Nghiên cứu thành phần hóa học của cây giảo cổ lam thu hái ở sapa

BỘ
Y TẾ
TRƯỜNG ĐAI HOC D ươc HÀ NÔI
TRẦN THỊ THU HƯƠNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
CÂY GIAO CỔ LAM THU HÁI ở SA PA
(Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dẫn: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ
DS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện'. Bộ môn Dược liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: Từ 2/2006 đến 5/2006
í'ệ AO
HÀ NỘI, 05/ 2006
i
1'
m
Lrời eẩm ctei
Çîm ng. Auô't q u á trình , làn t k íu ỉú luận, tế t tt g h iè flf lồ i đ ă nÍLỘ ti đượ^ ru t
n h iề u lự ạ iú p , đs^ tù ’ th ầ ự e à, g ia đ ìn h OÁ bạn. bè. Qíliiữnq. giú p . q u ặ Ixáu «//
ită ạ iú p . t ồ i kữ àtt tỉứ u iỉt k íiứ ă luận, nàtj-, đ ền ạ . t ít ề i eă nạ . eíto^ t ồ i h iể u biết tíiên t
n h iề u đlỀuL a ề e áe h tư duụ. tm ng. eồnạ. ũiịe. n ạ h iêtt eứu UÍVỠCL hứe QUiAn. íiíp ,
nàụ. tỗ i x ln . bàụ. tấ lồn g, b iA ơti íâ u sẮe tố i:
-ộ cỹ.Q <?. ^ ỉu ụ n . ^ í t a n ít ^Cỳ-f n ạ ư ề l ÇîliÂg, đ ă tậ n tìtÚL e íti hảe^, tạ a Ittọi
itiề u k iê n tn ia ii¿ f t h ư â n ạ . ílẫ n . t ô i h o à * t th à n h tú iú ă . lu â n .
Œ iS. ^ h ạ n t Çîuun. c/Ịn h , là nợẨĨỜi ĩtã q iÚ Ịt ỉĩõ tời ttltiều tmtuf. q u á tr ìn h
thựa h iề n k íiỡ á Lu ận .
Qơ/ eứ/tỹí æ//i e/iấ/i ỉ/ià /t/i eảftt đn Q< ỹ. Q uự ên .
e ù ỉtự . e á e Ỉ Â ầ ự e Ạ ạ / ếú%,
<3ếá?

ủ ậ . f/u ỉậ / e ù ê / i e ử a ( B đ ntởH. ^ u ị / e < ^ ’ê u , e á e p / ư h t ỹ í
Ế/in, ạ /a ^ / ỉ/ i eù/tự^ âạft óề ^ ạ /ú/i ỉ ạ/% m rỉ/ . í ĩ ĩẨ u Ắĩ/ẻ/t //tu ậft ¿f/ỉ. e/m /rĩí
/i4ĩàft ư t à ề t / t ÂÂỚÚ ¿ l i ậ ii n ừ ự
Hà nội, ngày 18 tháng 5 năm 2006.
Sình viền
Q m t t ^ á u i.
MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề 1
Phần I: Tổng qu an 2
1.1. Vị trí phân loại của cây Giao cổ lam 2
1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Gynostemma 2
1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Gynostemma

2
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi
Gynostemma 3
1.3. Thành phần hoá học cây Giảo cổ lam

4
1.4. Tác dụng và công dụng
6
1.4.1. Tác dụng dược lý 6
1.4.2. Công dụng 8
1.5. Những kết quả nghiên cứu cây Giảo cổ lam ở Việt N am

9
1.5.1. Về thực vật 9
1.5.2. Đặc điểm vi học
9
1.5.3. Về hoá học 10

1.5.4. Về độc tính và tác dụng sinh học 11
Phần II: Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu

13
2.1. Nguyên liệu 13
2.2. Phương tiện nghiên cứu 13
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất

13
2.2.2. Dụng cụ 13
2.2.3. Phương tiện và máy móc 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu
14
Phần III: Thực nghiệm và kết quả 16
3.1. Định tính các nhóm chất trong lá, thân Giảo cổ lam 16
3.1.1. Định tính Aavonoid
16
3.1.2. Định tính alcaloid
16
3.1.3. Định tính saponin
17
3.1.4. Định tính glycosid tim
18
3.1.5. Đinh tính coumarin
18
3.1.6. Định tmh tanin
19
3.1.7. Định tính anthranoid 20
3.1.8. Định tính chất béo, caroten, sterol

20
3.1.9. Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin
21
3.2. Quy trình chiết xuất các nhóm chất trong lá và thân cây Giẩo cổ lam 23
3.3. Định lượng cắn các phân đoạn 25
3.4. Định tính cắn các phân đoạn 26
3.4.1. Định tứih bằng phưoĩig pháp hoá học
26
3.4.2. Định tính bằng SKLM.„

26
3.5. Phân lập các chất trong phân đoạn EtOAc
29
3.5.1. Phân lập 29
3.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết của Vị và C3 29
3.6. Nhận dạng chất phân lập được 32
3.6.1. Nhận dạng Vị 32
3.6.2. Nhận dạng C3 33
3.7. Bàn luận 34
Phần IV: Kết luận và đê xuất
36
4.1. Kết luận 36
4.2. Đề xuất 37
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
ữ viết tắt
Viết đầy đủ
As
Ánh sáng
Dc

Dịch chiết
Dd
Dung dịch
EtOAc
Ethylacetat
HI
Hàm lượng
KI
Khối lượng
IR
Infra Red Spectroscopy
MS
Mass spectroscopy
n-BuOH
Buthanol
NMR
Nuclear magnetic resonance
Pư
Phản ứng
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
Tb
Trung bình
TT
Thuốc thử
u v
Ultra violet spectroscopy
ĐẶT VẤN ĐỂ
Trong xã hội ngày nay, xu hướng chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của con
người bằng những sản phẩm từ thiên nhiên ngày càng gia tăng. Việt Nam nằm

trong vùng khí hậu nhiệt đới có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng. Nhân
dân ta đã biết sử dụng cây cỏ làm thuốc phòng và chữa bệnh từ lâu đời. Song
cho tới nay cây cỏ vẫn còn nhiều bí ẩn, việc sử dụng chúng phần lớn theo kinh
nghiệm dân gian hoặc theo y học cổ truyền, còn rất nhiều câv thuốc, bài thuốc
chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa đầy đủ và kỹ lưỡng. Vì vậy vấn
đề nghiên cứu cây cỏ làm thuốc luồn được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Giảo cổ lam còn gọi là cổ yếm, Thất diệp đởm đã được nhân dân đùn2
làm thuốc nhưng chưa thấy ghi trong tài liệu " Những cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam" của GS.TS. Đỗ Tất Lợi [15] cũng như tài liệu" Cây cỏ thườns thấy
ở Việt Nam" của Lê Khả Kế [13]. GS.TS. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã lấv
mẫu Giảo cổ lam ở Cao Bằng tiến hành nghiên cứu về đặc điểm thực vật, bước
đầu nghiên cứu về thành phần hoá học, thử độc tính và một số tác dụng sinh
học đã thu được một số kết quả quan trọng. Gần đây GS.TS. Phạm Thanh Kỳ
mới thu hái được mẫu Giảo cổ lam ở Sa Pa. Để tìm hiểu xem thành phần hóa
học cây mọc ò Sa Pa (Lào Cai) có giống cây thu hái ở Cao Bằng hay không
chúng tôi được giao thực hiện đề tài; " Nghiên cứu thành phần hoá học của
cây Giảo cổ lam thu hái ở Sa Pa" với những nội dung sau:
> Định tính các nhóm chất trong thân và lá cây Giao cổ lam.
> Chiết xuất và phân lập một số chất trong cây Giao cổ lam.
> Nhận dạng các chất phân lập được.
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CỦA CÂY GlẲO c ổ LAM
Theo các tài liệu [3], [11] cây Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, một
chi nằm trong họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí). Vị trí của chi Gynostemma trong
hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau:
Ngành Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp Magnoliopsida (Ngọc lan)
Phân k?p Dilleniidae (Sổ)
Liên bộ Violanae (Hoa tím)
Bộ Cucurbitales (Bí)

Họ Cucurbitaceae (Bầu bí)
Chi Gynostemma
Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
Makino, Cucurbitaceae. Cây còn có một số tên khác như: cổ yếm, Thư tràng 5
lá [11], Thất diệp đởm, Tiểu khổ dược (Nhật Bản), Giẩo cổ lam (Trung Quốc),
Cam trà man, Cồng la oa đổ, Biển địa sinh căn, Giao dịch lam [14].
1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN Bố CHI GYNOSTEMMA
1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Gynostemma [40]
Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá đcfn, lá khía
răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng
chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có
lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng
hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ
nhị hàn liền thành cột. Bao phấn một ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô. Nhụy: bầu
hình cầu nhỏ, 2 -3 ngăn, 2 - 3 vòi nhụy vói đầu nhụy chia 2 -3 đầu nhọn. Quả
hình cầu, lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 - 3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc
có 3 góc. Hạt sần sùi,
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma
Gynostemma pentaphyllum [11]; Cây thảo mọc leo yếu, không lông, vòi
đơn. Lá kép có cuống chung dài 3 - 4 cm; phiến do 5 - 7 lá chét với mép có
răng dài 3 - 9 cm, rộng 1 ,5 -3 cm. Cây khác gốc; chùy hoa thòng. Hoa nhỏ,
hình sao, ống bao hoa rất ngắn; cánh hoa rời nhau cao 2,5 cm; nhị 5, bao phấn
dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy. Quả khô, tròn, đường kính 5 - 9 mm màu đen;
hạt 2-3 , treo, to 4 mm.
Hoa tháng 7 -8 . Quả tháng 9-10.
Cây mọc trên đất đá vôi, đá hoa cưcíng và đất núi lửa, trong rừng thưa,
lùm bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000 m. ở nước ta cây mọc từ
Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Thừa Thiên - Huế, Kon Turn vào
tới Đồng Nai [5], [6].
Phân bố ở Ân Độ, Xri Lanca, Mianma, Tning Quốc, Triều Tiên, Nhật

Bản, Thái Lan, Lào, Việt Nam và bán đảo Mã Lai [6]. Thu hái dây lá vào mùa
thu, phơi khô [5].
Một số loài khác trong chỉ:
Gynostemma laxum - cổ yếm lá bóng, Thư tràng thưa [5], [6], [11]: Dây
leo mảnh, lóng dài 10 — 20 cm, mỏng, mép có răng cưa nhọn, gân phụ 5 - 7
cặp, có lông mịn, hoặc không có lông. Cây có hoa khác gốc, chùy hoa ngắn
hay dài đến 30 cm; cánh hoa ròi nhau, cao 3 mm; nhị 5 dính nhau ở chỉ nhị và
bao phấn. Quả tròn, to 6 - 8 mm, hạt 2 - 3, hình trái xoan, hơi dẹt, dài và rộng
cỡ 4 mm.
Ra hoa vào tháng 5.
Phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Mianma, Äi độ, Thái lan. ở nước ta,
cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh Lào Cai, Hoà Bình, Ninh Bình và Quảng Trị.
Cây mọc leo trong các rừng thưa, savan cỏ, trên đất sét hoặc trong các rú bụi
trên núi đá vôi.
Gynostemma pedata [40]; Cây thảo, mảnh, nhẵn. Thân không tròn có
góc cạnh, bề mặt nhăn chứ không nhẵn. Lá hình chân vịt kép. Lá kép có 5 - 7
lá chét hình oval hoặc elip có đầu ừtn và gốc lá tù hoặc nhọn, mép khía răng cưa, dài
35 - 60 mm, rộng 15-25 mm, răng cưa tròn có 1 mũi nhọn ở đỉnh răng, khoảng
7 cặp gân; cuống lá chét 2 -5 rnm, cuống lá dài 3 - 4 cm. Tua cuốn đôi hoặc
chẻ đôi, mảnh. Cụm hoa đực ở nách lá, hình chùy rất mảnh, dài 11 - 16 cm;
phân nhánh với khoảng cách cách xa nhau 3 - 4 cm, các nhánh cũng dạng
chùy, có phủ lông tơ ngắn. Hoa rất nhỏ, khi nở hình sao, khi nụ hình cầu, cuống
2 mm. Đài dạng ống ngắn và đứng, phiến đài hình tam giác, dài 0,7 mm. Tràng
5, hình oval dài 2 mm, nhọn dần trên khoảng 1 mm. Nhị 1 bó, chỉ nhị hàn liền
dạng cột ngắn mở ra dạng đĩa ở trên đỉnh. Bao phấn 5, có 1 ô, đi dọc theo đĩa,
có vẻ như 2 ô. Hoa cái dạng chùy ngắn hơn hoa đực. Đài và tràng như hoa đực
nhưng lá đài ít nhọn hơn. Nhụy; bầu dưới, hình cầu thóp dần ở đỉnh, 2 - 3
ngăn, 2 - 3 noãn treo ò phần trên của ngăn, 2 - 3 vòi nhụy ngắn khác nhau
thành 2 - 3 nhỏm ít nhiều dài và khác nhau. Quả gần như nang, không mở,
hình cầu 5 - 6 mm, màu lục đen khi chín. Hạt treo, hình tim dẹt 2 bên hoặc

gần tam giác, nhăn dạng vân, dài 4 mm. Lá mầm thẳng. Rễ mầm hướng lên
đầu trên.
Cây có ở Ba Vì, Lạng Sơn, Sapa, Hà Nội, Ninh Bình, Hoà Bình.
1.3. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GlẢo c ổ LAM
Theo Võ Văn Chi [5], thành phần hoá học của Gynostemma pentaphyllum
có saponoside, flavonoid và các loại đường.
Các tài liệu [23], [31], [35] cho thấy dịch chiết phần trên mặt đất của
Gynostemma pentaphyllum có Rutin, Ombuin và 1 acid hữu cơ là acid
malonic; saponin triterpen phần aglycol có khung dammaran:
Khung dammaran
- 20R-21,24-cyclo-3 p,25-dihydroxyldammar-23(24)-en-21 -on.
- (20R,25S)-12ß,25-epoxy-20,26-cyclodammaran-3ß-diol.
- Panaxadiol.
- 2 a-hydroxypanaxadiol
- (20R,25S)-12ß,25-epoxy-20,26-cyclodammaran-3ß-ol
Theo Akihisa và cộng sự [17], đã phân lập được 1 chất 4a-metylsterol
mới có cấu trúc 4a,14a-dimethyl-5a-esgosta-7,9(ll),24(28)trien-3ß-ol.
Theo Piacente s. và cộng sự [32], bằng phưcmg pháp phổ cộng hưởng từ
hạt nhân 1 chiều, 2 chiều (II) và 2D NMR): ‘H-‘H (COSY, HOHAHA,
NOESY) và gắn đồng vị hạt nhân (HETCOR) các tác giả đã xác
định được cấu trúc của 4 glycosid có khung dammaran mới:
- 20(S),3ß,20,23trihydroxydammar-24-en-21-oicacid-21,231acton.
- epimer ở C2P 20(R).
- 20(S)dammar-23-en-3ß,20,25,26-tetraol.
- 20(S)dammar-25-en-3ß,20,21,2 tetraol.
Theo Hu L. và cộng sự [25], dịch chiết phần trên mặt đất của
cây Gynostemma pentaphyllum trong methanol có saponin triterpen. Phần
aglycol của saponin có khung dammaran mới là:
-12-oxo-2a,3ß,20(S)-trihydroxydammar-24-en.
Bằng TLC-FABMS, Lui G và cộng sự [29] đã xác định được chuỗi

glycosid của gypenoside A phân lập được từ Gynostemma pentaphyllum, sau
khi thuỷ phân gypenoside A với men cellulase có 8 vết tương ứng với gypenoside
A, A-Rham, A-Glu, A-Rham-Glu, A-Rham-Glu, A-Glu-Glu, A-Rham-2Glu, A-
Rham-2Glu. Từ đó xác định được; hai liẽn kết đường trong gypenoside A có thể là:
Rham-Glu, Glu-Glu.
Theo Cui J. và cộng sự [22], phần aglycol có khung dammaran của
gypenoside phân lập từ dịch chiết phần trên mặt đất của Gynostemma
pentaphyllum có cấu trúc giống với cấu trúc của aglycol của ginsenoside trong
nhân sâm (protopanaxadiol và protopanaxatriol).
1.4. TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG
1.4.1. Tác dụng dược lý
Theo các tài liệu [26], [27], [28] Gynostemma pentaphyllum là dược
liệu được sử dụng làm thuốc điều trị viêm gan, chứng cao huyết áp và chống
ung thư ở Đài Loan. Các tác giả đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm
và bảo vệ tế bào gan của dịch chiết phần trên mặt đất của cây Gynostemma
pentaphyllum. Kết quả cho thấy dược liệu có tác dụng chống viêm mạnh hơn
Indomethacin. Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của
tetracloruacarbon (CCI4) và acetaminophen được thể hiện rõ qua chỉ số AST
(aspartate aminotransferase) và ALT (alanine aminotransferase) giảm rõ rệt
sau khi dùng thuốc.
Dịch chiết nước của Gynostemma pentaphyllum có tác dụng kìm hãm sự
tích tụ tiểu cầu và làm đẩy nhanh quá trình làm tan cục máu đông. Kết quả cho
thấy dược liệu có tác dụng chống huyết khối trên mô hình thực nghiệm [33].
Gynostemma pentaphyllum là một trong 24 vị dược liệu của Trung
Quốc có tác dụng tới acid nucleic, protein và tế bào của bệnh nhân ung thư
phổi. Dược liệu có tác dụng tăng cường sức để kháng của cơ thể [24].
Wang C. và cộng sự đã chứng minh dịch chiết Gynostemma
pentaphyllum có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô thực
quản trên chuột. Vì vậy các tác giả cho rằng Gynostemma pentaphyllum có
tác dụng ngăn ngừa và chống lại ung thư [3 4 ].

Gynostemma pentaphylliim có tác dụng kìm hãm ung thư biểu bì
của chuột túi vàng sau khi gây ung thư bằng dimethylbenzanthracene
(DMBA). Các tác giả cũng nghiên cứu ảnh hưởng của Gynostemma
pentaphyllum tới gen đột biến tách từ khối tế bào ung thư sau khi gây
ung thư bằng DMBA. Kết quả cho thấy Gynostemma pentaphyllum có
tác dụng chống lại khối u [36], [37], [38].
Gynostemma pentaphyllum giúp hồi phục sự giảm bớt số lượns bạch
cầu, GOT, GPT, IgG trong huyết thanh chuột sau khi bị chiếu tia gamma (y).
Do vậy, dược liệu có tác dụng bảo vệ chuột tránh được sự tác động của tia bức
xạ [21].
Gynostemma pentaphyllum có tác dụng kìm hãm sự cảm ứng tia u v
của thực khuẩn lambda trong tương tác với Escherichia coli [39].
Bằng phương pháp điện hoá (electrochemical) Ma z. và Yang z. đã
nghiên cứu khả năng thu dọn gốc tự do anion Superoxide Oj“’ và hydrogen
peroxide ‘OH của Gynostemma pentaphylỉiim cho thấy kết quả khá tốt [30].
Theo li L. \ầ cộng sự [26], các gypenosid (sapcrán của cây Gynostemma
pentaphyllum) có tác dụng như là một chất chống oxy hoá lên các đại thực
bào, các microsom gan và tế bào biểu mô nội mạch. Kết quả cho thấy
gypenosid đã làm giảm các anion Superoxide và hydrogen peroxide có chứa
trong các bạch cầu trung tính của người và làm giảm sự bùng nổ oxy hoá được
khởi phát bởi zymosan chứa trong các tế bào bạch cầu đơn nhân của người và
trong các đại thực bào của chuột. Sự tăng của quá trình peroxyd hoá lipid được
khởi phát bởi Fe^7cystein, ascorbat/ NADPH hoặc hydrogen peroxide trong
các microsom gan và các tế bào biểu mô nội mạch bị ức chế bed các
gypenosid. Các tác giả cũng thấy rằng các gypenosid bảo vệ các màng sinh
học khỏi các tổn thương oxy hoá bằng cách làm đảo ngược sự giảm chất lỏns
màng của các microsom gan và các ty lạp thể (mitochondria), tăng hoạt tính
men của ty lạp thể trong các tế bào biểu mô nội mạch và giảm sự thất thoát
của men lactate dehydrogenase nội bào từ các tế bào này. Hiệu quả chốns oxy
hoá rõ rệt của các gypenosid cố thể rất có giá trị trong điều tri và phòng ngừa

nhiều bệnh như xơ vữa động mạch, bệnh gan và các triệu chứng viêm.
Các gypenosid chiết xuất từ Gynostemma pentaphyllum có tác
dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của
tetracloruacarbon (CCI4). Các tác giả cũng chỉ ra rằng gypenosid có tác
dụng bảo vệ và chống xơ hoá tế bào gan, ức chế dòng tế bào Huh-7,
Hep3B và HA22T phát triển [18], [19], [20].
Gynostemma pentaphyllum còn có trong thành phần của thực phẩm
(health food), bao gồm: Giảo C($ lam, mật ong, giấm. Dịch chiết Giảo cổ lam
tinh chế đã được các nhà khoa học Tning Quốc và Nhật Bản nghiên cứu về liều
lượng thuốc dùng trên người dưới dạng: thuốc tiêm, dung dịch uống, bột
thuốc, viên nén, chữa các bệnh về gan, bệnh tăng cholesterol máu [9].
1.4.2. Công dụng
Dược liệu có vị đắng, tính hàn, có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho
và long đờm. ở Trung Quốc dùng làm thuốc tu bổ cường tráng [5], [14]. Có
nơi như ở Quảng Tây, người ta dùng tậ ỉa chảy và dùng ngoài trị rắn cắn; còn
ở vùng núi Vân Nam, cây được sử dụng như cây cổ yếm lá bóng: chữa viêm
khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành
tá tràng, phong thấp đau nhức khớp, bệnh về tim [6 ].
Theo tài liệu [14], dược liệu có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu,
tăng sức khoẻ, chống lão suy, kháng ung thư. Tri ung thư, viêm phế quản mãn
tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm bể thận, viêm dạ dày ruột, cao huyết áp, cao
mỡ trong máu, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dày,
tiểu đường.
Bộ phận dùng là phần trên mặt đất. Liều 5-10 g.
1.5. NHŨNG KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u CÂY GlẢo c ổ LAM ở VIỆT NAM
ở Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Thanh Kỳ đã có 4
khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ và 1 luận văn Thạc sỹ dược học nghiên cứu về
cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái ở Cao Bằng. Sau đây
chúng tôi xin tóm tắt những kết quả mà các tác giả đã thu được.
1.5.1. Về thực vật [8]

Các tác giả đã mô tả đặc điểm thực vật của cây, đối chiếu với tài liệu thực
vật, GS. Vũ Văn Chuyên đã xác định tên khoa học mẫu cây nghiên cứu là:
Gynostemma pentaphylliim (Thunb.) Makino, họ Bí - Cucurbitaceae.
Các đặc điểm vi phẫu thân, lá, cuống lá cũng như đặc điểm bột dược
liệu đã được nghiên cứu nhằm góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu.
1.5.2. Đặc điểm vi học
1.5.2.1. Đặc điểm vi phẫu thân cây [4], [7], [8]
Quan sát vi phẫu thân có đặc điểm sau: thân có hình 6 cạnh, biểu bì là
những tế bào tròn, nhỏ đều đặn xếp thành hàng, thành tế bào phía ngoài hoá
ciitin. Mô dày cấu tạo bởi khoảng 2 - 3 lớp tế bào có thành dày, mô dày phát
triển ở phần lồi. Mô mềm vỏ là những tế bào hình trứng có thành dày hoá gỗ
tạo thành vòng liên tục uốn lượn theo chỗ lồi lõm của thân. Phía trong mô
cứng là mô mềm một có những bó libe gỗ xếp thành vòng tương ứng với phần
lồi của thân, Phía trong các bó libe gỗ xếp xen kẽ tạo thành vòng thứ 2. Bó
libe gỗ có mạch gỗ ở giữa và libe xung quanh, libe phát triển hơn ở phía
ngoài.
1.5.2.2. Đặc điểm vi phẫu lá [8]
Phần gân lá: Gân lá lồi nhiều về phía trên. Biểu bì trên tế bào hình chữ
nhật thường có lông che chở đa bào, các tế bào ngắn. Biểu bì dưới cấu tạo bởi
tế bào hình tròn, xếp thành hàng. Mô dày sát biểu bì trên và dưới sồm 2 - 3
lớp tế bào thành dày. Bó libe gỗ gân chính cấu tạo bởi 1 cung libe bao quanh
cung gỗ. Mô mềm gồm những tế bào thành mỏng có hình dạng thay đổi.
Phần phiến ỉá: Biểu bì trên và dưới có 1 lớp tế bào hình chữ nhật thỉnh
thoảng có lông tiết đầu đơn bào. Dưới biểu bì trên là lớp mô dậu gồm 1 - 2
hàng tế bào nhỏ. Mô mềm có 2 - 3 lớp tế bào thành mỏng.
Phần cuống lá: Cuống lá lồi phía dưới, lõm phía trên. Biểu bì là 1 lớp
tế bào tròn nhỏ xếp đều đặn thành hàng. Sát lófp biểu bì là 2 - 3 lớp tế bào mô
dày. Phía trong thường có 5 bó libe gỗ xếp thành vòng cung có tâm hơi lệch về
phía trên. Bó libe gỗ có cung libe phía ngoài bao bọc gỗ phía trong. Các tế bào
mô mềm có thành mỏng, hình dạng thay đổi.

1.5.2.3. Đặc điểm bột dược liệu [8]
Bột dược liệu có màu vàng xanh, Soi dưới kính hiển vi thấy các đặc
điểm sau: mảnh phiến lá có mạch xoắn nhỏ phân nhánh. Lông che chở đa bào.
Các mảnh biểu bì đặc biệt cấu tạo bởi các tế bào thành dày hoá gỗ. Mảnh
mạch xoắn. Sợi xếp thành bó riêng lẻ. Mảnh biểu bì lá mang lỗ khí và các
mảnh phiến lá có lớp tế bào mô dậu.
1.5.3. Về hoá học
1.53.1. Định tinh [4], [7], [8], [9]
- Bằng phương pháp định tính trong ống nghiệm, các tác giả đã xác
định được trong thân và lá Giẩo cổ lam thu hái ở Cao Bằng có: saponin,
flavonoid, acid hữu cơ, acid amin, sterol và đường.
- Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có
15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, p, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag.
Trong đó nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%) và ứiấp nhất là Ag (0,0001%).
1.5.3.2. Định lượng [4], [9], [12]
Bảng 1.1: Kết quả định lượng trong thân và lá cây Giảo cổ lam
ở Cao Bằng
Lá
Thân
Hàm lượng flavonoid (%)
5,58
1,17
Hàm lượng saponin (%)
7,39
3,79
Chỉ số phá bọt
666 333
Qiỉ số phá huyết
200
89

I.5.3.3. Phân lập [4], [8], [9], [12]
Các tác giả đã phân lập được một số chất và sơ bộ xác định cấu trúc:
- Flavonoid: Quercetin và Rutin, Rhamnazin.
OR3
OH
ÒH o
Quercetine
Rutin
Rhamnazin
R ,= R2=R3=H
Rj=glc^- rha; R2=Rs = H
R i= H; R2= R 3 = C H 3
- Saponin: 1 saponin có công thức phân tử là C47ĨỈ76O17 được dự kiến cấu
trúc thuộc nhóm triterpenoid, khung dammaran.
1.5.4. Về độc tính và tác dụng sinh học
L5.4.1. Độc tính [4], [8]
- Thử độc tính cấp trên chuột với mức liều 50g/kg (tưcmg đương 1250
lần liều dùng cho người) không có biểu hiện ngộ độc cấp trên chuột trong thời
gian theo dõi.
- Thử độc tính bán trường diễn trên thỏ với mức liều 3g/kg/ngày,
dùng liên tục trong một tháng đối với thỏ không thấy biểu hiện độc.
I.5.4.2. Tác dụng sinh học [8], [9], [12]
- Tác dụng hạ cholesterol máu của dịch chiết (1:1) trên chuột nhắt trắng
chủng Swiss theo phương pháp của Rao và cộng sự (phương pháp gây tăng
cholesterol ngoại sinh) thấy rằng với liều uống hàng ngày lOg/kg thể trọng
chuột, dược liệu đã ức chế sự tăng cholesterol máu ở chuột ăn cholesterol
hàng ngày 71% so với nhóm chứng là 0%.
- Theo phương pháp gây tăng cholesterol nội sinh trên thỏ dùng
dịch chiết (1:1) với liều 5g/kg/ ngày trong 4 ngày liền thấy có tác dụng
hạ cholesterol.

- Khả năng chống oxy hoá khá cao, đạt 50,11% ở nồng độ dịch
chiết (1:25) và 63,80% ở nồng độ 0,3 mg flavonoid toàn phần.
- Nghiên cứu tác dụng tăng lực trong nghiệm pháp chuột bơi đạt kết
quả 216,2% của lô thử so với lô chứng.
- Kết quả của việc nghiên cứu khả năng ức chế khối u của saponin toàn
phần chiết từ Giảo cổ lam cho thấy dược liệu có tác dụng chống khối u rất
tốt trong điều kiện thí nghiệm.
PHẦN n: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Nguyên liệu nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam được
GS.TS. Phạm TTianh Kỳ và cộng sự thu hái ở Sa Pa vào ứiáng 9 năm 2005. Dược
liệu sau khi thu hái phoi ở ncd thoáng mát, tách riêng phần thân và lá, đem sấy
khô ở nhiệt độ 50 - 60®c trong tủ sấy có quạt tíiông gió. Sau khi sấy khô, dược
liệu được bảo quản ở ncd khô ráo, thoáng mát.
Hình 2.1. Mẫu cây tưoi thu hái ở Sa Pa.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN cứ u
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất
Các thuốc thử, dung môi, hoá chất do phòng Giáo tài trưồrng đại học
Dược Hà Nội cung cấp.
2.2.2. Dụng cụ
Các loại dụng cụ thuỷ tinh, nồi cách thuỷ, Soxhlet, bộ cất thu hồi dung
môi tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dược liệu.
2.2.3. Phương tiện và máy móc
• Sấy dược liệu bằng tủ sấy SHELLAB.
• Bản mỏng sắc ký hoạt hóa trong tủ sấy BINDER ở nhiệt độ 105-
110°c trong 60 phút.
• Thu hồi dung môi bằng máy cất quay BŨCHi ROTAVAPOR R-200.
• Cân phân tích Précisa.
• Xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm SATORIUS ở bộ

môn dược liệu.
• Sắc k í lớp mỏng dùng bản mỏng tráng sẵn S ilic a se l GF254 của
MERCK (Đức).
• Sắc kí cột với chất nhồi cột là Sephadex LH-20.
• Đo phổ tử ngoại trên máy UV-VIS Spectrophometer cary lE-varian
(Australia) tại Phòng thí nghiệm trung tâm - Trường đại học Dược Hà Nội.
• Đo phổ hồng ngoại trên máy FT- IR spectrophometer 1650- Perkin
Elmer (USA) tại Phòng thí nghiệm trung tâm - Trường đại học Dược Hà Nội.
• Đo phổ khối trên máy 5989 - MS tại Phòng Cấu trúc - Viện Hoá Học
- Viện Khoa Học - Công nghệ Việt Nam.
• Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy NMR- BRUKER 500 MHz
tại phòng Cộng hưởng từ hạt nhân - Viện hoá học - Viện Khoa Học - Công
nghệ Việt Nam .
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
• Định tính các nhóm chất chính và chiết xuất theo phương pháp ghi
trong các tài liệu Thực tập dược liệu (phần hoá học) [2], Phương pháp nghiên
cứii hoá học cây thuốc [10] và Bài giảng dược liệu (tập 1) [1].
• Định tính bằng SKLM, phân lập bằng sắc ký cột theo phương pháp
ghi trong tài liệu Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc [10].
• Nhận dạng các chất phân lập được theo phưcfng pháp ghi trong tài liệu
The Flavonoid: Advances in research since 1986 [16]. Cấu trúc phân tử được
xác định dựa trên số liệu các phổ UV,IR, MS, NMR, so sánh với dữ liệu trong
thư viện phổ khối và phổ mô phỏng.
• Xử lý kết quả thực nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng
Student test ở mức ý nghĩa a = 0,05.
PHẦN ni: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. ĐỊNH TÍNH CẤC NHÓM CHẤT TRONG LÁ, THÂN GlẲo c ổ LAM
Các phản ứng định tính lá và thân được tiến hành song song theo cùng
một quy trình.
3.1.1. Định tính flavonoid

Lấy 10 g dược liệu chiết bằng Soxhlet với dung môi là chloroform đến
khi dịch CHCI3 hết màu xanh. Dược liệu được lấy ra làm khô cho vào 100 ml
cồn 90° đun cách thuỷ trong 10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn đem làm
các phản ứng định tính flavonoid.
Phản ứng Cvanidin:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột Mg kim loại,
thêm tiếp vài giọt HQ đặc, đun cách thuỷ thấy dịch chiết chuyển từ màu vàng
sang màu đỏ => phản ứng dương tính.
Phản ứng với PeCụ 5%:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt dung dịch FeClj
5%, thấy xuất hiện màu xanh đen => phản ứng dương tính.
Tác dung với kiềm:
+ Với dung dịch NaOH: cho 1 ml dịch chiết cồn vào ống nghiêm, thêm
vài giọt NaOH 10%, thấy màu vàng của dung dịch đậm lên => phản ứng
dương tính.
+ Hcd NH3: nhỏ một giọt dịch chiết cồn lên một miếng giấy lọc, hơ khô
rồi đặt lên miệng lọ amoniac đã mở nút. Quan sát thấy màu vàng của dịch
chiết đậm lên => phản ứng dưcfng tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam có flavonoid.
3.1.2. Định tính aicaloid
Cho khoảng 3 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thấm ẩm
bằng NH4OH 0,5N. 30 phút sau thêm 15 ml CHQ3 vào đậy kín. 12 giờ sau
gạn dịch chiết CHCI3 lắc dịch chiết với dung dịch acid sulfuric IN hai lần mỗi
lần 5 ml. Gộp các dịch chiết acid lại với nhau đem làm phản ứng :
+ Ông nghiệm 1: 1 ml dịch chiết thêm 2 - 3 giọt TT Mayer
+ Ống nghiệm 2: 1 ml dịch chiết thêm 2 - 3 giọt TT Dragendorff
+ Ống nghiệm 3: 1 ml dịch chiết thêm 2 -3 giọt TT Bouchardat
Kết quả cả 3 ống nghiệm đều không thấy xuất hiện tủa => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam không có alcaloid.
3.1.3. Định tính saponin

Quan sát hiên tương tao bot:
ƠIO vào ống nghiệm 1 g dược liệu cùng 5 ml nước, đun sôi nhẹ, lọc
nóng. Dịch lọc thu được hoà loãng với 10 ml nước lắc mạnh trong 1 phút, rồi
để yên trong 15 phút. Quan sát thấy cột bọt bền vững.
Phản ứng phân biêt saponin steroid và saponin triterpenoid:
Lấy khoảng 1 g dược liệu, chiết bằng cồn 90° trên nồi cách thuỷ trong
10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn. ƠIO dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm
mỗi ống 5 giọt.
Ống 1; thêm 5 ml NaOH 0,1N.
Ống 2: thêm 5 ml HCl 0,1N.
Lắc mạnh đồng thời hai ống trong 5 phút. Quan sát thấy cột bọt trong ống 2
cao hofn trong ống 1.
> Kết luận: Saponin trong lá và thân là loại triterpenoid.
Quan sát hiên tương phá huyết:
Cho 1 g bột dược liệu vào 10 ml dung dịch NaCl 0,9%, đun cách thuỷ
trong 30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc. Nhỏ 1 giọt máu bò 2% đã loại fibrin lên
lam kính, đậy lamen. Nhỏ 1 giọt dịch lọc ở trên vào 1 cạnh lamen. Quan sát
dưới kính hiển vi thấy hồng cầu bị vỡ ra khi dịch chiết thấm vào.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam có saponin triterpenoịdr-;

, ' ' ,<7
3.1.4. Định tính glycosid tim
Cho vào bình nón 250 ml khoảng 20 g bột dược liệu, ngâm trong 80 ml
cồn 25° trong vòng 24 giờ. Dịch chiết thu được đem loại tạp bằng chì acetat
30% dư. Lọc bỏ tủa, dịch lọc thu được cho vào bình gạn, lắc vài lần với
CHCI3.
Gạn lấy d ịch Chloroform , ch ia đều vào 4 ống ng hiệm nhỏ, bốc hcfi trên
nồi cách thuỷ tới khô. cắn đem làm các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann:
Hoà tan cắn trong ống nghiệm thứ nhất bằng 0,5 ml anhydric acetic.

Đặt nghiêng ống nghiệm 45°, thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành
ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia làm 2 lớp. Mặt tiếp xúc giữa lớp chất
lỏng xuất hiện vòng tím đỏ => phản ứng dương tính.
Phản ứng Legal:
Cắn trong ống nghiệm thứ 2 đem hoà tan bằng 0,5 ml cồn 90°. Thêm 5
giọt Nitroprussiat 1% và 5 giọt dung dịch NaOH 10%, không thấy xuất hiện
màu hồng trong ống nghiệm => phản ứng âm tính.
Phản ứng Ballet:
Cắn trong ống nghiệm thứ 3 được hoà tan bằng 0,5 ml cồn 90°. Thêm thuốc
thử Baijet mới pha vào (một phần dung dịch acid picric 1% và chúi phần dung dịch
NaOH 10%), không thấy xuất hiện màu vàng cam => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam không có glycosid tim.
3.1.5. Định tính coumarin
Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 100 ml, thêm 50 ml
cồn 90°, đun cách thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được
đem làm các phản ứng sau:
Phản ứng mò. đóng vòng lacton:
Cho vào hai ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml dịch chiết.
Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%.
Ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm trên nồi cách thuỷ đến sôi. Quan sát thấy:
Ông 1: dịch chiết có tủa đục.
Ống 2 : dịch chiết vẫn trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát
thấy:
Ống 1: dịch chiết vẫn có tủa đục.
Ống 2 : dịch chiết vẫn trong => phản ứng âm tính.
Phản ứng Diazo:
Qio 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2 ml NaOH 10%. Đun
cách thủy đến sôi, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử Diazo, không thấy trong

ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch => phản ứng âm tính.
Vi thăng hoa:
Cho 1 mg bột dược liệu vào 1 nắp chai bằng nhôm. Hơ trên đèn
cồn đến khi bay hết hofi nước trong dược liệu. Đặt lên trên miệng nắp nhôm
một lam kính, trên đó có để một miếng bông ướt. Đặt nắp nhôm trực tiếp trên
nguồn nhiệt. Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi dưới kính hiển vi, không
thấy có tinh thể hình kim nào xuất hiện => phản ứng âm tính.
Quan sát huỳnh quang:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH
5%, sấy nhẹ. Che 1/2 vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút
sau đó cất đồng xu đi, nửa hình tròn không che và nửa có che sáng như nhau
=> phản ứng âm tmh.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam không có coumarin.
3.1.6. Định tính tanin
Qio khoảng 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 20 ml
nước. Đun sôi trực tiếp trong 5 phút, lọc qua giấy lọc. Cho vào 4 ống nghiệm
nhỏ mỗi ống 1 ml dịch lọc đem làm phản ứng định tính :
ồng 1: thêm 1 giọt dung dịch FeClj 5%, thấy xuất hiện màu xanh đen
=> phản ứng dương tính.
Ong 2: thêm vài giọt dung dịch đồng acetat 10%, khôns thấy xuất
hiện tủa => phản ứng âm tính.
Ống 3: thêm vài giọt dung dịch chì acetat 10%, không thấy có tủa bông
=> phản ứng âm tính.
Ống 4: thêm 1 ml dung dịch gelatin 2%, không thấy xuất hiện tủa bông
trắng => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam không có tanin.
3.1.7. Định tính anthranoid
Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10 ml nước
cất đun sôi trực tiếp trong 10 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc, thêm 5 ml ether
ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether ethylic đem làm phản ứng

Bomtraeger. Qio 1 ml dịch chiết ether vào ống nghiệm sạch, thêm Iml dung
dịch NaOH 10%, không thấy xuất hiện màu hồng => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong lá và thân Giảo cổ lam không có anthranoid.
3.1.8. Định tính chất béo, caroten, sterol
Ngâm 10 g bột dược liệu trong bình nón bằng ether dầu hoả, để qua
đêm. Lọc lấy dịch, đem dịch làm các phản ứng:
Đinh tính chất béo:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết này lên 1 miếng giấy lọc để khô rồi quan sát:
không thấy có vết đục mờ trên miếng giấy lọc => phản ứng âm tính.
Đinh tính caroten:
Lấy 2 ml dịch chiết ether dầu cho vào ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách
thuỷ tới cắn. Cho thêm 2 giọt acid sulfuric đặc vào thấy màu dung dịch không
chuyển sang xanh da trời => phản ứng âm tính.