TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS (ADV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

1 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
*************

Bài tiểu luận

CHẨN ĐỐN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS
(ADV) BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY TẾ BÀO
Mơn học: Chẩn đốn bệnh gia súc, gia cầm
GVHD: TS. Nguyễn Ngọc Hải
SVTH: Vũ Thị Phương Thảo

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009


2 
 

Mục lục
I. Đặt vấn đề .......................................................................................... 3
II. Tổng quan......................................................................................... 3
II.1 Virus Aujeszky..................................................................... 3
II.1.a Tình hình................................................................. 3
II.1.b Đặc tính, phân loại.................................................. 4
II.1.c Hình thái và cấu trúc ADV ..................................... 5
II.1.d Sức đề kháng của ADV .......................................... 6

II.1.e Dịch tễ học .............................................................. 7
Các loài vật mẫn cảm với ADV ............................. 7
Đường lây nhiễm ................................................... 7
II.1.f Triêu chứng lâm sàng .............................................. 9
II.1.g Bệnh tích............................................................... 11
II.2 Phân lập ADV trên mơi trường tế bào ............................... 11
II.2.a Chuẩn bị mẫu ........................................................ 12
II.2.b Chuẩn bị môi trường tế bào .................................. 14
II.2.c Chẩn đoán ADV bằng Shell Vial Assay............... 15
II.2.d Chẩn đoán ADV bằng 24-Well Plate Cell
Culture Assay ................................................................. 15
II.2.e Thí nghiệm của Rafique A. Tahir, Sagar M. Goyal
........................................................................................ 17
III. Kết luận ......................................................................................... 18
IV. Tài liệu tham khảo ....................................................................... 18


3 
 

I. Đặt vấn đề
Aujeszky’s disease virus (ADV) gây ra những thiệt hại to lớn về
kinh tế đồi với ngành chăn ni heo vì nó làm tăng tỉ lệ chết và gây
ra những rối loạn sinh sản ở heo (Pensaert and Kluge, 1989). Vì thế
cần có một phương pháp chẩn đốn nhanh sự vấy nhiễm của ADV
trong các bầy đàn để kiểm soát một cách hiệu quả sự lây nhiễm của
bênh bằng cách cách ly và loại bỏ các đàn gia súc nhiễm nhằm làm
giảm những thiệt hại về kinh tế mà ADV đã gây ra.
Nhiều phương pháp đã được sử dụng để chẩn đoán sự vấy nhiễm
của ADV, bao gồm sự phân lập virus bằng phương pháp nuôi cấy

tế bào, phương pháp miễn dịch peroxidase, phương pháp miễn dịch
huỳnh quang, dot-blot, PCR. Mỗi phương pháp đều có những ưu,
nhược điểm riêng được so sánh về các mặt độ nhậy, độ đặc hiệu, dễ
phát hiện, chi phí và tốc độ.
Trong những năm gần đây, sự phân lập virus bằng shell vial assay
(SVA) kết hợp với kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang hay miễn dịch
peroxidase được sử dụng để phát hiện cytomegaloviruses, herpes
simplex virus, respiratory virus. Kĩ thuật SVA nhanh, nhậy và là
phương pháp đặc biệt đối với sự chẩn đoán các loại virus này. (b)
II. Tổng quan
1) Virus Ạujeszky
a) Tình hình
A. Aujeszky đã phát hiện ra bệnh này vào năm 1902 ở Hungary
trên bị và chó, đặt tên là bệnh “giả dại” vì ở phần lớn các lồi động
vật mắc bệnh đều có triệu chứng ngứa ngáy và tự cắn xé mình. Lợn
mắc bệnh khơng có những triệu chứng này mặc dù chỉ riêng lợn là
kí chủ tự nhiên của virus. Các động vật mắc bệnh đều có độ mẫn
cảm cao, tỉ lệ chết có thể lên tới 100%.


4 
 

Ở nước ta, bệnh có từ bao giờ chưa rõ, nhưng từ năm 1975 đến nay
bệnh có ở khắp các tỉnh phía Nam và nhiều tỉnh phía Bắc (a)
Phân bố
• AJD xuất hiện ở hầu hết các quốc gia Châu Âu, Mỹ, Mexico,
Cuba, Brazil, Venezuela, Nhật Bản, Đài Loan, Đông Nam Á.
• Trong những năm gần đây bệnh đã gia tăng tỷ lệ nhiễm bệnh và
trở nên nghiêm trọng tại các vùng có những nơng trai chăn ni

heo tập trung.
• Ở Thái Bình Dương, AJD xảy ra ở New Caledonia tới năm
1984, ở Newzealand và ở Polynesia thuộc Pháp (bằng chứng
huyết thanh học) tới năm 1999, nó được biết là đã xảy ra ở
Samoa, Tonga, Vanuatu, Wallis, Futuna và ở những đàn lợn
hoang dã ở Papua New Guinea. Chưa bao giờ có báo cáo từ Úc.
( />TM).
b) Đặc tính, phân loại
Herpesvirus là một loại virus có một lượng DNA lớn và chu kì sinh
sản xảy ra trong nhân tế bào. Họ Herpesviridae được chia làm 3 họ
phụ:
• Alphaherpesvirinae
• Betaherpesvirinae
• Gammaherpesvirinae (i)
Aujeszky’s disease (AJD), còn được gọi là bệnh giả dại
(pseudorabies), là một căn bệnh do porcine herpesvirus-1
[Aujeszky’s disease virus (ADV), pseudorabies virus (PRV)] gây
ra. Virus này thuộc bộ Herpesviridae, giống Alphaherpesvirinae.


5 
 

ADV nhiễm vào hệ thống thần kinh trung ương và những cơ quan
khác, ví dụ như cơ quan hơ hấp, nhiễm vào nhiều loại động vật có
vú ngoại trừ người và các lồi khỉ khơng đi.
Kí chủ tự nhiên của ADV là heo, là một nguồn lây nhiễm tiềm tàng
(ngoại trừ heo con dưới 2 tuần tuổi bị chết do viêm não). (g)
c) Hình thái và cấu trúc ADV
Cấu trúc tổng qt của ADV được cho thấy ở hình 1.

• Phần lõi bao gồm một sợi đôi DNA dài khoảng 150 kbp được
bao bọc bởi một capsid, vỏ (tegument) và vỏ bọc (envelope).
• Bộ gen của ADV bao
gồm 2 vùng đơn vị
(two unique regions),
một

đơn

vị

dài

(unique long UL), và
một

đơn

(unique

vị

ngắn

shot

US),

được cặp sườn bởi 2
trình tự lặp lại, một

cái bên trong (an
internal one-IRS), một cái ở phía cuối (a terminal one-TRS). Cả
bộ gen đã được Klupp và ctv giải trình tự.
• Những gen khác nhau trong bộ gen của alphaherpesvirus được
chỉ định bởi 2 kí tự là US hay UL phụ thuộc vào vị trí của nó
trong đơn vị dài UL hay đơn vị ngắn US theo sau đó là một con
số, con số chỉ ra vị trí của mỗi gen trong mỗi vùng đặc biệt.
• Vỏ capsid của ADV đóng gói và bảo vệ bộ gen. Nó bao gồm
162 capsomers, 150 hexon (1 hexon có 6 phân tử VP5 là protein
được biểu hiện bởi UL19 (pUL19) và 6 phân tử VP26 (pUL35)
và 12 penton (11 penton bao gồm 5 phân tử VP5, 1 penton 12


6 
 

phân tử pUL6 và hình thành lỗ xâm nhập hình trụ cho DNA mới
sản xuất (newly produced dsDNA), cả hai được liên kết bởi 3
cấu trúc (1 phân tử của VP19C (pUL38) và hai phân tử của
VP23 (pUL18) tất cả được xắp xếp trong một hàng rào 20 mặt.
• Khoảng trống giữa vỏ capsid và vỏ envelope được lắp đầy với
protein tegument. Protein tegument quan trọng trong quá trình
xâm nhập và nhân lên của virus, xâm nhập màng bao bọc chính
của màng nhân và màng của thể golgi.
• Vỏ envelope của virus là một màng phospholipids 2 lớp bao
gồm 10 glycoprotein (gB, gC, gD, gE, gH, gI, gK, gL, gM, gN).
Vỏ envelope đóng vai trị quan trọng trong việc gắn kết, xâm
nhập, đóng gói, thốt ra ngồi. Lan truyền giữa các tế bào, sự
đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ. (f)

d) Sức đề kháng của ADV
Khả năng sống trong mơi trường của ADV rất thấp. ADV có thể
sống một thời gian ngắn trong môi trường lạnh, ẩm với pH từ 6 đến
8. Mơi trường có ánh nắng và khơ sẽ giết virus ngay lập tức. (c)


7 
 

Phần lớn các chất sát trùng, tiêu độc đều có thể tiêu diệt được virus
như dung dịch NaOH 1%, trong 6 giờ, formal 3% trong 3 giờ, ở
nhiệt độ 60oC virus bị diệt sau 1 giờ.
Virus trong xác chết thối rữa bị diệt sau 10 ngày, trong thịt ướp sau
20 ngày.
Trong nước tiểu lợn bệnh, virus sống 3 tuần, trong chất độn chuồng
virus bị bất hoạt trong vòng 8-15 ngày.
Các chất hóa học có hợp chất Clo là thuốc sát trùng có hiệu quả
nhất như nước vơi đặc, các chế phẩm Clorua vơi hịa tan trong
nước. (a)
e) Dịch tễ học
Các lồi vật mẫn cảm với ADV
• Heo là kí chủ chính của
ADV, là nguồn lây nhiễm
chính cho một phổ rộng kí
chủ thứ hai như bị, cừu,
chó, mèo, chuột và lồi
gặm nhấm.
• Ngựa, chim, và người có
khả năng kháng ADV. (c)
Đường lây nhiễm

• ADV vẫn tồn tại ở dạng
tiềm tàng trong suốt thời gian sống của heo bị nhiễm bệnh đã
khỏi. Sự lây lan bệnh có thể do trực tiếp tiếp xúc giữa heo khỏe
và heo bệnh hoặc mang trùng, có thể qua khơng khí, cũng có thể
lây lan gián tiếp qua chất độn chuồng, dụng cụ chăn ni, người
chăm sóc…
• Dây thần kinh sinh 3 (trigeminal ganglia), bầu khứu giác
(olfactory bulbs), hành tủy (medulla), cuống não (brain stem),


8 
 

phổi (lungs), hạch bạch huyết (lymph nodes), tủy sống (spinal
cord) là những loại mơ chứa virus.
•

Vào những thời điểm stress như sinh đẻ, virus có thể hoạt động
trở lại và lây lan. Những con heo này có biểu hiện bệnh tích
nhẹ.

• Khi ADV hiện diện trong đàn, sự tiềm tàng và sự hoạt động trở
lại cuả virus rất quan trọng khi nghiên cứu sự lan truyền của
virus giữa các nông trại hoặc giữa nhóm heo với nhau.
• Sự lan truyền của
ADV xảy ra bằng
nhiều

con

đường

khác nhau, bao gồm:
AJD rất dễ lây,
chủ yếu lây lan
qua con đường
hơ hấp. Sự lây
nhiễm trong đàn
thì nhanh nhưng
có thể chậm giữa các đàn.
Chất tiết từ đường miệng và đường mũi, nước tiểu là một
nguồn bệnh tiềm tàng của virus và sự tiếp xúc trực tiếp giữa
đàn lợn nhiễm và không bị nhiễm là một con đường truyền
bệnh quan trọng.
Qua chất tiết từ tinh dịch hay âm đạo khi giao hợp.
Qua sữa hay sữa non của thú mẹ truyền qua thú con, ngồi ra
virus có thể xâm nhập qua nhau thai, truyền dọc từ thế hệ
này sang thế hệ khác.
Qua những vật dụng dùng trong thú y đã bị nhiễm (ví dụ như
kim tiêm, ống tiêm).


9 
 

Virus có thể tồn tại trong thịt heo đến 5 tuần. Những con chó
ăn thịt heo nhiễm cũng bị nhiễm và chết. Tỷ lệ nhiễm bằng
con đường ăn thịt heo bị nhiễm cao hơn là bằng đường hơ
hấp.
Lan truyền nhờ

gió từ nơng trại
này đến nơng trại
khác có thể xảy
ra dưới điều kiện
thích hợp. (báo
cáo ở Anh có thể
tới 2 km).
Virus có thể tồn
tại

nhiều

tuần

trong một vũng
nước đọng, trên
cỏ, ổ rơm. Vì thế, môi trường truyền nhiễm từ bầy đàn này
sang bầy đàn khác cần phải được quản lý, đặc biệt là những
nơi rác thải không được thu gom và xử lý.
Vai trị của cơn trùng đang được điều tra, lồi gặm nhấm cũng đóng một vai
trị là một nguồn nhiễm. Vai trị của lợn hoang dã trong khu vực Thái Bình
Dương

như

là

nguồn

nhiễm

đã

thật

sự

bùng

nổ.

(a,

/>f) Triêu chứng lâm sàng
Ở heo, ADV thường lan nhanh trong các bầy đàn mới nhiễm. Triệu
chứng lâm sàng ở lợn thường biểu hiện khác nhau tùy theo lưa tuổi.
• Heo con nhỏ hơn 2 tuần tuổi: diễn biến lâm sàng tiến triển
nhanh, tỷ lệ chết cao có khi tới 100%. Sốt cao trên 41oC, ủ rũ,


10 
 

lơng dựng đứng, da tím tái, lợn gầy sút nhanh, có triệu chứng
thần kinh, run rẩy, đi lảo đảo, đi vịng quanh, sau đó xuất hiện
những cơn co giật, đạp chân trong khơng khí là động tác đặc
trưng của bệnh, kiệt sức, tử vong trong vài giờ. Có thể thấy heo
nơn mữa, chảy nhiều dãi, đơi khi có con đi lỏng.
• Những con heo lớn hơn có biểu hiện: sốt, suy nhược, trầm cảm,
nơn, khó thở, xuất hiện bệnh tích từ hệ thần kinh trung ương,

dáng đi theo kiểu ngỗng, thờ thẫn, co cơ, mắt giật , tê liệt. Tỉ lệ
chết 20-100%.
• Heo con cai sữa có những biểu hiện giống trên với những triệu
chứng về đường hô hấp (ho, ắt xì, thở nặng nhọc, viêm kết mạc)
dễ thấy hơn. Tỷ lệ tử vong 5-10%.
• Những heo nái và heo đực giống: thường không quan sát thấy
triệu chứng thần kinh, con vật ủ rũ, sốt cao, ho, thở khó kéo dài
5-10 ngày, lợn bị gầy sút nhanh chóng, tỷ lệ chết thấp
Ở những nái mang thai có biểu hiện về rối loạn sinh sản như
sẩy thai, thai yếu, thai chết lưu trong bụng. phần lớn những
thai chết, thai sẩy có bệnh tích điển hình là hiện tượng hoại
tử gan, lách, tuyến thượng thận, hạch lâm ba ruột.

Neurological disorders in piglets.


11 
 

(Photos Copyright FAO 1997)

Ở bò chủ yếu biểu hiện ở 2 thể:
• Thể kích thích: đặc trưng nhất là ngứa nhiều ở một vùng hay
nhiều vùng ở các vùng da đầu, ngực, đùi.
• Thể bại liệt: con vật suy nhược, chướng bụng, táo bón, bại liệt,
chảy nhiều dãi, có trường hợp bị liệt bụng.
Ở chó và mèo:
• Ở mèo, triệu chứng đầu tiên là rối loạn vận động, con vật bồn
chồn, kêu nhiều, tiếng kêu khan khan, sau đó run rẩy, liệt tồn
thân và chết nhanh.

• Ở chó biểu hiện ngứa nhiều ở mõm, liệt cơ họng.
• Ở những lồi khác thường thì chỉ những vùng bị thương bị
phù,sung

huyết

ở

tủy

sống

(a, />HTM)
g) Bệnh tích

White to yellow necrotic foci on spleen (pig).
(Photos Copyright FAO 1997)

Bệnh giả dại ít có bệnh tích đặc trưng.
• Có những điểm hoại tử trắng ở gan, lách.
• Phổi xung huyết, phù.


12 
 

• Thùy tim và thùy đỉnh có các vết viêm màu đỏ sẫm.
• Hiện tượng phù nề vách ngăn giữa các thùy là rất phổ biến. (a,
/>M)
2) Phân lập virus trên môi trường tế bào

Cách xác định sự vấy nhiễm của PRV thường dựa trên sự phân lập
virus trên các môi trường tế bào cùng với sự xác định bằng kỹ thuật
miễn dịch huỳnh quang. Quy trình này được thực hiện trong vòng
từ 2-5 ngày, dựa trên thời gian xuất hiện cytopathic effects (bệnh
tích tế bào-CPE).
PRV có thể được ni cấy trên một phổ rộng các loại tế bào như tế
bào phổi thỏ (rabbit lung-ZP), tế bào thận thỏ (rabbit kidneyRK13), tế bào thận chuột Hamster (Hamster kidney-BHK21), tế
bào thận heo (porcine kidney-PK15), tế bào thận khỉ xanh (green
monkey kidney-GMK), tế bào phổi chồn Vizon (mink lung-MK),
tế bào thận chồn furo (ferret kidney-FK), tế bào phôi bào thai cừu
(ovine fetal lung-OFL), (bovine turbinate-BT), tế bào thận phổi gà
tây (turkey embryo kidney-TEK7,13,17,21). Tuy nhiên các dòng tế bào
BT, PK15 được sử dụng rộng rãi để phân lập và chẩn đoán PRV.
(b)
a) Chuẩn bị mẫu
Những mẫu vật có thể
được sử dụng để chẩn
đoán ADV bao gồm tủy
sống, phổi, lá lách, gan,
thận, hạch bạch huyết,
niêm mạc họng, amidam
được lấy từ những con


13 
 

heo nghi ngờ nhiễm ADV.
Lấy mẫu thí nghiệm ở heo
• Mẫu máu: lấy ở tĩnh mạch cổ hay ở tĩnh mạch tai bằng xylanh

tự động.
• Dịch mũi: khi con vật có biểu hiện rối loạn hơ hấp (khó thở, khị
khè…) lấy tăm bơng ngốy vào hốc mũi.
Thời gian lấy mẫu
• Khi con vật biểu hiện những triệu chứng lâm sàng, lấy mẫu ở
các lỗ tự nhiên.
• Khi con vật đã
chết (mới chết
trong vịng 6
giờ)

mổ

ra,

biều hiện bệnh
tích ở đâu thì
lấy mẫu tại đó
(đường hơ hấp, tiêu hóa, thần kinh).
Những điều cần lưu ý khi lấy mẫu:
• Lấy máu ở tĩnh mạch cổ khi cần lượng máu nhiều.
• Lấy máu ở tĩnh mạch tai khi khơng cần nhiều máu.
• Đối với nái mang thai nên lấy ở giai đoạn heo mới sinh 2-3
ngày.
• Khi lấy mẫu cần có dụng cụ cố định con vật, đeo găng tay.
• Khi lấy mẫu bằng tăm bông để tăm bông trong ống nghiệm vô
trùng cho vào lọ chứa dung dịch chuyên chở và bẻ đoạn que nơi
tay cầm.

14 
 

• Khi lấy mẫu máu thì ta nên cho chất kháng đơng vào. Có 3 loại
chất kháng đơng: EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate),
Heparin, Sodium Citrate, trong đó EDTA thường được sử dụng
nhất vì ít gây ảnh hưởng đến các tế bào máu.
• Cách lấy mẫu mơ:
lấy một nửa phần
mơ có bệnh tích,
một nửa phần giáp
bệnh tích.
Cách bảo quản mẫu:
• Mẫu để trong bình,
túi sạch.
• Dùng bình đá nếu mẫu được chuyển về phịng thí nghiệm ở
khoảng cách gần.
• Dùng đá khô bảo quản tối đa trong 7 ngày do đá khơ ít chảy
nước và ít ảnh hưởng đến bệnh phẩm. Mẫu được giữ ở -70oC
trong glycerol 50%.
Cách xử lý mẫu: lấy mẫu sao cho tạo được huyễn dịch 10-20%.
• Lấy tỷ lệ mẫu và HBSS (Hanks’ balanced salt solution) là 1
phần mẫu, 9 phần HBSS, mẫu được đồng nhất trong HBSS
thành huyễn dịch 10% bằng máy Laboratory Tissue Pulverizer.
Sau đó ly tâm 1000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút để loại bỏ
mãnh vỡ của mô. Dịch nổi bên trên được gạn ra và dự trữ ở 70oC. Hoặc ta có thể nghiền bằng tay.
• Mẫu mơ được để ngay góc cối gần chỗ miệng lấy ra. Nếu mẫu
mềm thì nghiền trực tiếp. Nếu mẫu cứng thì nghền bằng thủy
tinh nhuyễn để tách được các tế bào đơn.

15 
 

• Lấy 9 phần HBSS cho vào nghiền tiếp, nghiền xong cho vào
ống nghiệm.
• Sau đó cho mẫu vào tủ lạnh rồi đem ra thực hiện 1-2 lần để tế
bào vỡ ra và ta thu hoạch virus.
• Sau đó lọc lấy nước trong (ly tâm) cho vào lọ khác có nắp, cho
kháng sinh vào (penicillin, streptomicine) để trong 30’-1h, sau
đó lọc qua màng lọc 0.2 um và đưa vào môi trường tế bào.
• Mẫu huyết thanh cho qua lọc 0.2 um và đưa vào môi trường tế
bào.
b) Chuẩn bị môi trường tế bào
Cả hai loại tế bào PK-15 và BT được phát triển trong môi trường
tối thiểu của Eagle với muối, 8% huyết thanh thai bò, penicillin
(100 đơn vị/ml), streptomicine sulfate (100 ug/ml), fungizone (1
ml), gentmicine (50 ug/ml).
Mỗi giếng của đĩa 24 giếng được cho vào 1 ml dịch huyền phù tế
bào chứa 1.5x105 tế bào.
1 tấm phủ đường kính 12 mm được đặt vào mỗi shell vials (1-dram
ca. 3.7 ml shell vials) sau đó cho vào đó 1ml dịch huyền phù tế bào
chứa 1.0x105 tế bào. Để dễ thao tác, shell vials được đặt vào trong
các giếng của một đĩa 24 giếng rỗng và sau đó được phủ lên bằng
một đĩa 24 giếng khác. Đem đi ủ ở 37oC có 5% CO2 thường trong 3
ngày. (b)
c) Chẩn đốn ADV bằng Shell Vial Assay (SVA)
Các shell vial chứa các tế bào BT hay PK15 được cho vào 0.2 ml
mẫu đã được chuẩn bị. Sau đó nó được đem đi ly tâm với tốc độ
700 vòng/ phút trong 60 phút ở nhiệt độ 30oC.

Sau đó các shell vial được rửa với HBSS và thêm vào 0.5 ml MEM
chứa 4% huyết thanh thai ngựa (fetal horse serum-FHS). Thêm vào


16 
 

1 vial chứa mẫu không nhiễm (mock-infect cell) vào để làm đối
chứng âm.
Các shell vial sau đó được ủ ở 37oC trong khơng khí có 5% CO2 và
được quan sát bệnh tích đặc trưng trong các khoảng cách thời gian
là 8 giờ đồng hồ.
Sau khi xuất hiện CPE, tế bào một lớp trong các shell vial được
trộn trực tiếp với kháng thể nhuộm huỳnh quang. Sau đó các tấm
phủ được nhẹ nhàng loại ra bằng cách sử dụng cái kẹp. Các tấm
phủ được hơ khơ, để ở rìa slide kính, và kiểm tra huỳnh quang. (b)
d) Chẩn đoán ADV bằng 24-Well Plate Cell Culture Assay
Các giếng chứa tế bào một lớp PK15 hay BT được cho vào 0.5 ml
mẫu và ủ ở 37oC trong một giờ để virus hấp thụ. Sau khi rửa với
HBSS, 1.5 ml môi trường tối thiểu chứa 4% huyết thanh ngựa chữa
được cho vào và đem đi ủ ở 37oC trong khơng khí có 5% CO2.
Thêm vào 1 vial chứa mẫu không nhiễm (mock-infect cell) vào để
làm đối chứng âm. Đĩa dược quan sát dựa trên chỉ tiêu sự xuất hiện
bệnh tích tế bào mỗi ngày trong 7 ngày.
Những giếng có xuất hiện bệnh tích được xử lý với kháng thể gắn
huỳnh quang.
Môi trường nuôi cấy được loại bỏ và các tế bào một lớp bị nhiễm
được rửa với phosphate buffer saline (PBS), pH 7.2. Tế bào được
vét với vài giọt PBS bằng một pipet chuyển, và huyền phù tế bào
được cho vào một cái giếng có vịng đen (black-ringed well)

đường kính 7 mm trên một slide kính nhiều giếng (multiwell glass
slide).
Slide kính được sấy khơ hồn tồn và sau đó trộn với acetone trong
10 phút.


17 
 

1 giọt của dung dịch pha loãng 80 lần kháng thể IgG đánh dấu
huỳnh quang của ADV được cho vào mỗi giếng, và slide kính được
đem ủ ở 37oC trong 30 phút trong một cái hộp ẩm (moist champer).
Sau khi rửa với PBS (pH 8.5) trong 5 phút, tế bào được nhuộm
thêm với dung dịch Evan’s blue trong một phút và rửa dưới giọt
nước, và sấy khô.
Một tấm phủ được đưa vào slide
kính sau khi đã cho vào một giọt
dung dịch gồm 50% glycerin và
50% PBS, pH 7.2 vào mỗi
giếng.
Slide kính được quan sát bằng
kính hiển vi huỳng quang. (b)
PRV infected cells-CPE (h)
e) Thử nghiệm của Rafique A. Tahir, Sagar M. Goyal
2 ơng thử nghiệm với 244 mẫu do phịng thí nghiệm chẩn đốn thú
y ở Minnesota cung cấp. Mẫu được lấy từ những con heo nghi ngờ
nhiễm bao gồm não, amidant, và phổi. Thử nghiệm được thực hiện
bằng 2 phương pháp SVA và 24-well plate cell culture.
Kết quả đạt được:
• Trong 244 mẫu được xác định, 118 (48.4%) mẫu được xác định

là dương tính với phương pháp 24-well plate cell culture, 121
(49.2%) được xác định là dương tính với SVA.
• Trong 118 mẫu dương tính với phương pháp 24-well plate cell
culture thì có 113 (95,8%) mẫu là dương tính đối với dòng tế
bào BT, 117 (99,2%) mẫu là dương tính đối với dịng tế bào
PK15.


18 
 

• Trong 121 mẫu dương tính với SVA thì có 113 (93,4%) mẫu là
dương tính đối với dịng tế bào BT, 121 (100%) mẫu là dương
tính đối với dịng tế bào PK15.
• 24 giờ sau khi cấy mẫu vào, 91 (75.2%) mẫu có bệnh tích
dương tính đối với SVA, trái lại chỉ có 15 (12.7%) mẫu là
dương tính đối với phương pháp 24-well plate cell culture. (b)

III.

Kết luận
Từ kết quả thí nghiệm của Rafique A. Tahir, Sagar M. Goyal ta
thấy phương pháp SVA nhạy và nhanh hơn so với phương pháp
24-well plate cell culture.
Cũng như thế tế bào PK15 nhạy hơn tế bào BT trong việc phát hiện
ADV. (b)

IV.

Tài liệu tham khảo

1) Tiếng việt
(a) Tủ sách khuyến nông phục vụ người lao động-NXB lao động: Những điều
cần biết về một số bệnh mới do virus, trang 14-18.
2) Tiếng anh
(b) Rafique A. Tahir, Sagar M. Goyal: 1995, Rapid detection of pseudorabies
virus by the shell vial technique. J Vet Diagn Invest 7: 173-176.


19 
 

(c) United States Deparment of Agriculture Animal and Plant Health Inspection
Service Veterinary Services- Center for Epidemiology and Animal HealthNational Surveillance Unit Fort Collins, CO: National Pseudorabies
Surveillance Plan Final Draft
(d) United States Department of Agriculter- Animal and Plant Health Inspection
Service Technical Bulletin No 1923: Pseudorabies (Aujeszky’s Disease) and its
Eradication
(e) Carlos H. Romero, Paul N.Meade và ctv- Journal of Wildlife Disease, 37
(2), 2001, pp 289-296: Venereal Transmission of Pseudorabies Viruses
Indigenous to Feral Swine
(f) Hans Nauwynck, Sarah Glrieux và ctv, 2006- review article: Cell biological
and molecular characteristics of Pseudorabies virus infections in cell cultures
and in pigs with emphasis on the respiratory tract, page 230-234.
(g) OIE Terrestrial manual 2008- chapter 2-1-2- Aujeszky’s disease, page 145.
(h) A. Tatsanakit, A. Rungsipipat và ctv: In vitro efficacy of an organic
disinfectant citrex on selected swine viruses
(i) Harald Granzow, Frank Weiland và ctv- Journal of virology, Mar 1997, page
2072-2082: Ultrastructural analysis of the replication cycle of Pseudorabies
virus in cell culture.

3) Trang web
/>