Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid

BỘ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
^í|í5|í>f:^:ifí^5fí5fí::ịí>^^::ịí::Ịíiỉí5f:::í;:ịí
Đỗ THỊ BlCH HUỆ
NGHIÊN CỨU THÀNH LẬP TIÊU CHUẤN KIÉM NGHIỆM
MỘT SÔ' DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
■ ■ ■
(3C héa íu ậ tt tế t nạhiỀ Ịi ^ư đ 4 í »ặ- k h é u 200 1-2 00Ó )
Người hướng dẫn: Ts Nguyễn Viết Thân
Pgs Nguyễn Vàn Nội
Nơi thực hiện: Bộ môn Dược Uệu
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian: Tháng 02/2006 đên 05/2006
Hà Nội, tháng 05 năm 2006.
l ở i C Ẩ \M Ơ N
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn
TS. Nguyễn Viết Thân và PGS. Nguyễn Văn Nội đã trực tiếp hướng
dẫn, giúp đd tôi trong suốt quá trình học tập và làm khoả luận
Nhân dịp này tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới các thầy cô
giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong trường đặc biệt các thầy cô
giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu Trường Bại học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi
hoàn thành tốt khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân
và bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đd và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên:Đỗ Thi Bích Huê.
DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT
HPTLC : High-Performance Thin-Layer Chromatographv.
TT : Thuốc thử.

DĐVN : Dược điển Việt Nam.
ư v : Ánh sáng tử ngoại.
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ể 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về flavonoid 3
1.2. Tổng về các dược liệ u 3
PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

6
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 10
3.1. Chỉ thực- Chỉ xác 10
3.2.Trần bì 19
3.3. Kim ngân 24
3.3.1. L.japonica Thunb., Lamiaceae 26
3.3.2. L. confusa DC., Lamiaceae 29
3.4. Cây Râu m èo 41
3.5. Núc nác 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 54
TÀI LIÊU THAM KHẢO 56
Đ Ặ T V A N Đ Ể
Đã từ lâu ông cha ta đã biết sử dụng các loại cây cỏ để phòng và chữa
bệnh cho nhân dân. Ngày nav, với tiến bộ của khoa học kĩ thuật nền công
nghiệp hoá dược phát triển mạnh việc sử dụng cây cỏ thiên nhiên trons chiết
xuất bào chế và điều trị ngày càng tăng. Với một hệ thực vật phong phú và đa
dạng, Việt Nam có khoảng gần 4000 loài được dùng làm thuốc, việc xác định
nguồn gốc dược liệu khồng dễ dàng nhất là hiện nay tên gọi vị thuốc chưa
thống nhất cùng một cây có khi mỗi nơi gọi một khác (Sài đất tại một số địa
phưcmg tỉnh Vĩnh Phú gọi là Húng trăm) hoặc nhiều cây khác hẳn nhau lại

cùng mang một tên (Bồ công anh, Nhân trần, Cam thảo). Mặt khác, thực tế
hiện nay việc lưu thông phân phối chưa được kiểm soát chặt chẽ nên trên thị
trường có rất nhiều dược liệu không rõ nguồn gốc dẫn đến trong quá trình sử
dụng có thể ảnh hưởng đến kết quả điều trị. Vì vậy công tác kiểm nghiệm
dược liệu để xác định rõ nguồn gốc, tránh nhầm lẫn, giả mạo hết sức quan
trọng và cần thiết.
Hiện nay với sự ban hành của Dược điển Việt Nam III đã trở thành công
cụ, cơ sở pháp lý cho việc kiểm nghiệm dược liệu góp phần nâng cao hiệu quả
sử dụng thuốc đông dược. Tuy nhiên một số chuyên luận trong Dược điển
mới chỉ ở mức độ mô tả chưa có hình ảnh minh hoạ cụ thể như đặc điểm hình
thái cây thuốc, vị thuốc, đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột nén khó đối chiếu, dễ
nhầm lẫn. Để cụ thể hoá các tiêu chuẩn kiểm nghiệm trong DĐVN III, tạo
điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một sò dược liệu chứa Flavonoid”.
Mục tiêu: Hình ảnh hoá, lượng hoá, tăng thèm các dữ liệu về cây và dược
liệu trong quá trình kiểm nghiệm góp phần tạo điều kiện cho việc kiểm
nghiệm dễ dàng hơn, đạt hiệu quả cao và chính xác.
Nội dung khoá luận:
Kicm nghiệm các mãu dược liệu chuẩn iheo mộl số tiêu chuẩn trong
DĐVN III và đưa ra các ảnh chụp minh họa cây thuốc, vị thuốc, đặc điểm vi
phẫu, đặc diểm bột dược liệu.
ứng dụng phưcfng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
trong định tính các hoại chất trong dược liệu, có các anh chụp bản sắc ký,
bảng phân tích sắc ký đổ để tăng thêm các dữ liệu cho việc kiểm nghiệm dược
liêu.
PHẦN I.T Ổ N G QUAN
1.1. Tổng quan về Flavonoid
Flavonoid ỉà một trong những nhóm hợp chất polỵphenol tự nhiên,
chiếm một số lượng lớn trong thực vật cũng như trong dược liệu có nguồn gốc
thực vật. Nó có tầm quan trọng rất lớn đối với con người không chỉ vì nó cung

cấp chất màu thực vật mà còn vì có nhiều hợp chất trong nhóm có tác dụng
sinh lỵ (coumestron, phloridzin, rotenone ). Đa số các dược liệu và chế
phẩm đông dược được dùng trong y học cổ truyền và V học hiện đại với các
tác dụng: thanh nhiệt, liêu viêm, bổ gan, lợi mật, phòng chống xuất huyết,
phòng chống xơ vữa mạch, hạ huyết áp đều có thành phần chính là
flavonoid. Ngày nay flavonoid nói riêng và các hợp chất polyphenol tự nhiên
nói chung đang được nghiên cứu và ứng dụng trong đời sống và y được rất
nhiều.[3] [12] [23] [26]
Đến nay có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc [3], Flavonoid có
cấu trúc cơ bản kiểu Q -C 3-Q , trong đó mỗi Q là một vòng benzene gắn với
C3. Cấu trúc có thể là vòng kín hoặc hở.
Đính vào các vòng A, B của khung thường là một hoặc nhicu nhóm
hydroxyl tự do hoặc đã thay thế một phần. Các polyphenol có thể phản ứng
với nhau tạo ihành các phân tử phức tạp hcfn hoặc liên kết với các hợp chất
khác trong cây như các ose (dạng glycoside) hoặc protein [12J. Để phân loại
các flavonoid người ta dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và mức độ oxy hoá
của mạch 3C.
Euflavonoid (Flavonoid chính danh): gốc aryl ở vị trí C-2. Một số chất
điển hình: flavan, flavanon, jflavon, flavonol, chalcon, auron Nhóm này
chiếm số lượng lớn nhất trong số các hợp chất flavonoid.
^ Isüflavonoid: gốc aryl ở vị trí C-3. Một số chất chính isoílavon,
isoflavanon, rotenoid, .trong đó isoflavon là nhóm lớn nhất với 364 chất đã
xác định được cấu trúc.
♦ Neoflavonoid: gốc aryl ở vị trí C-2. Nhóm này íl chỉ có trong một số
loài.
♦ Biflavonoid: tạo thành từ 2 phân tử flavonoid. Có 6 nhóm biílavonoid
sắp xếp dựa theo kiểu liên kết trong cấu trúc.[3] [12J [23]
Flavonoid là một trong những nhóm phân bố rông rãi nhất trong tự nhiên.
Nó tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín lớp hai lá mầm, rất nhiều họ chứa
flavonoid với đủ các nhóm {Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae, Rỉitaceae ).

Lớp 1 lá mầm có khoảng trên 10 họ tìm thấy flavonoid: Araceae, ỉridaceae
Trong ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ số lượng flavonoid không
nhiều chủ yếu là dẫn chất của biflavonoid. Trong thực vật bậc thấp ít được gặp
các flavonoid. Động vật không tổng hợp được flavonoid nhưng một số loài
bướm thấy có flavonoid do lấy từ ihức ăn thực vật. [3
Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: Hoa (Kim ngân), quả
(Cam, Quýt), thân và lá (Râu mèo), vỏ thân (Núc nác) ngoài ra còn có trong
hạt, rề, thân rẻ, gỗ.[23] [26;
Nó là một nhóm hoạt chất có tính chất rất khác nhau và có khả năng
chuyển đổi lính chất giữa các cấu trúc khác nhau của nhóm [11] : Các
flavonoid glvcosid và flavonoid Sulfat phân cực nên không tan hoặc ít tan
trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước. Các aglycon
flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các dãn
chất flavonoid có nhóm 7- hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng.
Vì vậỵ không có phucfng pháp chung nào để chiết xuấl các flavonoid.[3'
Để xác định sự có mặt CÍIa các dãn chất nhóm flavonoid người ta sử dụng
phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda); Dung dịch tlavonoid trong ethanol.
them bột magie rồi nhỏ từ từ acỉd hỵdroclorid đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có
màu đỏ cam, đỏ thãm hoặc đỏ tươi.
Đc định lượng flavonoid người ta sử dụng một số phương pháp sau:
° Phương pháp cân: Chỉ dùng khi nguyên liệu giàu flavonoid và ít các
chất đi kèm.
° Phương pháp đo phổ tử ngoại.
° Phưcmg pháp đo màu: bàng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với
muối diazoni, tạo phức màu với AICI3 [3^
Trong đề tài này chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu trên một số cây và dược
liệu sau: Chỉ thực, Chỉ xác, Trần bì, Kim ngân, Râu mèo, Núc nác.
1.2. Tổng quan về các dược liệu.
Để thuận tiện cho việc theo dõi, đối chiếu và tránh trùng lặp, tổng quan
về các dược liệu nghiên cứu sẽ được trình bày theo từng dược liệu cùng với kết

quả nghiên cứu.
PHẦN 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PH ÁP NGH IÊN CÚX)
2.1. Nguyên liệu,
Các mẫu nghiên cứu được thu hái trực tiếp hoặc là các vị dược liệu đã
được xác định nguồn gốc rõ rkng, bao gồm:
• Chỉ thực: Quả non đã phơi hay sấy khô của cây Cam chua (Cừriỉs
aurantium L.) lấy tại Viện dược liệu.
• Chỉ xác: Quả chưa chín bổ đồi đã phơi hay sấy khô của cây Cam chua
{Citrus aiirantium L.) lấy tại Viện dược liệu.
• Trần bì: v ỏ quả đă phơi hay sấy khô của cây Quýt {Citrus reticuỉata
Blanco.) lấy tại Viện dược liệu.
• Kim ngân: Hoa, cành và lá của hai loài Kim ngân {Lonicera japónica
Thunb. ; Lonicera confusa DC.) lấy tại Nghĩa Trai Hưng Yên và Vườn
thực vật ĐH Dược Hà Nội.
• Núc nác: v ỏ thân cây Núc nác (Orữxyỉum ỉndicum (L.) Vent.) lấy tại
Vườn thực vật ĐH Dược Hà Nội.
• Râu mèo: Phần trên mặt đất của cây Râu mèo {Orthosiphon stamineus
Benth.) lấy tại Vườn thuốc Văn Điển.
Trong quá trình nghiên cứu có sử dụng các mẫu trên thị trường để kiểm
tra, đối chiếu so sánh.
2.2. Phưomg pháp nghiên cứu.
Xử Iv và báo quán mẫu.
Mẫu dược liệu nghiên cứu có thể là dược liệu tươi hay dược liệu đã phơi
khô, sau khi thu về được xử lý bảo quản theo phưoíng pháp chung, cụ thể:
• Mẫu dược liệu cắt vi phẫu có thể dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô được
làm mềm, bảo quản trong hỗn hợp Cồn- Nước- Glycerin
• Mẫu dược liệu dùng soi bột được thái nhỏ, sấy khô, nghiền thành bột,
báo quản trong lọ kín,
• Mầu dược liệu dùng để chạy sắc ký được ihấi nhò, sấy khô ở nhiệt độ
<60^’c, bảo quản nơi khô ráo.

Nghiên cứu dăc diểm hình thái bên ngoài.
o Mô tả đặc điểm, chụp ảnh cây lại nơi thu hái trực tiếp,
o Mô tả đặc điểm dược liệu.
o Các mẫu nghiên cứu được chụp ảnh, mô tả vế hình dạng, kích thước,
màu sắc, thể chất, mùi vị.
Nghiên cứu đăc diém vi hoc.
o Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu của dược liệu.[4] [16]
Tiến hành làm tiêu bản vi phâu cố định theo các bước sau:
Cắt vi phẫu: Dược liệu tươi hav khô đã ngâm mềm được cắt ngang bằng lưỡi
dao cạo hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tav, chọn các lát cắt mỏng.
Tẩy: Ngâm các lát cắt vào dung dịch cloramin hoặc nước Javen, thời gian
ngâm tuỳ từng mầu cụ thể, có thể rút ngắn bằng cách đun nóng —> Rửa bằng
nước nhiều lần —> Rửa bằng dung dịch acid acetic 10% —> Rửa bằng nước
cho hết acid acetic.
Nhuộm: Theo phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh metylen.
Nhuộm đỏ son phèn —> Rửa bằng nước —> Nhuộm xanh metỵlen - > Rửa
bàng nước, "rhời gian nhuộm tuỳ vào tính chất bắt màu của từng mâu cụ thể.
C ố định Vi phẫu sau khi nhuộm được khử nước từ từ bằng cồn với độ cồn
tăng dần 10^', 20'^ .80°,90“, sau cùng là cồn tuyệt đối. Lắc vi phẫu 3 lần trong
xylen. Đặt vi phẫu vào một giọt bôm Canada trên phiến kính, đậv lá kính. Đc
tiêu bản ở chỗ thoáng 2-3 tuần cho ổn định.
Tiêu bản vi phẫu cố định được quan sát mô tả đặc điểm và chụp ảnh dưới
kính hiển vi.
o Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu.
Xác định màu sắc, mùi vị, bột dược liệu bằng cảm quan.
Sử dụng các dung dịch khác nhau để lên kính: nước, cloral hydrat, glycerin
Quan sát dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm bột dược liệu.
Nghiên cứu vé thành phán hoá hoc bằng phương pháp sác kv lớp mỏng hiêu
năntĩ cao (HPTLC) [6Ị [21 ]
♦ Nguyên tắc:

HPTLC dựa trên nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng thông thường, tiến hành
trong điều kiện chuẩn nhất định với sự hỗ trợ của máy móc và phần mềm vi
tính chuyên dụng.
Sắc ký đồ dịch chiết trong các điều kiện khác nhau đặc trưng cho các mẫu
phân tích là cơ sở để kiểm nghiệm dược liệu theo phưcmg pháp “dấu vân tay”
(finger-print).
♦ Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dịch chấm sắc kỷ: Cho Ig dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml
methanol. Đun sôi trên cách thuỷ khoảng 10 phút. Lọc lấy dịch lọc để chấm
sắc ký.
Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagen GF254 chuẩn của hãng
MERCK. Bản mỏng được hoạt hoá ở 1 1 0 't trong 1 giờ, cắt thành bản 20x10
(cm^).
Chấm sắc ký: Sử dụng máy chấm sắc ký CAMAG-Linomat 5.0 với phần mềm
điều khiển winCATS. Cụ thể:
Kẹp bản mỏng vào đúng vị trí trên máy chấm Linomat 5.0.
Lấy vào xỵlanh chuẩn một thể tích mẫu chấm thích hợp và đặt lên máy.
Điều khiển quá trình chấm bằng máy vi tính: Dữ liệu cho mỗi lần chấm
được khai báo và lưu trong một file. Đánh dấu các lựa chọn và nhập các thông
số cần thiết. Quá trình chấm vết được tự động tiến hành, đổng thời có thổi khí
nén làm khô vết chấm.
Triển khai sắc ký: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất tách được tốt
nhất
Quá trình triển khai được thực hiện trong bình sắc ký tiêu chuẩn, dung
môi bão hoà tốt quá trình chạy dung môi phải Icn đều (vết dung môi phẳng).
Sau khi triển khai, bản mỏng được lấy ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hơi hết
dung môi.
Quan sát và chụp ảnh: Quan sát và chụp ảnh trong buồng quan sát của hệ
thống CAMAG Reprosta 3 với sự hỗ trợ của phần mcm winCATS ơ ánh sáng
tử ngoại bước sóng 254nm, 366nm, và ở ánh sáng trắng sau khi đã phun thuốc

thử hiện màu.
Thuốc thủ hiện màu: Phun bằng Vanilin trong ethanol và H2SO4 đặc, sau
đó sấy ngay bản mỏng ở nhiệt độ cao.
Xử ỉỷ kết quả: Sử dụng phần mềm Videoscan với độ chính xác phát hiện điều
chỉnh được.
Đinh tính: Với mỗi dược liệu khác nhau thực hiện các phản ứng khác nhau
theo các chuyên luận ghi trong DĐVN.
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả
3.1. Chỉ thực-chỉ xác
Tổng quan.
Trong DĐVN III Chỉ thực và Chỉ xác đều có chuyên luận riêng nhưng
là các vị dược liệu của cùng một cây thu hái ở các thời kỳ khác nhau nên
chúng tôi xếp chung vào mội phần để tiện theo dõi và đối chiếu.
Chỉ thực là quả non có đường kính trên 1 cm đã phơi hay sấy khô của câv
Cam chua (Ciĩrus aurantium L.) và giống cây trồng của nó hoặc cây Cam
ngọt {Citrus sinensis Osbeck.), họ Cam {Riitaceae) [2] [7 .
Chỉ xác là quả chưa chín có đường kính 3-4 cm, bổ đôi, phơi hay sấy khô
ở nhiệt độ thấp 40-50^C của cây Cam chua {Citrus auranĩium L.), họ Cam
{Ruíaceae).[2] [7]
Chỉ thực được thu hái vào tháng 5-6 thường là những quả non bị rụng còn
Chỉ xác được thu hái vào tháng 7-8.
Trên thực tế, như ở Trung Quốc, Chỉ thực được thu hái ở hcfn 10 cây chi
Citrus và Ponàrus. Một số cây chính: Poncitriis trifolia Raf.; Citrus wiisonii
Tanaka.; Citrus aurantỉum L.; Citrus aurantiiim L. var amara E ngl
Ở Việt Nam, Chỉ thực cũng được thu hái từ rất nhiều cây khác nhau thuộc
họ Cam nhưng chưa xác định chính xác được tên, người ta thường nói đến cây
Chấp {Ciírus hysírix DC.) [201
Cây Cam chua là cây gỗ nhỏ cao 2-4m nhánh không lông, gai thẳng,
xanh. Lá có phiến xoan ngược, dày, xanh đậm, dài 10 cm rộng 6 cm, mép có
răng cưa, cuống dài 3 cm, rộng có cánh 1-1,5 cm. Hoa rất thơm, có 20-24 nhị.

Quả tròn, to, chót lồi, đáy hơi có núm, có 10-12 múi rời nhau ở giữa, nhiều
hạl; quả bì dày, lúc non thơm, nạc chua đắng [9] [14;
Chỉ thực có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Ẩi Độ, Malaysia sau lan rộng ra
nhiều nước Đông Nam Á và Nam Trung Quốc và Châu Âu. ở nước ta cây
mọc nhicu ở phía nam.
Thành phần hoá học, Chỉ thực và Chỉ xác đều có chứa ílavonoid
(hesperidin), alcaloid (0,09%), gỉycoside (20,49%), saponin (5,86%), đặc biệt
chứa không dưới 2,5% tinh dầu [25] với 57 thành phần trong đó nhiều nhất là
citronelal, P“pinen và sabinen, tuy nhiên hàm lượng glycoside trong Chỉ xác
thấp hơn trong Chỉ thực (9,89%) [7] [20], Các nhà nghiên cứu khoa học Trung
Quốc còn tìm thấy trong dịch chiết từ vỏ quả có các acid amin, N-
methyltyramin senephrin [19] [28]
Trong nhân dân dùng Chỉ thực, Chỉ xác với tác dụng như nhau để chữa
thần kinh dễ bị kích thích, mất ngủ, ăn uống không tiêu, đầy hơi, ho đờm, tiểu
tiện khó [5] [7] [20]
Đối với vị thuốc Chỉ thực, ƠIỈ xác, DĐVN III yêu cầu kiểm nghiệm một
số tiêu chuẩn: Đặc điểm hình thái bên ngoài, đặc điểm bột, định tính bằng
phưcfng pháp hoá h ọ c
Riêng với Chỉ thực có thêm phần định tính bằng sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng: Silicagen H có chứa carboxy methỵl-cellulose natri
Dung môi khai triển: inethanol- aceton- cloroíorm- amoniac đậm đặc
(3:4:13:0,5).
Dung dịch thử: 0,5 g bột dược liệu trong 5 ml methanol đun hồi lưu trên
cách thuỷ 1 giờ, để nguôi, lọc, bay hơi dịch iọc đến khô, thêm 4 ml methanol
hoà tan. Lọc, được dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch synephrin 0,3 % trong methanol hoặc
0,5 g bột Chỉ thực chiết như dung dịch thử để được dung dịch đối chiếu.
Kết quả thưc nghiêm
Sau khi tiến hành nghiên cứii đối với Chỉ thực và Chí xác chúng tôi Ihu được
kết qua sau:

Đặc điểm hình thái bên ngoài.
• Mò tả dược liệu.
Chỉ thực: Dược liệu hình bán cầu, một số hình cầu đường kính 0,5-2,5 cm.
Vỏ ngoài màu lục đen có vết cuống quả hoặc vết sẹo của vòi nhuỵ. Trên mặt
cắt vỏ quả giữa hơi phồng lên màu trắng vàng dày 0,3-1,2 cm. v ỏ quả trong
và múi quả màu nâu. Mùi thơm, vị đắng hơi chua. (Hình 1 a)
Chỉ xác: Dược liệu hình bán cầu đường kính 3-4 cm, vỏ quả ngoài màu
nâu ỏ đỉnh có những điểm túi tinh dầu dạng hạt, vẫn còn vết vòi nhuỵ và vết
cuống quả. Mặt cắt lớp vỏ quả giữa màu trắng hơi nhô lên, đày 0,4-1 cm. Ruột
quả có từ 10-15 múi. Múi khô nhăn màu nâu đen trong có hạt. Mùi thơm, vị
đắng hơi chua. (Hình Ib)
❖ Đặc điểm vi học.
• Đặc điểm bột.
Bột màu vàng nâu mùi thơm, vị đắng hơi chua.
Soi dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm: Biểu bì vỏ quả ngoài là các tế bào
hình đa giác hoặc hình chữ nhật (3). Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình
lăng trụ nàm riêng lẻ (8). Lỗ khí (2) và các mảnh biểu bì mang lỗ khí hơi tròn
đường kính 16-25 ßm (5). Cấc tế bào vỏ quả giữa hơi tròn hoặc không đều,
dạng chuỗi ngọc nàm rải rác (9). Có rất nhiều túi chứa tinh dầu nằm trong lớp
biểu bì (1). Khá nhiều mạch xoắn nằm riêng lẻ hoặc nằm trong các mô (7).
Ngoài ra còn thấy rất nhiều thể inuHn nằm rải rác hoặc thành đám.( Hình Ic)
► Định tính,
Định tính bằng các phản ứng hoá học.
• Lấy 0,5g bột dược liệu thêm 10 ml methanol (TT) đun cách thuỷ trong
2 phúl, lọc. Lấy 5 ml dịch lọc thêm một ít bột magie và vài giọl acid
hydroclorỉd (TT), đổ yên —> Thấy xuấl hiện màu đỏ tía.
• Lấy 0,5 g bột dược liệu thêm 10 ml methanol đun hồi lưu cách thuỷ 10
phút, lọc. Lấy I ml dịch lọc thêm 5 mg kali tetrahydroborat, lắc đều thêm vài
giọt aciđ hỵdroclorid (TT) —> xuất hiện màu đỏ anh đào.
Định tính bàng HPTLC.

Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.2 sử
dụng bản mỏng là silicagen GF254 với hệ dung môi là Methanol- Aceton-
Cloroform- Amoniac đậm đặc (3:4:13:0,5), thu được kết quả:
• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
ký đồ của dịch chiết Chỉ thực, Chỉ xác trong methanol quan sát ở ư v
254nm (Hình 1.1.1; Hình 1.1.2).
• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
ký đồ của dịch chiết Q iỉ thực, Chỉ xác trong methanol quan sát ở u v
366nm (Hình 1.1.3; Hình 1.1.4).
• Sắc ký đổ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông sô' của sắc
ký đồ của dịch chiết Chỉ thực, Chỉ xác trong methanol quan sát ở ánh
sáng thường sau khi phun hiện màu (Hình 1.1.5; Hình 1.1.6).
Nhân xét: Chỉ thực và Chỉ xác là quả của cùng một cây thu hái tại các thời
điểm khác nhau nên chỉ khác nhau ở đặc điểm hình thái bên ngoài còn về đặc
điểm vi học, định tính và sắc ký về cơ bản là giống nhau.
Hiện nay trong DĐVN III kiểm nghiệm Chỉ thực yêu cầu bản mỏng
khác silicagen co chứa carboxy methyl-cellulosc natri nhưng chúng tôi tiến
hành nghiên cứu trên bản mỏng silicagen GF254 cho kết quả tách khá tốt,
tăng thêm các dữ liệu cho việc kiểm nghiệm dược liệu Chỉ thực.
Bản mỏng silicagen GF254 là bản mỏng được sử dụng phổ biến nên nếu
không có gì đặc biệt trong việc kiểm nghiệin chúng ta có thể nên đưa silicagen
GF254 vào dùng thay thế cho silicagen H có chứa carboxy mcthỵl-cellulose
natri.
Trong quá trình nghiên cứu, chúng lôi cũng liến hành so sánh các mẫu
Chì thực, Chỉ xác lấy tại Viện dược liệu và thu thập trên thị trường, thấy kết
quả sắc ký cũng có sự khác biệt. Điều này phù hợp thực tê Chỉ thực, Chỉ xác
có thể được thu hái từ các loài Cam khác nhau.
• í *
» ^ a ì í
• • • 9 ^

T T T T -T T T l'V i‘i 't ' l 'ĩ '1
• j«U tItiJIa winí,. ^
__
Hình la:Vị thuốc chỉ thực
• •
u ^ ’rrnrn
v r v m
Hỉnh lb:VỊ thuổc chỉ xác
-tí
ế
'Jt,
í
Hình Ic; Một số đặc điểm bột chỉ thực: 1-túi chứa tinh dầu;
2-lỗ khí; 3-biểu bì vỏ quả ngoài; 4-mảnh mô có chứa tinh thể calci oxalat
; 5-mảnh biểu bì mang lỗ khí; 6+7-mảnh mạch; 8~tinh thể Calci oxalat; 9-
mô mềm vỏ quả
Tr k 1
Track 1
ỉta rt End
areã S ub íl
# Rf H Rf
H
PM
Rf H
Ĩ°M
Mĩime
1 Ì).ÍỊ94
Oũ
ủ t t í
20e.9 10 Jí ti 133 ĨSỦ

I7ũ4g
3.J6
2 [1,674 ICO 9 D.esí; 132.3 e.e: ứ.7l)3 1LH 4 :.Í 4
3 ử 755 SA2.Ĩ)
ũ m íeeo.ỉ M ũ í ữ m 1SÍ.5 4777í ủ
94 11
Total Height Total .£t^a : iO?J?2 ^3
Hình 1.1.1; Kết quả sắc ký dịch chiết Chì thực quan sát ở
ánh sáng tử ngoại bước sóng 254tim
sác kí đồ
Cliỉ tlụrc -
Chi xác ở
bước sóng
254nm
Track 2
P ea k
í^ 5rt Ỉ'.'Í3X.
End a re
'ã
S u bs l
#
F1 H Rf H
^<.1
RI
H
A
r « i
rriâ
1
Ú 031 CŨ CI.Ũ44 líil 1 2.4:ĩ

ũ.ú e ỉ a .i 1)40.7 ũ.71
2 ữừm ủ 0 Ũ .H 7 ư-4 9
¿.64 Ũ ÍÍ 3 7 4
15ỄI9.S ủ.$7
3
D 2Ciặ 117 1 Lì .247 754 [1
11 -íặ Ũ 2V9 4Í.5 l Ì M l í 7.76
4
Ũ.3Í9 D 33S 184 1 2.Ở3
ủ 4Cf9 la í.iỉ 2326 6 1.44
5
Ũ 641 2 0 745 14 5 Ỉ 5
2f.íi1 ủ. 750 145S.3
2Ù22
p
LÌ.7ÍCI 1 5
0 ?lữ
3S!?1.4
58.71 Ũ S96
1 1 iw e ,7 6Í1 ỦU
Total HiỉigM 15627 s Tùial ^ ^ . 3 le iS ỹS
Hình 1.1.2: Kểt quả sắc ký dịcli chiết Chỉ xác quan sát ở
ánlì sáng từ ngoại bước sóng 254nni
16
T r ^ c ic 1
T ra c k 1
0''"
^ r
í- 1
-n | - -

p r -
■!► N

r -
<■ *
1 -T - T
' 1 ^
0 *
f ' ] ’
P e a k '5' Ẽn d a r«
a
S u b st
Rí H Pf H
ÍVal
ftf H
A iVol N a m e
\ Ũ o m
243 7
0 028 2019 c 7 20 Ũ 06Z 1158.2 2S423 3 ^ 7 2
2 ử Ú5$ 1 ÍOẾ 2
Ú ũ@4
265 1 .í
ộ 46 0 M 1
1 2 ÍÍ 1 39ÔD4 ĩ í , 2 Í
3 0 111 1248 1 0 U 2 I3 7 Í 3
4 S9
Ũ A62
Ố3.4
í 4659 0 1 9)
4

0.152
9 ^ 4
0 1?5
7 1 4 $
í / i í Ũ .192 45 Ù íífộ 2 .« 0 77
Ủ.21D t í l 0 I5S4 5 íi 65 õ 284 727 7 2 Ộ 6 Ỉ9 ô
c 0 50 3
0 ?75
54® 2
1 24
0 :ìqci
94 8
4
0 37
7
ÙAV^ DO 0 451 mơ5.7 5 01 Ũ 473 477.6
1Ồ701 3
Ì 4 *
Ẹ Ữ.Í1 í 2C4 4 0 Í544 IO^S.1 3 77 0 5-54 1DD3.7 1 ?4
ít ũ .« 4 1ỦÚ3 7 ủ 5 liũ I65Ủ 6 5 $9 ủ 6ỦS 145S 5 ÍỬ17Ỗ 1 3 ^ 2
10 c 613 1 -W 4 o . e s í lí 5 3 6 6 .2 Í ủ G4e ie& 7 2 177 5 2 .Í 2.32
ĩ t Ũ.Ỡ46 1Ộ97 2 0 7S5 rìD Ử Í 9 26 0.1^14 tì25 1 56^764 .a 73 $2
12
0 Ộ4ạ
4-46,5
0 0 5 4
4$3 3 1 72
0 ,977
179,7
3876,3 D.51 1

To lal Height 2804 3 1 T otal : 7 5 3 0 9 t
Hình 1.1.3: Kết quả sắc ký dịch chiết Chi thực quan sát ở
ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm
Sắc kí đổ Chỉ
thực-Chỉ xác ở
bước sóng
366nm
Trae k
Track 2
P e s k s rt E n d ỉirẽ ! 4 S u b i-t
Rf H Rf H
["-'oi
Fíf
H
[^"ol
t
Ũ ŨOŨ
O.Cl
o 023 1757 e.
3.52 0 03S
117 2,6
1 63
2
Ci.O?Si
1172,e
tJ [141
1 133.2 2 3íS u -Ut.s 500.6! 1ti24 3 ,s
t Ữ4
3
D.oẹs 5ũ g .e ti CISS &70 2

1 .7-4
g .ỮỠ9 72e,1 S4S9.P D se
4 ũ .t 14 5 Ũ 3.Í
0.1 19 1 07 0 .144 60.2 ■4205 7
0
5 0 .Ì5 2 2S .6 Ci.1;í2 2Ù0&.2 4 02 0 .210 7 5 ,e 2*^272.0 2 46
e Ù.25Ỉ- 2S5 0 ữ 2 7 t 5S7 ts J 1S ũ .¿S4 44S.Ũ 5 1 5 3 .6 Ũ 5J
7
PJÌSĨ.
a .ở Ủ.3â5 > Í6 3 ì A 'j3
Ũ 410
1^7 >» 1 3 .4S
s í) 4¥:4 24Ở.S (1 5 Í2
15322 D
6 .6 í p .65 4 3316 7 3S526.4
3 ,SI
a
sa 1 li .7 LI 5 ^2 :ì -432.*
íi 0 5P5 2 5 S 5.3
'J 6 5W .1
3,70
10 0.5S 5 2Í5S<5.3 Ủ .623 4275 4 s se Ũ 62S
•»Í55.2 62 S06.0
6 57
11
ữ íiíS 42 5 5 .2 0 727 9?3 3 2 t ti. e s Ũ .757 7e.S‘t í i ;iSS4SS.Ci :i& Sv
12
0.7 5 ?
7 6 9-ị ÍI t) 7ÍÌ2 lo o s a s 20 1-4 0 SOS 9P 27.7 19D374.D 1S 31
15 ủ .SOS & 6 i7 7

ủ S10 3640 Íí
ia :ỉ i
0 Ộ14
ạ ií i 0 16Ễ»ỨS5 Ồ
17
14
LE.965
2 4 3 s
0 se7 ¿ 60.6 ữ VS2 D SS2
41 .5
1 7tJ« .4 D 17
Toial H eight ^ 9 3 4 ,7 Total .arèa ÍIS5SI15»
Hình 1.1.4; Kết quả sắc ký dịch chiết Chỉ xác quan sát ở
ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm
17
Trac:fí 1
A Ả
- Ị — , 1— ;

1

r-
V T o.r
T r a c k 1
3ii
MĩiM. End
Subst
ỉV Rf H
F1 K
A.

r^ì
m«
1
0 Dữũ
ữ 0 ữ ũ lí
1^57 9 15 aỏ ủ Ủ51 4t j
t 04
rr
0 053 0 0
Ũ ŨSS 1Ũ31.S 3 50
fi 117 4.5 1Ũ42& 1 4^9
■ỉ
ử 125 ùữ
Ư.IÍ4 ^ 4 Ù 4D7 ứ l&D V 1
464i Ú ĩ ũử
4 Ũ 44Ứ 94Ữ
C.4Í3 205.;? Í.6ÍÍ
ủ 47^ 21.t 1374 2 D.eữ
5 ữ Í7D
Êô 5 D 6 !í 264.6 2Jíi 0 6 ií
Í52 3 1 Ộ2
f.
ữ ỎÍ2 2.ĩ 2.;ì
2.Ủ5 O.CÍậ
U4 2 2aỡ7 D í
7 Ũ.711 202.5
0 7ậ9 ÍTeQ.r 22.9S Ũ.820 2122.8
63256 3 27
s Ũ Ộ2D
: i 22 s ủ S72 ÍÍ7D 3

Ũ ^70 91 1
127249 5
ÍO Ú2
T(jts) Height 1Ĩ14Ĩ Í Torĩsl ílntB Ỉ2715S
Hình 1. ỉ .5; Ket quả sắc ký dịch chiết Chỉ thực quan sát ở
ánh sáng thường sau khi hiện màu
Sắc kí đồ Chỉ
thực-Chỉ xác
quan sát ở ánh
sáng thường
T ra c k 2
ầ h
Ì ¿ V A
i
,Ậ
7 V
T r^ c k 2
00
' 1
0 1
' 1 1 l
>;• í
1 ' i ' 1 ' I ‘
I '
^rt M 3 X .
E
nia a rẹ
ạ . _. _ .
„ S -y b^
Pi H

Rí H RI
H A
Ĩ-M
r)ĩjrri!í:
1
0 ũứữ ũ .o í “ 0.01 ¿’
1 t í 3 4 6 .43 Ũ.Ũl-9
36 4 *5357 0 2.43
2 ủ 0 ^ 7 ử 0
0 091
12ÍIS 2 e 75
Ũ 117 S.7 1 Ũ4ft6 7 3 m
Ú Í3 0 2 1 Ù .156 232 e t :ĩ O
D.1?D
. ¿253.9
O .W
4
0 2 M 29 *ị
Ũ.255 104? s 5 S2 o.ssei 10 5
1^242.2
5
ủ "J67
2Ủ 7 CI.3ỠS l i í . ã ữ 70 Lì ,42 i 25,ộ
12&4.‘9 0.46
6
0 4 2 Ĩ
25 s Ũ.45?.
163 4
0
ti-464 1 11 s 1533 4 0 5-ị

7 ủ ÍSŨ4 322 ‘S
ỉ $0 ủ t ũ ĩ 2 2ỹ íS s
1 0-5
ộ
0 69Ứ
4 Í3 .4 Ũ.7S4 ‘ị3 ‘W .3 24 2S Ú.7S6 453S ạ
eeũ98 9 33.40
ờ
ủ 7^e 43 í ô í5
Ũ.7Sâ
4 3 ÍS .7
24 27 D.836 2Ĩ1ÍÍÌ.3 6732 7 .3
23 3 4
lừ
3ậ?e i Ủ.S72
4715 s
56 2S 0,943
276 Ì 1Ữ79S4 4 35 2 ì
1 1
. ÍZỈLS_
D.y^e ti 1
a as4 LÍ5 /J i4 íiủ .ỹ tì S8
T o o l H eigM 17 9 3 7.2 T otal jSrea 2 3 2 42 7
3.2. Trần bì
Tổng quan
Từ xưa trong nhân dân đã truyền tụng câu “Nam bất ngoại Trần bì. Nữ
bất ly hương phụ.” Cho thấy tầm quan trọng của Trần bì. Đây là vị thuốc dân
dã, rất dễ kiếm mà lại có tác dụng tốt. [20]
Trần bì có tên khoa học: Citrus reùcuỉata Blanco. (= Citrus deỉiciosa
Ten.) thuộc họ Cam {Rutaceae), còn có tên khác là Hoàng quyết, Quyết,

Mandarinier(Pháp).[2] [20] [14]
Dược liệu là vỏ quýt đã phơi hay sấy khô. Người ta cho rằng vỏ quýt phơi
càng để láu càng coi là quý và tốt. [20
Về đặc điểm thực vật, Quýt là cây gỗ nhỏ cao 3-5m, gai ngắn, cành không
lông. Lá xoan bầu dục tưcfng đối nhỏ, mép có răng nhỏ, không lông, dài 7 cm,
rộng 3,5 cm; gân phụ 5-8 cặp; cuống tròn dài 0,6-0,7 cm. Hoa 1-3 ở nách lá,
cọng 1 cm, lá đài xanh không lông, cánh hoa dài 1 cm. Quả hơi bẹp, đầu cắt
ngang hay lõm, đáy tròn có chút núm, quả bì màu vàng hay cam mỏng, dễ
bóc.
Quýt có nhiều tạp chủng phức tạp như: Tangerine có trái màu cam là tạp
chủng giữa Quýt và Cam.
Quýt được trồng khắp nơi trong nước ta đặc biệt là các vùng Nghệ An,
Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Giang. Trên thực tế trong nhân dân sử dụng vỏ của
nhiều loại quýt khác chưa xác định được tên khoa học quýt giấy, quýt tàu ,
Thành phần hoá học của vỏ quýt tươi: tinh dầu 3,8% chủ yếu là limonen,
flavonoid (hesperidin), các vitamin A, B, các chất vô cơ như Brom. Nước quýt
có đường, acid citric, vitamin c, carotene. Lá cũng có chứa tinh dầu khoảng
0,5%.
Ngoài công dụng của quả quýt trong thực phẩm, v ỏ quýt và lá quýt để chế
tinh dầu, quýt còn là vị thuốc quan trọng và thông dụng trong nhân dân và
đông y.
v ề mặt tác dụng, theo y học cổ truyền Trần bì có vị cay đắng, tính òn,
quy kinh tỳ và phế có lác dụng kiện tỳ, hoá đờm được sử dụng trong các bài
thuốc để chữa ăn uống không tiêu, ăn không ngon, nôn mửa, trừ đờm [5] [20J.
Do Trần bì có chứa Brom nên còn có tác dụng làm dịu thần kinh. [14]
Nước quýt có tác dụng giải rượu, giải khát, bồi bổ; lá quýt hơ nóng chữa
đau bụng, ho.
Ngoài vị thuốc Trần bì nhân dán còn sử dụng các vị thuốc Thanh bì (vỏ
quả quýt còn xanh phơi hay sấy khồ), Quất hạch (hạt quýt phơi khô).[20]
Đối với vị thuốc Trần bì DĐVN III yêu cầu kiểm nghiệm một số tiêu

chuẩn sau: Đặc điểm hình thái bên ngoài, đặc điểm bột, định tính hoá học
Kết quả thưc nghiẽm
Đặc điểm hình thái bẽn ngoài.
• Mỏ tả dược liệu.
Vỏ cuộn lại, dày 0,1- 0,15 cm. Mật ngoài màu vàng nâu hay nâu nhạt. Mặt
trong màu trắng, xốp, chất nhẹ, giòn, dễ bị gãy. Dược liệu khi sử dụng được
cắt thành các sợi nhỏ. (Ảnh 2 b)
♦> Đặc điểm vi học.
• Đặc điểm bột.
Bột màu nâu, mùi thcfm hắc, vị cay.
Soi dưới kính hiển vi thấv: Mảnh vỏ quả ngoài gồm các tế bào hình dạng
khác nhau thành hơi đày. Mảnh mô mềm. Sát dưới lớp vỏ quả ngoài có các
tinh thể calci oxalat hình khối. Mảnh mạch vòng, vạch, điểm.
Các đặc điểm bột của Trần bì không có gì khác so với các hình ảnh minh
hoạ trong tài liệu [22].
* Định tính.
Định tính bằng các phản ứng hoá học.
Cho 2g bột dược liệu vào bình nón 100 ml thêm 10 ml ethanol 96% đun
hồi lưu cách thuỷ 10 phút, lọc. Dịch lọc chia 3 phần và làm các phản ứng sau:
♦ Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiêm thêm một ít bột Magie (TT) vài
giọt acid hydroclorid đặc (TT) '-> xuất hiện màu đỏ hồng.
♦ Lấỵ 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm thêm vài giọt dung dịch sắt (III)
clorid 5% —> xuất hiện màu xanh đen.
♦ Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm thêm vài giọt dung dịch Natri
hydroxyd 10 % xuất hiện màu vàng cam và ít tủa.
Định tính bằng HPTLC.
Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.2, với
hệ dung môi Diethylether : Ethylacetat (50:1), thu được kết quả :
• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
ký đồ của dịch chiết Trần bi trong methanol quan sát ở ư v 254nm

(Hình 2.1).
• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
ký đồ của dịch chiết Trần bì trong methanol quan sát ở u v 366nm
(Hình 2.2).
• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
ký đồ của dịch chiết Trần bì trong methanol quan sát ở ánh sáng thường
sau khi phun hiện màu (Hình 2.3).
Nhân xét: Với hệ dung môi Diethylether: Ethylacetat cho kết quả tách tưcíng
đối tốt. Ngoài việc sử dụng vaniiin trong cồn và H2SO4 làm thuốc thử hiện
màu chúng tôi còn hiện màu bàng hơi NH3 thấy có lên một số vết màu vàng
thể hiện là các fiavonoid. Có thể sử dụng NH3 làm thuốc thử hiện màu trong
HPTLC để kiểm nghiệm dược liệu chứa flavonoid. Đồng thời chúng tôi cũng
tiến hành so sánh các mẫu dược liệu lấy tại Viện dược liệu và thu thập trên thị
trường thấy cũng có một số khác biệt (Kết quả sắc ký).