rượu vang, nho và nấm men dùng trong sản xuất rượu vang

Luận văn tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách Khoa
Tp.HCM đã tận tình dạy bảo, xây dựng những kiến thức cơ bản cần thiết
cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt và
thầy Lê Văn Việt Mẫn vì sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình mà thầy cô đã
dành cho em trong suốt quá trình làm luận văn.
Mặc dù gặp nhiều khó khăn trong thời gian vừa qua, nhưng sự động
viên, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình đã giúp em hoàn thành
tốt nhiệm vụ được giao. Em xin chân thành cảm ơn tất cả những người đã
giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 1/2008
Nguyễn Đức Ninh
Luận văn tốt nghiệp
MỤC LỤC
Chương 1: GIỚI THIỆU................................................................1
Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp..................................................................1
Tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lên men.. .1
Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp.............................................................................1
Khó tự động hóa quá trình lên men.....................................................................................1
Tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men...................................................1
Ổn đònh hoạt tính của nấm men. Các chất mang cố đònh có tác dụng như là một tác nhân
bảo vệ tế bào chống lại những ảnh hưởng bất lợi của pH, nhiệt độ, dung môi và ngay cả
các kim loại nặng...................................................................................................................1
Dễ dàng tách nấm men ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, do đó làm giảm chi phí
về thiết bò và năng lượng.......................................................................................................1
Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần...............................................................................1
Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa và tự động hóa quá trình lên men................1
Động học quá trình sinh trưởng của nấm men....................................................................2
Động học quá trình sử dụng cơ chất: đường khử, nitơ amin và nitơ vô vơ. .......................2

Động học quá trình hình thành sản phẩm: do thời gian hạn hẹp và chưa có điều kiện về
kinh phí nên trong phạm vi bài luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày sản phẩm quan trọng
nhất của quá trình lên men là cồn mà chưa trình bày các hợp chất hương. Và chúng tôi
cũng khảo sát thêm sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suốt quá trình lên men
chính.......................................................................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN...............................................................3
2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN
XUẤT RƯU VANG............................................................................................................3
2.1.1 Rượu vang...............................................................................................................3
Nhóm rượu vang không có gas............................................................................................3
Nhóm rượu vang có gas.......................................................................................................3
2.1.2 Nho..........................................................................................................................4
Hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, cần thiết cho sự phát triển của nấm men vang.......4
Hàm lượng acid khá cao, đủ để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong
muốn trong và sau quá trình lên men....................................................................................4
Hàm lượng đường đủ để tạo ra hàm lượng cồn cao, nhờ đó ức chế được các vi sinh vật
gây hư hỏng trong rượu vang.................................................................................................4
Các hợp chất hương với thành phần và lượng thích hợp, vì thế rượu vang tạo thành có
tính chất cảm quan tốt............................................................................................................4
Đường..............................................................................................................................5
Nitơ 5
Acid hữu cơ.....................................................................................................................5
SO2 7
Tannin.............................................................................................................................7
Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acid ellagic. 7
i
Luận văn tốt nghiệp
Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và gallocatechin) và
flavan-3,4-diol........................................................................................................................7
2.1.3 Nấm men.................................................................................................................8

Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộc giống
Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với nhiều loại vi sinh
vật khác. Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ cồn cao hơn 6%v/v
(ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong môi trường có nồng độ cồn
lên đến 12%). Trước đây, nấm men NS được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng. Tuy
nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất
lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vò của rượu vang [23, 41, 42, 45, 149, 166, 207].
8
Nhóm khác góp phần vào hương vò rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá trình lên
men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces. Saccharomyces có khả năng chòu đựng
sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơ tăng và sự cạn
kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000). Như vậy, mặc dù có nhiều giống và loài nấm men
trong dòch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces
cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan
trọng trong lên men vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được gọi là “nấm
men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199]. .................................................................................9
Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với SO2, các loài
có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp.........................................10
Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol
tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.....................................10
Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các chủng nấm
men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chòu đựng đối với SO2 và làm tăng
chất lượng rượu vang [178]. ................................................................................................10
Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiae và
Saccharomyces bayanus var. uvarum để kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm tăng chất
lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao) [175]...........10
2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN...................................................................................................11
2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố đònh tế bào...............................................11
2. Sử dụng màng membrane vi xốp....................................................................................13
3. Sử dụng màng vi bao.......................................................................................................13

4. Đơn giản, dễ thực hiện [113, 185, 189]..........................................................................13
5. Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [185, 138]................................................13
6. Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố đònh và chất mang lớn hơn so với các kỹ thuật khác
[138].....................................................................................................................................13
7. Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vò thể tích chất mang cao hơn so với canh
trường vi sinh vật tự do [138]...............................................................................................13
8. Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lại cũng
như những điều kiện gây stress [138]..................................................................................13
9. Đơn giản, dễ thực hiện....................................................................................................13
10. Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối...............................................................13
ii
Luận văn tốt nghiệp
Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ bò tách ra,
làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch [113, 40]...............................................13
11. Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel [39]............13
12. Tế bào trên bề mặt dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát triển trong môi trường như là
các tế bào tự do [113, 39]....................................................................................................13
13. Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ bò tách
ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch.........................................................13
14. Các vật liệu cellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã tách lignine, …
[113, 138]..............................................................................................................................14
15. Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp,
vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [113, 138]......................................................14
16. Polymer tự nhiên [113]:................................................................................................14
17. Polysaccharide: alginates, κ-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid.. 14
18. Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol.................................................14
19. Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [138]..........14
2.2.2 Các chất mang cố đònh nấm men trong sản xuất rượu vang................................14
2.2.3 Cố đònh nấm men trong gel alginate....................................................................20
Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng

chất khô................................................................................................................................20
Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.................................................20
Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau.....................................................20
Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau..........................................................20
Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau....20
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài...............................................21
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong................................................22
Ưu điểm.........................................................................................................................22
Quá trình cố đònh dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209].....................22
Điều kiện cố đònh ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do đó, các tế bào
cố đònh không bò mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211]...............................22
Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176]...............................................................22
Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176,
192].22
Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27]..........23
Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205]..................................23
Nhược điểm và cách khắc phục....................................................................................23
Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]:...........23
Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử
tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dòch) như phosphate,
citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và
magnesium. Sự có mặt của các ion này trong dung dòch sẽ làm cho các hạt bò phồng ra,
dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn đònh và phá vỡ cấu trúc hạt gel.
Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men các chất ổn đònh gel như là
CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn đònh độ bền gel. Hoặc cũng
iii
Luận văn tốt nghiệp
có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và
các loại vật liệu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194].......................23
Không bền hóa học trong dung dòch điện phân và dung dòch có pH cao. Để khắc phục

điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và có nhiều phương pháp được đưa ra: tạo
liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), với polycations
(Birnbaum và cộng sự, 1981) và sấy khô hạt gel (Klein và Wagner, 1978; Burns và cộng
sự, 1985). Những phương pháp này đều có thể cải thiện độ bền trong dung dòch điện
phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tốn nhiều thời gian. Một số tác giả đã đưa
ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyền thống. Các
ion này có ái lực mạnh hơn đối với alginate, vì thế hạt gel barium và strontium alginate
bền hơn trong dung dòch điện phân so với hạt gel calcium alginate. Tuy nhiên, các ion
này vẫn không được ứng dụng rộng rãi vì độc tính của nó đối với nấm men và với môi
trường [144, 183, 192, 193, 194]. ........................................................................................23
nh hưởng của khối lượng phân tử..............................................................................24
nh hưởng của tỷ lệ G/M.............................................................................................24
Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể [101]......................................24
Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trò 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiên liên
kết vào block G hơn là block M và block MG. Do đó alginate có hàm lượng G lớn sẽ tạo
thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thời gian dài. Trong
suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ không bò phồng nở hay co
rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn. Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao sẽ
cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khi cố đònh. Trái lại, alginate có hàm
lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn và dễ bò rã ra hơn so với các gel giàu G
[101, 116, 144, 173, 181, 192, 193]. Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và
kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố đònh nấm men hơn vì gel này ít gây cản
trở đến khả năng khuếch tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn [210]..................24
nh hưởng của nồng độ alginate..................................................................................25
nh hưởng của pH tạo gel............................................................................................25
nh hưởng của nhiệt độ tạo gel...................................................................................25
nh hưởng của mật độ tế bào trong hạt.......................................................................25
nh hưởng của tỷ lệ S/V..............................................................................................25
2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố đònh................................................................26
Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinh trưởng

của nấm men cố đònh trên thủy tinh xốp (Controled pore glass) bằng phương pháp hấp
phụ. Khả năng sinh trưởng của nấm men tự do và cố đònh được đánh giá gián tiếp thông
qua tốc độ hấp thu O2 và tốc độ sinh CO2. Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men cố đònh
có hiện tượng giảm khả năng hấp thu O2 và sinh CO2 so với nấm men tự do [16]..........26
Doran và cộng sự (1985) cũng tiến hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men
Saccharomyces cerevisiae cố đònh trên gelatin. Kết quả thực nghiệm thu được tương tự
như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982). Ngoài ra tác giả còn nhận thấy rằng
tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nấm men cố đònh trên gelatin đều thấp hơn so với
nấm men tự do [56]..............................................................................................................26
iv
Luận văn tốt nghiệp
Hệ lên men sử dụng nấm men cố đònh là một hệ phản ứng dò thể, trong đó, các chất dinh
dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nấm men hấp phụ trên bề
mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơn so với trong
môi trường đồng thể. Chính sự thay đổi áp lực thẩm thấu một cách đột ngột gây mất cân
bằng trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào [16].
26
Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vò trí nào trên bề mặt tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực ellipsoide
của tế bào nấm men lưỡng bội. Vì vậy khi 1 cực của tế bào nấm men gắn vào chất mang
sẽ vô tình làm mất đi sự hình thành của một chồi mới [56]...............................................26
Wada và cộng sự (1980) nhận thấy rằng nấm men cố đònh sinh trưởng và giữ ổn đònh ở
khoảng 5,4.109 tế bào/mL gel [201]...................................................................................26
Melzoch và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sự phát triển và hình thái của nấm men cố
đònh trong gel Ca-alginate. Các tế bào nấm men cố đònh sau khi được hoạt hóa, nếu được
nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, số lượng tế bào sẽ tăng lên rất nhanh
(khoảng 1010 tế bào/mL gel) và sau đó hầu như giữ nguyên không đổi [142].................26
Banyopadhyay và cộng sự (1982) giả thuyết rằng chính sự mất cân bằng về trao đổi chất
làm cho các chồi của nấm men sau khi mọc thành nhanh chóng bò tách ra khỏi tế bào mẹ,
làm cho hình thái tế bào nấm men bò thay đổi [16]............................................................27

Melzoch và cộng sự (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái của tế bào nấm men cố đònh
trong gel được tiến hành bằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Kết quả khảo sát
cho thấy tế bào nấm men cố đònh có hình dạng và kích thước không đồng đều. Điều đó
cho thấy sự phát triển của các tế bào bò nhốt trong hạt gel phụ thuộc vào độ xốp và cấu
trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trống trong hạt gel của tế bào nấm men.
Trong chất mang, các tế bào nấm men có xu hướng kết tụ lại với nhau [142]..................27
Thay đổi thành phần lipid của màng membrane [96, 138]...............................................27
Thay đổi hàm lượng các chất trao đổi trung gian như là fructose-1,6-diphosphate,
glucsoe-6-phosphate và 3-phosphoglycerate [73]...............................................................28
Hàm lượng polysaccharide tạo cấu trúc (glycogen, mannan, glucan, trehalose), chất dự
trữ glycogen, DNA, và RNA cao hơn so với tế bào tự do [38, 71, 73, 96, 113, 138, 150,
193]. .....................................................................................................................................28
Desimone và cộng sự (2002) đã cho nấm men tiếp xúc với ethanol nồng độ 80% (v/v)
trong nhiều khoảng thời gian khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sống sót
của nấm men cố đònh cao hơn rất nhiều so với nấm men tự do. Sau 5 phút tiếp xúc với
ethanol, nấm men tự do bò tiêu diệt hoàn toàn, trong khi số lượng nấm men cố đònh vẫn
tương đương với thời điểm ban đầu [53]. ............................................................................28
Nghiên cứu của Krisch và Szajáni (1997) cho thấy rằng hàm lượng glucose trên 16%
(v/v) thì có ảnh hưởng độc đối với các tế bào nấm men tự do. Khi nồng độ cồn đạt 20%
thì nấm men tự do không còn tồn tại. Các tế bào nấm men được nhốt trong gel alginate
và hấp phụ trên cellulose thì có khả năng sống sót cao hơn nhiều so với nấm men tự do,
lần lượt là 72 và 62% [117]..................................................................................................28
v
Luận văn tốt nghiệp
Holcberg và Margalith (1981) cho rằng hàm lượng glucose 40 và 50%w/w sẽ ức chế tế
bào tự do, làm cho quá trình lên men hầu như không xảy ra, trong khi đó tế bào cố đònh
vẫn có thể lên men mặc dù tốc độ chậm [91].....................................................................28
Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của hàm lượng cồn cao và
ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao do đường gây ra [12, 113, 117, 133, 150, 206]......29
Nấm men cố đònh tạo thành glycerol nhiều hơn. Glycerol có tác dụng làm cân bằng thế

oxy hóa khử nội bào của nấm men hoặc sự cân bằng NAD+/NADH và hoạt động như là
một chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đối với áp lực thẩm thấu cao của đường trong suốt
quá trình lên men. Nhiều tác giả cũng cho rằng khi hàm lượng đường càng tăng thì lượng
glycerol tạo thành cũng tăng [15, 43, 52, 60]......................................................................29
Nấm men cố đònh chứa lượng acid béo no cao hơn so với nấm men tự do, nên làm tăng
khả năng chòu nồng độ cồn cao. Mức độ no của acid béo càng tăng sẽ làm tăng khả năng
chòu đựng đối với ethanol. Agudo (1992) cũng nhận thấy rằng các giống Saccharomyces
chòu cồn có chỉ số không no thấp hơn so với các chủng ít chòu cồn [53, 117, 150]............29
Nấm men cố đònh có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm
tăng khả năng giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường. Nagodawithana và
Steinkraus (1976) cho rằng khả năng chòu cồn tùy thuộc vào khả năng tế bào giải phóng
ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206]..........................................................29
Có hoạt tính enzyme ADH (là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành
ethanol) cao hơn [59]...........................................................................................................29
Tạo thành nhiều ester hơn. Do việc cố đònh các tế bào nấm men có thể làm thay đổi
hoạt động của các enzyme acetyl-transferase theo hướng tích cực hơn, do đó làm tăng
quá trình tổng hợp ester [20, 56, 113, 131, 133, 135, 193, 208]..........................................30
Tạo thành ít diacetyl hơn [113]..........................................................................................30
Tạo thành ít acetaldehyde hơn [193, 196, 208].................................................................30
Tạo thành ít methanol hơn [196, 208]................................................................................30
Tạo thành ít acid dễ bay hơi hơn [18, 196]........................................................................30
Tạo thành rượu bậc cao ít hơn khi lên men ở nhiệt độ thấp [20, 193]..............................30
2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH
LÊN MEN RƯU VANG ...................................................................................................32
2.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường........................................................................32
2.3.2 Ảnh hưởng của pH................................................................................................36
2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SO2............................................................................38
Chống hóa nâu: khi dòch nho tiếp xúc với O2 trong không khí trong suốt quá trình chà và
ép, dòch nho sẽ phản ứng với O2 trong không khí và bò oxy hóa. Quá trình oxy hóa làm
cho dòch nho bò sậm màu, và dòch nho sẽ dần chuyển sang màu nâu. Quá trình hóa nâu có

thể được tăng tốc do sự có mặt của enzyme polyphenoloxidase trong dòch nho. Loại
enzyme này rất nhạy với SO2 tự do và enzyme này sẽ bò bất hoạt khi thêm SO2 vào dòch
nho vì SO2 làm mất ổn đònh của các cầu disulfide trong enzyme. Ngoài ra, SO2 còn có
khả năng liên kết với acetaldehyde, chất làm cầu liên kết cho các hợp chất phenolic, nhờ
đó cũng làm kìm hãm quá trình hoá nâu [59, 30]. .............................................................38
Ức chế vi khuẩn và nấm men dại: nấm men vang có khả năng chòu đựng tốt đối với SO2
nhưng hoạt động của nấm men dại và vi khuẩn sẽ bò giảm đi đáng kể khi thêm vào một
vi
Luận văn tốt nghiệp
lượng nhỏ SO2. Độ nhạy đối với sulfite thì khác nhau đối với các giống nấm men khác
nhau. Kloeckera apiculata nhạy với hàm lượng SO2 tự do nhỏ hơn 5mg/L. Nhưng Candida
guilliermondii và Zygosacccharomyces spp. thì nhạy với hàm lượng SO2 gấp ít nhất
khoảng 10 lần [59, 90, 171]. ...............................................................................................38
2.3.4 Ảnh hưởng của tannin...........................................................................................40
2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ.......................................................................................41
Làm giảm mật độ tế bào nấm men...................................................................................41
Kéo dài pha lag, vì thế các giống non-Saccharomyces dễ chiếm ưu thế hơn so với
Saccharomyces.....................................................................................................................41
Thu hẹp màng lipid, do đó làm giảm khả năng vận chuyển của các hợp chất................41
Kéo dài thời gian lên men, làm tăng mối nguy xảy ra hiện tượng kéo dài thời gian lên
men hoặc qúa trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao......................41
Khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men cố đònh trên DCM, Bardi và Koutinas (1994) nhận thấy rằng khi nhiệt độ lên
men giảm từ 30 xuống 15oC, thời gian lên men của rượu vang sử dụng nấm men cố đònh
tăng 158%, trong khi đó nấm men tự do tăng tới 331%. Kết quả được minh họa như trong
Hình 2 .22 [17].....................................................................................................................42
Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành cố nấm men lần lượt trên 3 chất mang là
kissiris, γ-alumina và calcium alginate và tiến hành lên men ở các nhiệt độ khác nhau là
7, 13 và 27oC. Trong tất cả các trường hợp, tốc độ lên men của các tế bào cố đònh cao
gấp 2 – 3 lần so với tế bào tự do, và sự khác biệt về tốc độ lên men càng tăng khi nhiệt

độ càng giảm [14]. ..............................................................................................................43
Bardi và cộng sự (1996) đã nghiên cứu quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men
cố đònh trên gluten tại nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp. Kết quả cho thấy rằng tốc độ lên
men của nấm men cố đònh cao hơn nhiều so với nấm men tự do. Khi nhiệt độ giảm từ 30
xuống 15oC, thời gian lên men của nấm men cố đònh tăng 22%, trong khi đó, nấm men tự
do tăng 76% [18]..................................................................................................................43
2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG.....44
2.4.1 Dùng kỹ thuật cố đònh để khắc phục một số vấn đề trong sản xuất rượu vang..44
Cung cấp thêm chất dinh dưỡng (ammonium phosphate, chất chiết nấm men) [163].....47
Cấy lại bằng nấm men mới [163]......................................................................................47
Hấp phụ các acid béo lên than hoạt tính [163].................................................................47
2.4.2 Dùng kỹ thuật cố đònh trong một số phương pháp lên men.................................47
M. Iconomopoulou và cộng sự (2002) đã nghiên cứu khả năng ứng dụng của nấm men
cố đònh sấy thăng hoa (FGB) trong công nghiệp và nhận thấy rằng tuy ở chu kỳ 1, thời
gian lên men và năng suất lên men không có sự khác biệt so với nấm men tự do (ffdc)
nhưng ở chu kỳ 2, nấm men cố đònh cho năng suất lên men cao hơn hẳn và tốc độ lên
men tăng lên đáng kể (Hình 2 .24) [93].............................................................................47
Bardi và cộng sự (1997) đã lần lượt cố đònh nấm men trên 2 loại chất mang là DCM và
gluten để sử dụng cho quá trình lên men tónh nhiều chu kỳ tại các nhiệt độ khác nhau.
Kết quả cho thấy nấm men cố đònh trên DCM có thể sử dụng trong 43 chu kỳ, trong khi
đó, nấm men cố đònh trên gluten có thể sử dụng trong 29 chu kỳ. Kết quả nghiên cứu cho
thấy rằng khi sử dụng nấm men cố đònh để tiến hành lên men thì hàm lượng ethyl acetate
vii
Luận văn tốt nghiệp
tạo thành cao gấp 2 – 4 lần so với nấm men tự do, còn khi sử dụng nấm men cố đònh trên
DCM để lên men ở nhiệt độ thấp thì hàm lượng amyl alcohol thấp hơn nhiều so với nấm
men tự do, nhờ vậy mà giảm được độc tính cho sản phẩm rượu vang. Như vậy, sử dụng
nấm men cố đònh sẽ cải thiện hương vò tốt hơn so với nấm men tự do [20]. .....................47
Kourkoutas và cộng sự (2003) đã sử dụng nấm men cố đònh trên miếng mộc qua để lên
men rượu vang theo phương pháp lên men tónh nhiều chu kỳ. Và kết quả cho thấy rằng

quá trình lên men vẫn có thể tiếp tục trong khoảng 8 tháng mà không làm mất đi đáng kể
hoạt tính của nấm men. Khi thực hiện lên men ở nhiệt độ rất thấp (< 10oC) thì quá trình
lên men rượu vang hoàn thành chỉ trong vòng 4 ngày, ngắn hơn rất nhiều so với phương
pháp lên men truyền thống. Còn nếu lên men ở 0oC thì thời gian cần thiết khoảng là 50
ngày. Năng suất sinh tổng hợp ethanol thì cao hơn ít nhất là 4 hoặc 5 lần so với quá trình
lên men truyền thống. Bên cạnh đó, hương vò của sản phẩm cũng được cải thiện nhiều,
đặc biệt là ở nhiệt độ thấp [27]. Như vậy, quả mộc qua đã chứng tỏ là chất mang thích
hợp cho quá trình sản xuất rượu vang, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp. Kết quả nghiên cứu của
Kourkoutas và cộng sự (2001) khi cố đònh trên miếng táo cũng cho kết quả tương tự, với
thời gian sử dụng khoảng 7 tháng mà không làm mất đi hoạt tính [110]...........................48
Tsakiris và cộng sự (2004) đã tiến hành lên men rượu vang trắng sử dụng nấm men cố
đònh trên nho khô theo phương pháp lên men tónh nhiều chu kỳ và kết quả cho thấy rượu
vang tạo thành có hàm lượng acid dễ bay hơi, methanol và acetaldehyde thấp, và nấm
men cố đònh có độ bền sinh học trong khoảng 4 tháng [196]. Một nghiên cứu khác của
Tsakiris và cộng sự (2004) cũng cho thấy hệ thống lên men sử dụng nấm men cố đònh
trên nho khô có độ bền vận hành rất cao, có thể tiến hành quá trình lên men tónh nhiều
chu kỳ trong khoảng 1 năm mới phải thay nấm men cố đònh [197]. ................................48
Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành lên men liên tục rượu vang tại nhiệt độ thấp
và nhiệt độ phòng sử dụng lần lượt 3 chất mang là kissiris, γ-alumina và calcium alginate.
Kết quả cho thấy rằng, mặc dù cùng sử dụng nấm men cố đònh nhưng năng suất sinh tổng
hợp cồn khi lên men theo phương pháp liên tục cao hơn so với phương pháp lên men tónh
(bảng 2.11) [14]....................................................................................................................49
Kourkoutas và cộng sự (2002) đã thực hiện quá trình lên men rượu vang liên tục sử dụng
chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ưa lạnh cố đònh trên miếng táo. Kết quả
nghiên cứu cho thấy rằng năng suất lên men theo phương pháp này cao hơn nhiều so với
phương pháp lên men tónh truyền thống. Năng suất lên men cồn ở 5oC thì bằng với năng
suất lên men cồn ở 22 – 25oC theo phương pháp truyền thống. Bình lên men có thể vận
hành liên tục trong vòng 95 ngày mà không làm giảm năng suất tạo cồn. Đồng thời, hàm
lượng rượu bậc cao và acetaldehyde trong rượu vang này thì thấp hơn so với rượu vang
lên men theo phương pháp lên men tónh truyền thống (bảng 2.12). Điều đó chứng tỏ rằng

chất lượng rượu vang đã được cải thiện [112]. Một nghiên cứu khác của Kourkoutas và
cộng sự (2005) khi sử dụng chất mang là miếng táo, mộc qua và lê cũng cho kết quả
tương tự [107].......................................................................................................................49
Ogbonna và cộng sự (1989) đã tiến hành quá trình lên men rượu vang theo phương pháp
liên tục trong thiết bò phản ứng sinh học nhiều cấp (multistage bioreactor) sử dụng các đóa
sinh học (bioplate) làm tác nhân lên men. Các đóa sinh học này chính là nấm men cố đònh
trên các đóa thủy tinh đã được gia công tạo mặt lưới. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá
viii
Luận văn tốt nghiệp
trình lên men liên tục sử dụng nấm men cố đònh trên đóa thủy tinh không những có tính ổn
đònh cao, bền trong thời gian dài sử dụng mà còn có khả năng tạo sản phẩm có chất lượng
không thua kém sản phẩm tạo ra theo phương pháp lên men truyền thống [152].............50
2.4.3 Dùng kỹ thuật cố đònh trong sản xuất một số loại rượu vang..............................50
Làm lạnh để giảm tốc độ lên men.....................................................................................50
Tách dòch lên men ra khỏi nấm men (bằng cách xử lý với bentonite rồi lọc).................50
Thêm SO2 sau khi lọc xong...............................................................................................50
Sử dụng nấm men cố đònh không gây ra bất cứ sự thay đổi đáng kể nào trong quá trình
lên men.................................................................................................................................51
Tế bào giải phóng ra không ảnh hưởng đến độ trong của rượu vang...............................51
Các thành phần chính như ethanol, acid hữu cơ, nitơ tổng và rượu bậc cao không có sự
khác biệt đáng kể khi so sánh rượu vang tạo ra bởi nấm men cố đònh và rượu vang tạo ra
bởi nấm men tự do...............................................................................................................52
Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........53
3.1 NGUYÊN LIỆU............................................................................................................53
3.1.1 Nho........................................................................................................................53
3.1.2 Nấm men...............................................................................................................54
3.1.3 Alginate.................................................................................................................54
Chế phẩm dạng rắn, độ ẩm 20,05%..................................................................................54
Độ nhớt của dung dòch alginate 2% ở 25oC là 423,6cP....................................................54
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................................54

3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu........................................................................54
3.2.2 Phương pháp cố đònh nấm men trong gel alginate...............................................56
Nhân giống....................................................................................................................56
Nấm men trước khi sử dụng cần được nhân giống hai cấp:..............................................56
Ly tâm ..........................................................................................................................56
Sau khi nhân giống, nấm men được đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút, ở nhiệt độ
40C, thời gian 30 phút, để tách sinh khối. ..........................................................................56
Pha loãng ......................................................................................................................56
Dùng nước vô khuẩn pha loãng sinh khối nấm men đã ly tâm ở trên để đạt dung dòch
huyền phù nấm men mật độ 50.106 tế bào/mL..................................................................56
Tạo dung dòch alginate.................................................................................................56
Dùng nước cất hòa tan alginate để thu dung dòch có nồng độ alginate là 4%. ...............56
Hấp tiệt trùng................................................................................................................57
Vô khuẩn dung dòch alginate ở 1210C, trong 20 phút.......................................................57
Làm nguội.....................................................................................................................57
Làm nguội dung dòch alginate sau khi hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường. ....................57
Trộn...............................................................................................................................57
Trộn dòch huyền phù tế bào nấm men 50.106 tế bào/mL với dung dòch alginate 4% theo
tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo hỗn hợp đồng nhất. ............................................................................57
Tạo hạt..........................................................................................................................57
Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate natri-nấm men vào dung dòch CaCl2 2%. Đường kính
ống nhỏ giọt 3mm, lỗ ra đặt cách mặt trên của dung dòch CaCl2 2cm, hạt được tạo thành
ix
Luận văn tốt nghiệp
có đường kính khoảng 4÷5mm. Dung dòch CaCl2 được khuấy đảo liên tục trên bàn khuấy
từ với tốc độ 100÷200 vòng/phút. Mỗi giọt hỗn hợp alginate nấm men rơi xuống dung
dòch sẽ tạo thành một hạt nấm men cố đònh........................................................................57
Ngâm hạt.......................................................................................................................57
Hạt nấm men cố đònh tạo ra được ngâm trong dung dòch CaCl2 2% trong 2 giờ, tốc độ
khuấy đảo hạt vẫn giữ từ 100÷200 vòng/phút. Ta phải thay mới dung dòch CaCl2 2% sau

mỗi giờ ngâm để nồng độ ion Ca2+ trong dung dòch không bò giảm xuống quá thấp. ...57
Rửa hạt..........................................................................................................................57
Chắt bỏ dung dòch CaCl2, rửa lại hạt gel bằng nước cất và dòch lên men để muối CaCl2
không còn bám trên bề mặt hạt gel. Chúng tôi tiến hành rửa hạt gel 2 lần bằng nước cất
và một lần bằng dòch lên men cho tất cả các thí nghiệm...................................................57
Hạt sau khi được tạo thành phải được tiến hành lên men ngay. Nếu muốn bảo quản hạt
thì cho hạt gel chứa nấm men cố đònh vào dung dòch CaCl2 0,4%, bảo quản ở 5oC trong
vòng tối đa là 24h.................................................................................................................57
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên
men rượu vang nho sử dụng nấm men cố đònh trong gel alginate..................................57
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên
men rượu vang nho, sử dụng nấm men cố đònh trong gel alginate.................................58
3.2.5 Xử lý kết quả........................................................................................................58
Dựng đồ thò biểu diễn sự thay đổi mật độ nấm men theo thời gian:................................58
X = x(t) .............................................................................................................................58
Xác đònh tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men theo thời gian: .....................................58
58
Dựng đồ thò µ = f(t). Từ đó xác đònh được tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax trên đồ
thò. 59
Kiểm tra ANOVA để so sánh giá trò µmax giữa các mẫu thí nghiệm với nhau...............59
Dựng đồ thò biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian:..............................59
Xác đònh tốc độ sử dụng đường: (g/L/h)..........................................................................59
Xác đònh tốc độ sử dụng đường riêng: (g/h/1012 tế bào)...............................................59
Xác đònh tốc độ sử dụng đường trung bình: (g/l/h)...........................................................59
Kiểm tra ANOVA để so sánh các giá trò gS(max), γS(max) và KS giữa các mẫu với
nhau......................................................................................................................................59
Dựng đồ thò biểu diễn sự thay đổi hàm lượng cồn theo thời gian:....................................59
Xác đònh tốc độ sinh tổng hợp cồn: (g/L/h).....................................................................59
Xác đònh tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng: (g/h/1012 tế bào)...........................................59
Xác đònh tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình: (g/l/h)......................................................59

Xác đònh hiệu suất sinh tổng hợp cồn: η = (mol ethanol/ mol glucose)...........................59
Kiểm tra ANOVA để so sánh các giá trò gP(max), γP(max), PS và η giữa các mẫu với
nhau......................................................................................................................................59
3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.....................................................................................60
3.3.1 pH..........................................................................................................................60
Sử dụng máy đo pH............................................................................................................60
3.3.2 Nồng độ chất khô..................................................................................................60
x
Luận văn tốt nghiệp
Sử dụng khúc xạ kế để bàn, đơn vò đo là oBx...................................................................60
3.3.3 Hàm lượng đường khử [4].....................................................................................60
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử 3,5 –
dinitrosalicylic acid (thuốc thử DNS). DNS có màu vàng trong dung dòch kiềm sẽ bò khử
thành acid 3–amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam..........................................................60
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm
vi nhất đònh, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thò đường chuẩn của
glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên
cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540 – 600 nm.
60
Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid...............................................................................60
Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất. Sau đó
cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan
hoàn toàn..............................................................................................................................60
Chuyển dung dòch trên vào bình đònh mức 100mL và đònh mức đến vạch......................60
Dung dòch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6-8oC),
dùng tốt nhất trong 15 ngày.................................................................................................60
Dung dòch đường chuẩn................................................................................................60
Dung dòch đường chuẩn là dung dòch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1
(w:w), có nồng độ là 2g/L....................................................................................................60
Xử lý mẫu......................................................................................................................61

Vì trong dòch nho có chứa nhiều acid hữu cơ, các chất màu và nhiều tạp chất khác nên ta
phải tiến hành xử lý mẫu hợp lý để không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.........61
Dựng đường chuẩn........................................................................................................61
Lần lượt cho 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mL dung dòch chuẩn 2g/L vào 5 ống nghiệm khác
nhau. ....................................................................................................................................61
Sau đó, lần lượt thêm vào các ống nghiệm 2,8; 2,6; 2,4; 2,2 và 2mL nước cất theo đúng
thứ tự ống nghiệm như trên..................................................................................................61
Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dòch DNS, lắc đều.........................................61
Dùng một miếng nylon sạch bòt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở
nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 phút.................................................................................61
Làm nguội nhanh dung dòch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dòch
không còn phân lớp..............................................................................................................61
Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 540nm..........................................................................61
Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.................................61
Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A). ..........................61
Xác đònh hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm...............................................61
Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu ≤ 2g/L.........................................61
Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu, 2mL nước cất và 1mL dung dòch DNS, lắc đều. Sau đó
tiến hành tương tự như trên..................................................................................................61
Từ đồ thò đường chuẩn ta xác đònh đường nồng độ đường khử có trong mẫu nghiên cứu.
61
3.3.4 Hàm lượng nitơ amin tự do [4].............................................................................61
xi
Luận văn tốt nghiệp
Đònh lượng nitơ amin bằng phương pháp so màu với thuốc thử là ninhydrin...................61
Cơ chế phản ứng: Khi pH lớn hơn 4, các gốc nitơ amin tự do sẽ phản ứng với ninhydrin,
tạo phức có màu xanh tím....................................................................................................61
Dung dòch chuẩn glycine: hòa tan 0,1072g glycine và đònh mức đến 100mL. Bảo quản ở
4oC. Trước khi sử dụng pha loãng dung dòch này 50 lần được dung dòch A......................62
Hòa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin và 0,3g fructose trong nước

và đònh mức đến 100mL được dung dòch B. Chỉnh pH cuối 6,6 – 6,8. Dung dòch B được
bảo quản trong tối ở 4oC, dùng trong 2 tuần.......................................................................62
Hòa tan 1g KIO3 trong 300mL nước cất và 200mL cồn 96% v/v được dung dòch C. Dung
dòch C được bảo quản ở 5oC................................................................................................62
Pha loãng dòch nho và dòch lên men 50 lần.......................................................................62
Cho 2mL dung dòch đã pha loãng và 1mL dung dòch B vào mỗi 3 ống nghiệm. Đun cách
thủy (ở 100oC) trong 16 phút, làm nguội về nhiệt độ 20oC trong bể nước 20oC trong thời
gian 20 phút..........................................................................................................................62
Cho tiếp vào ống nghiệm 5mL dung dòch C, lắc đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ =
570nm trong vòng 30 phút...................................................................................................62
Làm 3 mẫu chuẩn song song với 2mL dung dòch A..........................................................62
Làm mẫu trắng với 2 mL dung dòch nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0...............62
Trong đó:............................................................................................................................62
3.3.5 Hàm lượng nitơ ammonium [184]........................................................................63
Dung dòch phenol: trộn 11mL phenol lỏng (≥ 89%) và đònh mức thành 100mL bằng
ethanol 95%. Dung dòch này chỉ dùng trong 1 tuần............................................................63
Sodium nitroprusside 0,5%w/v: hoà tan 0,5g sodium nitroprusside vào trong 100mL
nước. Dung dòch này dùng trong 1 tháng.............................................................................63
Alkaline citrate: hòa tan 200g trisodium citrate và 10g NaOH trong nước cất → đònh mức
thành 1L................................................................................................................................63
Sodium hypochlorite 5%: đây là dung dòch có bán sẵn trên thò trường. Dung dòch này
dùng trong 2 tháng...............................................................................................................63
Dung dòch oxy hóa: trộn 100mL dung dòch alkaline citrate với 25mL sodium
hypochlorite. Dung dòch này chỉ dùng trong 1 ngày............................................................63
Dung dòch chuẩn N 1g/L: hòa tan 4,7143g (NH4)2HPO4 trong nước cất và đònh mức
thành 1L. ..............................................................................................................................63
Dung dòch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dòch chuẩn N 1g/L và đònh mức thành 1L.63
Từ dung dòch chuẩn N 10mg/L pha loãng thành 5 dung dòch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L;
0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.............................................................................................63
Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đó:................................................................63

Bao erlen bằng màng plastic, để ở nhiệt độ phòng (22 - 27oC) ở nơi có ánh sáng nhẹ
trong vòng ít nhất là 1h. Dung dòch bền màu trong vòng 24h.............................................63
Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự như trên với các dung dòch chuẩn 0,1mg/L;
0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.............................................................................63
Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy về 0................................63
Đo màu ở bước sóng 640nm..............................................................................................63
3.3.6 Hàm lượng tannin [4]............................................................................................64
xii
Luận văn tốt nghiệp
Xác đònh hàm lượng tannin bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin – Denis.
64
Tannin bò oxy hóa bởi acid phosphomolybdic tạo thành hợp chất có màu xanh..............64
Thuốc thử Folin – Denis: cho 100g Na2WO4.2H2O, 20g acid phosphomolybdic và 50mL
H3PO4 vào 750mL nước, cho chảy ngược dòng trong 2h, làm nguội, và pha loãng đến 1L.
64
Dung dòch Natri carbonate bão hòa: cho 35g Na2CO3 khan vào 100mL nước, hòa tan ở
70-80oC, sau đó để nguội qua đêm. Dung dòch quá bão hòa chứa các mầm tinh thể
Na2CO3.10H2O. Sau khi kết tinh, lọc tinh thể qua len thủy tinh.......................................64
Dung dòch chuẩn acid tannic: 0,1g/L. Hòa tan 0,1g acid tannic trong 1L. Chuẩn bò dung
dòch mới cho mỗi lần xác đònh.............................................................................................64
Xây dựng đường chuẩn.................................................................................................64
Sử dụng pipet lấy từ 0-10mL dung dòch chuẩn acid tannic vào bình đònh mức 100mL
chứa 75mL H2O. .................................................................................................................64
Thêm 5mL thuốc thử Folin – Denis và 10mL dung dòch Na2CO3, sau đó đònh mức tới
100mL bằng nước cất. .........................................................................................................64
Trộn đều hỗn hợp trong 30 phút........................................................................................64
Xác đònh độ hấp thu A ở bước sóng 760nm. .....................................................................64
Dựng đường chuẩn độ hấp thu A theo mg acid tannic/100mL..........................................64
Đo mẫu..........................................................................................................................64
Dùng 1mL mẫu, xác đònh độ hấp thụ A tương tự như trên. ..............................................64

Từ đồ thò đường chuẩn ta xác đònh đường nồng độ tannin có trong mẫu nghiên cứu......64
3.3.7 Hàm lượng sulfur dioxide [171]...........................................................................64
Xác đònh hàm lượng sulfur dioxide bằng phương pháp Ripper........................................64
Sulfur dioxide có trong dung dòch mẫu sẽ bò oxy hóa bởi iodine. Lượng iodine dư tác
dụng với tinh bột làm cho dung dòch có màu xanh thẫm....................................................64
EDTA: acid ethylene diamine tetraacetic, muối di-sodium..............................................64
Dung dòch NaOH 4M (160g/L)..........................................................................................65
Acid sulfuric 10% (v/v)......................................................................................................65
Dung dòch tinh bột, 5g/L: Trộn 5g tinh bột với khoảng 500mL nước. Đun sôi khuấy trộn
liên tục và giữ trong 10 phút. Thêm 200g NaCl. Làm nguội và tạo thành 1 lít.................65
Dung dòch iodine 0,025M...................................................................................................65
Cho vào bình erlen:............................................................................................................65
Chuẩn độ ngay lập tức với iod 0,025M cho tới khi màu xanh xuất hiện rõ trong 10 đến
15 giây. Ghi n là thể tích iodine sử dụng.............................................................................65
Thêm 8 mL dung dòch NaOH, lắc một lần và để yên 5 phút. Thêm 10mL acid sulfuric
trong khi khuấy trộn mạnh. Chuẩn độ ngay lập tức với dung dòch iodine 0,025M, ghi n’ là
thể tích sử dụng....................................................................................................................65
Thêm 20mL NaOH, khuấy trộn đều rồi để yên 5 phút. Pha loãng với 200mL nước đá
lạnh. Thêm 30mL acid sulfuric trong khi khuấy trộn mạnh. Chuẩn độ sulfur dioxide tự do
ngay lập tức với iodine 0,025M, và ghi n” là thể tích sử dụng...........................................65
Hàm lượng mg sulfur dioxide tự do trong một lít rượu vang:............................................65
Hàm lượng mg sulfur dioxide tổng trên một lít rượu vang:..............................................65
xiii
Luận văn tốt nghiệp
3.3.8 Hàm lượng ethanol [4]..........................................................................................65
Cho 20mL mẫu vào bình cất 250mL, ghi lại nhiệt độ......................................................65
Thêm vào đó 20mL nước cất.............................................................................................65
Bình hứng được đặt trong chậu thủy tinh chứa hỗn hợp nước và đá để làm lạnh............65
Đun nhẹ bình cất (để tránh bọt không trào sang bầu bảo hiểm). Tăng nhiệt độ bình cất
khi bắt đầu sôi đều...............................................................................................................65

Chưng cất cho đến khi gần đạt 20mL, và pha loãng thành 20mL tại cùng nhiệt độ. ......65
Chuẩn bò bình tỷ trọng..................................................................................................66
Rửa sạch bình tỷ trọng, tráng 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng etanol 96%, hay 2 lần
bằng ete etylic hoặc aceton.................................................................................................66
Làm khô ngoài không khí hoặc sấy nhẹ ở 50oC trong 30 phút. Sau đó cân để biết khối
lượng bình.............................................................................................................................66
Xác đònh khối lượng bình và nước cất..........................................................................66
Từ từ cho nước cất vào bình tỷ trọng. Rót nhẹ theo thành bình để tránh tạo thành bọt
khí. Rót đầy đến miệng bình. ..............................................................................................66
Đậy nút bình tỷ trọng và ngâm trong bể điều nhiệt sao cho mực nước của bể trên vạch
mức của bình tỷ trọng..........................................................................................................66
Sau 30 phút, mở nút và dùng pipette hút bớt nước cất cho đến khi đáy của mặt khum
tiếp xúc với vạch mức..........................................................................................................66
Dùng giấy lọc lau khô bên trong cổ của bình tỷ trọng, nút và ngâm trong nước tại nhiệt
độ phòng trong vòng 15 phút...............................................................................................66
Đưa bình tỷ trọng ra khỏi nước. ........................................................................................66
Rửa bình tỷ trọng bằng bông thấm nước etanol 96% cho hết nước bám ngoài bình. Dùng
bông hoặc khăn sạch lau khô bình. Khi lau chỉ cầm ở cổ bình để tránh không gây ra sự
thay đổi nhiệt độ của dung dòch trong bình. Tránh không để sợi bông bám lại ở ngoài
thành bình. ...........................................................................................................................66
Để yên trong vòng 15 phút và cân....................................................................................66
Xác đònh khối lượng bình và rượu................................................................................66
Đổ hết nước ra khỏi bình tỷ trọng, rửa bằng acetone và làm khô trong không khí. .......66
Cho mẫu vào bình tỷ trọng và tiến hành tương tự như đối với nước................................66
Sau khi cân biết khối lượng rượu và bình..........................................................................66
Tỷ trọng tương đối của rượu (d) tính theo công thức:.......................................................66
Trong đó.............................................................................................................................66
Biết tỷ trọng tương đối (d) tra bảng sẽ tìm được hàm lượng rượu tính theo phần trăm thể
tích tại nhiệt độ khảo sát......................................................................................................67
3.3.9 Hàm lượng acid tổng [4].......................................................................................67

Khử CO2: cho khoảng 25mL mẫu vào 1 erlen nhỏ, gia nhiệt đến bắt đầu sôi và giữ trong
30s, lắc đều và làm lạnh......................................................................................................67
Thêm 1mL phenolphtalein vào 200mL nước sôi nóng trong erlen 500mL. Trung hòa đến
khi có màu hồng nhạt...........................................................................................................67
Thêm 10mL mẫu đã khử khí và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N...........................................67
3.3.10 Hàm lượng acid dễ bay hơi [171].......................................................................67
xiv
Luận văn tốt nghiệp
Lấy chính xác 20mL mẫu cho vào bình đònh mức, rồi rót vào bình cầu của bộ cất. Dùng
khoảng 20mL nước cất tráng sạch bình đònh mức 2 – 3 lần để chuyển toàn bộ rượu vào
bình cầu. Lắp hệ thống chưng cất, hứng dòch cất vào bình đònh mức trên. .......................67
Sau khi chưng cất được 2/3 dung tích bình mức và nhiệt độ hơi cất đạt 100oC thì ngừng
cất. Thêm nước cất gần vạch mức, để ở 20oC trong 30 phút. Sau đó thêm nước cất đến
vạch mức, lắc đều................................................................................................................67
Lấy 10mL dòch cất cho vào erlen 100mL, thêm 3 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng
NaOH 0,1N cho tới khi có màu hồng bền. Thêm 1mL tinh bột, 5mL acid sulfuric và chuẩn
độ với I2 0,02N cho đến khi có màu xanh nhạt. .................................................................67
3.3.11 Mật độ tế bào [3]................................................................................................67
Đối với nấm men trong dòch lên men: pha loãng mẫu rồi sau đó đếm trên buồng đếm
Thoma...................................................................................................................................67
Đối với nấm men cố đònh: rã hạt bằng dung dòch EDTA 5%, sau đó pha loãng mẫu đến
nồng độ cần thiết rồi đếm trên buồng đếm Thoma............................................................67
KẾT QUẢ và BÀN LUẬN...........................................................68
3.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ
TRÌNH LÊN MEN RƯU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL
ALGINATE..........................................................................................................................68
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng
của nấm men....................................................................................................................68
Mật độ tế bào nấm men cố đònh cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần
lượt là 155,13.106 tế bào/mL và 222,5.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại

của nấm men cố đònh ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,248 và
0,344 h-1. .............................................................................................................................68
Mật độ tế bào nấm men tự do cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần
lượt là 164,06.106 tế bào/mL và 240,63.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại
của nấm men tự do ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,458 và
0,764 h-1. .............................................................................................................................68
Khi nồng độ cơ chất đạt đến một giá trò tới hạn nào đó, hoạt độ nước giảm và xảy ra sự
co tế bào chất làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men [12]................................68
Patterson và cộng sự (1995) cho rằng áp suất thẩm thấu cao làm bất hoạt các enzyme
quan trọng đảm nhiệm nhiệm vụ sao mã DNA [123].........................................................68
Cheftel (1995) thì cho rằng khi tế bào chòu áp lực thẩm thấu cao, pH nội bào giảm đi 0,2
đơn vò. Do đó, hoạt động của nấm men sẽ bò ức chế vì pH nội bào thấp [123].................68
Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu do
hàm lượng đường cao gây ra. Trong khi nấm men tự do phải tiếp xúc ngay với môi trường
có hàm lượng đường cao thì nhờ có lớp chất mang, nấm men cố đònh tiếp xúc chậm hơn,
do đường cần có thời gian để khuếch tán từ bên ngoài vào bên trong chất mang, nhờ đó
nấm men cố đònh ít bò ức chế hơn [12]................................................................................70
Theo Vieira và cộng sự (1989), khả năng chòu đựng đối với áp lực thẩm thấu của
glucose càng tăng khi môi trường chứa càng nhiều ion Ca2+ và/hoặc Zn2+ [198]. Như
vậy, do cố đònh trong gel Ca-alginate nên trong môi trường lên men của nấm men cố đònh
xv
Luận văn tốt nghiệp
chứa nhiều ion Ca2+ hơn so với nấm men tự do, do đó mà khả năng chòu đựng áp lực
thẩm thấu cao hơn................................................................................................................70
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sử dụng cơ
chất trong quá trình lên men............................................................................................71
Hàm lượng đường sót thấp hơn. Đặc biệt ở những giá trò hàm lượng đường ban đầu cao
(320 – 360g/L) thì hàm lượng đường sót trong dòch lên men bởi nấm men cố đònh thấp
hơn hẳn.................................................................................................................................74
Tốc độ sử dụng đường cực đại cao hơn và thời gian để tốc độ sử dụng đường đạt đến giá

trò cực đại cũng ngắn hơn.....................................................................................................74
Tốc độ sử dụng đường riêng cao hơn hẳn..........................................................................74
Tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn. Đặc biệt ở những giá trò hàm lượng đường
ban đầu cao (320 – 360g/L) thì tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn hẳn. Giá trò tốc
độ sử dụng đường trung bình cũng là giá trò biểu thò năng suất sử dụng đường của nấm
men.74
Thời gian lên men ngắn hơn. Đặc biệt ở những giá trò hàm lượng đường ban đầu cao
(320 – 360g/L) thì thời gian lên men ngắn hơn hẳn............................................................74
Như đã trình bày ở phần trên, nấm men cố đònh có khả năng sử dụng cơ chất tốt hơn so
với nấm men tự do...............................................................................................................76
Theo Boulton và cộng sự (1996) thì trong suốt quá trình lên men, các hợp chất amino
acid và ammonium được hấp thu khi Saccharomyces cerevisiae bắt đầu phát triển và
chúng được tàng trữ trong không bào cho đến khi cần sử dụng. Saccharomyces có thể tích
lũy một lượng lớn các amino acid trong không bào và sau đó sử dụng các hợp chất này
khi chúng cần đến bằng cách điều chỉnh sự giải phóng amino acid từ không bào vào tế
bào chất [85]. Theo Pardonova và cộng sự (1986), khi cố đònh nấm men trong chất mang
alginate, do ảnh hưởng của chất mang và quá trình cố đònh nên kích thước không bào sẽ
tăng [138]. Do đó, nấm men cố đònh có khả năng tích lũy nitơ nhiều hơn so với nấm men
tự do......................................................................................................................................76
Đối với nấm men cố đònh, trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 360g/L, trong
dòch lên men còn sót lại một ít nitơ ammonium (4,25mg/L) thì trong tất cả các trường hợp
còn lại, hàm lượng nitơ gần như bằng 0 sau 60h lên men...................................................77
Đối với nấm men tự do, khi hàm lượng đường nằm trong khoảng 200 – 240g/L thì sau
60h lên men, hàm lượng nitơ ammonium gần bằng 0. Khi hàm lượng đường tăng lên đến
280g/L thì thời gian để hàm lượng nitơ ammonium được sử dụng hết bởi nấm men là 84h,
còn khi hàm lượng đường là 320g/L thì thời gian này là 108h. Đặc biệt, khi dòch nho chứa
360g/L đường, nitơ ammonium không được sử dụng hết, hàm lượng nitơ ammonium còn
sót lại trong môi trường là 13mg/L......................................................................................77
3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình tạo sản phẩm
78

Được bao bọc và bảo vệ bởi lớp vật liệu gel [113, 150, 206, 117, 133]...........................79
Có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm tăng khả năng
giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206].......................................79
Có hoạt tính enzyme ADH cao hơn [59]...........................................................................79
xvi
Luận văn tốt nghiệp
Nấm men cố đònh có khả năng sử dụng đường tốt hơn so với nấm men tự do nên hàm
lượng đường sót trong dòch lên men còn thấp, do đó nấm men cũng như vi khuẩn ít có khả
năng sử dụng đường để chuyển hóa thành các loại acid dễ bay hơi (acid acetic là acid dễ
bay hơi chiếm ưu thế)...........................................................................................................84
Quá trình cố đònh ảnh hưởng đến hình thái và hoạt động trao đổi chất của nấm men nên
đã làm giảm khả năng chuyển hóa đường thành acid acetic của nấm men.......................84
Dòch lên men bằng nấm men cố đònh có pH thấp hơn so với dòch lên men bằng nấm men
tự do. Mà như chúng ta đã biết, rượu vang pH thấp có độ bền sinh học và độ bền hóa lý
cao hơn rượu vang pH cao, đồng thời cường độ màu và độ bền màu cũng cao hơn [59].
Khi pH thấp, SO2 ở dạng tự do nhiều hơn, do đó mà khả năng ức chế vi khuẩn và nấm
men dại cũng tốt hơn............................................................................................................84
Dòch lên men bằng nấm men cố đònh có hàm lượng acid dễ bay hơi thấp hơn so với nấm
men tự do. Mà như chúng ta cũng đã biết, acid dễ bay hơi là hợp chất không mong muốn
trong sản xuất rượu vang. Dựa trên quan điểm này chúng tôi cho rằng nấm men cố đònh
tạo ra rượu vang có chất lượng tốt hơn so với nấm men tự do. Kết quả này cũng giống với
kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Bardi và cộng sự (1996), Tsakiris và cộng
sự (2004),… [18, 196]...........................................................................................................84
3.4.4 Kết luận chung......................................................................................................85
Mật độ tế bào cực đại và tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của tế bào cố đònh thấp hơn so
với tế bào tự do....................................................................................................................85
Tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp cồn của nấm men cố đònh cao hơn
so với nấm men tự do nhưng hiệu suất sinh tổng hợp cồn thì không cao hơn. Nấm men cố
đònh đặc biệt chiếm ưu thế so với nấm men tự do khi dòch nho có hàm lượng đường ban
đầu cao (320 – 360g/L)........................................................................................................85

Khả năng sử dụng nitơ ammonium cũng như nitơ hữu cơ của tế bào cố đònh cao hơn so
với tế bào tự do. ..................................................................................................................85
pH và acid tổng của dòch lên men bằng nấm men cố đònh thấp hơn, do đó làm tăng độ
ổn đònh về mặt hóa lý và sinh học cho sản phẩm...............................................................85
Hàm lượng acid dễ bay hơi tạo thành bởi nấm men cố đònh thấp hơn, do đó chất lượng
sản phẩm được cải thiện. ....................................................................................................85
3.5 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯNG TANNIN ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ
TRÌNH LÊN MEN RƯU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL
ALGINATE..........................................................................................................................86
3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sinh trưởng
của nấm men....................................................................................................................86
Đối với nấm men cố đònh, khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 17,8g/L thì mật độ tế bào
nấm men cực đại giảm từ 223.106 tế bào xuống còn 190,78.106 tế bào. Tốc độ sinh
trưởng riêng cực đại cũng giảm từ 0,340 xuống còn 0,371 h-1..........................................86
Đối với nấm men tự do, khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 17,8g/L thì mật độ tế bào
nấm men cực đại giảm từ 240,63.106 tế bào xuống còn 178,7.106 tế bào. Tốc độ sinh
trưởng riêng cực đại cũng giảm từ 0,682 xuống còn 0,052 h-1..........................................86
Yajima và Yokotsuka (2001) cho rằng tannin hấp phụ lên bề mặt nấm men, do đó làm
ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển các chất qua màng [208].........................................86
xvii
Luận văn tốt nghiệp
Wauters và cộng sự (2001b) thì cho rằng acid tannic ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp
chuỗi hô hấp (functional respiratory chain), dẫn đến hiện tượng thiếu hụt sắt, do đó làm
giảm tốc độ sinh trưởng của nấm men [204].......................................................................86
Một giả thuyết khác là acid tannic ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các acid béo không
no và/hoặc sterol, do đó làm giảm khả năng hấp thu O2 của nấm men, vì thế tốc độ sinh
trưởng của nấm men giảm. Hoặc cũng có thể acid tannic liên kết mạnh với các thành
phần này (đây là các lipid màng) nên đã làm giảm khả năng hấp thu O2 (Wauters và
cộng sự, 2001a,2001b; Mazauric và Salmon, 2005) [95, 203, 204]....................................86
3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sử dụng cơ

chất trong quá trình lên men............................................................................................88
Hàm lượng đường sót thấp hơn..........................................................................................91
Tốc độ sử dụng đường cực đại cao hơn và thời gian để tốc độ sử dụng đường đạt đến giá
trò cực đại cũng ngắn hơn.....................................................................................................91
Tốc độ sử dụng đường riêng cao hơn hẳn..........................................................................91
Tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn.........................................................................91
Thời gian lên men ngắn hơn..............................................................................................91
3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình tạo sản phẩm
93
3.5.4 Kết luận chung......................................................................................................99
Khi hàm lượng tannin thấp (1,8 – 2,8g/L) thì mật độ tế bào cực đại và tốc độ sinh trưởng
riêng cực đại của tế bào cố đònh thấp hơn so với tế bào tự do. Nhưng khi hàm lượng
tannin cao thì mật độ tế bào cực đại và tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của tế bào cố
đònh lại cao hơn so với tế bào tự do. Như vậy, khả năng sinh trưởng của nấm men cố đònh
ít bò ảnh hưởng bởi hàm lượng tannin hơn so với nấm men tự do.......................................99
Tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp cồn của nấm men cố đònh cao hơn
so với nấm men tự do nhưng hiệu suất sinh tổng hợp cồn thì không cao hơn. ..................99
Khả năng sử dụng nitơ ammonium cũng như nitơ hữu cơ của tế bào cố đònh cao hơn so
với tế bào tự do. ..................................................................................................................99
pH và acid tổng của dòch lên men bằng nấm men cố đònh thấp hơn, do đó làm tăng độ
ổn đònh về mặt sinh học và hóa lý cho sản phẩm...............................................................99
Hàm lượng acid dễ bay hơi tạo thành bởi nấm men cố đònh thấp hơn, do đó chất lượng
sản phẩm được cải thiện......................................................................................................99
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................100
4.1 KẾT LUẬN.................................................................................................................100
Thời gian lên men rút ngắn rất nhiều..............................................................................100
Tốc độ sử dụng đường và tốc độ sinh tổng hợp cồn cao hơn; đặc biệt tốc độ sử dụng
đường riêng và tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng thì cao hơn nhiều....................................100
pH và hàm lượng acid tổng thấp hơn, do đó giúp cải thiện độ bền hóa lý và sinh học cho
sản phẩm............................................................................................................................100

Hàm lượng acid dễ bay hơi thấp hơn, do đó giúp cải thiện chất lượng sản phẩm.........100
4.2 KIẾN NGHỊ.................................................................................................................100
Khảo sát thêm động học hình thành các hợp chất hương...............................................100
xviii
Luận văn tốt nghiệp
Khảo sát thêm ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ quan trọng khác như: mật độ cấy,
nhiệt độ lên men, hàm lượng nitơ ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang. 100
Khảo sát khả năng tái sử dụng của nấm men cố đònh trong chất mang alginate...........100
Tối ưu hóa quá trình lên men và tiến hành sản xuất thử ở quy mô lớn.........................100
Khảo sát việc cố đònh nấm men trên các loại chất mang mới, đặc biệt là các chất mang
trái cây như táo, lê, mộc qua,............................................................................................100
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................101
xix
Luận văn tốt nghiệp
Danh mục các bảng
Chương 2: TỔNG QUAN .................. Error: Reference source not found
Bảng 2.1: Thành phần của dòch nho và rượu vang thông thường [199]..3
Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dòch nho đỏ
và rượu vang đỏ [167]..................................................................6
Bảng 2.3: Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [85].............10
Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố đònh tế bào (còn nữa)..................13
Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố đònh nấm men trong sản
xuất rượu vang (còn nữa)............................................................15
Bảng 2.6: Tốc độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nấm
men cố đònh trong gel alginate và nấm men tự do [74].....................28
Bảng 2.7: Các hợp chất hương chính của rượu vang tạo bởi nấm men cố
đònh và nấm men tự do trong khoảng nhiệt độ 15 – 20oC [113]........31
Bảng 2.8: Thành phần của rượu vang trắng lên men bằng 4 loại nấm
men cố đònh trong gel alginate và nấm men tự do [208]....................32
Bảng 2.9: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá

trình lên men trong quá trình lên men tónh rượu vang ở 30oC bởi tế bào
cố đònh sấy thăng hoa (freeze-dried gluten supported biocatalyst – FGB),
tế bào tự do sấy thăng hoa (freef reeze-dried cells – ffdc) và tế bào cố
đònh chưa qua sấy (wet gluten supported biocatalyst – WGB) [93].......36
Bảng 2.10: Các nguyên nhân cơ bản gây ra hiện tượng kéo dài thời gian
lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn
rất cao [85, 170, 26, 163]..........................................................46
Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dòch nho bởi
nấm men cố đònh trên kissiris, γ-alumina và alginate tại 7, 13 và 27oC
[14] 49
Bảng 2.12: Các hợp chất dễ bay hơi tạo thành trong suốt quá trình lên
men liên tục rượu vang sử dụng nấm men cố đònh trên miếng táo và quá
trình lên men tónh sử dụng nấm men tự do. Quá trình lên men được thực
hiện ở 30oC [112].....................................................................50
Bảng 3.13: Thành phần của dòch nho sau khi ép.............................54
Bảng 3.14: Các chất bổ sung vào dòch nho khi khảo sát ảnh hưởng của
hàm lượng đường ban đầu đến quá trình lên men............................58
Bảng 3.15: Các chất bổ sung vào dòch nho khi khảo sát ảnh hưởng của
hàm lượng tannin ban đầu đến quá trình lên men............................58
xx
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 4.16: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh
trưởng riêng cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang,
sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate..........70
Bảng 4.17: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng
đường sót trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và
nấm men cố đònh trong gel alginate...............................................71
Bảng 4.18: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate..............72

Bảng 4.19: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate.....................73
Bảng 4.20: Độ lên men ứng với hàm lượng đường ban đầu khác nhau.73
Bảng 4.21: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên
men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel
alginate. 74
Bảng 4.22: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................75
Bảng 4.23: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng
cồn đạt được trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do
và nấm men cố đònh trong gel alginate...........................................78
Bảng 4.24: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................79
Bảng 4.25: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate.....................80
Bảng 4.26: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn trung bình của nấm men trong quá trình lên men rượu
vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate...81
Bảng 4.27: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh
tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do
và nấm men cố đònh trong gel alginate...........................................83
xxi
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 4.28: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh
trưởng riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................88

Bảng 4.29: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng
đường sót trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và
nấm men cố đònh trong gel alginate...............................................89
Bảng 4.30: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................89
Bảng 4.31: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường riêng cực đại (chỉ xét cho giá trò cực đại đầu tiên) trong quá
trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh
trong gel alginate.......................................................................90
Bảng 4.32: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên
men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel
alginate. 91
Bảng 4.33: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................92
Bảng 4.34: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................94
Bảng 4.35: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn riêng cực đạitrong quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate.....................94
Bảng 4.36: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................95
Bảng 4.37: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh
tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do
và nấm men cố đònh trong gel alginate...........................................96
xxii
Luận văn tốt nghiệp

Danh mục các hình vẽ
Chương 2: TỔNG QUAN .................. Error: Reference source not found
Hình 2.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b, c)..........................................4
Hình 2.2: Cơ chế của quá trình biến đổi các hợp chất nitơ bởi nấm men
[85] 6
Hình 2.3: Các acid không bay hơi trong rượu vang: a) acid citric, b)
acid tartaric, c) acid malic, d) acid succinic, e) acid lactic...................6
Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của acid tannic .....................................8
Hình 2.5: Các kỹ thuật cơ bản để cố đònh tế bào [113]....................12
Hình 2.6: Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi
alginate, (c) sự phân bố các block [186]........................................20
Hình 2.7: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên
ngoài [186]...............................................................................21
Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên
trong [186]...............................................................................22
Hình 2.9: Con đường hình thành các chất tạo hương vò cho rượu vang
[85] 30
Hình 2.10: Hàm lượng ethanol (P) thay đổi theo thời gian ứng với các
nồng độ cơ chất khác nhau. Hàm lượng glucose ban đầu (g/L): ο, 51;  ,
103; ∆, 136; •, 204; , 251; , 297 [12]...................................33
Hình 2.11: Tốc độ sử dụng glucose cực đại (dS/st) ( ) và tốc độ tạo
thành ethanol cực đại (dP/dt) (ο) khi hàm lượng đường thay đổi [12]. .33
Hình 2.12: Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian. Hàm lượng
đường ban đầu (g/L): .................................................................34
Hình 2.13: Sự sử dụng glucose trong suốt quá trình lên men. -ο ο- nấm
men tự do; -•-•- nấm men cố đònh trong gel agar [91]......................34
Hình 2.14: Khả năng tạo cồn của nấm men trong suốt quá trình lên
men. -ο ο- nấm men tự do; -•-•- nấm men cố đònh trong gel agar [91]35
Hình 2.15: nh hưởng của pH đến tốc độ lên men của nấm men cố
đònh () và nấm men tự do (o). Tốc độ lên men tương đối được tính

bằng phần trăm so với tốc độ lên men cực đại [98].........................37
Hình 2.16: nh hưởng của pH đến khả năng sống sót của nấm men cố
đònh () 37
Hình 2.17: nh hưởng của pH đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt
quá trình lên men: , pH 2,80;  pH 3,0;  pH 3,25;  pH
xxiii
Luận văn tốt nghiệp
3,50;  pH 3,70. Các ký hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với nấm men
cố đònh và nấm men tự do [208]..................................................38
Hình 2.18: nh hưởng của hàm lượng SO2 đến quá trình lên men rượu
vang trắng (được đặc trưng bởi độ lên men, tính theo % so với hàm
lượng chất khô ban đầu) [69]......................................................39
Hình 2.19: nh hưởng của SO2 đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt
quá trình lên men: , không bổ sung;  64mg/L;  101mg/L;
 192mg/L;  325mg/L. Các ký hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với
nấm men cố đònh và nấm men tự do [208].....................................40
Hình 2.20: nh hưởng của tannin đến hàm lượng cồn tạo thành trong
suốt quá trình lên men:  477mg GAE/L;  667 mg GAE/L; 
920 mg GAE/L;  1246 mg GAE/L;  2178 mg GAE/L. Các ký
hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với nấm men cố đònh và nấm men tự do
[208]. 41
Hình 2.21: nh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng cồn tạo
thành trong suốt quá trình lên men:  10oC;  15oC;  20oC;
 25oC;  30oC;  40oC. Các ký hiệu rỗng và đặc lần lượt
ứng với nấm men cố đònh và nấm men tự do [208]..........................42
Hình 2.22: nh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men
rượu vang sử dụng nấm men cố đònh trên DCM và nấm men tự do [17].
43
Hình 2.23: Sự chuyển hóa acid malic bởi nấm men tự do và nấm men
Schizosaccharomyces pombe cố đònh khi sử dụng các hàm lượng đường

ban đầu khác nhau [126]............................................................45
Hình 2.24: Động học của quá trình lên men rượu vang ở những nhiệt độ
khác nhau sử dụng nấm men cố đònh trên gluten. Dòch nho có nồng độ
chất khô ban đầu là 204g/L, sử dụng nấm men cố đònh trên gluten sấy
th ng hoa (FGB 1,2), nấm men tự do sấy th ng hoa (ffdc) (các chữ số 1ă ă
và 2 là lên men lặp lại lần thứ nhất và lần thứ 2) [93]......................48
Hình 3.25: Quy trình ép nho.......................................................53
Hình 3.26: Sơ đồ nghiên cứu.......................................................55
Hình 3.27: Quy trình cố đònh nấm men trong gel alginate bằng phương
pháp tạo gel từ bên ngoài............................................................56
Hình 4.28: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men
rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel
xxiv