Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

oOo

PHẠM NHƯ QUỲNH
ữ^G DỤNG LC - MS ĐỂ k h ả o s á t
DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA
• • •
GLYCYL PUNTUMIN
ở ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM
• • •
KHOÁ LUẬN TỐT HGh S Í^ Ư Ợ C s ĩ k h ó a 2000 - 2005
Giáo viên hướng dẫn:^ ĩhiíESf1<íguyễn Quốc Bình
2. Ths. Nguyễn Đình Tuấn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hoá Sinh, Bộ môn Dược Lực
Trường ĐH Dược Ha Nội
Phòng giám định hoá pháp lý
Viện Khoa Học Hình Sự
Thời gian thực hiện: Tháng 2 đến 5 năm 2005
HÀ NỘI, THÁNG 5-2005
•ĩnưÃ -ầS ):
h i ũ ì m
M ề l e ă n t tU t
æJiL bàụ. tẩ LầỊiẨỊ. b iỉí Ổ4^ sâu sẨíi lới:
ÇîS^. QlụuíỊỈMt. Qjuốa (Bưih
Çîhs. QlxỊuụỀn^ ^inlt ^uLOLtt^
Qílhữnụ. nẮỊUồl tliầụ. đ ă tận. tình kưỔitiỊ. dẫn ^ giújfL đẵ ear ihựít hiỀễt ÚỈL hjơăit
thùnh Luătz Ịtùự
¿jttL æitL e/i£UL Uloj^l eỏMtL €Ỉ4^ ấỉAe tliầụ. cA eỉutẨỊ. eúíí eoM. Ixà, kụ. thuậl úien. trmiạ.

ímfL tnồềt^ 'JôéiL n^ưđe, J¿í¿a^ Çît^'èitxj. ^ a i kú<i nyưđe, 'Tôi Qlội.
Ốtn. æiit ehăễt thủềih eủin. ốn. eÓM, eáễ^ lứ^ kụ. íluíâl aỉỀn. tạ i phồng, ^iăiễv đỉnh
háiL pháp. Líị <UiềM. DCÍ^úit kúe, hình ẴẨjt (Bà eồềzạ. an. đ ă hxiêitxỊ. ílẫết^ hẶ tnỷ kụ. Ihuut
úỉt t€i(% mại đỉềrt klejt tliuÛJt. Iđi eko^ eML lỉun. lốt đề. tà i itàụ
^ u ế ỉ eù n g .^ ejit^ æ/#t el^ A t^ euMWL Ổ4t^ (B cư i ^ i c u n líiềxv^ eă a fth ô ttjg . !ư uz^ e ă e
Im Ịtiờĩtí^ồểig. ^ ạ i hoe n)ưé<í '7ŨĨL Qlội đũ txm i^nũí ítieju kiej^ thuâiL Lợi ejn. trsníj.
thồi íjiojiL kạa ÜÁ thu'e hiện. kháiL Luận, tạ i ù^ưằnxẬ
'7ùỉt Qlộiy tkánẨẬ. 5/2005.
Sinh aiỀn.
^ h ụ i^ QUu¿ Qjuí/jzh
Mục lục
Lời cảm ơn
Mục lục
Chú giải chữ viết tắt
Đặt vấn đề 1
Phần I: Tổng quan 3
I. Dược động học 3
1. Khái niệm 3
2. Các thông số Dược động học cơ bản 3
2.1. Diện tích dưới đường cong (AUC) 3
2.2. Thể tích phân bố (Vd) 6
2.3. Hệ số thanh thải (Cl) 6
2.4. Thời gian bán thải (Tjỵ
2
) 8
3. Mối quan hệ giữa các thông số Dược động học 9
4. Các mô hình nghiên cứu Dược động học 10
II. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC - MS) 11
1. Giới thiệu nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 11
2. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 13

2.1. Thời gian lưu giữ 13
2.2. Thể tích lưu 14
2.3. Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký 14
2.4. Khả năng phân giải 15
2.5. Quá trình cột và sự mở rộng giải pic
Phương trình Van - Deemter 15
3. Một số trang thiết bị trong kỹ thuật HPLC 16
3.1. Cột tách sắc ký 16
3.2. Các loại detector 17
III. Tổng quan về Glycyl Funtumin 22
Phần II: Thực nghiệm và kết quả 25
I. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 25
1. Hóa chất 25
2. Dụng cụ 25
3. Động vật thí nghiệm 26
4. Phương pháp nghiên cứu 26
4.1. Thẩm định phương pháp 26
4.2. Bố trí thí nghiệm và lấy mẫu 28
4.3. Xây dựng đường cong Dược động học 28
4.4. Phương pháp xử lý số liệu 32
II. Thực nghiệm và kết quả 32
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện chạy HPLC - MS 32
1.1. Chọn điều kiện làm việc cho HPLC 33
1.2. Chọn điều kiện làm việc cho Detector MS 33
2. Khảo sát phương pháp định lượng Glycyl
Puntumin trong huyết tương chó thí nghiệm 35
2.1. Xây dựng đường chuẩn 35
2.2. Xác định tính chính xác của phương pháp 36
2.3. Hiệu suất chiết của GF
trong huyết tương chó 37

3. Thiết lập các thông số Dược động học
của GF trên động vật thí nghiệm 38
3.1. Sơ bộ khảo sát sự biến thiên nồng độ GF
trong huyết tương theo thời gian 38
3.2. Thiết lập các thông số
Dược động học GF trên chó 40
Phần III: Bàn luận và kết luận 44
Tài liệu tham khảo
Phu luc
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
Aưc
C1
^Max
cs
EI
F, SKD
GF
HPLC
K
MS
RSD
SD
SIM
TDSH
T i/2
^Max
Vd
Diện tích dưới đưòỉng cong Nồng độ - thời gian
(Area Under the Curve)
Hệ số thanh thải

(Clearance)
Nồng độ thuốc đạt cực đại trong huyết tương
Nồng độ thuốc ở trạng thái cân bằng
(^steady-state)
Cộng sự
lon hóa phun ion
(Electrospray Ionization)
Sinh khả dụng.
Glycyl Funtumin
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High - Performance Liquid Qiromatography)
Hệ số tốc độ thải trừ
Khối phổ
(Mass Spectrum)
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Sắc ký đồ toàn ion
(Total Ịon Chromatogram)
Tương đương sinh học
Thời gian bán thải
Thời điểm thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương
Thể tích phân bố
(Volume of distribution)
ĐẶT VÂN ĐỂ
Dược động học là một phần quan trọng trong hồ sơ về một thuốc dưới cả
góc độ khoa học, quản lý và nhất là sử dụng lâm sàng. Các thông số Dược
động học sẽ phản ánh số phận của thuốc trong cơ thể. Thông qua hiểu biết về
Dược động học người thầy thuốc sẽ có được sự lựa chọn cách thức đưa thuốc,
thời gian đưa thuốc sao cho hợp lý và hiệu quả nhất.
Với mục đích nâng cao chất lượng và tính an toàn của thuốc, quá trình

cấp phát số đăng ký lưu hành thuốc ở trên thế giới cũng như Việt Nam ngày
càng được tiến hành một cách chặt chẽ, kỹ lưỡng. Một trong những phần quan
trọng trong bộ hồ sơ đăng ký là phải có thông tin về Dược động học của thuốc.
Trong các chuyên mục của Dược thư cũng như những tờ rơi hướng dẫn sử
dụng thuốc, phần công bố về Dược động học của thuốc luôn nhận được sự
quan tâm hàng đầu của cả bác sĩ điều trị, dược sĩ lâm sàng thậm chí cả ngưòi
dùng thuốc.
Glycyl Puntumin (GF) là một chất điều hoà miễn dịch đã được phát triển
ở Trường Đại Học Dược Hà Nội từ khoảng 30 năm nay. Hiện đang được tiến
hành sản xuất thử nghiệm và thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn cuối. Song song
với quá trình trên, cơ quan Quản lý Dược đã cấp phép cho Aslem (chế phẩm
bào chế từ GF) SỐ đăng ký nghiên cứu. Tuy nhiên do hạn chế về phương pháp
và thiết bị nên phần Dược động học của GF chưa từng được khảo sát. Để hoàn
thiện hồ sơ về Aslem thì những hiểu biết về Dược động học của GF là đòi hỏi
thiết thực và cấp thiết.
Trong đề tài luận văn này, với mục đích chủ yếu là học tập phương pháp
luận nghiên cứu, chúng tôi mạnh dạn đặt vấn đề sử dụng HPLC-MS, một
phương pháp phân tích hiện đại, tin cậy với độ nhạy cao để khảo sát về Dược
động học của GF trên động vật thực nghiệm, cụ thể:
1. Khảo sát khả năng sử dụng HPLC-MS để định lượng GF
2. Thiết lập các điều kiện thực nghiệm khi sử dụng HPLC-MS để định lượng
GF
3. Thiết lập các thông số Dược động học GF trên động vật thí nghiệm
PHẦN I: TỔNG QUAN
I. Dược ĐỘNG HỌC .
1. Khái niệm:
Dược động học của một thuốc là một khái niệm để phản ánh số phận của
thuốc trong cơ thể, bao gồm các quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hoá và
thải trừ. Các quá trình này được biểu thị thông qua những thông số Dược động
học, trong đó có 4 thông số cơ bản, có nhiều ý nghĩa trong thực hành lâm sàng

là: diện tích dưới đường cong nồng độ-thời gian (AƯC), thể tích phân bố (Vd),
hệ số thanh thải (Cl) và thời gian bán thải hay nửa đòi sinh học (Ti/
2
) [14, 30].
Thông qua các thông số Dược động học người thầy thuốc lâm sàng có thể
quyết định liều lượng cần đưa vào cơ thể của mỗi thuốc, khoảng cách giữa các
lần đưa thuốc hoặc hiệu chỉnh lại liều lượng trong các trường hợp bệnh nhân
có những bất thường về sinh lý, bệnh lý. Đối với ngành dược, các thông số này
là những gợi ý tốt cho việc lựa chọn dạng bào chế và cải tiến dạng bào chế để
tạo được những dạng thuốc có các thông số Dược động học mong muốn[14].
2. Các thông số Dược động học cơ bản
2.1. Diện tích dưới đường cong (AUC - Area Under the Curve)
Diện tích dưới đường cong (AUC - của đồ thị biểu diễn sự biến thiên của
nồng độ thuốc trong máu theo thời gian) biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc
vào được vòng tuần hoàn ở dạng còn hoạt tính sau một thời gian t và được tính
bằng mg.h.l ^ hoặc ịxg.h.mỉ'J [14, 18, 24].
Giả sử toàn bộ lượng thuốc đưa vào cơ thể đều vào được vòng tuần hoàn
chung ở dạng còn hoạt tính và sẽ phát huy tác dụng dược lý thì trị số AUCỔ
cho phép đánh giá được chất lương của dạng bào chế.
Hình 1: Diện tích dưới đường cong (AUC)
Có nhiều cách để tính AUC, có thể tính theo phương pháp tích phân trên
máy tích phân (AUC = fc.dt ) hay tính toán đơn giản theo quy tắc hình thang.
đ
Ngoài ra giá trị AUC cũng có thể tính được thông qua hệ số thanh thải theo
công thức sau:
_ F*D
AUCổ=
° C1
Trong đó : Dq là liều dùng, Cl là hệ số thanh thải, F là sinh khả dụng
Công thức ở trên cũng cho thấy mối liên hệ giữa trị số AUC vói sinh khả

dụng của thuốc (F), tức là mức độ và tốc độ hấp thu của dược chất từ dạng bào
chế vào vòng tuần hoàn chung của cơ thể ở dạng còn hoạt tính. Trị số F là đại
lượng biểu thị trực tiếp tính hiệu quả của một dạng bào chế.
Nếu thuốc được đưa qua đường tĩnh mạch (I.V) thì F = 1. Ngược lại khi
thuốc được đưa vào cơ thể bằng các con đường khác thì luôn có một lượng
nhất định bị tổn hao khi hấp thu vào máu hoặc bị mất hoạt tính khi qua gan,
do đó F luôn < 1.
Đối với sinh khả dụng một thuốc người ta phân chia thành SKD tuyệt đối
và SKD tương đối [14, 18, 24].
• SKD tuyệt đ ối: được tính bằng tỷ số tổng lượng dược chất được hấp thu
vào đại tuần hoàn từ dạng bào chế của nó và từ dạng tiêm động mạch hay tữih
mạch.
SKDj„yetđô'i = — *100%
tuyẹtđOi A ĩỊr _ *r)
^thủ
Nếu liều của 2 chế phẩm như nhau và trọng lượng người thử thuốc bằng
nhau th ì:
ATTP
* 100%
• SKD tương đ ối: Với những thuốc không dùng đường tiêm tĩnh mạch ta
dùng khái niệm SKD tương đối. SKD tương đối của 1 chế phẩm (thử) so với 1
chế phẩm khác lấy làm chuẩn (dạng bào chế được coi là có khả năng hấp thu
tốt hoặc chế phẩm đã được công nhận về hiệu lực tác dụng) là tỷ lệ dạng hoạt
tính của chế phẩm thử vào đại tuần hoàn so với chế phẩm chuẩn vào đại tuần
hoàn.
SKD^g«, = ^ ^ * 1 0 0 %
^chuẩn
Để so sánh SKD của 2 dạng thuốc hoặc 2 biệt dược cân dùng khái niệm
KSD tương đối. Nhưng SKD tương đối chỉ cho phép so sánh mức độ hấp thu
mà chưa xét đến tốc đố hấp thu của chúng. Vì thế cần phải đưa ra khái niệm

tương đương sinh học (TOSH). Hai chế phẩm được coi là TDSH nếu mức độ
và tốc độ hấp thu vào tuần hoàn chung của các dược chất là gần như nhau trên
cùng đối tượng và điều kiện thử. Để đánh giá TĐSH ngoài AUC còn phải đánh
giá các đại lượng [18]. Hai thuốc A và B là TOSH nếu:
£80 120 > > 80
AUC(B) C^.(B)
120 > T-»<y > 8 0
T„„(B)
2.2. Thể tích phân bố(Vd- Volume of distrìbution)
Thể tích phân bố là hệ số tỷ lệ giữa tổng lượng thuốc đưa vào cơ thể và
nồng độ thuốc trong huyết tương.[14, 24].
_ Tổng lượng thuốc đưa vào cơ thể (P) |-y , J « 1
Nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp)
Thể tích phân bố biểu thị sự phân bố của thuốc trong cơ thể, nhưng nó
không biểu thị một thể tích sinh lý thực, hơn nữa thể tích này không có liên
quan gì đến thể tích máu, huyết tương, huyết thanh hoặc phần nước của cơ thể.
Thực chất thể tích phân bố là một giá trị tưởng tượng nên còn gọi là thể
tích biểu kiến, biểu thị một thể tích cần phải có để toàn bộ lưcmg thuốc được
đưa vào cơ thể phân bố ở nồng độ bằng nồng độ trong huyết tương.
Thể tích phân bố được sử dụng để tính toán liều lượng thuốc cần đưa vào
trong cơ thể để đạt được một nồng độ Cp mong muốn nào đó.
p - Vd*Cp
F
Trong đó D: liều thuốc cần đưa (g,mg)
F: là sinh khả dụng của thuốc (%).
Cp: nồng độ thuốc trong huyết tương (g/l, mg/ml).
2.3. Hệ số thanh thải (Clearance = Cl).
Hệ số thanh thải (Cl) hay còn gọi là độ thanh lọc hoặc độ bài xuất, biểu
thị khả năng của một cơ quan nào đó của cơ thể (thưcmg là gan và thận) lọc
sạch thuốc ra khỏi huyết tương khi máu tuần hoàn qua cơ quan đó. ơearance

được tính bằng ml/phút, biểu thị số mililit huyết tương được gan hoặc thận lọc
sạch thuốc trong thời gian 1 phút. [14, 24].
C1 = -^ (ml/phút)
Cp
Trong đó: V là tốc độ bài xuất của thuốc qua cơ quan (gan, thận ) (mg/phút)
Cp là nồng độ thuốc trong huyết tương (mg/ỉ)
Cũng có khi Clearance được tính cho 1 kg thể trọng: ml/phút/kg.
Trị số C1 thực chất cũng chỉ là một trị số ảo, có tính lý thuyết vì sự tuần
hoàn của máu qua các cơ quan là hồi lưu, lặp đi lặp lại liên tục và thực tế
thuốc chỉ được lọc sạch hoàn toàn ra khỏi huyết tương sau một khoảng thời
gian 7*Tiỵ2 (xem “thời gian bán thải”).
Hệ số thanh thải có mối liên hệ mật thiết với sinh khả dụng, liều dùng và
cả với AUC của thuốc.
Trong phạm vi điều trị, khi mức liều chưa đủ gây bão hòa hệ bài xuất
thuốc thì C1 là một trị số hằng định, nghĩa là cứ sau một khoảng thời gian nhất
định lại có một tỹ lệ hằng định của thuốc được lọc sạch khỏi huyết tương, về
góc độ toán học, tốc độ bài xuất thay đổi tỷ lệ thuận với sự thay đổi của nồng
độ thuốc trong huyết tương tuân theo quá trình động học bậc 1. Trái lại, nếu
liều dùng quá lớn và cơ chế thanh lọc thuốc bị bão hòa thì quá trình bài xuất
thuốc sẽ tuân theo quá trình động học bậc 0, nghĩa là sau một khoảng thời
gian nhất định có một lượng thuốc cố định bị loại khỏi huyết tưoỉng. Trong
trường hợp này, C1 không hằng định nữa mà sẽ dao động.
Giá trị C1 được công bố với mỗi thuốc thường là Cltoàn bộ’ biểu thị khả
năng loại bỏ thuốc ra khỏi huyết thanh, huyết tương của tất cả các cơ quan bài
xuất trong cơ thể như gan, thận, phổi, da, nước bọt, các tuyến tiết Tuy
nhiên, chỉ có 2 cơ quan gan và thận là có khả năng lọc thuốc mạnh nhất, còn
lượng thuốc được bài xuất qua các cơ quan còn lại rất nhỏ và ít có ý nghĩa. Vì
thế người ta coi Cltoàn bộ xấp xỉ bằng tổng của Clg^ và Cl,hận.
^^toàn bộ ~ ^^thận ^^gan quan khác
^^toàn bộ ** ^^thận ^^gan

Như vậy ở mức liều điều trị, trị số C1 tỷ lệ nghịch với thời gian bán thải,
có nghĩa là thuốc có C1 lớn là thuốc được thải trừ nhanh ra khỏi Cơ th4(Ti/2 sẽ
ngắn).
-í:. —'
Từ trị số C1 và nồng độ thuốc đo được trong huyết tương, ta có thể tính
được tốc độ bài xuất thuốc ra khỏi cơ thể (v):
V = C1 * Cp (mg/min)
Cp là nồng độ thuốc trong huyết tương
C1 được xác định theo mức cp ở trạng thái ổn định, nghĩa là khi quá trình
hấp thu thuốc đã hoàn thành. Lúc này Cp = Qs (Qteady-state)'
Nếu dùng thuốc theo đưòfng truyền tĩnh mạch liên tục thì ta có thể lấy
máu ở thời điểm bất kỳ sau khi truyền xong, còn nếu dùng thuốc theo đường
uống, tiêm bắp hay truyền gián đoạn thì Qs chỉ có thể đạt được sau k h o ản ^ s^
Tv2-
2.4. Thời gian bán thải (T
1 1 2
). [14, 24].
Tj
/2
được biểu thị theo 2 nghĩa:
- Ti/
2
a hay Ti
/2
hấp thu là thời gian cần thiết để một nửa lượng thuốc đã
uống được vào vòng tuần hoàn. Nếu thuốc được đưa qua đường tĩnh mạch
hoặc đường tiêm bắp thì pha này không có hoặc không đáng kể, như vậy
không có Ti/
2
a-

■ Ti
/2
ß hay Ti
/2
bài xuất là thời gian cần thiết để một nửa lượng thuốc bài
xuất ra khỏi cơ thể. Ty2 ß còn gọi là thời gian bán thải, trong thực hành điều
trị, người ta sử dụng Ti
/2
này.
Giá trị Tj
/2
được tính toán thông qua C1 và Vd theo công thức sau:
rj. _ 0,693 *Vd
C1
ở những đối tượng bất thường về sinh lý và bệnh lý, sự thay đổi C1 là
nguyên nhân kéo theo sự thaỵ đổi do đó vấn đề hiệu chỉnh khoảng cách
đưa thuốc là bắt buộc.
Thời điểm sau (5* Tj/
2
) thì nồng độ thuốc ở trạng thái cân bằng (Qs), bởi
vì từ giai đoạn này trở đi, quá trình bài xuất cân bằng với quá trình phân bố,
do đó, sự thay đổi nồng độ diễn ra chậm và đạt ở trạng thái cân bằng. Thuốc
được coi là bài xuất hoàn toàn ra khỏi cơ thể sau (7*Tj/2). Lúc này nồng độ
thuốc trong máu chỉ còn chưa đầy 1% so với nồng độ ban đầu.
3. Mối quan hệ giữa các thông số Dược động học. [14].
C1 và thể tích phân bố (Vd) là những thông số Dược động học độc lập.
Điều đó có nghĩa là sự thay đổi C1 có thể không ảnh hưởng đến Vd hoặc
ngược lại. Trong khi đó thời gian bán thải (T
1
/

2
) lại phu thuôc C1 và Vd. Nếu
Tị
/2
thay đổi cổ nghĩa là C1 hoặc Vd hoặc cả C1 và Vd đã có sư biến đổi.
C1 cho ta biết tổng các quá trình bài xuất thuốc xảy ra trong cơ thể còn
thể tích phân bố cho biết sự phân bố của thuốc.
Mối quan hệ giữa C1 và Vd được phản ánh trong phương trình
C1 = K*Vd
Trong đó: K là hằng số tốc độ thải trừ hay còn gọi là hệ số bài xuất.
Tuy nhiên không phải cứ có sự thay đổi về Vd sẽ kéo theo sự thay đổi về
C1 bởi vì đây là hai thông số Dược động học độc lập và có quan hệ mật thiết
đến một trị số thứ 3 rất quan trọng đó là nồng độ thuốc trong máu.
Trong số ba trị số: Cl, Vd và Qs thì giá trị Q, thực ra chỉ phụ thuộc C1
chứ không phụ thuộc Vd. Quan hệ này được biểu thị qua hai phương trình sau
đây tùy theo cách dùng thuốc:
- Khi đưa thuốc bằng cách truyền tĩnh mạch liên tục, nồng độ thuốc ở
trạng thái hằng định (Qs) được tính theo phương trình:
C*~.
ss- Q
- Còn nếu truyền ngắt quãng hoặc uống nhiều liều kế tiếp nhau thì:
F*D
c =
C1*T
AUC
hoặc Q, =
1
Với T là khoảng thời gian từ khi đưa thuốc vào cơ thể đến thòi điểm lấy
máu để xác định Qs- Và có thể tính T từ công thức trên:
T=

c .
Nếu Vd giảm, có nghĩa là thuốc được phân bố trong một thể tích ít hon,
ta thường suy luận rằng như vậy thì nồng độ sẽ tăng. Thực ra không hẳn như
vậy. Trường hợp này nếu muốn tăng nồng độ thì C1 phải giảm, còn nếu Vd
giảm mà C1 lại tăng thì c sẽ không thay đổi.
4. Các mô hình nghiên cứu Dược động học.[20, 30].
Pharmacokinetic là khái niệm để chỉ động học về hấp thu, phân bố,
chuyển hoá và thải trừ của một chất. Khác với dược lực, Dược động học
nghiên cứu về cách thức mà cơ thể sống sử dụng để điểu khiển các chất ngoại
lai (xenobiotic) chứ không phải nghiên cứu tác động của thuốc lên cơ thể
sống.
Dược động học dựa trên đường cong nồng độ của thuốc hoặc sản phẩm
chuyển hóa của chúng trong cơ thể và những dữ liệu động học có liên quan
khác. Những thông số về Dược động học và mối tương quan giữa chúng được
thể hiện dưới dạng biểu thức toán học. Mối liên hệ toán học được thiết lập dựa
trên dữ liệu động học liên quan thu được trên mô hình nghiên cứu phù hợp gọi
là mô hình Dược động học (pharmacokinetic model). Hiện có ba mô hình
thông dụng được áp dụng phổ biến cho nghiên cứu về Dược động học của một
hợp chất trong hệ thống sống [24, 30].
- Mô hình sinh lý Dược động học, sử dụng các cơ quan và các vùng khác
nhau trong hệ thống sống.
- Mô hình ngăn cổ điển, dựa trẽn sự phân chia cơ thể thành những phần
hợp lý mà không cần có ý nghĩa về mặt giải phẫu, bao gồm cả những phần của
cơ thể được tập hợp lại.
- Mô hình không vách ngăn dựa trên lý thuyết thống kê thòi điểm của
biến ngẫu nhiên (the moment of random variable) trong đó coi sự tồn tại của
từng phân tử thuốc trong cơ thể là độc lập với nhau và thời gian tồn tại của
một phân tử thuốc trong cơ thể được xem như một biến ngẫu nhiên.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mô hình nghiên cứu không
vách ngăn để khảo sát Dược động học của GF.

^ ^
-

-
II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO GHÉP KHÔI PHỔ (HPLC-MS).
1. Giới thiệu nguyên tác cấu tạo của hệ thống HPLC:
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp,
sắc ký lỏng hiện đại là phương pháp tách trong đó pha động là 1 chất lỏng;
pha tĩnh chứa trong cột là 1 chất rắn đã phân chia dưới dạng phân tử hay là 1
chất lỏng phủ trên 1 chất mang dạng rắn hay 1 chất mang rắn đã được biến đổi
bằng liên kết hoá học với các nhóm hưu cơ [1, 3, 25].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được đưa ra đầu tiên năm 1969 nhưng
mới phát triển khoảng 20 năm trở lại đây. Cho đến nay HPLC đã chứng tỏ là
một trong những công nghệ phát triển và quan trọng bậc nhất trong các phòng
thí nghiệm hiện đại.
HPLC có nguyên tắc hoạt động tương tự sắc ký lỏng cột nhồi cổ điển, tuy
nhiên ở HPLC quá trình tách chất xảy ra nhanh hơn và tốt hơn [1, 25].
Các bộ phận cơ bản của một thiết bị HPLC được mô tả trong hình 2.
Bơm mẫu
Hình 2 : Sơ đồ hệ thống HPLC đơn giản.
Với các thiết bị HPLC hiện đại những bộ phận cơ bản của máy như bơm
cao áp, bộ bơm mẫu, bộ trộn dung môi đều được kết nối và xử lý trên máy vi
tính [25].
Hợp chất cần phân tích được hoà tan trong dung môi thích hợp bơm vào
đầu cột (thủ công hay tự động) và dịch chuyển trong cột nhờ dòng liên tục của
dung môi, lúc này các cấu tử tách ra trên cột. Bộ phận đưa mẫu vào cột là bộ
bơm mẫu. Các hợp phần của mẫu trong cột tương tác thuận nghịch vói pha
động theo kiểu liên tục. Bằng việc lựa chọn pha động (còn gọi là dung môi rửa
giải) và vật liệu nhồi cột thích hợp các hợp phần trong mẫu chuyển động trong
cột với tốc độ khác nhau. Khi các chất trong mẫu đi ra khỏi cột bộ phận nhận

biết (Detector) sẽ tiếp thu và truyền tín hiệu đến thiết bị ghi hay máy tứih. sắc
ký đồ là bản ghi phản ứng của Detector theo hàm thời gian và chỉ ra sự xuất
hiện các cấu tử dạng pic. [25'
2. Một sô đại lượng đặc trưng của HPLC
2.1. Thời gian lưu g iữ : [1,3]
Các chất tan trong hỗn họfp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký,
chúng sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất
định. Đó là thời gian lưu của mẫu trong hệ cột đã chọn. Thòi gian lưu này
được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa
giải ra khỏi cột tách ở điểm có nồng độ cực đại. Nếu gọi là thời gian lưu
tổng cộng của chất tan i ta luôn có :
Írì "*"^i
Trong đó : tg là thời gian không ỉm giữ
t'/Ịị là thời gian lưu giữ thực của chất i trong cột sắc ký.
Với A và B kế tiếp nhau trong sắc ký thì chúng ta có :
_ tn
a = -^
tA
a được gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B, hay hệ số tách
của hai chất đó. Đại lượng a càng lớn thì sự tách của 2 chất càng rõ ràng. Khi
đại lượng này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký của hai chất A và B.
2.2 Thể tích lưu: [1,3]
Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc ký
trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột cho đến lúc chất tan
được rửa giải ra
ở thời điểm có nồng độ cực đại (nghĩa là tương ứng với thời
gian lưu ÍRi).
2.3. Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc k ý : [1,3]
Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký người ta dùng
khái niệm số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa

trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Bề dày H
của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:
- Đường kính của hạt pha tũih, hình dạng và kiểu hạt (tròn hay mảnh).
- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất phân tích
- Tốc độ, thành phần pha động trong quá trình sắc ký
- Độ nhớt của pha động.
Bề dày (chiều cao) H được xác định bằng công thức :
16
Đây chính là chiều cao lý thuyết của 1 đĩa. Như vậy với một cột sắc ký
chiều dài L thì số đĩa lý thuyết N của cột đó là :
N = #
H
Hay là N= 16.
‘•Ri
Trong đó: Wị là chiều rộng đáy pic sắc ký, ÍỊỵ là thời gian lưu của chất i.
2.4. Khả năng phân giải : [1,3]
Hai đại lượng H và N là những hằng số đặc trưng cho một loại cột tách,
nhưng chúng chưa chỉ rõ cho ta biết, hai chất tan A và B được tách ra khỏi
nhau đến mức nào, khi nó được rửa giải ra khỏi cột sắc ký. Vì thế người ta đưa
ra đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo công thức :
D _ ^*(^RA ~^Rb)
WÂ + W
3
Trong đố các giá trị t'uß là thời gian liũi hiệu lực của hai chất A và B , còn và
Wß là chiều rộng đáy pic sắc ký của hai chất A và B.
Như vậy, để tách hoàn toàn hai cấu tử ra khỏi nhau thì phải đủ lớn.
Tuy nhiên nếu R^B quá lớn là không cần thiết vì lúc này cần rửa giải mất
nhiều pha động cho chất thứ hai.
2.5. Quá trình cột và sự mở rộng dải pỉc. Phương trình Van - Deemter

Nói chung chiều cao H của một đĩa phụ thuộc rất rõ rệt vào tốc độ của pha
động chảy qua cột sắc ký trong quá trình rửa giải các chất tan. Quan hệ này trong
một mức độ nhất định, nó được mô tả bởi phương trình Van Deemter sau đây:
H'= — + - + Cphađộng u.
^ + Cphadô„g« u
Chiều cao H của đĩa biểu thị cho sự mở rộng dải và các yếu tố ảnh hưởng đến
sự mở. Nó là hàm số của các quá trình nhiệt động học và động học ttong cột. E)ó là :
- Những tính chất không điều hoà của dòng, dẫn đến xáo trộn đối lưu.
- Sự khuếch tán dọc và ngang trong pha động.
- Mức độ giới hạn cân bằng của chất tan giữa pha động và pha tĩnh (sự
truyền khối),
A, B, c là các hệ số phụ thuộc ba yếu tố trẽn,
u là tốc độ pha động.
H (chiều cao
Hình 3 : Sơ đồ H - u đối với cột sắc kí lỏng.
Hiệu quả của cột tách tốt khi số đĩa lý thuyết của cột tách lón, chiều cao
của đĩa lý thuyết nhỏ sẽ cho số đĩa lý thuyết lớn. Một cách lý tưởng ta sử dụng
tốc độ dòng ứng yới chiều cao đĩa tối thiểu (tốc độ tối ưu). Trong thực tế người
ta sử dụng tốc độ pha động nằm ở phía phải u tối ưu một chút, tuy hiệu quả
cột có giảm đi chút ít nhưng lại rút ngắn được thời gian phân tích [11].
3. Một số trang bị trong kĩ thuật HPLC ;
3.1. Cột tách sắc ký: [1,3]
Cột tách là bộ phận chính của quá trình sắc ký, vì mọi diễn biến sự tách
một hỗn hợp chất mẫu đều xảy ra ở đây và kết quả của sự tách tốt hay không
tốt thì cột tách luôn luôn là một yếu tố quyết định. Người ta nói cột tách là trái
tim của hệ thống sắc ký cũng là hoàn toàn đúng.
Cột tách được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp
suất cao đến vài trăm bar, có khi đến 1000 bar. Thông thường có đường kính
trong từ 2- 5mm, chiều dài 15 - 25 cm, tùy mục đích phân tích ta có thể chọn
loại cột khác nhau. Pha tĩnh (chất nhồi cột) là những chất rắn xốp và kích

thước hạt rất nhỏ, đưcmg kính cỡ hạt từ 3 - lOịLim, diện tích bề mặt riêng
thường từ 50 - 500mVg, chứa trong cột tách, làm nhiệm vụ tách sắc ký hỗn
hợp chất phân tích. Hiện nay, pha tĩnh thường được sản xuất từ các Silica
trung tính, qua việc Ankyl hoá các nhóm -OH trên bề mặt Silica trung tính
bằng các nhóm Ankyl của mạch cacbon thẳng (- C
2
, - Cg loại này có
bề mặt không phân cực. về chất nhồi c -18 trên nền Silica có Hypersil OD5 -
C-18 (hãng Shandow), Lichrosorb RP - 18 (hãng Merck), C-18 Corasil (hãng
Whatman), Symmettry C-18 (hãng Waters),
Tùy thuộc vào bản chất của các pha mà ta có những phương pháp sắc ký
khác nhau:
- Sắc ký phân bố : Trong loại này có hai hưófng ngược nhau là pha thuận
và pha đảo.
- Sắc ký trao đổi ion và cặp ion
- Sắc ký hấp phụ,
- Sắc ký rây phân tử hay sắc ký trên gel [1].
Hiện nay, sắc ký phân bố pha đảo được sử dụng phổ biến nhất trong phân
tích vì nó cho kết quả tách tốt với nhiều đối tượng tách.
3.2. Các loại Detector trong HPLC *Detetor khối phổ
Về nguyên tắc thì đây chính là một máy quang phổ khối lượng. Việc sử
dụng máy MS làm Detector cho HPLC là một thành công trong việc ghép hai
kĩ thuật này. MS là một Detector ưu việt bậc nhất trong sắc ký hiện nay, có độ
nhạy rất cao và độ chọn lọc cao.[ 21].
Máy khối phổ đầu tiên được chế tạo bởi J.Thompson (Anh) vào năm
1912 và F.W. Aston vào năm 1919 nhưng thiết bị hoàn thiện hơn từ năm
1932. Sơ đồ chung của một máy khối phổ được thể hiện ở hình 4:
Hình 4: Sơ đồ chung của máy khối phổ
Mẫu được nạp vào máy có thể ở 3 dạng : khí, lỏng, rắn Khi ghép nối
với HPLC, mẫu lỏng từ cột vào buồng hoá khí mẫu, dưới áp suất thấp (nhờ

bơm hút chân không) biến mẫu lỏng thành dạng khí (áp suất lO'"^ - 10’^mm
Hg). Mẫu sau khi biến thành dạng khí đựng ở bình chứa đi sang buồng ion
hoá qua một lỗ nhỏ có đường kính 0,013 - 0,050 mm . Quá trình ion hoá được
thực hiện ở đây. Có khá nhiều phương pháp ion hoá như : phương pháp va
chạm Electron, ion hoá phun ion, ion hoá hoá học, ion hoá trường, ion hoá
Proton, bắn phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh Hiện nay phương pháp ion
hoá phun ion và ion hoá hoá học được sử dụng phổ biến cho Detector khối
phổ khi ghép nối HPLC.[21, 22].
Trong phương pháp ion hoá phun ion (EI - Electrospray Ionization) các
phân tử hoá chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao
quản bằng kim loại cao thế (3- 5kV) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ
thoát ra chung quanh ống mao quản. Dưới tác dụng của điện thế cao và khí
phun nitơ tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao
quản.
Trong khí nóng các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện
tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, sẽ vỡ
dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích. Sau đó các ion dưoỉng hoặc âm tạo
thành được đưa vào bộ phần tách ion qua một cửa rất nhỏ. Dung môi và khí
Nitơ bị bơm hút ra ngoài. Trong ống mao quản và đầu thoát ống mao quản,
quá trình sau đây sẽ xuất hiện :
M + ->MH^
Việc thêm acid vào dung môi sẽ làm giảm thế mao quản cần thiết để
phân cắt nước thành các ion.
Trong phương pháp ion hóa phun ion (Electrospray ionization) có hai kỹ
thuật đó là: ESI (+) và ESI (-).
Với kỹ thuật ESI (+) tạo ra ion dương: M +nH'^
(n>i)
z n
Với kỹ thuật ESI (-) tạo ra ion âm: M -
z n

Trong đố: m là phân tử khối của ion
z là điện tích của ion
M là phân tử lượng
Các ion được hình thành được tách biệt ra khỏi nhau theo số khối nhờ bộ
phận thiết bị riêng là một nam châm có từ trường hoặc kèm theo một điện
trường nữa. [21]
Có 3 loại thiết bị chính :
- Khối phổ kế hội tụ đơn
- Khối phổ kế hội tụ hai lần
- Khối phổ kế tứ cực.
Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song với nhau
thành một bó. Hai đầu được đặt lên 2 giá đỡ. Từng cặp đối diện âm hay dương
của nguồn điện một chiều. Ngoài ra thế tần số vô tuyến đã được sử dụng cho
cả hai cặp. Cả hai trường đều không làm tăng tốc phần tử điện tích dưoỉng từ
nguồn đi ra. Tuy nhiên chúng làm cho các phần tử dao động xung quanh trục
trung tâm khi chuyển động do đó chỉ có các ion có số khối nhất định mói đến
bộ phận thu góp được. Do sự thay đổi tần số và thế cung cấp đã làm cho các
ion có số khối khác nhau lần lượt đến bộ phận thu góp [21]. Tại đây ion được
nhận diện, đo cường độ và ghi kết quả dưới dạng khối phổ.
Khối phổ (Mass spectrum) đó là giản đồ biểu diễn cường độ tưoỉng đối
của các ion sinh ra từ phân tử hóa chất theo trị số m/z, trên đó ion có cường độ
lófn nhất (ion căn bản 100%), các ion còn lại có cường độ tương đối (< 100%)
so với ion căn bản.
Khối phổ kế (Mass spectrometer) ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra
từ phân tử hóa chất ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram)
và khối phổ được lấy theo FULLSCAN MS trong khoảng khối lượng ghi tất
cả các ion sinh ra' từ phân tử hóa chất. Trong sắc đồ toàn ion, pic A ứng với
thời gian lưu biểu diễn tổng cường độ các ion Aj, A
2
, A 3 được sinh ra từ

chất A.
Nếu ngay từ đầu ta chỉ cho khối phổ kế nhận diện ion Aj (z = 1) mà thôi
và ghi sắc đồ theo thời gian, đó là áp dụng kỹ thuật SIM (selected ion
monitoring) để phát hiện chất A. sắc đồ lúc mấy giờ chỉ ghi pic có chứa ion