Nghiên cưu một số yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của rifampicin trong viên nén rifampicin, isoniazid và piraazinamid

r" ^
m
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN TỨ SƠN
NGHIÊN CỨU MỘT số YẾU Tố ẢNH HƯỞNG ĐẾN
ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA RIFAMPICIN TRONG VIÊN
NÉN RIFAMPICIN, ISONIAZID VÀ PIRAZINAMID
KHOÁ LUẨN TỐT NGHIÊP Dược sĩ KHO Á 2001-2006
Giáo viên hướng dẫn: PGS .TS . Phạm Ngọc Bùng
ThS. Võ Quốc Ánh
Nơi thực hiện : Bộ môn Vật lý - Hoá lý và phòng TN
trung tâm ĐH Dược Hà Nội
Thời gian thực ^ừ-2(2005 đến 5/2006
•

:: \
; /, '3 /
\^"'-4ũúơ.cny
/

HÀ NỘI-5/2006
■ ' < l í . c C
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tớ i:
PGS .TS . Phạm Ngọc Bùng ( Chủ nhiệm bộ môn Vật lý-Hoá lý )
ThS. Võ Quốc Ánh ( Giảng viên bộ môn Vật lý-Hoá lý)
Hai người thầy kính mến đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi
hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo, cán bộ của bộ
môn Vật lý-Hoá lý, Bào chế, Phòng thí nghiệm trung tâm trường đại học Dược

Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình
làm thực nghiệm.
Nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo
trường đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt và dạy bảo tôi trong suốt 5 năm qua.
Và cuối cùng xin cảm ơn gia đình và bạn bè tôi đã luôn quan tâm và giúp đỡ
tôi trong học tập và cuộc sống.
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Nguyễn Tứ Sơn
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN 2
/.7. Vài nét về bệnh lao và vấn đề sử dụng thuốc chống lao

2
1.1.1. Vài nét về bệnh lao 2
1.1.2. Tình hình sử dụng và sinh khả dụng của thuốc chống lao

2
1.2. Rifampicin và chế phẩm chứa Rifampicin
5
1.2.1. Công thức hoá học 5
1.2.2. Dược động học 5
1.2.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
6
1.2.4. Tác dụng không mong muốn 6
1.2.5. Chỉ định và liều dùng
6
1.2.6. Một số chế phẩm chứa Rifampicin trên thị trường

6
1.3. Tính chất lý hoá và các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của
RMP.

1

!

.

1.3.1. Tính chất lý hoá 7
1.3.2. Độ ổn định của RMP và các yếu tố ảnh hưởng

7
1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng và phương pháp lão
hoá cấp tốc
1.5. Độ ổn định của thuốc và phương pháp thực nghiệm

12
1.5.1. Khái niệm về độ ổn định của thuốc 12
1.5.2. Một số quy định trong nghiên cứu độ ổn định của thuốc

13
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
15
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

15
2.1.1. Nguyên liệu và thiết b ị

15
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
16
2.2. Kết quả và nhận xét 20
2.2.1. Thẩm định phưcfng pháp HPLC trong định lượng RMP 20
2.2.2. Khảo sát động học phân huỷ RMP trong môi trường pH 1 và 6,8 24
2.2.3 Khảo sát tương tác dược chất - dược chất trong viên nén 3
thành phần
2.3. Bàn luận 44
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 48
- TÀI LIỆU THAM KHẢO
- PHUC LUC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
RMP:
Rifampicin
INH:
Isoniazid
PZA:
Pyrazinamid
ETH:
Ethambutol
DĐVN:
Dược điển Việt Nam
SKD:
Sinh khả dụng
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
TĐPƯ:
Tốc độ phản ứng
ĐẶT VẤN ĐỂ

Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người và có xu hướng ngày
càng lan rộng trong cộng đồng. Hiện nay trên thế giới có 2,2 tỷ người nhiễm
vi khuẩn lao, và mỗi năm ước tính có khoảng 2 triệu người chết do bệnh lao.
Trong đó, 75% bệnh nhân lao ở độ tuổi lao động, có khoảng 95% bệnh nhân
lao và 98% ca tử vong do bệnh lao gặp ở các nước thu nhập vừa và thấp, 80%
số bệnh nhân lao thuộc 22 nước được WHO xếp vào danh sách những nước
chịu ảnh hưởng của bệnh lao cao nhất (trong đó có Việt Nam). Những con số
đó khẳng định sự lan rộng và phát triển bệnh lao một tình trạng khẩn cấp
mang tính toàn cầu, một thảm hoạ của y tế công cộng.[2]
Phác đồ điều trị lao hiện nay có sự phối hợp các thuốc để tăng hiệu quả
điều trị và tránh hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao. Việc phải dùng
nhiều loại thuốc một lúc trong thời gian dài gây nhiều bất tiện cho bệnh nhân,
Dạng chế phẩm phối hợp các dược chất được sản xuất nhằm khắc phục khó
khăn này. Tuy nhiên, khi phối hợp các thuốc điều trị lao(RMP, INH,
PZA,ETH) trong một dạng bào chế đã có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự ổn
định của RMP, dẫn đến sinh khả dụng các thuốc phối hợp thấp và không ổn
định [17]. Để góp phần tìm biện pháp nâng cao độ ổn định của RMP trong
dạng thuốc phối hợp RMP, INH, PZA, chúng tôi thực hiện đề tài:“ Nghiên cứu
một số yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của Rifampicin trong viên nén
Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid ” với các mục tiêu sau:
1- Đánh giá được ảnh hưởng của INH và PZA đến độ ổn định của
RMP trong môi trường pHl và pH 6,8, và viên nén 3 thành phần.
2 - Xác định được động học phân huỷ của RMP và dự tính được tuổi thọ
của viên 3 thành phần bào chế thử nghiệm.
PHẦNl: TỔNG QUAN
1.1-VÀI NÉT VỂ BỆNH LAO VÀ VÂN ĐỂ sử DỤNG THUỐC CHỐNG
LAO.
1.1.1“ Vài nét về bệnh lao.
Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn lao gây ra, có thể biểu
hiện cấp hay mạn tính. Hay gặp nhất là lao phổi (80-85%), ngoài ra có thể gặp

các thể lao ngoài phổi khác như: màng phổi, xương, màng não
Hiện nay, bệnh lao là một trong những bệnh nhiễm trùng gây tử vong
hàng đầu trên thế giới và đang là một trong những dịch bệnh vượt khỏi tầm
kiểm soát của nhiều nước kể cả những nước phát triển. Trên thế giới có
khoảng 9-10 triệu người mắc lao mới hàng năm, và ước tính đến năm 2020 sẽ
có thêm 200 triệu người mắc bệnh lao và 70 triệu người chết do lao. Theo ước
tính của WHO, mỗi năm có thêm khoảng 65 triệu người nhiễm vi khuẩn lao,
chiếm khoảng 1% dân số toàn cầu. Trong bản báo cáo hàng năm(2004) của
WHO thì Việt Nam đứng thứ 13 trong số 22 nước có số người mắc bệnh lao
cao trên thế giới. Hàng năm, Việt Nam có thêm 145.000 người mắc bệnh lao
các thể, và có hcfn 20.000 người chết[2].
1.1.2- Tình hình sử dụng và sinh khả dụng của thuốc chống lao.
Về điều trị lao, ngày nay lao không còn là một bệnh nan y như trước đây.
Bệnh lao có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu bệnh nhân lao tuân thủ nguyên tắc và
phác đồ điều trị. Thuốc điều trị lao được biết đến đầu tiên là Streptomycin, sau
đó cùng với sự tìm ra INH, RMP, PZA có thêm nhiều sự lựa chọn trong điều
trị lao. Khi phối hợp hợp lý những thuốc này thì hiệu quả điều trị cao, tỷ lệ tái
nhiễm và thời gian điều trị bệnh lao giảm đi đáng kể. RMP, INH, PZA, ETH
được xem lựa chọn đầu tay để điều trị.
Mặc dù vậy nhưng số bệnh nhân lao vẫn gia tăng đáng báo động. Đặc biệt
là gần đây có dấu hiệu gia tăng tình trạng kháng RMP và INH-2 thuốc có hoạt
lực mạnh[28]. Một số tác giả cho rằng nguyên nhân gây ra tình trạng này là
do việc kê đơn không hợp lý, dùng thuốc không tuân theo phác đồ điều trị
[2,28]. Hiện tượng này không những làm tăng tỷ lệ tái phát mà còn tạo điều
kiện xuất hiện chủng vi khuẩn lao kháng thuốc.
WHO đã khuyên cáo phải phối hợp các thuốc chống lao, dùng đúng liều,
đều đặn, và đủ thời gian(ít nhất 8 tháng). Việc phải sử dụng nhiều loại thuốc
trong một thời gian dài đã gây nhiều khó khăn cho bệnh nhân trong quá trình
điều trị. Có nguy cơ bệnh nhân quên thuốc, không tuân thủ đúng phác đồ điều
trị. Nhằm giảm phiền hà cho bệnh nhân, hạn chế sai sót trong kê đofn, tính

liều, và chuẩn hoá phác đồ điều trị cũng như dễ dàng cho việc quản lý chương
trình chống lao người ta đã kết hợp 2, 3 hoặc 4 loại dược chất trong một dạng
bào chế.
Thuốc được bào chế dạng viên phối hợp kết hợp 2, 3, 4 dược chất có nhiều
ưu điểm cho việc điều trị. Tuy nhiên khi phối hợp nhiều loại dược chất trong
cùng một đơn vị bào chế làm tăng nguy cơ tương tác, làm giảm sinh khả dụng
của thuốc. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về SKD của RMP trong các chế
phẩm kết hợp, cho thấy SKD của RMP trong một số thuốc phối hợp không ổn
định[6,10,26,28].
Trong nước, Lê Thị Luyến và cộng sự [6] là những người đầu tiên quan
tâm đến SKD của RMP trong thuốc chống lao phối hợp tại Việt Nam. Nghiên
cứu cho thấy SKD của thuốc chống lao phối họfp 2, và 3 thành phần đang sử
dụng tại Việt Nam thấp hơn so với viên chuẩn đofn lẻ, thể hiện ở tốc độ hấp
thu RMP trong viên hỗn hợp chậm hơn. Tmax (2thành phần) = 2,5 giờ, Tmax
(3 thành phần) = 3 giờ và Tmax (viên đcfn lẻ) = 1 giờ. Nồng độ Cmax RMP
trong huyết tương trong thuốc 2 và 3 thành phần thấp Cmax (3 thành phần) =
5,59 ± 1,86 |ig/ml), Cmax (2 thành phần) = 6,48 ± 1,85 |Lig/ml trong khi đó
Cmax (viên đơn lẻ) = 10,44 ± 2,01 |ig/ml, đều này dễ dẫn đến tình trạng vi
khuẩn sẽ kháng RMP, và tỷ lệ tái phát gia tăng.
Nghiên cứu về tưoỉng đương sinh học các chế phẩm chứa RMP trên thị
trường, tác giả G. Pillai và cộng sự [16], sau khi so sánh kết quả các thông số
động học cho thấy không có sự tương đương sinh học giữa các chế phẩm phối
hợp và các chế phẩm đơn thành phần chứa RMP. Có sự tương tác giữa các
dược chất làm giảm khả năng hấp thu của RMP trong các chế phẩm đa thành
phần. Do đó, năm 1994 tổ chức y tế thế giới và hiệp hội chống lao và bệnh
phổi quốc tế đã khuyến cáo: ” Chỉ sử dụng các chế phẩm phối hợp trong điều
trị lao khi đã chứng minh được sự đảm bảo về sinh khả dụng và tương đương
sinh học của RMP trong các chế phẩm này ”.[33]
Tác giả s. Singh và cộng sự [28] đã chỉ ra yếu tố chính gây ra SKD thấp và
không ổn định của RMP trong dạng thuốc phối hợp là sự tăng phân hủy RMP

trong dạ dày khi có mặt INH. Với dạ dày rỗng, RMP có thể bị phân huỷ 20-
50% tức là nếu dùng RMP với liều là 10-12 mg/kg thể trọng thì nồng độ hấp
thu chỉ còn 5-6 mg/kg thể trọng. Khi sử dụng liều < 9mg/kg thì mất hiệu lực
điều trị. Ngoài ra các tác giả còn đưa ra nhiều ý kiến về vấn đề liên quan tới
SKD của RMP như là yếu tố công thức, yếu tố về thực hành tốt sản xuất thuốc
và sự ảnh hưởng của tá dược đến hấp thu RMP. Khi RMP được chỉ định cùng
với p-amino salicylic, bentonit, hay các antacid chúng sẽ làm giảm SKD của
RMP khá rõ rệt. Thứ tự tác động của các antacid là magnesi trisilicat > nhôm
hydroxyd > natri bicarbonat.
Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng ưu điểm sử dụng thuốc điều trị lao
phối hợp rất lớn. Nếu áp dụng các biện pháp bào chế hcfp lý và có quy trình
sản xuất tốt vẫn có thể có được các chế phẩm độ ổn định và SKD cao, hiệu
quả điều trị tốt.
R.Panchanula và cộng sự[23] nghiên cứu so sánh sinh khả dụng của viên
phối hợp với viên đơn thành phần lại cho kết quả rất khả quan,
max
của thuốc phối hợp và viên đơn lẻ gần như nhau: (viên phối hợp) = 12,1
|0.g/ml, (viên đơn lẻ) = 12,2 ^Ig/ml, của hai loại trung bình là 1 đến 2
giờ
1.2. RIFAMPICIN VÀ CHẾ PHẨM chứ a RIFAMPICIN
1.2.1 Công thức hoá học[3,21,30]
HO._
CH
3 C 0 0 ,,^ ^ C H 3 ^
H
CH,
NH
CH
:N-
■CH,

M=823.0
Tên khoa học: (12Z, 14E, 24E)-(2S, 16S, 17S, 18R, 19R, 20R, 21S, 22R,
23S)- 5, 6, 9, 17, 19 -pentahyroxy - 23 - methoxy - 2,4,12,16,18,20,22
heptamethyl - 8 - [ N- (4-methyl-l-piperazinyl) formimidoyl ]- 1, 11- dioxo-
2, 7-[ epoxy (1, 11, 13- pentadecatrieno) imino] 1, 2- dihydronaphtho [2, 1- b]
furan- 2 1- yl acetat.
RMP là một kháng sinh bán tổng hợp từ Rifamycin B. Rifamycin được
chiết xuất từ Streptomices mediteranei.
1.2.2 Dược động học[4]
Thuốc được hấp thu tốt qua đường tiêu hoá. Sau khi 2-4h thuốc đạt nồng
độ tối đa trong máu. Trong máu thuốc gắn vào protein huyết tương khoảng 75-
80%. RMP thải trừ chủ yếu qua gan và thận. Ngoài ra nó còn thải trừ qua nước
bọt, đờm, nước mắt, làm cho các dịch này có màu đỏ da cam. Thời gian bán
thải của thuốc khoảng từ 1,5 đến 5 giờ. Khi chức năng gan giảm thì tj/2 của
thuốc kéo dài. Ngược lại do sự cảm ứng hệ enzym oxy hoá thuốc ở gan, sau
khi điều trị khoảng 14 ngày thời gian bán thải của thuốc bị rút ngắn lại. Thuốc
có chu kỳ gan -ruột. RMP làm tăng chuyển hoá một số thuốc qua tác dụng
gây cảm ứng cytocrom P450 như: thuốc tránh thai, phong bế p - adrenergic,
chẹn kênh canxi, diazepam, digitoxin, quinidin,
1.2.3 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng.[4]
RMP gắn vào chuỗi p của ARN- polymerase phụ thuộc AND của vi
khuẩn làm ngăn cản tạo thành chuỗi ban đầu trong quá trình tổng hợp ARN.
Thuốc không chỉ tác dụng tiêu diệt trực khuẩn lao, phong mà còn có tác dụng
tiêu diệt các vi khuẩn Gram (-), E.coli, trực khuẩn mủ xanh, Nesserie
meningitidis, Heamophilus influenzae. RMP diệt vi khuẩn cả trong và ngoài tế
bào. trong môi trường acid thuốc tác dụng mạnh gấp 5 lần.
1.2.4 Tác dụng không mong muốn[4]
RMP gây độc với gan nhất là với người có tiền sử bệnh gan, nghiện rượu
và người cao tuổi. Tác này tăng lên khi dùng phối hợp với INH. Ngoài ra RMP
còn có tác dụng không mong muốn khác như: Rối loạn tạo máu, rối loạn tiêu

hoá, phát ban, choáng phản vệ.
1.2.5 Chỉ định và liều dùng[4]
Điều trị bệnh lao, phong, nhiễm khuẩn do tụ cầu, phòng viêm màng não
cầu. Liều dùng: lOmg/kg cân nặng/ngày, tối đa 600mg/ngày.
1.2.6 Một số chế phẩm chứa RMP trên thị trường[8]
Viên 2 thành phần RMP, INH : Rifa-H 250( viên nén bao phim của xí
nghiệp dược phẩm trung ương II ), Rifampicin-Rimifon( viên nén bao phim
của xí nghiệp dược phẩm trung ương I), Co-Barcin 250-450(Sanofi), RH( Viên
nén bao phim-Đức), Rimactazid( viên nén bao phim- Imexpharm Đồng tháp).
Viên 3 thành phần (RMP, INH, PZA): Rimcure 3-FDC( viên nén bao
phim- Novartis), Refater(viên nén bao phim-Sanofi).
Viên 4 thành phần : Rimstar 4-FDC( viên nén bao phim Novartis).
1.3. TÍNH CHẤT LÝ HOÁ VÀ CÁC YÊU Tố ẢNH HƯỞNG ĐÊN ĐỘ
ỔN ĐỊNH CỦA RMP.
1.3.1. Tính chất lý hoá [3,18,30]
Bột tinh thể màu đỏ nâu, nhiệt độ nóng chảy từ 183°c đến 188°c. khó
tan trong nước, aceton, ethanol 96% và ether. Tan trong methanol, ethylacetat.
Dễ tan trong cloroform.Độ tan của RMP ở 25°c trong nước là lOg/lOOml (pH
2,0), 0,4g/100ml (pH 5,3) và 0,28g/100ml (pH 7,5).
Hỗn dịch 1% trong nước có pH từ 4,5 đến 6,5. không bền khi gặp ẩm. Đo
quang ở bước sóng từ 220 đến 500 nm có 4 cực đại ở 237 nm, 254nm, 334nm
và 475 nm. RMP Có pKa 1,7 do có nhóm 4- hydroxy và pKa 7,9 do có nhóm
3- piperazine nitrogen. Phản ứng màu với aminopersulphat trong dung dịch
đệm phosphat pH 7,4 cho màu từ da cam đến tím đỏ.
1.3.2 Độ ổn định của RMP và các yếu tố ảnh hưởng
1.3.2.1- Độ ổn định của RMP trong môi trường hoà tan
Việc tiếp xúc với môi trường acid và môi trường kiềm trong đường tiêu
hoá ảnh hưởng đến độ ổn định của RMP trong thuốc phối hợp, từ đó ảnh
hưởng đến sinh khả dụng của thuốc. Các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến độ
ổn định của RMP trong môi trường hoà tan, đặc biệt là trong môi trường pH 1

(môi trường pH dạ dày). Sở dĩ như vậy là do tại môi trường này RMP hoà tan
tốt [7] nhưng lại bị phân huỷ khá nhanh, đặc biệt là khi có mặt INH [26].
RMP không bền trong môi trưòmg acid và kiềm. Trong môi trường trung
tính tốc độ phân huỷ RMP chậm hơn trong môi trường acid và kiềm [18]. Đã
có nhiều nghiên cứu khẳng định sự phân huỷ RMP trong môi trường acid. Các
nghiên cứu này còn cho thấy sự ảnh hưởng của các dược chất khác trong công
thức đến độ ổn định của RMP[25,26,28]
Shishoo và các cộng sự [26] khi nghiên cứu độ ổn định của RMP trong
môi trường hoà tan bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao đã thấy
sự phân huỷ RMP trong môi trường HCl 0,1N, ở 37°c khi có mặt INH cao
gấp 2 lần RMP đơn thành phần. Sau 45 phút, RMP đơn thành phần bị phân
huỷ 12.4% RMP, khi có mặt INH thì RMP bị phân huỷ là 21,5%. Các tác giả
đã xác định động học của quá trình phân hủy RMP khi có mặt INH là phản
ứng bậc 1 với hằng số tốc độ là k = 4,6.10'^ (phúr‘).
Cũng trong một nghiên cứu về sự ổn định của RMP, s. Singh cùng cộng
sự [28] cũng chứng minh RMP rất dễ bị phân huỷ trong môi trường acid. Khi
chỉ có đơn thành phần RMP trong môi trường HCl 0,1N, 37°c sau 50 phút
RMP bị phân huỷ khoảng 17,8 - 24,4%. Khi có mặt đồng thời RMP và INH
thì sau 15 phút RMP bị phân huỷ 8,5%, và tăng lên 50% sau 3 giờ. INH bị
phân huỷ 1,8% sau 15 phút và 10,3% sau 3 giờ. Nghiên cứu này cho thấy PZA
gần như không ảnh hưởng đến sự phân huỷ RMP trong môi trường acid, chỉ có
INH ảnh hưởng đến sự phân huỷ RMP.
Về sản phẩm phân huỷ của RMP trong môi trưòỉng hoà tan, trong môi
trưòỉng acid RMP bị thuỷ phân thành 3- formyl rifamycin và 1- amino - 4-
methyl piperazine [18,27]. Trong môi trường pH 8,2 và 20-22°C RMP bị oxy
hoá tạo thành rifampicin quinon. Nếu ở môi trường pH 8,2 nhưng khi tăng
nhiệt độ lên 60-70°C thì RMP bị phân huỷ cho các sản phẩm dạng 25-
desacetyl rifamycin. Sự có mặt INH trong môi trường acid làm tăng tốc độ
phân huỷ RMP thành 3-formyl rifamycin [18].
Khi nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến độ hoà tan của RMP trong 2

môi trường pHl và pH6,8, nhóm nghiên cứu Phạm Ngọc Bùng, Võ Quốc Ánh
và Lê Thị Hải Yến [7] thấy rằng tốc độ hoà tan RMP trong môi trường pHl là
tương đối tốt (80,8% trong 15 phút) còn trong pH 6,8 thì lại rất thấp (53,6%
trong 60 phút). Trong nghiên cứu này cũng cho thấy INH làm giảm đáng kể
tốc độ hoà tan của RMP trong cả 2 môi trưcmg. Không những thế INH còn
thúc đẩy quá trình phân huỷ RMP trong môi trường pH 1. PZA ít ảnh hưởng
đến tốc độ hoà tan của RMP trong pH 1 nhưng làm giảm đáng kể độ hòa tan
của RMPỞpH6,8.
Như vậy trong môi trường pH 1 RMP tan tốt nhưng kém bền và tăng phân
huỷ khi có mặt INH ( pyrazinamid, ethambutol ảnh hưởng không đáng kể
[26]).
1.3.2.2- Độ ổn định của RMP trong môi trường rắn
Nguyên liệu RMP bền vững ít nhất 5 năm ở 25 °c nếu bảo quản tránh ẩm
và tránh ánh sáng, [18].
Có nhiều nghiên cứu về độ ổn định của RMP trong viên đcm thành phần và
đặc biệt trong viên kết hợp đa thành phần. Khi kết hợp các dược chất trong
một dạng bào chế, một số nghiên cứu đã phát hiện sự giảm hàm lượng
RMP[13,24]
Khi lấy mẫu viên thuốc INH, RMP ở cả dạng đơn thành phần và dạng kết
hợp ở các chương trình chống lao, và thị trường K.L. Laserson và cộng sự [20]
đã thấy rằng các thuốc đa thành phần có tỷ lệ hàm lượng dược chất không đạt
yêu cầu cao hơn các mẫu thuốc đơn thành phần. T.A. Kenyon và các cộng
sự[19] bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đã phát hiện các 31% các chế
phẩm phối hợp không đạt tiêu chuẩn. Trong đó 15% mẫu có hàm lượng RMP
thấp.
Khi nghiên về sản phẩm phân huỷ của RMP trong viên phối hợp 4 thành
phần (225 mg RMP, 150mg INH, 750mg PZA, 400mg ETH) ở điều kiện
40*^0, độ ẩm 75%. S.Shingh cùng cộng sự [29] thấy rằng cùng với sự giảm
hàm lượng RMP (từ 60% đến 90%) thì hàm lượng isonicotinyl hydrazone (sản
phẩm của sự kết hợp giữa 3- formyl Rifamycin và INH [26,29]) cũng tăng lên

tương ứng.
Tuy nhiên, những nghiên cứu trên mới chỉ đánh giá độ ổn định của RMP
trong viên phối hợp khi có tá dược, chưa có nghiên cứu nào công bố về tương
tác dược chất- dược chất ở trạng thái rắn không có tá dược. Cũng như chưa có
công bố nào về động học phân huỷ RMP trong viên phối hợp.
Ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm ảnh hưcfng nhiều đến độ ổn định của RMP
trong viên phối hợp. R. Panchanula [11] đã nghiên cứu các sản phẩm phối hợp
trong nhiệt độ phòng (20 - 35°C), không khống chế độ ẩm trong thời gian 16 -
38 tháng kết quả cho thấy hàm lượng RMP trong thuốc vẫn nằm trong giới
hạn quy định của dược điển, và không thấy những biến đổi vật lý của thuốc.
Tác giả cho rằng sự không ổn định của thuốc không phải là nguyên nhân gây
ra sinh khả dụng thay đổi của các chế phẩm phối hợp.
Khi bảo quản viên nén 4 thành phần khi tiếp xúc với nhiệt và độ ẩm trong
điều kiện 40®c, độ ẩm 75% thì thấy RMP bị phân huỷ rõ rệt [17]. Khi so sánh
các mẫu viên phối hợp 4 thành phần được bao gói khác nhau, s Singh và cộng
sự [29] thấy rằng ở điều kiện thường không quan sát thấy sự thay đổi vật lý
hay hoá học nào. Tuy nhiên trong điều kiện 40°c, độ ẩm 75% thì các viên tiếp
xúc với ánh sáng và độ ẩm cho thấy biến đổi rõ về vật lý. Biểu hiện là viên bị
chảy nước hay nứt viên, đồng thời hàm lượng dược chất giảm. Còn các mẫu
được bao gói bằng vỉ nhôm kín thì ít bị ảnh hưởng.
Như vậy, thuốc chống lao dạng phối hợp khi bảo quản cần tránh ánh sáng
và độ ẩm, những yếu tố có thể ảnh hưởng đến hàm lượng dược chất trong viên.
1.4. ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐÊN T ố c ĐỘ PHẢN ỨNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP LÃO HOÁ CÂP T ố c Dự ĐOÁN TUỔl THỌ CỦA
THUỐC [1,5,22]
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới tốc độ của các phản ứng hoá học. Người ta
thấy rằng khi nhiệt độ tăng lên 10°c, tốc độ (v) và tưoỉng ứng hằng số tốc độ
(k) của phản ứng tăng lên từ 2 đến 4 lần. Để đặc trưng cho ảnh hưởng này
người ta thường sử dụng đại lượng hệ số nhiệt độ y,0 , còn gọi là hệ số
Vant'Hoff:

^ ^ 10
ĩ 10 ~
k^.
Trong đó kj là hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ T
kx+10 là hằng số tốc độ của phản ứng đó ở nhiệt độ T+10
Yio “ 2 ^ 4
Hệ số Yio của phản ứng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng
phản ứng. Khi biết được Yio và hằng số tốc độ của phản ứng k| (ở Tj) của phản
ứng, có thể tính được hằng số tốc độ của phản ứng này ở bất kỳ nhiệt độ T
nào
k„ = k_ v"
T - T,
n =

-
10
Hệ số Vant'Hoff chỉ gần đúng và chỉ áp dụng được ở khoảng nhiệt độ
hẹp. Với khoảng nhiệt độ lớn quy tắc này không còn đúng nữa.
Biểu thức chính xác và thưòĩig dùng phổ biến hơn để biểu thị ảnh hưởng
của nhiệt độ tới tốc độ của phản ứng là phương trình Arrhenius
dlnk ^ ^
dT " RT'
hay k =
Đại lượng E được gọi là năng lượng hoạt hoá của phản ứng. (Năng
lượng hoạt hoá của phản ứng là năng lượng dư tối thiểu của phân tử so với
năng lượng phân tử trung bình của chất phản ứng ở nhiệt độ T để có thể tham
gia vào phản ứng).T là nhiệt độ tuyệt đối, R là hằng số khí lý tưởng, A là hằng
số Arrhénius.
Năng lượng hoạt hoá E là đại lượng quan trọng trong nghiên cứu động
học các phản ứng hoá học.

Dạng tích phân phương trình Arrhénius là:
Ink = - —. - + c
R T
Trong thực nghiệm xác định hằng số tốc độ của phản ứng ở một vài
nhiệt độ, sau đó lập đồ thị (Ink - 1/T). Năng lượng hoạt hoá E được xác định
dựa và độ dốc của đường biểu diễn(lnk - 1/T). Cũng có thể xác định đơn giản
bằng cách chỉ xác định hằng số tốc độ kjị và k-p2 ở 2 nhiệt độ Ti vàT2.
Ta có phưcmg trình sau:
E = I n ^
Từ giá trị E tính được theo phương trình trên tính hằng số k của nhiệt độ
bảo quản. Dựa vào động học của phản ứng xảy ra, có thể tính được tuổi thọ
của thuốc nghiên cứu ở nhiệt độ bảo quản. Đây là cơ sở của phưofng pháp lão
hoá cấp tốc nghiên cứu tuổi thọ của thuốc.Nguyên tắc của phương pháp là
nâng nhiệt độ bảo quản thuốc để làm tăng tốc độ phân huỷ thuốc, rút ngắn
thời gian nghiên cứu dự báo tuổi thọ của thuốc. Điều kiện lão hoá cấp tốc phải
đảm bảo không làm thay đổi cơ chế phân huỷ thuốc.
1.5. ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM
1.5.1- Khái niệm về độ ổn định của thuốc :
Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hoặc thành
phẩm) bảo quản trong điều kiện xác định giữ được những đặc tính vốn có về
mặt vật lý, hoá học, vi sinh, tác dụng dược lý và độc tính trong giới hạn quy
định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc. [1]
Thông thường, trong quá trình nghiên cứu các thuốc cần phải được thử
độ ổn định. Phương pháp thử là bảo quản ở các điều kiện khác nhau, nghiên
cứu sự thay đổi về tính chất cơ lý và hoá học của thuốc trong quá trình bảo
quản nhằm mục đích chứng minh hay dự đoán tuổi thọ của thuốc.
1.5.2- Một số quy định trong nghiên cứu độ ổn định của thuốc[l,12,14]
trong hướng dẫn về độ ổn định của ICH, WHO cũng như cục quản lý
dược một số nước (Mỹ, úc, ASEAN) đã nếu ra một số quy định chung trong
việc nghiên cứu độ ổn định của thuốc như sau:

Loại thử nghiệm
Điều kiện bảo quản
Thời gian
tối thiểu
Số lô tối thiểu
Dài hạn (trong
điều kiện thực)
Với các nước châu âu,
Nhật, Mỹ:
25°c±2°c /60%±5%RH
12 tháng
3 lô
Các nước Đông Nam Á:
30®c ±2®c / 70%±5%RH
12 tháng
Thuốc có dược
chất bền vững:21ô
Thuốc có dược
chất kém bền
vững: 3 lô
Lão hoá cấp tốc
Quy định chung với các
nước;
40°C±5°C/75%±5%RH
(Thử nghiệm bổ sung:
30°C±2°C/60%±5%RH
6 tháng 3 lô
Thử nghiệm bổ sung; Là thử nghiệm khi thuốc thử nghiệm lão hoá cấp
tốc trong 6 tháng có biểu hiện bị biến đổi “có ý nghĩa” sẽ được áíử nghiệm bổ
sung ở điều kiện trung gian thấp hơn về độ ẩm và nhiệt độ là 30C±2C/60%

±5%RH để cung cấp thêm tư liệu trong hồ sơ duyệt cấp số đăng ký.
Sự biến đổi “có ý nghĩa” được quy định như sau:
+ Giảm đi 5% hàm lượng dược chất so với ban đầu hoặc không đạt yêu
cầu về hàm lượng.
+ Sản phẩm phân huỷ vượt quá giới hạn quy định.
+ Không đáp ứng yêu cầu của các chỉ tiêu đề ra trong tiêu chuản như:
hình thức cảm quan, mùi vị, màu sắc, độ trong, độ đồng nhất, các chỉ tiêu vật
lý, hoá lý như độ rã, độ hoà tan, điểm chảy, pH
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA
2.1- NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u .
2.1.1- Nguyên liệu và thiết bị
* Nguyên liệu, hoá chất: Các nguyên liệu, hoá chất được sử dụng trong
đề tài có nguồn gốc và tiêu chuẩn như bảng sau:
Nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
RMP
Trung quốc
BP2001
Rifampicin quinon
Viện kiểm nghiệm
Tạp chuẩn
3- formyl rifamycin
Viện kiểm nghiệm
Tạp chuẩn
INH
Trung quốc
BP2001
PZA

Trung quốc
BP2001
Methanol
Đức
For HPLC
Acetonitril
Đức
For HPLC
Nước cất 2 lần
Phòng TNTT
* Thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ( Thermo Finnigan )
- Máy đo độ hoà tan: loại Icốc, 8 cốc.(Vankel)
- Cân phân tích Mettler( chính xác 0,1 mg)
- Tủ ấm (Memmert, Binder) tủ vi khí hậu (Cimacell).
- Máy dập viên tâm sai Korsch
- Máy lắc siêu âm ( Sonorex super -Rk 106), máy lọc hút chân không.
- Các loại dụng cụ thí nghiệm thuỷ tinh dùng trong phân tích.
2.1.2- Phưomg pháp nghiên cứu
2.1.2.1- Phương pháp HPLC định lượng RMP trong viên nén.
+ Điều kiên sắc ký.
- Pha động: nước : acetonitril: đệm phosphat: acid citric ; kaliclorat
với tỷ lệ : 398 : 500 : 79 : 16 : 16
Pha động được pha trong ngày,lọc qua màng 0,45 các thành phần trừ
acetonitril, trộn acetonitril vào hệ pha động sau lọc, siêu âm 30 phút đuổi khí,
chạy đẳng dòng.
- Cột sắc ký(Altech): C18. (250 X 4,6 mm, hạt 5 |j.m)
- Tốc độ dòng: Iml/phút
- Detector UV-VIS : 475 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 10 )Lil

Yêu cầu phải có sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc trong
khoảng khảo sát. Các píc thu được phải gọn đẹp.
+Nguyên tắc định lượng: Theo nguyên tắc định lượng viên nén 3 thành phần
RMP, INH, PZA bằng phương pháp HPLC theo USP 24. Lập đường chuẩn
RMP trong các lần định lượng, tính toán kết quả dựa vào đường hồi quy nồng
độ RMP theo diện tích pic.
Rifampicin dùng để lập đường chuẩn có hàm lượng 99,7% theo kết quả kiểm
nghiệm của Viện kiểm nghiệm - Bộ y tế
+ Chuẩn bị mẫu thử:
Pha dung môi hoà tan bột viên : Acetonitril: Methanol tỷ lệ 1 : 1 (dm A)
Pha dung môi pha loãng với các thành phần : Nước, acetonitril, K2HPO4,
KH2PO4, acid citric với tỷ lệ lần lượt là 640 : 250 : 77 : 23 ; 10 (dm B)
Cân 5 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền viên trong cối rồi cân
chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng RMP là khoảng 100
mg. Hòa tan lượng bột viên bằng dm A, rồi chuyển vào bình định mức 25 ml,
thêm dm A đến vạch, lắc 10 phút cho tan hết dược chất (lắc siêu âm nếu cần).
Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 25 ml, thêm dm B
đến vạch, lọc qua màng 0,45. Chạy sắc ký với điều kiện sắc ký như trên.
2.1.2.2. Nghiên cứu động học phân huỷ RMP trong môi trường pH 1 và
pH6,8
+ Phương pháp nghiên cứu động học phân huỷ RMP trong môi trường
pHl và pH6,8 .
Cân RMP hoà tan trong acetonitril rồi chuyển vào bình định mức 100,0
ml. điều chỉnh pH sao cho đạt pH 1 và pH 6,8, nồng độ RMP là 0,16mg/ml.
Lọc qua màng 0,45, rồi tiến hành định lượng bằng HPLC theo nguyên tắc định
lượng viên nén mục 2.1.2.1, với mẫu thử là dung dịch tại thời điểm đo. Định
lượng RMP tại các thời điểm 20, 40, 60, 80, 100 phút. Các mẫu được đặt
trong bể điều nhiệt ở 37°c trong suốt quá trình nghiên cứu. Các mẫu được làm
3 lần, lấy kết quả trung bình.
+ Phương pháp nghiên cứu động học phân huỷ RMP trong môi trường

pH 1 và pH 6,8 khi có mặt INH và PZA.
Mẫu có INH : cân 1 lượng INH và RMP cho vào bình định mức 100,0
ml, sao cho nồng độ RMP là 0.16 mg/ml, INH là 0,08 mg/ml, điều chỉnh pH
sao cho đạt pH 1 và 6,8. Rồi tiến hành định lượng RMP bằng HPLC như trên.
Các mẫu sắc ký được đặt trong bể điều nhiệt ở 37°c trong quá trình nghiên
cứu. Các mẫu được làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Mẫu chứa đồng thời 3 thành phần: cân RMP, INH, PZA trong bình định
mức 100,0 ml. Sao cho nồng độ RMP là 0,16 mg/ml, INH là 0.08 mg/ml, còn
PZA là 0,44 mg/ml, điều chỉnh pH. Rồi tiến hành định lượng RMP bằng
HPLC như trên. Các mẫu sắc ký được đặt trong bể điều nhiệt ở 37°c trong quá
trình nghiên cứu. Các mẫu được làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
+ Dùng các phương trình sau để xác định động học phân huỷ RMP:
- Với phương trình bậc 1: In C( = In Cq - kt
- Với phương trình bậc 2: — =— + kt
c Co
- Với phương trình bâc 3: -Ụ = - ^ + 2kt
c , Co
- Với phương trình bậc 0: c = Cp - kt
Các dữ liệu Cj (nồng độ của RMP tại thời điểm t) và t thực nghiệm được
biểu diễn theo các cách trên nếu thu được phương trình dạng đường thẳng thì
phản ứng nghiên cứu có bậc của phương trình động học tưoỉng ứng.
2.1.2.3 - Phương pháp nghiên cứu tương tác dược chất- dược chất trong
viên nén.
Để nghiên cứu tương tác giữa các dược chất ở thể rắn dưới tác dụng của
lực nén chúng tôi đã bào chế các mẫu viên nén như sau:
+ Bột viên R (viên chứa RMP): Bột viên được bào chế bàng cách nghiền
mịn RMP trong cối, rây qua rây 0,25mm.
+ Bột viên RH: (viên chứa RMP, INH theo tỷ lệ là 150 : 75.) Bột viên
được bào chế bằng cách nghiền riêng biệt RMP và INH trong cối, rây qua rây
0,25mm. Cân RMP, INH theo tỷ lệ 150:75. Trộn 2 dược chất theo nguyên tắc

trộn đồng lượng.
+ Bột viên RHZ:(viên chứa RMP, INH, PZA theo tỷ lệ 150 : 75 : 400).
Bột viên được bào chế tưcfng tự như viên 2 thành phần ở trên, có thêm thành
phần PZA. Trộn dược chất theo nguyên tắc trộn đồng lượng.
Các mẫu viên được dập với các mẫu bột đã chuẩn bị ở trên đồng khối
lượng và lực nén trung bình, không chứa các loại tá dược viên nén.
Các mẫu viên được nghiên cứu trong các điều kiện như nhau là;
+ Điều kiện 1; Nhiệt độ phòng thí nghiệm(25-35°C). Độ ẩm : 75% ± 5%.
+ Điều kiện 2: Nhiệt độ 40°c± 2°c, Độ ẩm : 75%± 5%.
+ Điều kiện 3: Nhiệt độ 50°c± 2°c, Độ ẩm : 75%± 5%.
+ Điều kiện 4: Nhiệt độ 60°c± 2°c, Độ ẩm : 75% ± 5%.
Các mẫu viên được bao gói bằng 2 lần túi polyme và đặt trong các bình
thuỷ tinh kín(chứa dung dịch NaCl bão hoà đảm bảo độ ẩm tương đối
15% ±5%.) trước khi đặt vào các tủ ấm, tủ vi khí hậu.
Sau các khoảng thời gian nhất định, các mẫu được định lượng xác định
hàm lượng RMP bằng phương pháp HPLC theo mục định lượng viên nén 3
thành phần 2.1.2.1 Xác định động học từ các số liệu thực nghiệm.
2.1.2.4 - Phương pháp thực nghiệm dự đoán tuổi thọ của thuốc.
+ Bảo quản mẫu: Mẫu thuốc được bảo quản trong các điều kiện như thí
nghiệm đánh giá tương tác dược chất mục 2.1.2.3.
+ Xác định động học phân huỷ RMP: Sau các khoảng thời gian, định
lượng RMP trong các mẫu viên bằng phưcmg pháp HPLC theo như định lượng
viên nén RMP phần 2.1.2.1. Dựa vào các giá trị hàm lượng RMP định lượng
được tính các hằng số tốc độ phản ứng K tương ứng tại mỗi nhiệt độ.
+ Xác định bậc phản ứng phân huỷ RMP theo như mục 2.1.2.2.
+ Xác định năng lượng hoạt hoá: theo công thức
e = ^ i„ £ ì
?;-r, ẳ:,
+ Xác định phương trình động học khi bảo quản ở các nhiệt độ bảo quản
Từ năng lượng hoạt hoá E ta tính được hằng số tốc độ K ở nhiệt độ T bất

kỳ theo công thức:
e(T2-T,)
Kr. R-T,T,
Với các giá trị E, Kj. đã biết
Tính tuổi thọ của thuốc (chỉ xét trên chỉ tiêu hàm lượng RMP) dựa vào tọo
(là thời gian thuốc còn lại 90% hàm lượng)
2.2- KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT.
2.2.1- Thẩm định phương pháp HPLC trong định lượng RMP.
2.2.1.1- Tính chọn lọc của phương pháp
Phương pháp định lượng RMP được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng
hiệu năng cao, tính toán nồng độ RMP dựa trên diện tích pic. Chúng tôi sử
dụng detector UV-VIS với bước sóng 475nm, là cực đại hấp thụ của RMP.
Các sản phẩm phân huỷ của RMP cũng có độ hấp thụ tương đối cao tại bước
sóng này. Các thành phần dược chất và tá dược khác hầu như không hấp thụ
tại bước sóng 475nm.
Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn RMP, trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn
thấy xuất hiện pic của RMP với thời gian lưu tương ứng là 5,4 phút, pic này
tách hoàn toàn khỏi các pic của các sản phẩm phân huỷ của RMP. Điều này
cho thấy diện tích pic đo được tương ứng với thời gian lưu của RMP chỉ phụ
thuộc vào nồng độ RMP.
MII «teĩ
Hình 2.la: sắc đồ mẫu chuẩn RMP
ỉiình 2.1b: sắc đồ RMP khi có Rifampicin quinon, và 3-formyl rifamycin
2.2.1.2- Xác định độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng sai số tưcfng đối của
5 lần định lượng RMP khác nhau trong cùng một ngày. Sai số tương đối càng
nhỏ thì độ lặp lại của phương pháp càng cao.
Nghiền mịn 20 viên phối hợp RMP, INH và PZA. Thực hiện cân, xử lý
mẫu và định lượng RMP từ bột mịn thu 5 lần theo phương pháp ghi ờ mục
2.1 .2.1 . Kết quả được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Khảo xát độ lặp lại của phương pháp HPLC định lượng RMP.
TT
Hàm lưọmg RMP
(mg)
Hàm lượng RMP
(%)
Số liệu thống kê
1
157,30
104,87 t(0,95; 4)= 2,776
'l'B = 105,43%
SD= 1,08%
s = 0,54%
8 (%) = 1,42%
2
157,00 104,67
3
159,30 106,20
4 156,70 104,47
5
160,40
106,93