NGHIÊN CUSU BIỂU HIỆN PROTEIN PANTON VALENTINE LEUKOCIDIN của VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Y HC THC HNH (864) - S 3/2013



40
NGHIÊN CứU BIểU HIệN PROTEIN PANTON VALENTINE LEUKOCIDIN
CủA VI KHUẩN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS


Ân Khắc Huy, Nguyễn Thị Phơng Lan,
Diệp Thế Tài, Vin Pasteur Tp. H Chớ Minh

TểM TT:
t vn : Panton Valentine leukocidin (PVL) l
mt trong nhng c t liờn quan n hoi t mụ, lm
tng c lc, úng vai trũ quan trng trong kh nng
xõm nhim ca cỏc chng vi khun S. aureus. Nghiờn
cu biu hin protein PVL l bc u trong vic
nghiờn cu vai trũ gõy bnh cng nh tm soỏt phõn
b PVL trong cng ng v nhim trựng bnh vin
hin nay.Phng phỏp: PCR c dựng trong thu
nhn gen mc tiờu lukS-PV mó húa PVL-S. K thut
to dũng c s dng to ra vector tỏi t hp
pET22b-PVL-S. Biu hin PVL-S c cm ng bng
IPTG, c khng nh bng in di SDS-PAGE v lai
Western blot vi khỏng th khỏng His. Kt qu: Gen
lukS-PV thu c ỳng kớch thc d kin l 375 bp.
Vector tỏi t hp sau khi kim tra bng PCR, enzyme
ct hn ch v gii trỡnh t cho kt qu gen lukS-PV
chốn ỳng chiu v ng khung trong vector pET22b.

Protein PVL-S ó c biu hin thnh cụng vi kớch
thc 18 kDa khi chuyn vector pET22b-PVL-S vo t
bo BL21(DE3). Kt lun: Protein PVL c biu hin
thnh cụng, õy l c s cho nhng nghiờn cu tip
theo v protein PVL-S trong vic to khỏng th v
nghiờn cu quy trỡnh thu sinh khi ln protein ny ang
c tip tc trin khai.
T khúa: S. aureus, Panton Valentine leukocidin
gene, protein.
T VN
Staphylococcus aureus (S. aureus) l mt trong
nhng tỏc nhõn hng u gõy nhim trựng bnh vin
v cng ng. Thờm vo ú l kh nng khỏng cỏc
loi khỏng sinh ang gia tng gõy khú khn trong
cụng tỏc iu tr, nht l cỏc chng S. aureus khỏng
methicillin (MRSA). Nguy him hn l nhng chng S.
aureus mang gen lukS-PV mó húa protein PVL [1]. S
biu hin PVL l nguyờn nhõn ca nhng tn thng
liờn quan n hoi t mụ, tng c lc cho S. aureus
v gõy gim s lng bch cu trong t bo ch.
PVL c cu to t 2 thnh phn l PVL-S v
PVL-F c gn xen k nhau to nờn cu trỳc dng
vũng cú hot tớnh [2]. Khi xõm nhp vo vt ch, S.
aureus s tng hp hai thnh phn PVL-S v PVL-F
di dng monomer hũa tan trong nc. u tiờn
PVL-S gn lờn mng bch cu, sau ú s dimerizes
vi PVL-F, tip tc gn xen k hỡnh thnh mt cu
trỳc dng vũng [3], tri qua nhng thay i v hỡnh
dng dn n s hỡnh thnh mt l xuyờn qua mng
bch cu dn n vic ly gii lm gim s lng

bch cu. Sau khi ly gii, nhng ht trong bch cu
s c gii phúng, c th l histamine t basophil.
Nhng ht ny s kớch thớch cỏc bch cu trung tớnh
sn xut enzyme (-glucuronidase v lysozyme), cỏc
thnh phn chemotactic (leukotrimen-B4 v IL-8) dn
n mt lot cỏc viờm nhim trung gian [4,5,6].
Nhng phn ng trờn s lm hoi t vựng mụ xung
quanh v trớ nhim. Kh nng tng c lc ca nhng
chng S. aureus cú biu hin PVL cho ti nay vn
cha c lm rừ.
Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi tin hnh to
dũng v biu hin protein PVL-S trong h thng E. coli
vi mc tiờu phc v cho cỏc nghiờn cu tip theo v
PVL trong vic tỡm hiu c ch gõy bnh cng nh vai
trũ ca protein ny trờn cỏc chng MRSA .
PHNG PHP NGHIấN CU
Chng vi sinh vt v plasmid
Chng chun S. aureus ATCC 25923 c s
dng thu nhn gen lukS-PV. Chng chun E. coli
DH5 (F endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi
recA1 gyrA96 lacU169 (80 lacZ M15)) (Promega)
dựng lm chng ch to dũng v lu tr plasmid
tỏi t hp. Chng E. coli BL21(DE3) (F dcm ompT
hsdSB (rB mB-) gal met)
(Promega) dựng biu hin protein tỏi t hp.
Plasmid pET22b do hóng Novagen cung cp, chu s
kim soỏt ca promoter T7 c dựng lm vector
biu hin PVL.
Thu nhn gen ớch bng phn ng PCR
Phn ng PCR thu nhn gen lukS-PV c tin

hnh vi cp mi c hiu cho gen lukS-PV, do
chỳng tụi t thit k cú mang trỡnh t nhn bit ca
enzyme ct hn ch EcoRI u 5 v NotI u 3
nhm khuch i on gen mc tiờu di 375 bp:
5-CGAATTCATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCC3
v 5 CGCGGCCGCATTATGTCCTTTCACTTTTTTC - 3.
Chng trỡnh phn ng PCR bao gm 25 chu k,
mi chu k gm 1 bc bin tớnh 94
0
C trong 1
phỳt, 1 bc bt cp 55
0
C trong 1 phỳt v mt
bc kộo di 72
0
C trong 1 phỳt; cui phn ng l
mt bc kộo di trong 10 phỳt 72
0
C. Sn phm
PCR sau ú c bo qun 4
0
C v c kim tra
bng in di trờn gel agarose 1,5%.
Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013



41

Thiết lập vector tái tổ hợp pET22b-PVL-S có

mang gen lukS-PV
Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme cắt hạn
chế EcoRI và NotI. Sản phẩm cắt được nối vào
vector biểu hiện pET22b bằng enzyme T4 DNA
ligase. Vector tái tổ hợp tạo thành được đặt tên là
pET22b-PVL-S và được biến nạp vào E. coli DH5α
bằng phương pháp hóa biến nạp.
Sàng lọc thể biến nạp và giải trình tự DNA
PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu và sử dụng
enzyme cắt hạn chế BsaI và XbaI để sàng lọc thể
biến nạp. Bên cạnh đó, giải trình tự cũng được dùng
trong việc khẳng đình sự đồng khung của gen mục
tiêu vào plasmid. Qui trình giải trình tự được thực
hiện tại Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. Trình
tự thu nhận được so sánh với trình tự lý thuyết bằng
phần mềm ClustalX 2.0.12.
Biểu hiện protein PVL-S
Tiến hành biến nạp plasmid pET22b-PVL-S vào
dòng tế bào E. coli BL21(DE3) và sàng lọc bằng
kháng sinh ampicillin và PCR khuẩn lạc. Chọn khuẩn
lạc dương tính với phản ứng PCR để tiến hành biểu
hiện protein dưới sự cảm ứng của IPTG.

Hình 1: Kết quả điên di gen lukS-PV
(A): M. Thang 100bp; 1. Chứng âm; 2. Sản phẩm PCR thu nhận gen lukS-PV.
(B): M. Thang 100bp; 1. Chứng dương; 2. Chứng âm; 3 và 4. Sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định gen lukS-PV
(C): M. Thang 100bp; 1. Chứng dương; 2. Sản phẩm PCR gen lukS-PV từ plasmid

4000 bp
1600 bp

1 2 M

Hình 2: Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng
enzyme cắt hạn chế
M. Thang 1kb plus; 1. Plasmid pET22b (chứng
dương); 2. Plasmid tái tổ hợp

Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013



42
Phân tích protein PVL-S bằng SDS-PAGE và lai
Western blot
Các mẫu protein thu được sau khi phá tế bào sẽ
được xử lý với dung dịch nạp mẫu 2X (SDS 4%, Tris-
HCl (pH=6,8) 0,125M, Sucrose 10%, Bromphenol
blue 0,04%, Beta-mercapto 10%). Tiến hành điện di
SDS-PAGE với nồng độ gel polyacryclamide là 16%.
Protein sau khi điện di được chuyển lên màng lai và
thực hiện lai Western blot với kháng thể đơn dòng
kháng đuôi 6xHis và phát hiện nhờ kháng thể kháng
IgG của chuột cộng hợp với HRPO.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thu nhận gen lukS-PV
Gen lukS-PV được khuếch đại bằng phản ứng
PCR với cặp mồi đặc hiệu, cho sản phẩm có một
vạch có kích thước 375 bp (hình 1A) tương ứng với
kích thước gen lukS-PV như đã thiết kế theo lý
thuyết. Như vậy, cặp mồi đặc hiệu do chúng tôi thiết
kế có thể dùng để thu nhận trình tự gen mục tiêu
đúng như trình tự lý thuyết.
Tạo vector tái tổ hợp pET22b-PVL-S mang gen
lukS-PV
Sàng lọc khuẩn lạc và tách chiếc plasmid tái tổ
hợp sử dụng cho PCR plasmid với cặp mồi đặc hiệu
cho gen lukS-PV, cho kết quả tương ứng với kích

thước của gen lukS-PV (hình 1C). Sản phẩm cắt mở
vòng của plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme BsaI
và XbaI (hình 2) cho một vạch có kích thước khoảng
2000 bp tương ứng với gen lukS-PV chèn vào giữa vị
trí của 2 enzyme trên. Plasmid pET22b được cắt với
cặp enzyme BsaI và XbaI thì đoạn ngắn chỉ dài
khoảng 1650 bp do không có gen lukS-PV chèn vào
(hình 2, giếng 1). Như vậy, plasmid thu nhận được là
plasmid pET22b có gắn gen lukS-PV.
Vector tái tổ hợp pET22b-PVL-S được kiểm tra
thêm một lần nữa bằng phương pháp giải trình tự
DNA. So sánh kết quả giải trình tự với trình tự gen
lukS-PV theo thiết kế cho thấy có sự tương đồng
100% (hình 3). Gen lukS-PV được gắn chèn vào vị trí
của enzyme EcoRI và NotI có sự đồng khung dịch mã.