phương pháp lên men bề mặt

Nhom:
TRAN DUY TIEN
MAI HOANG VU
NGUYEN QUOC CUONG
Mục lục:
Phần I: Tổng quan về enzym amylase
I.Amylase là gì?
II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
II.1.Đặc tính của enzym α-amylase
II.2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
III. Lịch sử phát hiện eznym
Phần II: Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
I.Vai trò của giống trong công nghệ enzym
II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzym
III.Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
IV.Qúa trình phân lập giống VSV
IV.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae
VI. Phương pháp bảo quản giống VSV
VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh
VI.2. Bảo quản giống trong đất hay trong cát
VI.3. Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase
I.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
I.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt
I.1.1. Môi trường lỏng
I.1.2. Môi trường đặc
I.2. Qui trình sản xuất nấm mốc giống
I.2.1. Nguyên liệu

I.2.2.Chuẩn bị mốc giống
I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng
I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác
I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay
I.2.3. Qui trình sản xuất
II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
II.1. Nguyên liệu
II.2. Qui trình công nghệ
II.3. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae
II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm
II.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym
II.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Phần IV : Ứng dụng và kết luận
I.Ứng dụng
I.1.Ứng dụng amylase trong sản xuất bia
I.2. Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn
I.3.Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc
I.4.Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt
II.Kết luận
Phần V: Phụ lục và tài liệu tham khảo

Lời giới thiệu:
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong
kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn
tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và
khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công
đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó,
chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều
sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ,
amino acid,….

Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ
hoá và giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên,
trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng
acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô
cơ như HCl và H
2
SO
4
. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó
kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp
ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym
để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều
ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở
nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase
càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện
nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà
không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là
các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài
ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột:
Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí
cho quá trình tinh sạch dịch đường.
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp
nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,
… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở
nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho
nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm
mềm vải,…

Phần I: Tổng quan về enzym amylase

I.Amylase là gì?
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội
phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R’ + H-OH  RH + R’OH
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( enzyme nội
bào ) và exoamylase ( enzyme ngoại bào ).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase
( hay α-dextrin 6 – glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-
1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các
liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme
thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
 Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
• Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại
củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt
và có công thức tổng quát là (C
6
H
12
O
6
)
n
.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều
có cấu tạo từ amylase và amylopectin ( Meyer, 1940 ). Các loại tinh bột đều
có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được
xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
-Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ

200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo
thành một mạch xoắn dài không phân nhánh.
-Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da,
được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-
glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không
tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-85
0
C ) thì
tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột . Dưới tác dụng của enzyme
amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy
phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và đường
hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi
dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose.
-Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan
trọng cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và
tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose.
Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp
chủ yếu là đường và tinh bột.
• Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ
trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase
có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV,
glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-
glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-
glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong
khoảng 2 triệu-3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn
quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất
béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan.
II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
II.1.Đặc tính của enzym α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác

nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase
là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các
glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu
thành nên phân tử enzyme:
- α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da
( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ).
- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của
globuline.
-Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).
-α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa
1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca
tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt
động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn
tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của
các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó
sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt
độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca
trong phân tử và nồng độ Mg
2+
. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các
kim loại nặng như Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. Một số kim loại như :Li
+

, Na
+
, Cr
3+
, Mn
2+
,
Zn
2+
, Co
2+
, Sn
2+
, Cr
3+,
không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase.
Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau
( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3;
Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan=
4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9;
amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ). Không giống các α-amylase khác,
amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose
này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol
enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ,
song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt
động và nằm ở phía trong phân tử enzyme.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị
thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và
maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) .
Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và

maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau:
G5 G4+G1; G6 G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít )
α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của
amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân
nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo
thành dextrin tới hạn phân nhánh.
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase
nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-
amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường
lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose
và maltose có thể lên tới 84-87%.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường
không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là
4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ). Theo số liệu của
Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm
amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì
pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của
Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn
Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0
o
C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau
15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực
của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova,
Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH=
5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-
2,8.Ở 0
o
C và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn

khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối
với tác động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 50
0
C và bị vô hoạt ở
70
O
C( Kozmina, 1991 ).
Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với
tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40
0
C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa
của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 50
0
C trong 2 giờ,
α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ).
II.2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ). α-amylase từ các nguồn
khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách
các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột
hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-
amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột
nguyên song với tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất
bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ
nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch
hóa nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp
tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với
iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới

disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị
phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy,
người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc
glucopiranose 1 ).
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân
của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên
amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-
1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác
dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và
19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông
thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao
của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại
amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose

III.Lịch sử phát hiện eznym
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra
quá trình lên men.
Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết

của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ
thường.
Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm ở dạng dung dịch và lịch
sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây.
α-amylase
Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen
và Pessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có
thể tách được ở dạng bột.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa
đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa.
Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu
đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa. Danh từ diastase (từ chữ Latinh
diastasis - phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme lúc bấy giờ.
Phần II: Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus
Oryzae

Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường.
Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp.
Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức
và phương diện thì khác nhau hoàn toàn.
Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn
của VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự
nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức
tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên
men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng.
Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm
kém không đồng nhất.
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân
lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh
học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn

( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn
giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng
sản phẩm được cải thiện .
I.Vai trò của giống trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy
- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là
hoạt tính enzyme)
- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất
- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm
Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV
II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và
được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong
công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định.
Đó là:
- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này
phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá
trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp
hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể
VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại
khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì
sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
- Giống phải cho năng suất sinh học cao.
- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh
trong điều kiện sản xuất công nghiệp.
- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ
kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.

- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng
tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.
 Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên
men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.
III. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Condium of Aspergillus oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp
Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm
những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách
ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm
ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có
cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2
mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng
lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài,
gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những
bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có
màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được
rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển
có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu
sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện
thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.

IV.Qúa trình phân lập giống VSV
VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường
đến nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất
hữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật,

trong cơ thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có
nhiệt độ cao. VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường.
Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong
hoàn cảnh khắc nghiệt nhất.
Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme
thì có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách
phân lập cho phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu
điểm riêng biệt. Sau đây là 1 số ưu điểm:
IV.1.Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
-Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh
được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để
chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế
bào. Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô
sản xuất công nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh.
-Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với
hàng loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác
nên VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn.
-Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự
khác biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong
điều kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã
quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng
ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi
trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi
với điều kiện sản xuất công nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với điều
kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết.
-Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó

thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và
đặc điểm này để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV
sinh tổng hợp enzyme mà ta cần.
Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease
cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân
lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều
tinh bột trong tự nhiên.
-Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV,
VSV trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến.
Những đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ
hai là nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất
cao. Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến
hành. Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền
vững. Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp.
IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
-Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi
với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần
qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
-Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những
giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc
điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.
-Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men,
dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả
năng thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất
cao.
IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có
thể rất nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào
không bị thoái hoá. Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt
được những kết quả tốt.

V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay
có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là
giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo
chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả
đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng
thí nghiệm.
Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai
tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng
khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào
bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml
nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu.
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông
nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng.
Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10
-3
, 10
-4
ở những ống nghiệm tiếp
theo.
Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc
cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar).
Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ
ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ

xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi
cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống
thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có
thể dự trữ trong máy làm đông.
-Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H
2
O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch
huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác
có chứa môi trường sinh trưởng của nấm.
KH
2
PO
4
1,4 MgSO
4
.7H2O 0,1
NH
4
NO
3
10 FeSO
4
.7H2O 0,01 PH =
6,5
KCl 0,5 hồ tinh bột 20

Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng
bởi Autoclave ở 121
0
C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau
đó đem ủ ở 25 – 30
0
C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi
nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ,
để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo
quản thích hợp.
VI. Phương pháp bảo quản giống vsv
Mục đích của bảo quản giống VSV dùng trong sản xuất enzym là đảm
bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn định của hoạt tính
enzym. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau:
VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh
Phương pháp dựa trên nguyên tắt là VSV sẽ hạn chế quá trình trao đổi
chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian
này VSV có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzym.
Cách thực hiện: Ống giống VSV được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm
có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng
cho sản xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản.Có thể làm thêm
hai ống để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công
tác bảo quản giống.