Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
Ệ Á u
‘ Títư-vrÊNÌ
\ a\ ^ ' ; /
NGHIÊN CỨU ỨN(Ì4í6 S ^ H I Ế T p h a r ắ n đ ể
ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN D TRONG SYRO THUỐC
PATARVIT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÀNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHỆP Dược sĩ KHOÁ 2000-2005)
Ngưòi hướng dẫn: TS. Thái Duy Thìn
PGS.TS. Thái Phan Quỳnh Như
Nơi thực hiện: - Phòng Hoá Lý 1- Viện Kiểm nghiệm
- Bộ môn Hoá dược- Trường đại học Dược
Hà Nội
Thời gian thực hiện: Tháng 10/2004 -5/2005
Hà Nội- 5/2005
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý 1 - Viện kiểm
nghiệm và Bộ môn Hoá dược - Truờng đại học Dược Hà Nội trong thời gian từ
tháng 10/2004 đến tháng 5/2005. Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các thầy cô giáo trong bộ
môn hoá dược và các cán bộ của phòng hoá lý 1- Viện kiểm nghiệm.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đối với các thầy cô giáo
trường đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản và cơ sở
hoá phân tích, hoá dược để tôi áp dụng trong quá trình thực nghiệm và hoàn
thành khoá luận tốt nhiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết on sâu sắc đối vói:
- TS. Thái Duy Thìn (Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược-Trường đại
học Dược Hà Nội)
- PGS.TS. Thái Phan Quỳnh Như (Trưởng phòng Hoá lý 1- Viện
kiểm nghiệm)

đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận.
Xin chân thành cảm ơn NCS Trần Việt Hùng, các thầy cô giáo trong bộ
môn hoá dược và các cán bộ của phòng Hoá lý 1- Viện kiểm nghiệm đã giúp tôi
hoàn thành khoá luận này.
Hà Nội, tháng 5/2005
Sinh viên
Bùi Đình Sơn
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề

1
Phần 1: Tổng quan 3
1.1. Vitamin D

3
1.1.1. Công thức cấu tạo 3
1.1.2. Nguồn gốc 3
1.1.3. Tính chất 4
1.1.4. Tác dụng dược lý
1.1.5. Chỉ định 4
1.1.6. Các chế phẩm vitamin D 4
1.1.7. Các phương pháp định lượng vitamin D

.
5
1.2. Kỹ thuật chiết pha rắn

.
6

1.2.1. Phân loại 6
1.2.2. Thực hành 7
1.2.3. ưu nhược điểm 8
1.3. Kỹ thuật HPLC 9
1.3.1. Khái niệm cơ bản 9
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng 11
1.3.3. Hệ thống HPLC 13
1.3.4. Pha tĩnh

.
13
1.3.5. Pha động 14
1.3.6. Cách đánh giá pic 15
1.3.7. Các phưofng pháp định lượng 16
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả
17
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 17
2.1.1. Nguyên liệu và thiết bị
17
2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
18
2.2. Kết quả thực nghiệm 19
2.2.1. Khảo sát quá trình chiết 20
2.2.2. Khảo sát hiệu suất chiết 25
2.2.3. Lựa chọn điều kiện sắc ký 26
2.2.4. Khảo sát tính thích họrp của hệ thống HPLC
27
2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính

.

28
2.2.6. Định lượng vitamin D trong syro Patarvit 30
2.2.7. Đánh giá độ chính xác

32
2.2.8. Đánh giá độ đúng
34
2.2.9. Khảo sát LOD và LOQ 35
2.3. Bàn luận 36
Phần 3: Kết luận và đề x u ất 38
3.1. Kết luận 38
3.2. Đề xuất 38
Tài liệu tham khảo
CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD
Giới hạn phát hiện
LOQ
Giới hạn định lượng
LI
Lần 1
STl
Số thứ tự
SPE
Chiết pha rắn
spíc
Diện tích píc
IB

Trung bình
ĐẶT VẤN ĐỂ
Vitamin là nhóm chất thiết yếu đối với sự sống mà cơ thể con người
không thể tự tổng hợp được hoặc tổng hợp ở lượng rất ít không đủ đáp ứng vói
nhu cầu. Các vitamin cần phải được cung cấp từ nguồn ngoại sinh. Vì vậy phối
hợp các vitamin nhằm cung cấp một số vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh lý
và bệnh lý không thể thiếu được của cơ thể đã trở thành cách sử dụng thuốc
quen thuộc.
Hiện nay trên thị tnrofng, có một số lượng lớn rất đa dạng và phong phú
các chế phẩm hỗn hợp vitamin (multivitamin). Việc đảm bảo chất lượng của
nhóm chất này đã trở thành nhu cầu cấp thiết.
Việc phân tích các vitamin tan trong dầu và trong nước đã được thực hiện
thành công bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên đối với
vitamin D thì việc phân tích vẫn là một vấn đề khó khăn. Vitamin D có hoạt
lực sinh học mạnh nên có hàm lượng rất nhỏ, ở mức tạp so với các vitamin
khác trong các chế phẩm hỗn hợp. ở nồng độ phân tích được vitamin D thì
hàm lượng của các tá dược và tạp phân huỷ của các vitamin khác rất nhiều và
tương đương với vitamin D. Thực tế chỉ cổ thể định lượng được các chế phẩm
vitamin D đơn có hàm lượng cao còn với các chế phẩm hỗn hợp với hàm
lượng vitamin D thấp thì chỉ có thể định tính.
Vì thế để định lượng được các chế phẩm hỗn hợp với hàm lượng thấp đòi
hỏi phải có giai đoạn xử lý đặc biệt để làm sạch và làm giàu mẫu. Trong luận
văn này chúng tôi đế cập đến việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn (solid
phase extraction) để làm sạch và làm giàu mẫu trước khi tiến hành định lượng
bằng phương pháp HPLC.
Syro Patarvit là một ví dụ về sự phối hợp của các vitamin tan trong dầu
với các vitamin tan trong nước ở dạng bào chế syro thuốc. Công thức cho 5ml:
Vitamin BI
2 mg
Vitamin B2 Img

Vitamin B6
Img
Nicotinamid 5mg
Vitamin A 1.000 UI
Vitamin D3
200UI
Lysine lOOmg
Trong tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm chỉ quy định định tính chứ không
định lượng được vitamin D. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu
ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin D trong syro thuốc Patarvit
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao " vói các mục tiêu sau:
• Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu vitamin D
trong syro thuốc.
• Xây dựng quy trình HPLC để định lượng vitamin D
• Áp dụng định lượng vitamin D trong syro thuốc Patarvit
PH ẦNl
TỔNG QUAN
1.1. VITAMIN D [1,2,7,8 ,9,11,12,13,16 ]
1.1.1. Công thức cấu tạo
- Vitamin Dị.
C27H44O (M= 384,6)
Tên khoa học : ergocalciferol
- Vitamin D,
C27H44O (M= 384,6)
Tên khoa học : Qiolecalciferol
1.1.2. Nguồn gốc
Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn từ động vật như trứng, sữa, thịt
Trong cơ thể vitamin D được tổng hợp ở các tế bào dưói da nhờ ánh sáng
tử ngoại
Vitamin D còn có nguồn gốc tổng hcfp.

1.1.3. Tính chất
Tinh thể hình kim, không màu, không mùi, không tan trong nước, dễ tan
trong các dung môi hữu cơ như ethanol, cloroform, ether và các chất béo.
Không bền với nhiệt độ, không khí, ánh sáng.
1.1.4. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Tham gia vào quá trình tạo xương: làm tăng hấp thu calci và phosphat ở
ruột, tăng tái hấp thu calci ở ống lượn gần, tham gia vào quá trình calci hoá
sụn tăng trưởng. Vì vậy vitamin D rất cần thiết cho sự phát triển bình thường
của trẻ em.
Điều hoà nồng độ calci trong máu: Nếu các quá trình trên không cung
cấp đủ calci, làm nồng độ calci máu giảm thì vitamin D (kết hợp với hormon
tuyến cận giáp) sẽ huy động calci từ xương ra.
Ngoài ra vitamin D còn tham gia biệt hoá tế bào biểu mô và gần đây đang
nghiên cứu tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư.
Vì thế khi thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm
giảm calci huyết, khi đó calci bị huy động từ xưofng nên hậu quả là trẻ em
chậm lớn, còi xương, chậm biết đi, chậm kín thóp. Người lớn sẽ bị loãng
xương, xốp xương.
1.1.5. Chỉ định
Phòng và điều trị còi xương do thiếu vitamin D
Phòng và điều trị loãng xương, dễ gãy xương.
Chống co giật do suy tuyến cận giáp
Hạ calci huyết
Một số bệnh ngoài da như chứng xơ cứng bì
1.1.6. Vitamin D và các chê phẩm multivitamin
Vitamin D thường được phối hợp với các vitamin tan trong dầu và các
vitamin tan trong nước. Một số chế phẩm phối hợp được liệt kê trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Một số chế phẩm phối hợp của vỉtamin D
Tên sản
phẩm

Dạng bào
chế
Thành phần
Hàm iượng
D (U.I)
Nhà sản
xuất
Enpovid
Nang mềm A,D 400
Cty TNHH
SPM
Vitamin A-D
Nang mềm A,D 500
XNLHD Hậu
Giang
Hydrosol
Hỗn dịch
A, D, Bl, B2,
E, B6 , pp, B5
500 Ul/ml
Roche
Patarvit
Syro
Bl, B2, B6 ,
pp, A, D,
B12
40 Ul/ml Patar Lab
L'l'D
Homtamin
Viên nang

mềm
A, D,B1,B2
400 UI
Hàn Quốc
1.1.7. Các phương pháp định lượng YÌtamin D
- Phương pháp hóa học [2, 7,12,13]
+ Nguyên tắc: Vitamin D tạo màu vàng với thuốc thử antimon clorid.
Đem đo quang ở 500 và 550nm, tiến hành song song với mẫu chuẩn.
+ Nhận xét: Quy trình thực hiện rất phức tạp, bao gồm các giai đoạn xà
phòng hóa trong điều kiện tránh oxi hóa, chiết tách và tinh chế qua các cột sắc
ký bán điều chế sử dụng các chất nhồi là đất tẩy màu dùng cho sắc ký và đất
silic dùng cho sắc ký, sau đó tạo màu và đo quang. Do tiến hành qua nhiều
giai đoạn nên làm giảm độ chính xác,
- Phương pháp sinh học [2, 7,12,13]
+ Nguyên tắc: Hoạt lực vitamin D được đánh giá thông qua xác định mức
độ vôi hóa xương trên thỏ hoặc chuột.
+ Nhận xét: Phương pháp này tiến hành khá phức tạp. Kết quả phụ thuộc
nhiều vào các cá thể và đòi hỏi người thử nghiệm phải được đào tạo kỹ lưỡng.
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1,2, 7,11,12,16]
+ Nguyên tắc: Dựa trên sự phân bố khác nhau của vitamin D giữa pha
động và pha tĩnh so với các thành phần hoạt chất khác.
+ Nhận xét: Đây là phương pháp hiện đại, ngày càng được áp dụng phổ
biến. Tuy nhiên cũng chỉ có thể áp dụng trực tiếp với các chế phẩm đơn hoặc
đa thành phần trong đó vitamin D có hàm lượng cao (>500 UI/1 đơn vị phân
liều) còn với các chế phẩm có hàm lưcmg D thấp thì đòi hỏi phải có biện pháp
xử lý mẫu phù hợp để làm sạch và làm giàu mẫu.
1.2 KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN [5,14,15]
Đây là kỹ thuật chiết được ứng dụng ngày càng nhiều. Ngày nay, trong
thực hành phân tích, nó đã dần thay thế các phuofng pháp chiết lỏng-lỏng cổ
điển.

Phương pháp chiết pha rắn sử dụng các cột được nhồi các chất rắn khác
nhau, có cơ chế tưcmg tác giữa các chất phân tích với dung môi và pha rắn
giống như trong sắc ký lỏng.
Do cơ chế chiết tách trên mà các chất pha rắn được sử dụng cũng giống
như pha tĩnh trong sắc ký lỏng.
1.2.1 Phân loại các kiểu chiết
- Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên kết mà sử dụng ngay các nhóm chức
trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ. về cơ bản, sử dụng điều kiện sắc ký pha
thuận. Chất hấp phụ hay được dùng nhất là silicagel, magnesi silicat, nhôm
oxyd.
- Kiểu phân bố trên pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ đã được thay đổi,
gắn thêm nhóm chức hoá học đóng vai trò chính trong kiểu tương tác phân
bố, bao gồm các kiểu điều kiện sắc ký sau:
• Pha thuận: pha tĩnh phân cực sẽ giữ lại các chất phân cực và cho phép
các chất không phân cực đi qua cột. Thông thường kiểu này sử dụng các dung
môi ít hoặc không phân cực.
• Pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngược lại kiểu pha thuận.
• Pha đảo tạo cặp ion: pha tĩnh không phân cực, mẫu phân cực có chứa
các phân tử cần phân tích ở dạng ion kết hợp với ion trái dấu được thêm vào
trong mẫu, trở thành phân tử trung hoà được lưu giữ lại trên cột và rửa giải
theo cơ chế pha đảo.
• Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đã được thay đổi, gắn với các nhóm
chức có thể ion hoá. Cơ chế tách chiết của kỹ thuật này cũng giống như sắc ký
trao đổi ion. Các nhóm chức gồm nhóm trao đổi anion mạnh hoặc yếu và
nhóm trao đổi cation mạnh hoặc yếu.
1.2.2. Thực hành chiết, làm sạch và làm giàu mẫu qua 5 bước
• Bước 1: Chọn loại cột pha rắn.
Có thể sử dụng các cột Iml, 2ml hoặc 5ml phụ thuộc vào: thể tích mẫu,
mức độ tạp chất, tính phức tạp của nền mẫu, lượng chất phân tích quan tâm,
tính chất dung môi mẫu và tính chất tương tác giữa chất phân tích với pha rắn.

• Bước 2: Luyện cột.
Luyện cột nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu cần chiết và loại
một số tạp chất còn ở trên cột. Thông thường sau khi luyện cột phải rửa tiếp
cột bằng một dung môi giống như dung môi dùng để chuẩn bị mẫu.
• Bước 3: Chuyển mẫu vào cột chiết.
Chuyển chính xác lượng mẫu cần chiết vào cột, sử dụng pipet hoặc
micropipet. Cần lưu ý, để tránh tắc cột, cần phải ly tâm hoặc lọc mẫu trước khi
chiết. Sau khi chuyển toàn bộ mẫu, sử dụng máy hút chân không hoặc áp lực
đẩy.
• Bước 4: Rửa.
Nếu như hợp chất cần quan tâm lưu trên cột, rửa để loại bỏ các chất
không mong muốn, các tạp chất không lưu trên cột bằng dung dịch đã dùng để
chuẩn bị mẫu hoặc một dung dịch khác mà nó không rửa giải hợp chất cần
quan tâm.
• Bước 5: Rửa giải các hợp chất cần thiết.
Sử dụng lượng nhỏ thể tích dung môi hữu cơ mà nó chỉ rửa giải hay chiết
các hợp chất quan tâm và để lại các tạp chất không được loại trong quá trình
rửa. Dịch rửa giải được thu hồi để tiếp tục phân tích.
1.2 .3 . ưu nhược điểm và ứng dụng của chiết pha rắn.
Chiết pha rắn là một phương pháp chiết thuận tiện, không đắt, tiết kiệm
thời gian và có thể thay thế cho chiết lỏng-lỏng. Kỹ thuật này được dùng để
làm sạch và làm giàu mẫu phân tích. Thêm vào đó, nó giảm đáng kể lượng
dung môi hữu cơ sử dụng.
o Gliát phán tích
• Tạp cliỉít
ĩ K y
tỉ-7
Ồ ^ Ồ
Điéư kiện hoạ cột Đưa mẫu vào cột Rửa
Giữ Jạ|tap chat, đe cliĩít quan táìii đi tịU it cột

Điẻu kiệíi hoá cột
<ỉô
Rửa giai
Đưa màu vào cột
¥ầ
Rửa giải
Hình 1.1: Sơ đồ miêu tả kỹ thuật chiết pha rắn trong phân tích
1.3. KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [3,4,6,16]
1.3.1. Khái niệm cơ bản
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách hoá lý dựa
vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và
không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất
lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một
chất rắn đã được phân chia dưổi dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên
một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liến kết hoá học
với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử.
- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại
sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất
trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đã được gắn pha liên kết
ta có sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân
tử. Quyết định hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tương tác:
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước
tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại.
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng.
• Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu của một chất là thòi gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ:
Hình 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng

Nếu gọi Ir là thời gian lưu giữ của một chất
Thì: t R = Ir — to
Trong đó: t \ là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh),
to là thời gian chết (thời gian không lưu giữ).
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có
thể thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau
cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
• Hệ số phân bố
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và
pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân
bố được tính theo công thức :
Cs
K =
Trong đó Cs, là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở
thời điểm cân bằng.
• Thừa số dung lượng
Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
k ' =
= Kx
M
M
Trong đó Qs, Qm là lượng chất tan có trong pha tĩnh và pha động
Vg, Vj^ là thể tích pha tĩnh và pha động.
Có thể tính k’ theo một công thức khác :
• Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k’ khác nhau, hệ số
chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.
ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy a luôn lớn

hơn 1, a càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thưòỉng phân tích
trong điều kiện a trong khoảng 1,5 đến 2.
• Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số : Số đĩa lý thuyết (N)
hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H).
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức :
iV = 16x hoặc 5,54 X
v^./2y
Trong đó w : Là chiều rộng pic ở đáy pic
: Là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức :
N
Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất
định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối vói
mỗi chất phân tích.
• Độ phân giải (Rs)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong
một điều kiện sắc ký đã cho . Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính
theo 1 trong 3 công thức sau:
hoăc hoâc
tv,+w, “ 1 + *’, 4
Hệ số đối xứng (T)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:
r = iii
2A
Trong đó Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
A là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đường
cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic.
1.3.3. Hệ thống HPLC
Theo thứ tự từ đầu đến cuối của hệ thống máy HPLC có các bộ phận

chính sau
• Bình chứa dung môi
• Bơm cao áp : đẩy pha động qua cột sắc ký
• Bộ phận tiêm mẫu : tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định
• Cột tách (pha tĩnh)
• Detector
• Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính
1.3.4. Pha tĩnh
* Khái niệm: Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách
một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ,
đường kính cỡ hạt từ 3 - 1 0 , diện tích bề mặt hạt thường từ 50 - 500 mVg.
* Phân loại
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.
Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong
kỹ thuật HPLC.
- Căn cứ theo trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành
hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh là
chất lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LLC).
- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký
pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó
thành hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài),
* Điều kiện đối với một pha tình
- Phải trơ và bền vững vói các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc
- Tính chất bề mặt phải ổn định
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
1.3.5. Pha động

* Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất
linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp
nhiều dung môi trộn lẫn vói nhau theo những tỷ lệ nhất định. Nó cũng có
thể là dung dịch các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói
chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được
hiệu quả phân tách tốt nhất.
• Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký
của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thòi gian lưu giữ các chất mẫu và
hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến :
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thời gian lưu giữ của chất tan
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh
- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký
• Điều kiện đối với một pha động
- Phải trơ đối với pha tĩnh
- Hoà tan được chất cần phân tích
- Bền vững theo thời gian
- Có độ tinh khiết cao
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp vói loại detetor dùng để phát hiện các chất phân tích
- Có tính kinh tế và không quá hiếm
• Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động
- Thành phần các chất tạo ra pha động
- Tốc độ dòng pha động
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)
1.3.6. Cách đánh giá pic
Đánh giá diện tích pic : Diện tích pic của một chất tương ứng vói tổng

lượng chất đó.
Đánh giá chiều cao pic ĩ Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic là
một đại lượng tỷ lệ vói diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá.
1.3.7. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC.
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc
là: Nồng độ của chất tỉ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó. Có 4
phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:
* Phưcỉng pháp ngoại chuẩn.
* Phương pháp nội chuẩn.
* Phương pháp thêm.
* Phương pháp phần trăm diện tích píc (hoặc phần trăm chiều cao pic).
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2 .1. NGUYÊN LIỆU, THIÊT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.1. Nguyên liệu và thiết bị
Đối tượng'.
Mẫu syro Patarvit
Nhà sản xuất: Patar Lab Ltd., Pait (Thái Lan)
Số lô: 406146
Hạn dùng: 06-2006
Công thức: trong mỗi 5 ml syro chứa:
Vitamin Bl
2mg
Vitamin B2 1mg
Vitamin B6 1mg
Nicotinamid 5mg
Vitamin A
1.000 UI
Vitamin D
200UI

Lysine 100mg
Hoá chất:
- Chất đối chiếu vitamin D (dầu 1000.000 Ul/g)
- Chất đối chiếu vitamin A (dầu 1000.000 ưl/g)
- Chất đối chiếu vitamin Bl, B2, B6 , pp
- Methanol tinh khiết sắc ký
- Acetonitril tinh khiết sắc ký
- Nước cất
- Hexan
Dụng cụ-thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : HP 1100, gắn với máy vi tính và máy
in
- Cột Lichrosorb RPl 8(250 X 4 mm, 5 và 10fj,m )
- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu vói đường kính lỗ màng lọc 0,45
- Máy lắc siêu âm
- Cân phân tích Mettler AB 204
- Cột SPE C18 (200 mg X 2 ml)
- Bộ thiết bị chiết pha rắn
- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức chính xác 50 ml; 25 ml; 20 ml; 10
ml; ống đong, pipet chính xác, cốc có mỏ và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung:
- Khảo sát và xây dựng quy trình chiết
+ Lựa chọn dung môi để rửa sạch tạp và dung môi để rửa giải
+ Khảo sát thể tích dung môi để rửa sạch tạp mà vẫn không làm mất
vitamin D
+ Khảo sát thể tích dung môi rửa giải để rửa giải hết vitamin D
+ Khảo sát lượng dung mồi để rửa sạch các vitamin còn lại trong cột để
phục hồi cột.
- Xây dựng quy trình HPLC để phân tích Vitamin D

Để xây dựng chương trình sắc ký thích họfp, chúng tôi tiến hành khảo sát:
+ Kiểu sắc ký áp dụng
+ Cột tách sử dụng
+ Các điều kiện về pha động (thành phần, tỉ lệ, tốc độ dòng)
+ Bước sóng
- Đánh giá chương trình sắc ký vừa xây dựng
+ Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
+ Khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin D
+ Khảo sát giới hạn phát hiện và giói hạn định lượng
- Áp dụng định lượng vitamỉn D trong syro Patarvỉt.
+ Sử dụng quy trình chiết và quy trình sắc ký đã xây dựng ở trên để định
lượng vitamin D trong syro Patarvit
+ Khảo sát tính chính xác của kết quả phân tích.
+ Khảo sát tính đúng của kết quả phân tích.
Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nhiên cứu sử dụng trong khoá luận là sắc ký lỏng hiệu năng
cao và chiết pha rắn (SPE), Tiến hành thực nghiệm để xây dựng quy trình
chiết tối ưu và chương trình sắc ký phù hợp nhất. Sau đó thông qua xử lý
thống kê các kết quả khảo sát để đánh giá chương trình sắc ký và phương pháp
đã xây dựng.
❖ Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thông
qua các đặc trưng sau:
- Giá trị trung bình: - 1
X
_ lv
p . - ~ 4
- Đô lêch chuẩn: s = \ —

V « - 1

- Sai số chuẩn: =
4~n
t s
- Sai số tương đối: 8% = 100
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
2.2.1. Khảo sát quá trình chiết:
Xử lý cột (luyện cột) : lần lượt cho qua cột 3ml methanol, 3ml nước, 5ml
methanol- nước (50:50).
Khảo sát điều kiện chiết:
- Pha dung dịch mẫu: tiến hành pha một dung dịch chuẩn có công thức
cho mỗi 5 ml như sau:
Vitamin BI 2 mg
Vitamin B2
1 mg
Vitamin B6
1 mg
Nicotinamid 5 mg
Vitamin A
1.000 UI
Vitamin D
1.000 UI
Cân chính xác khoảng 20mg Bl, lOmg B2, lOmg B6 , lOmg dầu Vitamin D
(1000.000 Ul/g), lOmg dầu Vitamin A (1000.000 Ul/g). Cho vào bình định
mức 50 ml, hoà tan bằng methanol tuyệt đối rồi thêm methanol đến vạch.
Hút Iml dung dịch trên cho qua cột SPE đã được xử lý
- Pha dung dịch vitamin D chuẩn.
- Pha dung dịch vitamin A chuẩn
Khảo sát điều kiện rửa:
Mục đích của chúng ta là làm sạch mẫu trứơc khi sắc ký. Vậy phải chọn
loại dung môi và thể tích dung môi phù hcfp để rửa hết các vitamin tan trong

nước (Bl, B2, B6 , PP) trong khi không rửa trôi vitamin D.
Trong mẫu có một lượng lớn các vitamin tan trong nước gồm Bl, B2, B6 ,
PP. Để rửa sạch các vitamin này ta lựa chọn nước, sau đó là methanol-nước
(50:50).Tiến hành khảo sát thể tích nước và methanol- nước để loại hết các
vitamin tan trong nước mà không mất vitamin D: