, có liên kết phân tử mạnh thông qua các nhóm hydroxyl và acetamide.

Chitin tan trong một số dung môi hữu cơ có chứa clorua liti như:
N, N – dimetylacetamid (DMAc) chứa 5% LiCl, N – etyl pyrrolydon – LiCl, Khả
năng hòa tan của chitin trong DMAc – LiCl phụ thuộc vào độ deacetyl của mẫu,
khả năng này giảm khi độ deaxetyl hóa tăng lên. Chitin cũng có thể bị phân tán
trong dung dịch chiocyanat liti đặc nóng và được tái kết tủa bằng sự pha loãng với
nước, ancol hoặc aceton. Cấu trúc cứng của chitin sẽ bị phá hủy một cách từ từ do
sự hình thành phức giữa ion canxi và nhóm acetamid ở vị trí C
2
của N – acetyl

glucosamin, làm cho hệ dung môi bao gồm CaCl
2
.2H
2
O – MeOH trở thành hệ
dung môi khá tốt cho việc hòa tan chitin.
Khác với cellulose, chitin tan chậm trong dung dịch hypochloride ở nhiệt độ
phòng, nhưng không tan trong dung dịch Scheweitzer [Cu(NH
3
)
4
](OH)
2
. Chitin tan
trong dung dịch của natri trong amoniac lỏng để cho ra hợp chất đơn natri.
Tính tan của chitin ảnh hưởng đáng kể đến khả năng ứng dụng của nó. Do
đó, nghiên cứu biến tính chitin tạo ra các dẫn xuất khác nhau có khả năng hòa tan
trong các dung môi thông thường gần đây được tập trung chú ý nhằm nâng cao hiệu
quả sử dụng của loại polysaccharide thiên nhiên quý giá này.
 Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý của CTS

CTS có cấu trúc tinh thể không đổi so với cấu trúc của chitin. CTS là chất
rắn xốp nhẹ, hình vảy, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy có thể xay nhỏ với kích thước
khác nhau, màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt được thể hiện ở hình 1.7.
Hình 1.7. Hình dạng và màu sắc của CTS
CTS do có nhóm –NH
2
tự do nên không tan trong nước nhưng tan dễ dàng
trong các dung môi hữu cơ như axit formic, axit axetic, axit propionic, axit citric,
axit lactic, khi đó nhóm amin tự do bắt đầu hình thành nhóm –NH
3
+
[16]. Nhờ đặc
tính này mà CTS có giá trị ứng dụng và giá trị thương mại cao hơn chitin vì có thể
chế tạo thành nhiều dạng khác nhau như màng mỏng, sợi, bột
CTS có khả năng tạo màng rất tốt. Ngoài ra CTS cũng có một số tính chất
khác như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, khả năng kết
dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm Các tính chất này của CTS phụ thuộc
rất lớn vào khối lượng phân tử (KLPT) và độ đề axetyl (ĐĐA). ĐĐA là một thông
số quan trọng, đặc trưng cho tỷ lệ giữa 2 – acetamido – 2 – deoxy – D –
glucopyranose với 2 – amino – 2 – deoxy – D – glucopyranose trong phân tử chitin
và chitosan. ĐĐA của chitosan nằm trong khoảng 56% – 99%. CTS có ĐĐA cao thì
có khả năng hấp thụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt hơn [13], và khả năng

kháng khuẩn, kháng nấm cũng cao hơn. Tuy nhiên, khả năng hút nước của CTS lại
giảm khi tăng ĐĐA [14].
Hơn nữa, CTS còn có khả năng chống oxy hóa, ngoài ĐĐA, KLPT khả năng
này còn phụ thuộc vào độ nhớt của CTS. CTS có độ nhớt thấp thì khả năng chống
oxy hóa cao [13].
Bảng 1.1. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi ĐĐA [14]
Tính chất CTS

ĐĐA
75% 87% 96%
Độ nhớt (cP) 111,2 103,4 107,3
Tính thấm nước (%) 659 472 486
Độ tan (%) 99,4 99,6 99,5
 Tính chất hóa học
 Tính chất hóa học của chitin
Chitin có tính chất của ancol, amin và amit vì trong phân tử có các nhóm
chức –OH, –NHCOCH
3
trong các mắt xích N – axetyl – D – glucosamine và
nhóm –OH, –NH
2
trong các mắt xích D – glucosamine. Phản ứng hóa học có thể
xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O
-
; dẫn xuất thế N
-
; hoặc dẫn xuất thế
O
-
, N
-
.
Mặt khác, các liên kết β (1–4) glycosit giữa các monome trong chitin rất dễ bị
cắt đứt bởi các chất hóa học như axit, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzym thủy phân.
Phân tử chitin có thể được kí hiệu tượng trưng như sau:
a. Phản ứng Van-Wisseleigh
Chitin, CTS phản ứng với dung dịch I
2

/KI cho màu nâu, khi có mặt axit
H
2
SO
4
thì chuyển thành đỏ tím, do các liên kết β (1–4) glycosit gây ra. Đây là phản
ứng đặc trưng của chitin, CTS.
Phản ứng này không xảy ra đối với các polysaccaric có số phân tử đường
nhỏ hơn 6 nên được dùng để định tính chitin, chitosan và dùng để kiểm tra
glucosamine.

Chit
-CH
2
OH
-OH
-NHCOCH
3
b. Phản ứng deaxetyl hóa chuyển chitin thành chitosan
Phản ứng deaxetyl hóa chitin là phản ứng tách nhóm axetyl ra khỏi nhóm
chức (–NHCOCH
3
), được thực hiện trong dung dịch NaOH 40 ÷ 60% ở nhiệt độ 90
÷ 100
0
C và trong khoảng thời gian từ 3 ÷ 5 giờ.
Thực chất phản ứng trên là phản ứng thuỷ phân trong môi trường kiềm. Các
yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng là: nồng độ, nhiệt độ và thời gian.
c. Phản ứng cắt mạch
Phản ứng cắt mạch là quá trình làm đứt liên kết β (1–4) glycosit gồm các

phương pháp cắt mạch chủ yếu sau:
- Cắt mạch bằng các enzym như chitosanase, papain.
- Cắt mạch bằng tác nhân hóa học: H
2
O
2
, các peraxit, HCl, NaNO
2
/H
+

- Cắt mạch bằng chiếu xạ: gamma Co–60, siêu âm, chùm electron.
d. Các phản ứng tạo dẫn xuất
Tùy thuộc tác nhân phản ứng vào nhóm chức –NH
2
, –OH hay cả 2 nhóm
chức để tạo dẫn xuất khác nhau:
- Phản ứng vào nhóm chức –OH
Đối với chitin, phản ứng thường xảy ra với các nhóm –OH vì nhóm –
NHCOCH
3
tương đối kém hoạt động.


→
+
H






→




 !



""




#!
Phản ứng deaxetyl hóa sản phẩm mới hình thành với dung dịch NaOH
Chitin kiềm tham gia phản ứng hydroxyethyl hóa tạo dẫn xuất hydroxyethyl
chitin
Phản ứng sulfat hóa
Chit–OH + SO
3
–NC
5
H
5
 →
NHC
55

Chit – O – SO
3
NC
5
H
6
 →
NaCl
Chit –
SO
3
Na
- Các phản ứng vào nhóm –NH
2
Chit – NH
2
+ HOOC – CH
3
→ Chit – NH
3
+
+ CH
3
COO
-
Chit – NH
2
+ Cl – CH
2
– COOH → Chit – NH – CH

2
COOH + HCl
- Phản ứng thủy phân: Trong axit clohydric đậm đặc, ở nhiệt độ cao gây cắt
mạch thu được glucosamin. Quá trình thủy phân xảy ra đầu tiên ở cầu nối
glucoside, sau đó loại nhóm axetyl.
(C
32
H
54
N
4
O
21
)
x
+ 2(H
2
O)
x
→ (C
28
H
50
N
4
O
19
)
x
+ 2(CH

3
COOH)
x
$
e. Phản ứng este hóa:
Chitin tác dụng với axit nitric đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat.
Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N, N – dimetyl
anilin cho sản phẩm chitin sunfonat.
 Tính chất hóa học của CTS
CTS là một polyme mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết
β (1–4) glycosit. Các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: axit,
bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân. Mỗi mắt xích phân tử của CTS có
3 loại nhóm chức có khả năng phản ứng để tạo ra các dẫn xuất khác nhau của CTS.
Phản ứng với axit glyconic của nhóm –NH
2
Chit – NH
2
+ OHC – COOH → Chit – N = CHCOOH + H
2
O
Phản ứng với halogen axit như axit monocloroaxetic tạo dẫn xuất
N – carboxylmethyl CTS theo phản ứng
Chit – NH
2
+ Cl – CH
2
COOH → Chit – NH – CH
2
– COOH + HCl
Phản ứng với alhydride axit tạo dẫn xuất N-acyl CTS

Chit – NH
2
+ R – CO – O – CO – R → Chit – NH – COR + RCOOH
Phản ứng thế với halogen hydrocacbon tạo muối amoni bậc 4
Phản
ứng tạo bazơ
Schiff với nhóm cacbonyl
- Nhóm amino tự do còn có thể tham gia phản ứng tạo bazơ Schiff với nhóm
cacbonyl, chẳng hạn với axit glyconic
Chit – NH
2
+ OHC – COOH
→
Chit – N = CH – COOH + H
2
O
Chit – N = CH – COOH + Na
+
→
Chit – N = CH – COONa + H
+
Chit – N = CH – COONa
4
,
o
NaBH t
→
Chit – NH – CH
3
(tan)

- Sự hiện diện của nhóm amin tự do trong đơn vị D – glucosamine có thể
được proton hóa trong môi trường axit làm cho CTS có thể hòa tan được trong môi
trường axit loãng, tạo thành dung dịch có pH khoảng 4,0 ÷ 6,4.
Phản ứng với axit đậm đặc tạo muối khó tan
Phản ứng với dung dịch I
2
/KI trong môi trường H
2
SO
4
cho màu tím. Đây là
phản ứng dùng để định tính CTS.
 Ứng dụng của CTS
1.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm

Chit
-CH
2
OH -CH
2
OR
-OH +5RX → Chit -OR + 4HX + X
-
-NH
2
-N
(+)
R
3
CTS là một polyme dùng an toàn cho người và có hoạt tính sinh học đa dạng.

CTS được dùng để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản hoa quả tươi vì nó tạo
màng sinh học không độc. CTS đã được đưa vào thành phần trong thức ăn: sữa
chua, bánh kẹo, nước ngọt, Các sản phẩm ăn kiêng có chứa CTS nhằm làm giảm
cholesterol, lipit máu, giảm cân nặng, chống béo phì, dùng để tránh nguy cơ mắc
bệnh tim mạch, tiểu đường, đã được Nhật Bản và một số nước sử dụng. CTS được
dùng làm sản phẩm thay thế hàn the. CTS là chất phụ gia bảo quản tốt cho giò và
bánh cuốn ở nhiệt độ phòng và bảo quản đến 26 ngày ở nhiệt độ 8
o
C. Nghiên cứu
cho thấy CTS là chất phụ gia có giá thành phù hợp và an toàn sức khỏe [12].
1.5.2. Trong nông nghiệp và thủy sản
Trong nông nghiệp, CTS được sử dụng để tăng cường hoạt động của các
vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống để kháng lại nấm bệnh trong đất,
cố định phân bón nhằm tăng khả năng nảy mầm của hạt, kích thích tăng trưởng
và tăng năng suất.
Trong lĩnh vực thủy sản, CTS được bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích
thích sinh trưởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trường ao nuôi. Ngoài ra, CTS cũng
được ứng dụng làm màng bao, làm chất kết dính để làm tăng độ ổn định của thức ăn
cho tôm. Với CTS làm màng bao thức ăn thủy sản được sử dụng ở nồng độ thấp
(khoảng 0,1%), nếu không thức ăn sẽ có vỏ cứng gây khó khăn cho động vật thủy sản
khi ăn và chitosan này phải có ĐĐA cao để màng bao được ổn định hơn trong môi
trường nước.
1.5.3. Trong xử lý môi trường
CTS có thể tạo phức với nhiều kim loại nặng như đồng, chì, crom… nhờ ái
lực của các nhóm amin. Tính chất của CTS ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo phức
với kim loại. Khi ĐĐA càng tăng thì khả năng tạo phức sẽ tăng. Vì vậy, CTS được
sử dụng như là nhóm tác nhân chính để xử lý nước thải.
CTS còn được sử dụng làm tác nhân thu hồi protein trong ngành công nghiệp
thực phẩm. Phân tử CTS có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối liên kết với các hạt keo
protein thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng xuống. Protein được thu

hồi bằng CTS có thể được tận dụng làm thức ăn gia súc vì CTS an toàn và protein
thu được có chất lượng tốt, chứa đủ các axit amin cần thiết.
1.5.4. Trong y học và công nghệ sinh học

CTS và dẫn xuất của nó được ứng dụng rộng rãi trong y học và công nghệ
sinh học nhờ các tính chất quan trọng như tương thích sinh học cao, tự phân hủy
sinh học, khả năng tạo màng, không độc, có khả năng làm lành vết thương, kháng
khuẩn, kháng nấm,…
a)
Glucosamine
b) Băng cầm máu
Hình 1.8. Chitosan sử dụng trong y học
CTS được dùng làm chất tạo màng, tạo dính để tạo viên nang bao bọc thuốc
hoặc làm tá dược hay các chất mang sinh học dẫn thuốc. Ở một số nước đã sản xuất
chỉ phẩu thuật tự hoại bằng chitosan, thuốc đau khớp từ glucosamin và một số sản
phẩm thủy phân từ chitosan.
Trong công nghệ sinh học, chitosan có nhiều tác dụng đa dạng như: có khả
năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại
khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế
bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Chitosan không những ức chế các vi khuẩn
gram dương, gram âm mà cả nấm men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của
chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối
lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực
phẩm.
 Điều chế chitosan
Công nghệ sản xuất chitosan dựa trên nguyên tắc loại bỏ muối calcium,
protein và các chất màu, lipid có trong vỏ tôm, cua, ghẹ…
Việc khử các tạp chất để sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản có thể thực hiện
bằng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hoặc kết hợp hai phương pháp.
Hiện nay các quy trình sản xuất chitin quy mô lớn chủ yếu sử dụng phương pháp hóa

học. Do phương pháp này có ưu điểm như nhanh, đơn giản và dễ thực hiện với quy
mô lớn. Quy trình chế tạo chitin bằng phương pháp hóa học được tóm tắt trên hình
1.9.

%&'!(&
)*+,!%
/!
Chin

Chitosan
Hình 1.9. Tổng quát quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản bằng
phương pháp hóa học
1.6.1. Nguyên liệu
Nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin/CTS là phế liệu thủy sản, chủ
yếu là vỏ tôm, ghẹ, mực. Tùy theo từng loại nguyên liệu mà hàm lượng chitin biến
đổi khác nhau. Trong đó nang mực có hàm lượng chitin cao nhất, kế đến là tôm sú
và tôm thẻ (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Thành phần hóa học một số phế liệu thủy sản để sản xuất chitin [14]
Nguyên liệu
Thành phần hóa học (%)
Độ ẩm Protein Khoáng Lipid Chitin
Cua xanh 4,5 24,0 56,0 2,0 12,9
Ghẹ chấm 12,9 10,3 57,9 0,3 17,1
Đầu tôm sú 9,1 26,8 29,3 0,5 34,9
Vỏ tôm sú 9,7 42,8 20,8 1,2 36,5
Nang mực 6-8 7-8 0,7-1 - 75-80

Hình 1.10. Nguyên liệu chiết tách chitin
Trong khóa luận này, nguyên liệu được sử dụng là vỏ tôm. Một vài thông số
về thành phần hóa học của vỏ tôm được trình bày trên bảng 1.3.

Bảng 1.3. Thành phần cơ bản của vỏ tôm thẻ chân trắng
Thành phần hóa học Hàm lượng* (%)
Chitin 29,4 ± 1,4
Hàm lượng protein 24,3 ± 1,2
Hàm lượng khoáng 26,5 ± 1,9
Hàm lượng lipit 2,2 ± 0,5
1.6.2. Khử khoáng
Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO
3
và rất ít
Ca
3
(PO
4
)
2
. Để khử khoáng người ta thường dùng các loại axit như HCl, H
2
SO
4
,
Quá trình khử khoáng thường được thực hiện ở nhiệt độ thường kết hợp với khuấy
đảo. Chất lượng chitin thu được phụ thuộc nồng độ của axit, thời gian ngâm và tỷ lệ
khối lượng trên thể tích (w/v) của quá trình khử khoáng. Thông thường, nồng độ
HCl được sử dụng đối với phế liệu tôm thấp hơn so với phế liệu cua, ghẹ. Vì vậy,
tùy theo từng loại nguyên liệu và yêu cầu chất lượng chitin mà thực hiện chế độ khử
khoáng sao cho phù hợp [14].
1.6.3. Đề protein
Quá trình khử protein từ phế liệu thủy sản có thể thực hiện với nhiều hóa
chất

như NaOH, Na
2
CO
3
, NaHCO
3
, KOH, K
2
CO
3
, Ca(OH)
2
, Tuy nhiên, thường dùng
NaOH nồng độ từ 1% – 10% ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ cao, thời gian xử lý từ
vài giờ đến vài ngày, cần thực hiện khuấy đảo trong khi xử lý để tăng cường hiệu
quả của quá trình đề protein. Tùy theo tính chất của nguyên liệu mà ta có thể chọn
chế độ đề protein phù hợp [14].
1.6.4. Đề axetyl

Thông thường quá trình đề axetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin
trong dung dịch NaOH hoặc KOH đậm đặc. Nồng độ NaOH thường sử dụng từ 40
– 50% ở nhiệt độ 100
o
C hoặc cao hơn, cần thực hiện khuấy đảo. Tùy vào nguồn
chitin và yêu cầu tính chất của CTS mà công đoạn đề axetyl được thực hiện ở các
chế độ khác nhau [14].
Hiện nay, hai công đoạn xử lý kiềm (đề protein và đề axetyl) có thể cho phép
gộp lại thành một giai đoạn xử lý kiềm đặc. Khi xử lý kiềm có nồng độ cao từ 40 –
50% trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp sẽ xảy ra đồng thời các phản
ứng thủy phân protein, thủy phân lipit và đề axetyl hóa.


CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất
- Vỏ tôm được thu mua tại các nhà hàng, quán ăn trên địa bàn quận Gò Vấp,
Tp. Hồ Chí Minh.
- HCl dạng tinh khiết của Trung Quốc
- NaOH dạng tinh khiết của Trung Quốc
- H
2
O
2
dạng tinh khiết của Merck, Đức.
- Nước cất được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm
2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị
- Máy sắc ký gel thấm qua (GPC) LC-20AB Shimadzu, Nhật, sử dụng
detector RID - 10A và cột Utrahydrogel 250 của hãng Waters, Mỹ, tại Trung tâm
Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM; Viện Năng lượng nguyên
tử Việt Nam.
- Máy nghiền bi Fritsch, Đức, tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp. HCM
- Máy đo quang phổ hồng ngoại FT - IR 8400s, Shimadzu, Nhật, tại Trung
tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM.
- Một số trang thiết bị khác dùng cho thí nghiệm như cân phân tích, tủ sấy, lò
nung, bình hút ẩm, tại Phòng thí nghiệm Hóa học trường Đại học Sài Gòn.
2.2.2. Dụng cụ
Các dụng cụ chịu nhiệt như cốc thủy tinh, cốc sứ và một số dụng cụ khác tại
Phòng thí nghiệm Hóa học trường Đại học Sài Gòn.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp chiết tách chitin từ vỏ tôm
Nguyên liệu: Vỏ tôm sau khi thu mua về được loại bỏ chân, râu, đuôi và tạp

chất sau đó rửa sạch.
Để tìm ra quy trình chiết tách thu được chitin chất lượng tốt, chúng tôi thực
hiện theo hai quy trình hình 2.1 [13, 14].
- Quy trình 1: Khử khoáng trước sau đó đề protein.
- Quy trình 2: Đề protein trước, khử khoáng sau.

%&'!(&
)*+,!%
*&!%0!
/!
*&!%0!
123&
 !
4
5%6
!(78/9!%
:;<5;$
4
5%6
$5$$$
:;<5;$
=&>!
%&'!(&
/!
*&!%0!
)*+,!%
*&!%0!
123&
 !
4

5%6
$5$$$
:;<5;$
4
5%6
!(78/9!%
:;<5;$
=&>!
Hình 2.1. Hai quy trình chiết tách chitin từ vỏ tôm
Khử khoáng: Vỏ tôm được ngâm trong dung dịch HCl 5% theo tỉ lệ 1:10 (w/v)
khoảng 2 giờ, ở nhiệt độ phòng, thực hiện khuấy đảo để phản ứng xảy ra đồng đều
hơn. Sau khi khử khoáng sản phẩm được rửa trung tính đến pH = 7.
Đề protein: Sản phẩm sau khi khử khoáng được ngâm trong dung dịch
NaOH 5% với tỷ lệ w/v = 1/10 và cho lên bếp điện, ổn định nhiệt độ ở 100
o
C,
khuấy liên tục. Sau khi đề protein, tiến hành rửa sản phẩm đến pH = 7, ngâm trong
nước cất qua đêm, sau đó rửa lại đến pH = 7.
Tẩy màu: Quá trình tẩy màu sử dụng H
2
O
2
0,1% với tỉ lệ w/v = 1/10 trong 30
phút. Sau đó rửa sạch và để khô tự nhiên. Sấy mẫu ở nhiệt độ 60 – 70
o
C trong thời
gian là 2 giờ.

2.3.2. Phương pháp chế tạo chitosan
Chitin được làm ẩm 10% bằng nước cất. Sau đó cho vào dung dịch NaOH

50% với tỉ lệ w/v = 1/10, đun trên bếp gia nhiệt ở nhiệt độ 90
0
C và lấy mẫu theo 30,
60, 90, 120, 150 và 180 phút. Các mẫu chitosan thu được kí hiệu lần lượt là CTS30,
CTS60, CTS90, CTS120, CTS150, CTS180 tương ứng với thời gian lấy mẫu. Mẫu
lấy ra được rửa sạch bằng nước cất tới pH = 7, ngâm qua đêm và rửa lại tới pH = 7.
Để khô tự nhiên và sấy ở nhiệt độ 60 – 70
0
C [13, 14].
2.3.3. Phương pháp xác định độ đề axetyl và khối lượng phân tử CTS
a. Xác định đồ đề axetyl
Có nhiều phương pháp xác định ĐĐA của CTS như: phân tích nguyên tố,
dùng phổ UV, IR và NMR… Tuy nhiên, các phương pháp phổ biến hiện nay là sử
dụng UV, NMR và IR.
Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
để xác định ĐĐA của CTS do tính thuận lợi, đơn giản và nhanh chóng so với các
phương pháp khác.
( )
1320
1420
A
ĐĐA(%) = 100 - (31,92 × - 12,20) 1
A
Mẫu CTS được
nghiền nhỏ bằng cối nghiền bi (Fritsch, Đức) và rây qua rây 200 mesh. Cân khoảng
3 – 5 mg mẫu bột CTS trộn cùng với 100 mg KBr trong cối mã não, ép viên trên
máy ép chuyên dụng trong thời gian khoảng 10 phút (hình 2.2). Tiến hành đo phổ
IR trên máy FT – IR 8400S Shimadzu, Nhật (hình 2.3) và tính ĐĐA (%) theo công
thức: [18]
Với A

1320
, A
1420
là mật độ quang tương ứng tại các số sóng 1320, 1420 cm
-1
.

Hình 2.2. Mẫu màng CTS/KBr sau khi ép viên
Hình 2.3. Máy quang phổ hồng ngoại FT – IR 8400S (Shimadzu, Nhật)
b. Xác định KLPT CTS
Phương pháp sắc ký gel thấm qua (Gel Permeation Chramatography – GPC)
xác định KLPT trung bình khối lượng (M
w
) và KLPT trung bình số lượng (M
n
) là
phương pháp thường được dùng để xác định KLPT polyme và chỉ số đa phân tán
(Polydispersity Index – PI) của polyme bao gồm cả CTS.
Hình 2.4. Máy sắc ký gel thấm qua (GPC) LC – 20 Shimadzu, Nhật
$
Các bước xác định khối lượng phân tử CTS được đo bằng GPC:
- Bước 1: Lập đường chuẩn thời gian lưu và KLPT của mẫu chuẩn Pullulan
Hòa tan 0,01 gam các mẫu chuẩn Pullulan có KLPT là 738 – 380 000 Da
(bảng 2.1) vào trong 2ml dung môi CH
3
COOH 0,25M /CH
3
COONa 0,25M. Xác
định thời gian lưu của các mẫu dung dịch Pullulan trên máy LC – 20AB, Shimadzu,
detector RID – 10A, sử dụng cột Utrahydrogel 250, 500 và Linear của hãng Waters,

nhiệt độ cột là 40
0
C, pha động là dung môi CH
3
COOH 0,25M /CH
3
COONa 0,25M
với tốc độ chảy là 1ml/phút. Thể tích mẫu tiêm vào cột khoảng 50μl. Xác định thời
gian lưu từ phổ đồ GPC (bảng 2.2).
Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu chuẩn Pullulan
STT Mw, Da PI POLYMER LABORATORIES Batch No
1 738 1 STACHYOSE TETRAHYDRAT 20910 – 1
2 12 200 1.06 POLYSACCHARIDE 20902 – 1
3 23 720 1.07 POLYSACCHARIDE 20903 – 1
4 48 000 1.09 POLYSACCHARIDE 20904 – 1
5 100 000 1.1 POLYSACCHARIDE 20905 – 1
6 380 000 1.12 POLYSACCHARIDE 20907 – 1
Bảng 2.2. KLPT và thời gian lưu của các mẫu chuẩn Pullulan đối với cột
Ultrahydrogel Linear
Số thứ tự mẫu 1 2 3 4 5 6
Thời gian lưu, Phút 9,739 10,780 11,222 11,695 12,091 13,315
KLPT × 10
3
, Da
380 100 48 23,7 12,2 0,738
Thiết lập đường chuẩn trên máy mối tương quan KLPT và thời gian lưu
(hình 2.5)

Hình 2.5. Đường chuẩn tương quan giữa KLPT và thời gian lưu của Pullulan đối
với cột Utrahydrogel Linear

Chuan pulullan, Sigma USA COT VINAGAMMA
Linear : ax+b
a = – 0.7531064 b = 13.07259
R^2 = 0.9792989 R = 0.9895953 Dispersion = 0.1213883
Bảng 2.3. KLPT và thời gian lưu của các mẫu chuẩn Pullulan đối với cột
Utrahydrogel 250
Số thứ tự mẫu 1 2 3 4 5
Thời gian lưu, Phút 7,00 7,50 8,12 8,64 10,52
KLPT × 10
3
, Da
100 48 23,7 12,2 0,738

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
-5
0
5
10
15
20
uRIU
Detector B Ch1
Hình 2.6. Đường chuẩn tương quan giữa KLPT và thời gian lưu của
Pullulan đối với cột Utrahydrogel 250
Linear : ax+b a = – 0.6024559 b = 9.236203
R^2 = 0.9975414 R = 0.9987699 Dispersion = 0.0363634
0.0 2.5 5. 0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
-5
0
5

10
15
20
uRIU
Detector B Ch1

a
b
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min
-5
0
5
10
15
20
uRIU
Detector B
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min
0
5
10
15
20
uRIU
Detector B
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min
0
10
20
30

40
uRIU
Detector B
Hình 2.7. Sắc kí đồ GPC thời gian lưu của mẫu chuẩn Pullulan ghi trên cột
Ultrahydrogel 250 với KLPT a) 100 000, b) 40 000 c) 23 720 d) 12 200 và e) 738
- Bước 2: Xác định KLPT của mẫu CTS
Hòa tan CTS vào dung dịch đệm CH
3
COOH 0,25M/ CH
3
COONa 0,25M cho
đến khi tan hoàn toàn, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm (Millipore filters). Tiêm
khoảng 50μl mẫu dung dịch CTS vào cột sắc ký. Các điều kiện khác tương tự
như đã mô tả đối với mẫu chuẩn pullulan. Xác định thời gian lưu và so sánh với
đường chuẩn để xác định KLPT của mẫu CTS cần đo.

c
d
e
f
Hình 2.8. Sắc kí đồ thời gian lưu của mẫu Chitosan KLPT thấp (f), CTS KLPT thấp
(g) và CTS KLPT cao (h)
Bảng 2.4. Kết quả M
w
của CTS đo bằng GPC
Thời gian lưu, phút
6,957
6,068
Bảng 2.4 đưa ra kết quả điển hình xác định KLPT đối với các mẫu là
chitosan KLPT thấp và cao.

2.3.4. Phương pháp xác định độ ẩm và hàm lượng khoáng
( )
2 3
2 1
W - W
H(%) = . 100 2
W - W
Độ ẩm được xác định bằng
phương pháp phân tích trọng lượng. Sấy khô cốc ở nhiệt độ 105
0
C trong 5 giờ (đến
khối lượng không đổi), sau đó để cốc trong bình hút ẩm để làm nguội. Cân xác định
khối lượng của cốc sấy là W
1
(g). Cho mẫu vào cốc sấy cân được khối lượng W
2
(g).
Sấy ở 105
0
C trong 24 giờ, cân được khối lượng W
3
(g). Độ ẩm (H) được tính theo
công thức: [17]
Thí nghiệm được lặp lại 4 lần, dùng chuẩn student để loại bỏ sai số thô và
đánh giá kết quả ở mức tin cậy 95% (p < 0,05).

g
h