Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Staphylococcus aureus gây độc đường ruột nhóm B trong thịt lợn bán tại Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC







NGUYỄN THỊ THU HUYỀN






NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
VI KHUẨN Staphylococcus aureus GÂY ĐỘC ĐƢỜNG
RUỘT NHÓM B TRONG THỊT LỢN BÁN TẠI THÁI
NGUYÊN




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Vấn đề an toàn thực phẩm đang trở thành một vấn đề quan trọng đối
với sức khỏe cộng đồng ở hầu hết các nước phát triển và ở cả các nước đang
phát triển. Trong các loại thực phẩm sử dụng hàng ngày thì thịt lợn là loại
thực phẩm thông dụng thường xuyên được sử dụng để chế biến các món ăn
trong thực đơn hàng ngày của mỗi gia đình. Tuy nhiên trong thời gian gần đây
có rất nhiều bệnh dịch liên quan đến thịt lợn mà vì lợi ích trước mắt con
người vẫn sử dụng và bỏ qua các tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm đã -
đang - và sẽ đe dọa sức khỏe của con người. Các vụ ngộ độc có thể có nhiều
nguyên nhân như do: hóa chất, bản thân thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,
thực phẩm chứa vi sinh vật gây bệnh,…Trong đó, các vụ ngộ độc thực phẩm
do nhiễm vi sinh vật gây ra phát triển nhanh chóng với các hậu quả nghiêm
trọng.
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị
nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc có chứa các chất có tính chất độc
hại đối với con người. Trong số các vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh đó có tụ

cầu vàng (Staphylococcus aureus) là một trong những nguyên nhân chính gây
ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng có thể do ăn, uống phải
độc tố ruột của tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng.
Điều đáng chú ý ở đây là một số độc tố của chúng bền với nhiệt và khó bị
phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó là độc tố ruột staphylococcal
enterotoxin B (SEB). SEB cũng là tác nhân gây ra ngộ độc thực phẩm thường
gặp nhất ở S. aureus. Hơn nữa chúng lại có khả năng kháng methiciline,
penicillin, khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây những căn
bệnh nguy hiểm. Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu cho nhiễm
độc các độc tố nhóm này, phương pháp phòng ngừa đặc hiệu cũng không có,
việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì
không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có mặt
SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Mặt khác, việc giết mổ và bán thịt lợn chủ yếu do tư nhân thực hiện,
phương tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y.
Việc kiểm tra vệ sinh thú y của cán bộ kiểm dịch còn gặp nhiều khó khăn hiện
chỉ dừng lại ở mức độ kiểm tra cảm quan thịt được bán tại chợ.
Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính của vi khuẩn Staphylococcus aureus gây
độc tố đường ruột nhóm B trong thịt lợn ở Thái Nguyên.”
2.Mục tiêu nghiên cứu:
Xác định tỉ lệ nhiễm và đặc tính của độc tố nhóm B ở vi khuẩn
Staphylococcus aureus trên thịt lợn, từ đó làm cơ sở để các nhà dịch tễ học có
những biện pháp nhằm khắc phục tình trạng ngộ độc thực phẩm.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát tình hình giết mổ và xác định tỉ lệ nhiễm Staphylococcus
aureus

- Xác định các đặc tính sinh hoá của các chủng Staphylococcus aureus
đã phân lập được
- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus
phân lập được trên chuột bạch khoẻ
- Phân lập và xác định trình tự gen độc tố đường ruột Enterotoxin nhóm
B của chủng Staphylococcus aureus
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng Staphylococcus aureus đã phân
lập được đối với một số loại kháng sinh.





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và
độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Tình hình nhiễm trùng, nhiễm độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị
nhiễm vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc
hại đối với người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều
người tại cùng một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng một loại thức ăn. Ngộ độc
thực phẩm có những triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu
chảy .v.v hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây
ngộ độc [34].
Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một
trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở cả các

nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát
triển [31]. Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200
bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm. Các triệu chứng lâm sàng khá đa
dạng, từ mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với
nguy cơ tử vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời
sống của bệnh nhân. Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua
thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng. Ví dụ, mỗi năm ở Hoa Kỳ
có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca
nhập viện và 5 nghìn ca tử vong [23]. Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân
khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm.
Các loại mầm bệnh gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm:
Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm
các mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc.
Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh
vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh [15]. Các mầm bệnh vi sinh vật
bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus, trong đó các loại vi khuẩn gây
ra tới 90% số ca bệnh tử vong ở người.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất và phân
phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn
đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng
thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt đã
làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao. Số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [23]
Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh
trực tiếp từ thực phẩm vẫn còn chưa được phát hiện đầy đủ. Tại Hoa Kỳ, chỉ
có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong
do nhiễm trùng độc thực phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân

[23]. Trong số các nguyên nhân đã được xác định, có một số mầm bệnh có
khả năng gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ
tử vong cao như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia
enterocolitica.v.v [15].
Listeria monocytogenes thường gặp ở sữa và các sản phẩm từ sữa, thịt,
cá và rau. Vi khuẩn này có thể gây viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiết
niệu và tử vong, đặc biệt nguy hiểm với người suy giảm miễn dịch có khả
năng lây nhiễm cao như: ung thư, AIDS, nghiện rượu, đái tháo đường.
Escherichia coli có mặt trong tất cả các loại thực phẩm chết biến không vệ
sinh, có nhiều chủng với các khả năng gây bệnh khác nhau như chủng gây ỉa
chảy (EPEC); chủng sinh độc tố ruột (ETEC) gây ỉa chảy ở trẻ em và khách
du lịch.v.v…[28]
Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu
gây ra ngộ độc [3] .
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus
aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B
Tụ cầu S. aureus là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh được ghi
nhận sớm nhất vào đầu những năm 1880. Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm
trùng, nhiễm độc thức ăn được biết đến từ năm 1914, nhưng mãi tới năm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
1930, Dack và cs mới xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể
gây ra bởi các độc tố ruột có trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [5].
Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực
phẩm do S. aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt
là ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan
sữa, 7% từ cá, sò, ốc .v.v… và 3,5% từ trứng [30]. Tại Pháp, trong số các thực
phẩm nhiễm S. aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản

phẩm từ sữa (đặc biệt là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và
hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác
từ gia cầm (9,5%) [19]. Tại Hoa Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực
phẩm do S. aureus được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do
tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt:
5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [33]. Ở
châu Á các vụ nhiễm S. aureus chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và
trong khu vực Đông Nam Á.
Ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ ngộ độc S. aureus ở trẻ
em vì uống sữa bị nhiễm S. aureus. Còn ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc
S. aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5
trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở
vùng Kansai. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có
nhiễm S. aureus của tập đoàn Snow.
Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S. aureus
cao là Indonesia và Philippines. Việt Nam cũng là một trong những nước có
tỷ lệ nhiễm S. aureus cao ở trong khu vực châu Á. Như vậy, giữa các nước
khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa
dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
(96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v. Đáng chú ý là vi khuẩn S.
aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [7].
Tình trạng ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn
mà tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ
biến ở nhiều địa phương khác trên cả nước [30]. Tuy nhiên, cho tới nay tại
Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc hay tử vong do
ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn

cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB:
- Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các
cơ sở chuyên khoa.
- Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có
biểu hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh.
- Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc
thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá
mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều
công sức và thời gian kéo dài. Do đó, khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các
nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng
nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn tới tử vong ở người.
Dựa theo bảng 1.1 dưới đây, chúng ta nhận thấy tình trạng xuất hiện vi
sinh vật S. aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước. Vi
khuẩn có thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm
khi họ cùng tiêu thụ một loại thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus có
thể xảy ra với bất kì đối tượng nào. Tuy nhiên, người già, trẻ em và những
người có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc
nặng nề hơn [4].





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Bảng 1.1. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng
trên toàn quốc từ 2007 – 2012.

STT

Địa điểm
Thời
gian
Số ngƣời
mắc
bệnh
Đặc điểm bệnh
nhân
1
Mầm non bán công Vĩnh
Thọ - Phú Thọ
9/2007
100
Học sinh
2
Mầm non Vườn Hồng, P9
– Tân Bình; Tiểu học Âu
Cơ, Q11 – TP HCM
12/2007
65
Trẻ em (từ 2-5
tuổi)
3
Minh Long – Quảng Ngãi
2/2008
53
Người dân
4
Hà Nội
5/2008

122
Khách dự đám
cưới
5
Cty TNHH Alliace One,
KCN Giao Long, Bến Tre
6/2008
100
Công nhân
6
Sơn La
9/2008
581
Người dân
7
Tiểu học Tam Bình,
Q.Thủ Đức – TP HCM
11/2008
51
Học sinh và phụ
huynh
8
Cty Phú Nguyên, KCN An
Đồng, Hải Dương
8/2009
160
Công nhân
9
Bản Hùn xã Chiềng Cọ
Sơn La

4/2012
300
Khách dự đám
cưới

Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB của nó
gây nhiễm trùng, nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng
và cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
đang nhiễm độc nhiễm trùng. Nhưng trước hết chúng ta cần phải tìm hiểu về
đặc tính sinh hoá và nghiên cứu ở mức độ phân tử làm nền tảng. Chính vì vậy,
việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn và cấp bách.
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1. Lịch sử phát hiện
Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi
thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt.
Năm 1880 Louis Paster cũng đã tiến hành phân lập và nghiên cứu về
Staphylococcus aureus.
Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày
tại hội nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông
sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tương đối đầy
đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng.
Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm,
đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S. aureus sau này.
Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ
hơn về vi khuẩn này. Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus
aureus.
Năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối

tương quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tương của vi
khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện
này mới được chấp nhận rộng rãi.
1.2.2. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp
Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài
Staphylococcus aureus.
Tên khoa học: Staphylococcus aureus [12] .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm
chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh
ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzyme này mà trên môi
trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn
được gọi là tụ cầu vàng.
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng
dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các
nhóm I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S.
aureus [5].
1.2.3. Đặc điểm vi khuẩn học
1.2.3.1. Hình dạng và kích thƣớc
Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có
nghĩa chùm nho) Tế bào tụ cầu khuẩn S. aureus hình tròn, đường kính 0,5-
1m, không di động, không sinh nha bào, không có vỏ capsule (giáp mô),
không có lông, bắt màu Gram dương.
Trong bệnh phẩm tụ cầu thường tụ tập thành đám nhỏ như những chùm
nho. Trong môi trường canh khuẩn xếp thành những đám lớn (Hình 1.1).

Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi
khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus
cereus cũng thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [33].
1.2.3.2. Tính chất nuôi cấy
Tụ cầu S. aureus sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp 30-37
o
C, pH 7,2-7,6
[2].
- Môi trường nước thịt: Sau 5-6h nuôi cấy ở điều kiện 37
o
C vi khuẩn
phát triển làm đục môi trường, sau 24h độ đục tăng, lắng cặn nhiều, không tạo
màng trên mặt môi trường.
- Môi trường thạch thường: Sau 24h nuôi cấy ở điều kiện 37
o
C, vi
khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, vàng thẫm hoặc vàng

chanh.
- Môi trường thạch máu: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24h/37
o
C hình thành
những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, có thể gây dung huyết.
- Môi trường thạch Chapman Stone: Chapman Stone agar là môi
trường chọn lọc để phân lập vi khuẩn tụ cầu. Sau 24h/30
o
C, tụ cầu khuẩn
S aureus lên men đường mannit (mannitol) làm giảm pH môi trường (tỷ lệ
pH= 7,2 giảm xuống pH =6,8), tạo thành những khuẩn lạc dạng S, màu vàng.
- Chuyển hoá đường: Tụ cầu khuẩn có khả năng lên men đường
glucoza, lactoza, levuloza, mannoza, mannit, saccaroza, không lên men đường
galactoza.
- Phản ứng Catalaza: dương tính.
1.2.3.3 Độc tố và khả năng gây bệnh
- Các loại độc tố:
Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng sốc
nhiễm độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố
epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin
(staphylokinase); coagulase; hyaluronidase; β – lactamase và độc tố ruột
(enterotoxin) – trong đó có SEB [5]. Ngoài ra, tụ cầu có hệ enzyme phong
phú góp phần làm tăng độc lực của chúng đối với các tế bào vật chủ.

Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus

Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng
không phải là tất cả mọi chủng. Các độc tố này là những protein tương đối
bền với nhiệt, nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ
28000-30000 Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [5].
Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm
trong nhóm những độc tố ruột do S. aureus tạo ra [25]. Về miễn dịch, các loại
này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên
chéo. Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ
tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. Các enterotoxin có thể được xác định
bằng các kỹ thuật miễn dịch [3]. Trong các dạng độc tố ruột do S. aureus sinh
ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố thường gặp nhất trong các
vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu. Ngoài ra SEB còn là một trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê trong danh mục vũ
khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học [18].
- Cơ chế gây bệnh
Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây
bệnh có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh. Bước quan

trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là
sự bám dính (adherence) của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ.
Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết
niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt
phế nang, tổ chức nội mô). Giống như các vi khuẩn Gram dương khác là
Streptococcus và Mycobacteria, S. aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ
các adhensin có bản chất polypeptide. Một khi đã bám dính vào bề mặt tế bào
vật chủ, tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động các quá
trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và
hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. S. aureus sẽ tiếp tục tiến sâu
vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion). S. aureus
xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase;
hemolysine, leukocidin; exfoliatine .v.v, phá hủy các thành phần cấu tạo tế
bào vật chủ [35, 36].
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ
cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng.
Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ
rộng, dẫn đến các vi khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo
điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng tăng trưởng về số lượng. Ngoài nguyên
nhan là do tụ cầu, một số trường hợp có thêm vai trò của vi khuẩn
Clostridium difficile [5]. Ước tính khoảng 0,1 mg S. aureus đã đủ gây ngộ độc
thực phẩm ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc độ
nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [33].
- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng S. aureus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các
triệu chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ)
thời gian ủ bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác

(trung bình 2-3 giờ). Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu
chứng nôn ói, đau quặn bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất
nôn chủ yếu là nước. Triệu chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo
máu và ít mất nước hơn so với tả và E. coli. Bệnh nhân không sốt hay phát
ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với
các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người bệnh bình thường. Phần lớn trường
hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24 giờ sau khởi phát nhưng trường
hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong. Bệnh nhân ngoài ra có thể bị
sốc do mất nhiều nước và chất điện giải. Khác với ngộ độc thực phẩm do vi
khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân mắc ngộ độc do
độc tố SEB của S. aureus sẽ bị sốt cao [4].
1.2.4. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng
tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476,
N315, Mu50, RF122 .v.v. [11],[17], [20],[ 12], [22]. Ví dụ: Steven và cs đã
thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S. aureus
COL. Kết quả giải trình tự đã được đăng ký trên Genbank với mã số:
CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó,
trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G - C, điều này gây ra mối
quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây
bệnh Gram dương khác [29].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ
giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [13]. Tại Pháp, trong số 61
chủng phân lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống
enterotoxigenic. Ở Pháp, trong 332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều
loại thức ăn có 57% chủng chứa các gen SEG,SEB, SEI và SEJ xuất hiện với
tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA và SEE, trước đây vốn được xem là
chiếm ưu thế [4, 27].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
1.3. Nội độc tố đƣờng ruột staphylococcal enterotoxin B
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B
SEB là 1 trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S. aureus.
Thông thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các
hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc
tố ruột) [14].
Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong
các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [14]. Độc tố ruột SEB được hình
thành khi tụ cầu S. aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi
trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu
.v.v [4].
Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S.
aureus nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự amino acid của SEB
đã được xác định từ năm 1970 [21]. Giống như các cấu trúc protein ngoại bào
khác của S.aureus thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong
thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal
peptide) gồm 27 amino acid ở đầu N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức
năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị
cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt động trong môi trường
ngoài tế bào gồm 239 amino acid trong 1 chuỗi polypeptit đơn, có khối lượng
phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm:
7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối cystein ở vị
trí 120 và 140 [41]. Theo Bruce A. G và cs (2009), protein SEB có 2 vùng cấu
trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB
chống lại sự tác động của các proteases, gồm trypsin, chymotrypsin và papain
có trong ruột [14].
Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần
giống với các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G ,S, T cùng do vi khuẩn
S. aureus tạo ra. Đặc biệt, trình tự amino acid của SEB có mối tương

đồng cao với trình tự amino acid độc tố ruột C1 cũng có 239 amino acid [16].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các siêu kháng nguyên
staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên phân tử
MHC nhóm II. Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên
SEA, SEB và SEC sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ
[14].
Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen SEB
của chủng vi khuẩn S. aureus S6. Theo đó, trình tự của 1 gen SEB hoàn thiện
được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung
đọc mở gồm 798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide
thứ 1042 [16]. Đoạn gen SEB phân lập ở các chủng từ những vùng địa lý khác
nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Trình tự gen SEB
của các chủng khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386),
COL (CP000046, AF410775) .v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu
gen (NCBI) [24], [17], [32].
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B
Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các
lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ. Các độc tố liên kết trực tiếp đến
phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia
tăng số lượng lớn các lympho T. SEB được coi là một "siêu kháng nguyên”
của vi khuẩn vì có thể tạo thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế
bào trình diện kháng nguyên và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4,
CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà
không cần thiết phải có một quá trình chế biến và trình diện thông thường.
Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine, interleukin 2 (IL-
2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các interferon. Nếu ăn thực phẩm
có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn, và tiêu

chảy. Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của
lông ruột được sinh ra ồ ạt [14]
Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào
trình diện kháng nguyên bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17
1/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích sản xuất cytokin một cách ồ ạt gây
lên hiện tượng sốc độc tính trong cơ thể.
SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định.
SEB có khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được
nhiệt độ sôi trong vài phút. Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh
khô, SEB có thể được lưu trữ trong hơn một năm [14].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm có trong thịt lợn
tươi.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu thịt lợn tươi lấy tại các chợ trung tâm thành phố Thái Nguyên
- Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn ở dạng tổng
hợp, khi dùng pha theo công thức hướng dẫn.
+ Môi trường thạch Chapman: Dùng để phân lập vi khuẩn S. aureus
+ Môi trường thạch máu: dùng để thử khả năng dung huyết của vi
khuẩn S. aureus
+ Huyết tương thỏ để thử phản ứng coagulase của vi khuẩn S. aureus.
+ Chuột bạch khỏe khối lượng tỷ lệ 18 – 20 g/con
+ Nước muối sinh lý 0,9 %: Dùng để pha loãng mẫu.
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy
vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que
cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ và
các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di
Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-
Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy

Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac
110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các
trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
- Khoanh giấy kháng sinh
2.3 Cặp mồi sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19
Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen
đích được thiết kế dựa trên trình tự chuẩn của đoạn gen SEB trên ngân hàng
gen quốc tế NCBI (phụ lục 2.1 kèm theo)
Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng nghiên cứu
Mồi
Trình tự
T
m
(
0
C)
P - SEB - F
5’ATGTTGCACAAATCGAGTAAATTC 3’
55,1
P - SEB - R
5’ TCAATTATGCTCAGTTACACCACC 3’
52,4

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu
thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hoá theo tiêu chuẩn

Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO).
2.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu xét nghiệm.
Chúng tôi sử dụng phương pháp lấy mẫu được tiêu chuẩn hoá theo TCVN
[9]
- Thu thập mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt ở
các chợ trong Thành phố Thái Nguyên.
- Với mẫu thịt: Lau dao bằng cồn 70
0
, sau đó dùng dao cắt lấy 100-
200gram thịt/mẫu; cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông
tin cần thiết
2.4.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus trong 1gam thịt
lợn tƣơi trên thạch Chapman .
Theo TCVN [10].
- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Cân 1g thịt tươi (không lấy mỡ) nghiền
nát trong cối sứ, nghiền tiếp bằng máy xay thịt, cho vào bình tam giác bổ sung
9ml dung dịch nước muối sinh lí, được độ pha loãng 10
-1
. Ly tâm
3000vòng/phút trong 30 phút, tiếp tục pha loãng đến đậm độ không còn khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20
năng dương tính(10
-6
, 10
-7
).
- Cấy dàn trên thạch Chapman, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa thạch
khác nhau, bồi dưỡng 37

o
C/24h.
- Đếm số khuẩn lạc S. aureus (khuẩn lạc có dạng S, trơn nhẵn, bề mặt
vồng, rìa gọn, tròn, màu vàng). Chỉ những đĩa thạch sau khi cấy 37
o
C/24h
(với 0,1ml dịch nuôi cấy) có ít nhất 30 khuẩn lạc và không quá 300 khuẩn lạc
mới được chấp nhận. Tính kết quả theo Quinn.P.J et al (1994) [26].
2.4.3. Phƣơng pháp xác định một số đặc tính hoá sinh của S. aureus
2.4.3.1. Xác định khả năng dung huyết trên thạch máu.
Sử dụng que cấy cấy ria khuẩn lạc S. aureus đã phân lập được trên thạch
máu. Quan sát khả năng dung huyết của từng chủng
2.4.3.2. Xác định khả năng làm đông tụ huyết tƣơng thỏ (phản ứng
coagulase).
Cho một lượng khuẩn lạc S. aureus vào dung dịch huyết tương thỏ. Nuôi
ở 37 độ C quan sát sau 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h. [8].
2.4.3.3. Phƣơng pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn
Staphylococcus aureus phân lập đƣợc.
* Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)
Cách pha: Cân 27 gram môi trường BHI vào 1000 ml nước cất.
Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn.
Chia ra các ống nghiệm 5ml/ống.
Hấp ướt 121
0
C/15 phút.
Bảo quản ở 4
0
C.
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc đã được nuôi cấy ở 37
0

C trong
24h trên môi trường Chapman cho vào ống môi trường BHI đã chế, đem môi
trường nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C trong 24h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21
Sau đó tiến hành tiêm phúc mạc chuột bạch với liều lượng 0,5ml canh
trùng/con. Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm. Khi chuột chết, tiến hành mổ khám
bệnh tích và phân lập vi khuẩn và nuôi cấy lại trên môi trường Chapman.
Đối với chuột bạch đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng
0,5ml/con dung dịch BHI nguyên chất. Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết, tiến
hành mổ và khám bệnh tích và nuôi cấy lại trên môi trường Chapman.
2.4.4. Phƣơng pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và
hóa dƣợc của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus .
* Nguyên lý chung
Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với
kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô
khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy.
* Mục đích
Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích
rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần
đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn.
* Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường: Sử dụng đĩa petri ф = 9cm, đáy bằng, thạch
Muller Hinton, 25ml/đĩa để nuôi cấy vi khuẩn kiểm tra.
- Dịch nuôi cấy vi khuẩn pha loãng bằng PBS, đậm độ ≈ 10
8
vi

khuẩn/ml, cấy láng đều trên mặt thạch.
- Đặt khoanh giấy kháng sinh, khoảng cách đều 2cm, mỗi đĩa thạch đặt
tỷ lệ 6-8 khoanh. Bồi dưỡng đĩa thạch ở 37
0
C/24h, đọc kết quả dựa trên
đường kính vòng vô khuẩn.
+ Rất mẫn cảm: ф > 20 mm.
+ Mẫn cảm trung bình: ф tỷ lệ 15-20mm.
+ Mẫn cảm yếu: ф tỷ lệ 10-14 mm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22
+ Kháng thuốc: ф < 10mm. [26].
2.4.5. Phƣơng pháp tách DNA tổng số
Nguyên lý:
Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm,
mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết DNA dựa theo nguyên tắc hòa
tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha
không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Mục đích là thu được các phân tử
nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác
nhân cơ học hay hóa học. Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện
nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase).
Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung
dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng
cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong
muốn.
Tiến hành:
- Ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000v/p trong 7 phút, thu
cặn loại bỏ dịch.
- Bổ sung 1540 μl extraction buffer vào mỗi mẫu.

- Bổ sung 5 μl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37
o
C trong 90 phút
- Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65
o
C trong 120 phút, có đảo trộn.
- Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), spin down, ly tâm
12000v/p trong 15 phút ở 4
o
C, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới.
- Lặp lại bước trên
- Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ.
- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4
o
C, thu tủa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23
- Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở
4
o
C, thu cặn.
- Để khô tự nhiên, sau đó bổ sung 25 μl nước khử ion.
2.4.6. Phƣơng pháp PCR
Nguyên lý:
Kỹ thuật tổng hợp DNA nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ
bản của sao chép DNA trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn DNA cần được mở
xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và
điều kiện môi trường thích hợp và DNA polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR
có khác là dùng nhiệt độ cao (95

o
C) để biến tính chuỗi DNA sợi kép, kết hợp
với Taq DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp
cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế
chủ động. Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn DNA chỉ với một lượng nhỏ
DNA ban đầu.
Tiến hành:
- Sau khi đo nồ ng độ DNA khuôn , tính và tạo các nồ ng độ DNA củ a
các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn
được giống nhau, và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.
- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các
thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA.
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy.
Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng
Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng
15,75
Dung dịch đệm (10X)
2,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

24
dNTPs (10mM)
2,5
Primer P-SEB-F (20pmole/µl )
1
Primer P-SEB-R (20pmole/µl )
1
Taq DNA polymerase (2.5u/µl )

0,25
DNA
2
Tổng thể tích
25

Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:








Hình 2.1. Chu trình phản ứng PCR
2.4.7. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose
Nguyên lý:
Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn DNA quan tâm từ
bản điện di trên gel agarose. Trong phương pháp này phân tử DNA quan tâm
sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử
dụng đệm để thu lại các phân tử DNA này. Thông qua phương pháp này mẫu
DNA sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác
Tiến hành:
- Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di.
95
o
C
95
o

C
5 phút
1 phút
51
o
C
50 giây
72
o
C
72
o
C
1phút
10 phút

30 chu kì
4
o
C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

25
- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy
ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1µl thể tích.
- Bổ sung dịch kết gắn DNA vào ống Eppendorf chứa đoạn gel vừa cắt,
theo tỉ lệ: V
mẫu
:V
GB

= 1: 3.
- Ủ hỗn hợp ở 60
o
C trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho
đến khi gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 v/p
trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000
v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong
vòng 1 phút để loại đệm WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5ml. Bổ sung 25 µl nước khử ion khử
trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu
DNA.
2.4.8. Phƣơng pháp đọc trình tự DNA trên máy đọc tự động và phân tích
kết quả bằng phần mềm chuyên dụng.
Trình tự nucleotid của gen SEB được xác định bằng phương pháp xác
định trình tự gen tự động trên máy ABI PRISM
R
3100 Avant Genetic
Analyzer. Tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ gen - Viện
Công nghệ Sinh học.
+Phân tích kết quả:
- Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính BioEdit 7.0.
- Khai thác dữ liệu từ genbank để so sánh.
- Xử lý và phân tích các trình tự đoạn gen seb có kích thước khoảng 336
bp của vi khuẩn S. arerus bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit.
2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu