KỸ THUẬT NUÔI cấy và bảo QUẢN p FALCIPARUM dài NGÀY TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Y HC THC HNH (856) - S 1/2013



26

pituitary function after brain injury induced
hypopiyuitarism: A prospective 12 month study. JCEM
90: 6085 6092.
4. Bondanelli M, de Marinis L, Ambrosio MR, Monesi
M, Valle D, Zatelli MC, Fusco A, Bianchi A, Farneti M &
degli Uberti EC, (2004) Occurrence of pituitary
dysfunction following traumatic brain injury, Journal of
Neurotrauma 21: 685696.
5. Brooke AM, Kalingag LA, Miraki-Moud F, et al
(2006). Dehydroepiandrosterone (DHEA) replacement
reduces growth hormone (GH) dose requirement in
female hypopituitary patients on GH replacement. Clin
Endocrinol (Oxf) 65(5):67380.
6. Bushnik T, Englander J & Katznelson L (2007).
Fatigue after TBI: association with neuroendocrine
abnormalities. Brain Injury 21 559566.
7. F. Bernard1, J. Outtrim, D. K. Menon and B. F.
Matta (2006). Incidence of adrenal insufficiency after
severe traumatic brain injury varies according to
definition used: clinical implications. British Journal of
Anaesthesia 96 (1): 726
8. Ghigo E, Masel E, Aimaretti G, et al (2005),
Consensus guidlines on screening for hypopituitarism
following traumatic brain injury, Brain Injury 19:711
724.

9. Herrmann BL, Rehder J (2006). Hypopituitarism
following severe traumatic brain injury. Experimental
and Clinical Endocrinology and Diabetes 114 316321.
10. Kelly DF, Gaw Gonzalo IT, Cohan P, Berman N,
Swedloff R, Wang C (2000), Hypopituitarism following
traumatic brain injury and aneurysmal subarachnoid
hemorrhage: a preliminary report, Journal of
Neurosurgery 93:743752.

Kỹ THUậT NUÔI CấY Và BảO QUảN
P.FALCIPARUM
DàI NGàY
TRONG PHòNG THí NGHIệM

Lê Thành Đồng, Trịnh Ngọc Hải
Vin St rột - KST - CT TP H Chớ Minh

T VN
Nhm ỏp ng nhu cu nghiờn cu khoa hc v
thc hin cỏc th nghim ỏnh giỏ hiu lc ca cỏc
thuc iu tr st rột, ng thi phc v cho cụng tỏc
ging dy. Sau mt thi gian di thc hin vic nuụi
cy, bo qun ký sinh trựng st rột Plasmodium
falciparum trong phũng thớ nghim, Vin St rột - Ký
sinh trựng - Cụn trựng TP. H Chớ Minh ó nghiờn
cu, b sung hon thin cỏc ni dung k thut, cỏc
thnh phn, tiờu chun, iu kin nuụi cy, bo qun
v t chc biờn son thnh ti liu hng dn k
thut nuụi v bo qun Plasmodium falciparum
phũng thớ nghim. Ti liu ny ó c Hi ng

Khoa hc k thut v cỏc chuyờn gia, cỏc nh khoa
hc gúp ý v thng nht thụng qua.
K THUT NUễI CY V BO QUN
1. iu kin phũng nuụi cy v trang thit b,
dng c, vt t
1.1. iu kin phũng
Phũng nuụi cy phi m bo din tớch lp
t cỏc bung nuụi, cú li i, ni ng thao tỏc, cú
iu ho khụng khớ, mỏy hỳt m v ốn cc tớm.
1.2. Trang thit b, dng c, vt t
a) Trang thit b, dng c c nh:
- Box vụ trựng,
- T sy, t m, t lnh thng v t lnh sõu
- Ni cỏch thu, ni hp, bỡnh ng nit lng
- Phớch ỏ, cõn phõn tớch, mỏy o pH, kớnh hin vi
- Mỏy ct nc 1 v 2 ln, bỡnh nuụi (dessicator),
chai 20ml,100ml
- T CO
2,
mỏy ly tõm ln, nh; mỏy sy túc, l thy
tinh 5ml
- iu hũa khụng khớ, mỏy hỳt m, ốn cc tớm
- Pipett eppendoft 5,10,100,200,500,1000àl
- Qu búp cao su, pipett aid
b) Vt t, dung mụi, húa cht tiờu hao:
- Mng lc millipore kớch thc 0,22àl
- Kim bm, bm tiờm 1, 2, 5 v 10 ml
- Nit lng, mu mỏu, lam kớnh
- Dung dch sulfocromic m c
- Ethanol v methanol

- Cht chng ụng: heparin 5000 IU
- NaHCO3 5%, sorbitol 5%, RPHS, pH, bt RPMI
1640, glucoza
- Giemsa vi dung dch m pH 7,2
- Gentamicine
- NaOH, axit citric, natricitrat, NaCl 0,9%, glyxerol
Lu ý: Cỏc hoỏ cht phi cú hn s dng v bo
qun ỳng theo yờu cu.
d) Cỏc loi mụi trng:
- Mụi trng nuụi cy RPMI 1640 (gibco hoc
sigma)
- Mụi trng RP
- Mụi trng y cú 10% huyt thanh (RPHS)
- Mụi trng y (RPHS)
- Hematocrit
- Hepốs
Tựy theo nhu cu m mua sm cỏc dng c, vt
t, húa cht v mụi trng ỏp ng.
2. Nguyờn tc vụ trựng trong thu thp mu v
nuụi cy
2.1. Nguyờn tc vụ trựng trong thu thp mu
mỏu thc a
- Ni tin hnh ly mỏu phi thoỏng v sch.
- Tt c cỏc dng c dựng cho thc nghim phi
vụ trựng. Sỏt trựng bng cn ethanol 70
o
trc khi
m cỏc l mụi trng v hoỏ cht.
- Kim tra tt c cỏc dng c trc khi tin hnh
th nghim, trỏnh dựng nhng dng c hng hoc

khụng tt.
Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013



27

- Thao tác kỹ thuật phải đảm bảo vô trùng, tránh
tạp nhiễm.
- Rửa sạch tay bệnh nhân trước khi lấy máu bằng
xà phòng và sát trùng bằng cồn ethanol 70
o
.
- Không dùng chung kim chích máu.
- Để đề phòng các bệnh lây nhiễm qua đường máu
(HIV, HBV…) phải dùng găng tay khi tiếp xúc với máu
của bệnh nhân. Tránh máu dính vào da hoặc qua các
niêm mạc mắt, mũi. Rửa tay trước và sau khi làm việc
với xà phòng sau đó dùng ethanol 70
o
để sát trùng.
- Khi ly tâm các mẫu máu không dùng quá tốc độ
cho phép tránh gây vỡ.
- Khi vận chuyển các mẫu máu phải vặn chặt nắp
cẩn thận và đựng trong túi nilon kín.
- Tất cả các dụng cụ làm xong phải được rửa lại
bằng xà phòng và sát trùng với ethanol 70
o

- Những rác thải (kim, bơm tiêm, bông, các phiến

nhựa đã dùng…) phải được để vào nơi qui định về
chất thải y tế.
2.2. Nguyên tc vô trùng trong nuôi cy ti
phòng thí nghim
- Các dung dịch dùng trong nuôi cấy phải được
lọc vô trùng qua màng lọc millipore 0,22µm và bảo
quản ở 4
o
C hoặc -20
o
C tuỳ theo từng loại.
- Tất cả dụng cụ thuỷ tinh phải được ngâm trong
dung dịch sulfocromic đậm đặc ít nhất 3 giờ. Rửa
sạch dưới vòi nước và ngâm trong nước cất (3 lần).
Để khô và sấy vô trùng ở nhiệt độ 180
o
C trong 30
phút. Đối với những nắp nhựa hoặc cao su hấp ướt ở
120-150
o
C. Những dụng cụ bằng nhựa khác chỉ dùng
1 lần. Những dụng cụ đã được sấy, hấp phải để vào
một tủ sạch riêng biệt.
- Khi rửa các dụng cụ bằng thuỷ tinh phải đeo
găng tay dày. Đeo kính và găng tay khi tiếp xúc với
dung dịch sulfocromic đậm đặc.
- Khi làm việc trong phòng vô trùng phải có áo
choàng. Rửa tay, đeo găng và sát trùng bàn bằng
cồn ethanol 70
o

trước và sau khi làm việc.
- Các pipett dùng trong nuôi cấy KST phải dùng
quả bóp cao su hoặc pipett trợ giúp (pipett aid),
không dùng miệng để hút.
- Tất cả các dụng cụ bẩn đều được bỏ vào thùng
đựng rác và chuyển ra khỏi phòng vô trùng sau khi
đã làm xong.
- Cuối ngày phải vệ sinh lại phòng và bật đèn cực
tím qua đêm.
3. Các bước thực hiện
3.1. Bc 1: Chun b hng cu lành
- Lấy 10ml máu tĩnh mạch nhóm O (hoặc A) cho
vào tube, ly tâm có chứa chất chống đông: 0,25-0,3ml
ACD cho 1 ml máu hoặc heparin (20 đơn vị / ml).
- Trộn đều máu và ACD.
- Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút. Hút bỏ phần nổi.
- Thêm môi trường RP (môi trường không có
huyết thanh) vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 5:1
- Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút. Hút bỏ phần nổi. Rửa
2 lần với môi trường RP. Lần thứ 3 rửa với môi
trường đầy đủ có 10% huyết thanh (RPHS).
- Trộn cặn hồng cầu với môi trường đầy đủ
(RPHS) để có dịch treo 40% (4 ml cặn + 6 ml RPHS).
- Chia vào các lọ nhỏ (2-3ml).
- Ghi ngày lấy máu.
- Bảo quản ở 4
o
C trong vòng 30 ngày.
- Kiểm tra vô trùng: Lấy 1 ít hồng cầu vừa rửa cho
vào lọ có chứa 1ml môi trường RPMI, đặt vào tủ ấm

37
o
C trong 24h. Nếu tủa trắng đục là nhiễm trùng,
phải bỏ đi.
3.2. Bc 2: Chun b huyt thanh
- Lấy 250ml máu nhóm O (hoặc AB với các chủng
mới phân lập), không chống đông cho vào chai hoặc
lọ thủy tinh vô trùng.
- Để lọ nằm nghiêng (thể tích càng rộng, sự tách
huyết thanh càng lớn).
- Để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ, sau đó để tủ lạnh
4
o
C qua đêm.
- Dùng pipett nhẹ nhàng hút phần huyết thanh nổi ở
trên chia vào các lọ nhỏ để tiện sử dụng (1,1ml/10 ml
môi trường). Phần huyết thanh có lẫn hồng cầu chuyển
vào tube ly tâm. Ly tâm 2.000 vòng trong 5 phút. Hút
phần huyết thanh nổi ở trên chia vào các lọ nhỏ.
- Ghi tên nhóm máu, số lượng và ngày tách trên lọ.
- Kiểm tra vô trùng giống như với hồng cầu.
- Tiệt trùng huyết thanh ở 56
o
C trong 30 phút (đặt
trong nồi cách thủy, chú ý không để nước ngập tới
nắp của lọ).
- Để nguội và bảo quản ở -20
o
C trong vòng 30
ngày.

3.3. Bc 3: Chun b môi trng nuôi cy dài
ngày
- Môi trường RP để rửa hồng cầu
Môi trường RPMI 10 ml
NaHCO
3
5% 0,42 ml
- Môi trường đầy đủ RPHS
Môi trường RPMI 10 ml
NaHCO
3
5% 0,42 ml
Huyết thanh O (AB) 10% 1,2 ml
Bảo quản ở 4
o
C trong vòng 1 tuần.
3.4. Bc 4: Chun b hng cu nhim P.
falciparum
a) Thu thập trực tiếp từ bệnh nhân:
- Sau khi khẳng định bệnh nhân nhiễm
P.falciparum đơn thuần. Đếm mật độ ký sinh trùng,
nếu trên 0,1% nuôi cấy sẽ thành công hơn. Lấy 1-2
ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân chuyển vào lọ vô
trùng đã có sẵn dung dịch chống đông. Lắc đều, ly
tâm 2000 vòng trong 5 phút.
- Hút bỏ phần nổi. Rửa 3 lần với môi trường đầy
đủ RPHS.
- Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ với
hematocrit là 4%.
- Chuyển hỗn dịch này vào đĩa nuôi hoặc lọ nuôi

tùy theo kích thước của đĩa hoặc lọ nuôi:
+ Đĩa nuôi có đường kính 35mm cho vào 1,5ml
hỗn dịch máu và môi trường.
+ Đĩa 60mm cho vào 4 ml hỗn dịch máu và môi
trường.
+ Lọ có diện tích 25 cm2 cho 4 ml.
+ Phiến nhựa 24 giếng cho 0,5 ml.
Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013



28

- Xoay nhẹ đĩa nuôi cho máu phủ đều đáy.
- Cho đĩa vào bình nuôi (Desicator), đốt nến đợi
khi nến gần tắt khóa vòi của bình nuôi (5% O
2
, 5%
CO
2
và 90% N
2
).
- Đặt bình nuôi vào tủ ấm 37
o
C ± 0,5
o
C.
Chú ý:
- Trường hợp thu thập máu ở xa phòng thí

nghiệm, vận chuyển máu bằng cách: Lấy 5ml máu
bệnh nhân cho vào lọ vô trùng có sẵn 5ml RPMI 1640
và 10µl heparin (lọ 5000 đơn vị / ml). Hỗn dịch này để
ở nhiệt độ phòng trong vòng 8 giờ. Hoặc giữ trong
nước đá 36 giờ nhưng chú ý không đặt tiếp xúc trực
tiếp với đá. Sau đó tiến hành theo các bước như thu
thập trực tiếp từ bệnh nhân.
- Giữ máu trong đông lạnh (nitơ lỏng) bằng cách ly
tâm mẫu máu 2000 vòng trong 5 phút. Hút bỏ phần
nổi. Thêm đồng thể tích dung dịch đông lạnh vào cặn
hồng cầu và chuyển vào tube đông lạnh. Ghi tên bệnh
nhân hoặc số hiệu, ngày lấy máu rồi cho ngay vào
bình nitơ lỏng. Khi có điều kiện sẽ lấy ra để nuôi cấy.
b) Nuôi cấy các mẫu từ trong nitơ lỏng (phá đông)
- Lấy các mẫu từ trong nitơ lỏng ra và làm tan
đông bằng cách đặt tube máu vào nồi cách thuỷ 37
0
C
trong 1-2 phút.
- Chuyển máu đã được làm tan sang tube ly tâm.
- Cho đồng thể tích dung dịch sorbitol 27% (nhỏ
từng giọt và trộn nhẹ nhàng).
- Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút.
- Hút bỏ phần nổi.
- Thêm sorbitol 5% vào cặn hồng cầu theo tỉ lệ
(2:1). Trộn nhẹ nhàng sau khi nhỏ từng giọt. Rửa 2
lần với sorbitol 5%.
- Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút.
- Hút bỏ phần nổi.
- Thêm RPHS vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 2:1 và

rửa 3 lần.
- Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút. Hút bỏ phần nổi.
- Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ (RPHS)
với 20% huyết thanh để có dịch treo 4%.
- Chia vào các đĩa hoặc lọ nuôi theo kích thước.
3.5. Bc 5: Thay môi trng (24giờ/ lần)
Pha môi trường đầy đủ (RPHS) và đặt vào tủ ấm ít
nhất 30 phút trước khi thay môi trường hàng ngày.
Chú ý nếu pH của môi trường quá kiềm (chuyển thành
màu hồng cánh sen phải bỏ đi và pha môi trường
mới). Lấy bình nuôi ra khỏi tủ ấm, mở khóa bình, lấy
các đĩa nuôi đặt lên mặt bàn của box vô trùng.
3.6. Bc 6: Làm tiêu bn lam, theo dõi KST
hàng ngày
- Nhẹ nhàng nghiêng đĩa nuôi tránh xáo trộn. Dùng
pipett pasteur vô trùng, nhẹ nhàng hút bỏ phần môi
trường ở phía trên (tránh hút hồng cầu ở phía dưới).
- Dùng pipett vô trùng lấy khoảng 2-5 µl làm tiêu bản
lam giọt đàn. Sau đó cho môi trường mới vào đĩa nuôi,
lắc nhẹ để trộn đều máu và môi trường. Cho đĩa vào
bình nuôi, đốt nến, khóa vòi và đặt vào tủ ấm 37
o
C.
- Khi lam khô, cố định bằng methanol tuyệt đối và
nhuộm giemsa với dung dịch đệm pH 7,2.
- Để lam khô tự nhiên hoặc dùng máy sấy tóc.
3.7. Bc 7: Soi lam và tính mt đ nhim KST (%)
- Soi lam dưới vật kính dầu 100, thị kính 10.
- Đếm hồng cầu nhiễm KST thể vô tính theo 2.000
- 3.000 hồng cầu (khoảng 10 vi trường).

- Tính phần trăm hồng cầu nhiễm theo công thức
sau:
Số hồng cầu nhiễm KST đếm được / Tống số hồng
cầu đếm được (cả nhiễm và không nhiễm) x 100.
- Ghi kết quả vào sổ theo dõi hàng ngày.
4. Phụ lục 1. Pha hóa chất và môi trường cho
nuôi cấy KST dài ngày
4.1. Môi trng RPMI 1640 (Gibco hoc Sigma)
Bột RPMI 1640 10,4g
Hepès 5,94g
Glucoza 2,00g
Gentamicine 0,04g
Nước cất 2 lần vừa đủ 960 ml
- Chỉnh pH đến 6,8 bằng dung dịch NaOH 1N sao
cho khi thêm 0,42ml NaHCO
3
/10 ml môi trường sẽ
có pH 7,2 - 7,5.
- Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích
thước 0,22µm và chia vào các lọ. Ghi ngày pha, thử
vô trùng và bảo quản ở -20
o
C trong vòng 1 tháng.
- Kiểm tra vô trùng: Lấy 1ml môi trường RPMI, đặt
vào tủ ấm 37
o
C trong 24h. Nếu tủa trắng đục là
nhiễm trùng, phải bỏ đi.
4.2. Pha NaHCO
3

5%
NaHCO
3
5g
Nước cất 2 lần vừa đủ 100 ml
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước
0,22µm và chia vào các lọ. Ghi cẩn thận ngày pha,
thử vô trùng và bảo quản ở 4
o
C trong vòng 1 tháng.
4.3. Dung dch chng đông ACD

Axit citric 0,24g
Natricitrat 0,665g
Glucoza 1,48g
Nước cất 2 lần vừa đủ 50 ml
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước
0,22µm và cho vào lọ vô trùng. Ghi ngày pha, thử vô
trùng và bảo quản ở 4
o
C trong vòng 1 tháng. Dùng
0,2-0,3ml/ml máu.
4.4. Dung dch đông lnh
Sorbitol 1,512g
NaCL 0,9% 36 ml
Glyxerol 14 ml
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước
0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng. Ghi ngày
pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20
0

C.
4.5. Dung dch phá đông
Sorbitol 27% 27g
Nước cất 2 lần vừa đủ 100 ml
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước
0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng. Ghi ngày
pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20
0
C.
Sorbitol 5% 5g
Nước cất 2 lần vừa đủ 100 ml
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước
0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng. Ghi ngày
pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20
0
C.