Nghiên cứu xác định độc tố ruột (enterotoxin) của staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
…………………………………



NGUYỄN ĐỖ PHÚC
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH
ĐỘC TỐ RUỘT (ENTEROTOXIN)
CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS
GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 40 01




LUẬN ÁN TIẾN SĨ: VI SINH VẬT HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
GS.TS. NGUYỄN THỊ KÊ
PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC




TP. Hồ Chí Minh – năm 2010

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 3

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Thị Kê, PGS.TS. Trần
Linh Thước, người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện tốt
nhất trong suốt thời gian em thực hiện luận án. Thầy, Cô đã dạy bảo em rất nhiều
điều trong khoa học cũng như trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Hùng Vân, giảng viên trường Đại học Y
Dược TP. HCM đã tận tình giúp đỡ cho em rất nhiều về kiến thức lẫn những kinh
nghiệm thực tế cho em thực hiện tốt luận án.
Em rất cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Vệ sinh Y tế Công cộng TP. HCM
đã
tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, kinh phí và thời gian giúp cho em thực hiện tốt luận
án này.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Khoa Sau Đại học - Trường
ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin cảm ơn các anh, chị Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử A
– Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ để
tôi thực hiện tốt luận án này.
Tôi xin cảm ơn các anh, chị Labo Vi sinh thực phẩm, Trung tâm Kiểm
nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm khu vực phía Nam – Viện Vệ sinh Y tế Công
cộngTP.HCM
đã hỗ trợ rất nhiều cho tôi trong quá trình làm luận án.
Xin gửi những lời thân thương đến vợ và hai con tôi đã luôn luôn ở bên tôi và động
viên tôi trong những lúc mệt nhọc, lo lắng trong công việc và trong thời gian thực hiện
luận án.

Cảm ơn bạn Đặng Vũ Bích Hạnh, giảng viên Trường ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc
gia TP. HCM, là người bạn cùng khóa NCS, đã luôn luôn hỗ trợ và động viên tôi trong
thời gian thực hiện luận án.
Và trên hết, con xin chân thành cảm ơn công ơn sinh thành, dạy dỗ và tảo tần nuôi
con khôn lớn của Cha, Mẹ ruột; Cha, Mẹ vợ đã hết lòng thương yêu và lo lắng cho gia
đình và các con của con và mọi người trong gia đình hai bên nội ngoại để cho con yên
tâm học tập và công tác tốt.
Xin cảm ơn tất cả!
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2010
Nguyễn Đỗ Phúc
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 4

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC HÌNH v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ GÂY
NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM CỦA S. AUREUS 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học chính 3
1.1.2. Các nhân tố độc lực 5
1.1.3. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus 7
1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S. AUREUS 10
1.2.1. Đặc điểm chung và phân loại 10
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo độc tố SE. 12

1.2.3. Hoạt tính của độc tố ruột SE 13
1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS
TRONG THỰC PHẨM 13
1.3.1. Định lượng S. aureus trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy 13
1.3.2. Phát hiện và định lượng S. aureus trong thực phẩm bằng
phản ứng PCR 14
1.4. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG SE TRONG
THỰC PHẨM 17
1.5. XÁC ĐỊNH TIỀM NĂNG SINH ĐỘC TỐ CỦA CÁC CHỦNG S. AUREUS
BẰNG PHẢN ỨNG PCR DỰA VÀO GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ 21
1.6. PHƯƠNG PHÁP TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG
VÀO VIỆC PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH ELISA 21
1.6.1. Phương pháp tạo kháng thể đa dòng 21
1.6.2. Tinh chế và đánh dấu kháng thể 23
1.6.3. Các bước qui trình ELISA sandwich 25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 28
2.1.1. Dụng cụ 28
2.1.2. Thiết bị 28
2.1.3. Hóa chất 29
2.1.4. Sinh vật phẩm 32
2.2. PHƯƠNG PHÁP 34
2.2.1. Chọn mẫu và địa điểm thu mẫu 34
2.2.2. Định lượng S. aureus trên mẫu thực phẩm bằng phương pháp MPN 35
2.2.3. Kiểm tra độ sống S. aureus bằng phương pháp hộp trãi 36
2.2.4. Phân tích định tính SE bằng bộ kit Tecra 36
2.2.5. Phát hiện gen sinh độc tố SE bằng phương pháp multiplex- PCR 38
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc

Trang 5

2.2.6. Phương pháp gây miễm dịch trên thỏ và kiểm tra hiệu giá
kháng huyết thanh 39
2.2.7. Tinh chế kháng thể 41
2.2.8. Kiểm tra độ sạch kháng thể bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 42
2.2.9. Xác định nồng độ kháng thể bằng phương pháp Bradford 42
2.2.10. Đánh dấu kháng thể kháng độc tố A và B với enzyme HRP 43
2.2.11. Phương pháp ELISA trực tiếp phát hiện SEA, SEB bằng
kháng thể cộng hợp HRP 44
2.2.12. Kiểm tra phản ứng chéo của kháng thể cộng hợp HRP 44
2.2.13. Xây dựng qui trình ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB
trong thực phẩm 45
2.2.14. Đánh giá qui trình ELISA sandwich phát hiện độc tố SEA/SEB 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM S. AUREUS TRONG
THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ VÀ TỶ LỆ GÂY NGỘ ĐỘC BỞI S.
AUREUS TẠI TP. HỒ CHÍ MINH 49
3.1.1. Khảo sát tình hình nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố
tại TP. HCM 49
3.1.2. Tỷ lệ gây ngộ độc thực phẩm bởi S. aureus trong một số vụ ngộ độc
thực phẩm tại TP. HCM 50
3.2. XÁC ĐỊNH LOẠI ĐỘC TỐ RUỘT PHỔ BIẾN GÂY NGỘ ĐỘC
BỞI S.AUREUS 51
3.2.1. Khảo sát khả năng sinh độc tố ruột của các chủng phân lập
trên môi trường TSGM và BHI 51
3.2.2. Xác định loại độc tố SE bằng phương pháp ELISA 53
3.2.3. Xác định loại độc tố SE phổ biến bằng phương pháp multiplex-PCR
nhân bản sao các gen mã hóa độc tố 55
3.3. TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA

PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ SEA, SEB TRONG THỰC PHẨM 62
3.3.1. Gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh thỏ kháng SEA và SEB 62
3.3.2. Thu nhận và tinh chế kháng thể đa dòng kháng SEA và SEB
65
3.3.3. Tạo kháng thể cộng hợp với enzyme HRP 67
3.3.4. Xây dựng qui trình ELISA sandwich phát hiện độc tố SEA và SEB 69
3.3.5. Đánh giá hiệu lực qui trình ELISA sandwich phát hiện SEAvà SEB 79
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỂ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 82
4.2. ĐỀ NGHỊ 82
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 83
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Diễn giải
Ab Antibody (kháng thể)
ABTS 2,2’-Azino-di(3-ethyl-benzonthiazoline-6-sulfonic acid)
Ag Antigen (kháng nguyên)
AP Alkaline phosphatase
APS Ammonium persulfate
BHI Beef Heart Infusion

BP Baird - Parker
CFA Complete Freund’s Adjuvant
CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
entA
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEA
entB
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEB
entC
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEC
entD
Gen maõ hoaù ñoäc toá SED
entE
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEE
ETA Exfoliative exotoxin A
ETB Exfoliative exotoxin B
Fc Fragment crystalizable
HRP Horse radish peroxidase
IFA Incomplete Freund’sadjuvant
Ig G Immunoglobulin (Kháng thể lớp G)
IL Interleukin
INF Interferon
kDa Kilodalton
MHC Major histocompatiblity complex
MPN Most probable number
MSA Mannitol salt agar
MWCO Molecular weight cut off
ODTB OD trung bình
OD Optical density
OPD o-Phenylenediamine

ORF
Open reading frame
PBS Phosphate buffer saline
PCR Polymerase chain reaction
pI Isoelectric point
Pre Prebleed
SDS - PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
SE Staphylococcal enterotoxin
TB Trung bình
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 7

TEMED Tetramethyl ethylene diamine
TMB Tetramethybenzidine
TSA Trypticase soy agar
TSGM Tecra staphylococcal growth medium

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái của S. aureus 3
Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc S. aureus trên môi trường Bair-Parker (A)
và môi trường Manitol salt agar (B) 4
Hình 1.3. Các dạng thử nghiệm ELISA phổ biến 20
Hình 1.4. Cơ chế hình thành Schiffbase trong phương pháp cộng hợp
kháng thể - enzyme thông qua nhóm NH
2
24
Hình 2.1. Thang phân tử lượng protein 33

Hình 2.2. Bố trí mẫu trong phương pháp khuếch tán trong gel 40
Hình 3.1. Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S. aureus
trong môi trường TSGM 52
Hình 3.2. Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S. aureus
trong môi trường BHI 53
Hình 3.3. Kết quả
phân tích gen mã hóa độc tố SE ở các chủng S. aureus
phân lập từ thực phẩm và mẫu chất nôn 59
Hình 3.4. Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh kháng SEA với độc tố
SEA ở thỏ trước khi gây miễn dịch 63
Hình 3.5. Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh kháng SEB với độc tố
SEB ở thỏ trước khi gây miễn dịch 64
Hình 3.6. Kiểm tra độ sạch của kháng thể qua các bước tinh chế bằng điện di
SDS-PAGE 65
Hình 3.7. Định lượng kháng thể bằng phương pháp Bradford 66
Hình 3.8. Kết quả ELISA trực tiếp kiểm tra khả năng phát hiện độc tố SEA và
SEB của kháng thể cộng hợp bằng phương pháp ELISA trực tiếp 68
Hình 3.9. Kết quả khảo sát loại dung dịch đệm phủ giếng trong qui trình
ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB 70
Hình 3.10. Kết quả khảo sát loại tác chất khóa giếng trong qui trình ELISA
phát hiện SEA, SEB 71
Hình 3.11. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEA thích hợp để
phủ giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEA 72
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEB thích hợp dùng
để phủ giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEB 73
Hình 3.13. Kết quả khảo sát thời gian ủ giếng thích hợp của qui trình ELISA
phát hiện SEA, SEB 74
Hình 3.14.
Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng nguyên trong qui trình
ELISA phát hiện SEA, SEB 75

Hình 3.15. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng thể cộng hợp trong
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 8

qui trình ELISA phát hiện SEA, SEB 76
Hình 3.16. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của qui trình ELISA sandwich
phát hiện SEA, SEB ở các nồng độ kháng nguyên là 16, 14, 12, 10,
8, 6, 4, 2 (ng/ml) 78


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các đặc tính chính của S. aureus 5
Bảng 1.2. Qui định về mức cho phép hiện diện của S. aureus trong thực
phẩm tại Việt Nam 7
Bảng 1.3. Một số đặc điểm sinh hóa chính cuảa độc tố ruột 12

Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng để nhân bản sao các gen mã hóa độc tố SAE
bằng phản ứng PCR 34
Bảng 2.2. Bố trí thực hiện dựng đường chuẩn bằng phươg pháp Bradford 43
Bảng 2.3. Xử lý kết quả đánh giá qui trình ELISA sandwich so với qui trình
ELISA của TECRA 47

Bảng 3.1.
Tỷ lệ nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM 49
Bảng 3.2. Tỷ lệ ngộ độc do S. aureus trong một số vụ ngộ độc thực phẩm
tại TP. HCM 51
Bảng 3.3. Kết quả định loại độc tố SE được tổng hợp bởi 19 chủng S. aureus

phân lập từ thực phẩm 54
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra khả năng nhân bản và độ đặc hiệu của 5 cặp mồi
nhân bản sao 5 gen mã hóa 5 loại độc tố SE bằng phản ứng
multiplex-PCR 56
Bảng 3.5
Kết quả kiểm chứng loại độc tố được sản sinh bởi các chủng S. aureus
bằng phản ứng multiplex-PCR nhân bản sao các gen mã hóa độc tố SE 58
Bảng 3.6. So sánh kết quả xác định loại độc tố tạo ra bởi các chủng S. aureus
bằng phương pháp ELISA và kết quả xác định gen mã hóa độc tố
bằng phản ứng multiplex-PCR 60
Bảng 3.7. Kiểm tra sự hình thành kháng thể kháng SEA, SEB trong huyết thanh
thỏ được gây đáp ứng miễn dịch xác định bằng phương pháp khuếch
tán trên gel 62
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính của kháng thể kháng SEA, kháng thể
kháng SEB cộng hợp HRP bằng phản ứng ELISA trực tiếp 67
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra phản ứng chéo giữa kháng thể kháng SEA cộng hợp
với SEA với SEB và của kháng thể kháng SEB cộng hợp với SEA 68
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát loại dung dịch phủ giếng 69
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát lọai tác chất khóa giếng trong qui trình ELISA
phát hiện SEA, SEB 71
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEA thích hợp để phủ giếng
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 9

trong qui trình ELISA phát hiện SEA 71
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEB thích hợp dùng để phủ
giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEB 72
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát thời gian ủ giếng thích hợp của qui trình ELISA

phát hiện SEA, SEB.………………………… 74
Bảng 3.15.
Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng nguyên trong qui trình
ELISA phát hiện SEA, SEB
75
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng cộng hợp trong qui trình
ELISA phát hiện SEA, SEB 76
Bảng 3.17. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của qui trình ELISA sandwich
phát hiện SEA, SEB 78
Bảng 3.18. Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa qui trình ELISA sandwich
phát hiện SEA và qui trình ELISA của TECRA 79
Bảng 3.19. Kết quả đánh giá các thông số qui trình ELISA sandwich phát hiện
độc tố SEA 80
Bảng 3.20. Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa qui trình ELISA sandwich
phát hiện SEB và qui trình ELISA của TECRA 80
Bảng 3.21. Kết quả đánh giá các thông số kỹ thuật tương đối của qui trình
ELISA sandwich phát hiện độc tố SEB 81




Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 10

MỞ ĐẦU

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 11


An toàn Vệ sinh thực phẩm là vấn đề được nhiều quốc gia trên thế giới rất
quan tâm. Việc sử dụng thực phẩm không an toàn là một trong những nguyên nhân
gây ra các bệnh truyền nhiễm lây qua thực phẩm. Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực
phẩm (Bộ Y tế) và Tổ chức Y tế Thế giới, hàng năm tại Việt Nam có khoảng 3 triệu
người bị nhiễm độc từ thực phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD. Mặt khác, theo
số liệu của Bộ Y tế, trong các năm 2000-2007 cả nước có 1.358 vụ ngộ độc thực
phẩm ở bếp ăn tập thể với 34.411 người bị ngộ độc và 379 người tử vong (Hội thảo
về Vệ sinh an toàn thực phẩm ngày 23/10/2007).
Hiện nay phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vi sinh vật gây ô nhiễm thực
phẩm là phương pháp nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa và miễn dịch.
Các phương pháp mới như PCR, ELISA đang được nghiên cứu ứng dụng trong
phân tích vi sinh vật trong thực phẩm nhằm giúp cho công tác thanh tra giám sát
thực phẩm hoặc điều tra nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật được

nhanh chóng hơn.
S. aureus là một trong những vi khuẩn gây ra ô nhiễm thực phẩm và là nguyên
nhân thường gặp trong ngộ độc thực phẩm. Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm
51% các vụ ngộ độc trong 6 tháng đầu năm 2007 có nguyên nhân là do thực phẩm
nhiễm vi sinh vật, 8% do hóa chất, và 27% là do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên.
Trong các vụ ngộ độc tập thể được xác định nguyên nhân là do vi sinh vật thì
S. aureus chiếm 20-30%, đứng thứ hai sau Salmonella [65]. Ngộ độc thực phẩm do
S. aureus được gây ra bởi độc tố ruột của vi khuẩn này [64].
Để xác định nhanh S. aureus có liên quan đến một vụ ngộ độc hay không
phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt, nhân bản sao trình tự gen nuc mã hóa
cho protein nuclease chịu nhiệt đặc trưng cho S. aureus có thể được sử dụng để thay
cho phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên để kết luận S. aureus là nguyên nhân gây ngộ
độc thực phẩm thì bên cạnh việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn cần phải xác
định sự hiện diện của độc tố ruột của vi khuẩn.
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 12

Xét nghiệm độc tố ruột của S. aureus trong thực phẩm có thể được thực hiện
một cách gián tiếp thông qua việc xác định sự hiện diện của gen mã hóa độc tố
trong vi khuẩn có trong thực phẩm bằng phản ứng PCR. Mặt khác, độc tố ruột của
S. aureus trong thực phẩm có thể được xác định một cách trực tiếp bằng phản ứng
ELISA sử dụng kháng thể kháng độc tố này. Ở Việt Nam S. aureus đã được các cơ
quan quản lý nhà nước xác định là một trong các chỉ tiêu vi sinh vật cần được kiểm
soát trong thực phẩm. Tuy nhiên, nguyên nhân trực tiếp gây ngộ độc thực phẩm do
S. aureus là độc tố ruột của vi khuẩn này vẫn chưa được các cơ quan quản lý quan
tâm đúng mức. Để góp phần xây dựng các công cụ phân tích hữu hiệu dùng cho
việc xét nghiệm, giám sát độc tố ruột do S. aureus trong thực phẩm, luận án “
Nghiên cứu xác định độc tố ruột (enterotoxin) của S. aureus gây ngộ độc thực

phẩm” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định loại độc tố S. aureus gây ngộ độc
phổ biến tại Việt Nam, xây dựng qui trình multiplex-PCR phát hiện các gen sinh
độc tố và xây dựng qui trình ELISA phát hiện các độc tố này trong thực phẩm, góp
phần xây dựng các công cụ phân tích hữu hiệu dùng cho việc xét nghiệm, giám sát
độc tố ruột do S. aureus trong thực phẩm ở nước ta.
Nội dung nghiên cứu của luận án
Nội dung của luận án tập trung và giới hạn vào các vấn đề sau:
1- Khảo sát tình hình nhiễm S.aureus trong thực phẩm đường phố và tỷ lệ gây
ngộ độc bởi S. aureus tại thành phố Hồ Chí Minh.
2- Xác định loại độc tố ruột phổ biến gây ngộ độc bởi S.aureus bằng phương
pháp ELISA và phương pháp multiplex-PCR.
3- Tạo kháng thể và xây dựng qui trình ELISA phát hiện độc tố phổ biến trong
thực phẩm.
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 13











CHƯƠNG 1.
TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 14

1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ GÂY NGỘ ĐỘC
THỰC PHẨM CỦA S. AUREUS
1.1.1. Đặc điểm sinh học chính
S. aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây ngộ độc
thực phẩm. S. aureus thuộc giống Staphylococcus, là vi khuẩn hình cầu, không di
động, gram dương, đường kính 0,5 - 1,5µm, tế bào xếp thành hình chùm nho (Hình
1.1), không di động, có vách tế bào kháng lysozyme và nhạy với lysotaphin.
S. aureus có tính hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, tăng trưởng được trong khoảng
nhiệt độ rất rộng, từ 7 - 48
o
C, khoảng nhiệt độ tối ưu là 30 - 45
o
C; tăng trưởng được
trong khoảng pH 4,2 - 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,5; có tính chịu mặn tăng trưởng được
trong môi trường chứa trên 15% NaCl; chịu được áp suất thẩm thấu cao của 33-55%
saccharose nhưng bị ức chế ở 60%. S. aureus phân bố rộng trong tự nhiên được
phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng. Vi khuẩn
này còn hiện diện trong không khí, bụi, rất nhạy với kháng sinh và chất diệt khuẩn.
Mặt khác S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt khi bị xử lý ở 60
o
C từ 2 – 50
phút. Vi khuẩn này có tính cạnh tranh yếu, dễ bị vi sinh vật khác ức chế [19].

A


B
Hình 1.1. Hình thái của S. aureus
A. Dưới kính hiển vi điện tử; B. Dưới kính hiểm vi quang học

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 15

Về đặc điểm sinh hóa, S. aureus có men catalase, cho phản ứng đông huyết
tương dương tính nhờ enzyme coagulase. Phản ứng đông huyết tương là đặc trưng
để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. S. aureus cho phản ứng DNAse,
phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,
sucrose, nhạy với novobicine[4]. Một số chủng S. aureus có khả năng gây tan máu
trên môi trường thạch máu. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, thường
thấy rõ sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng [25]. Trên môi trường Baird
Parker, khuẩn lạc S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 - 1,5mm,
quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 - 5mm. Trên môi trường Manitol salt agar
(môi trường Chapman), khuẩn lạc S. aureus có dạng tròn, bờ đều và lồi, màu vàng
nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.2.).

A. Môi trường Bair-Paker
B. Môi trường Chapman
Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc S. aureus trên môi trường Bair-Parker (A) và môi
trường Chapman (B)

Đa số các chủng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều độc tố ruột
(enterotoxin) trong môi trường có nhiệt độ trên 15
o
C, nhiều nhất khi chúng tăng
trưởng ở nhiệt độ 35 - 37
o
C [4]. Các đặc tính sinh hóa chính của S. aureus phân biệt
với Staphylococcus khác và Micrococcus được tổng hợp trên Bảng 1.1.
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc
Trang 16

Bảng 1.1. Các đặc tính chính của S. aureus [12]
Đặc tính S. aureus S. epidermidis Micrococci

Catalase + + +
Coagulase + - -
Thermonuclease + - -
Nhạy với Lysostaphin + + -
Sử dụng glucose + + -
Sử dụng manitol + - -

1.1.2. Các nhân tố độc lực
S. aureus có thể gây nhiễm trùng, tạo mủ ở những vết xây xước trên bề mặt
da, gây nhiều bệnh truyền nhiễm như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm
màng não, nhiễm trùng tiểu, viêm xương tủy, viêm màng trong tim. S. aureus cũng
là nguyên nhân gây nhiễm trùng vết mổ và nhiễm trùng dụng cụ y khoa. Mặt khác
S. aureus còn gây ngộ độc thực phẩm bởi độc tố ruột enterotoxin, và gây hội chứng
shock do siêu kháng nguyên trong máu [62]. Độc lực của S. aureus được hình thành
do tác dụng phối hợp của nhiều nhân tố độc lực khác nhau sau đây.
* Staphylococcus aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:
- Protein nhận diện và bám dính

Bề mặt tế bào S. aureus có adhesin protein với vai trò nhận diện và bám
dính, tạo protein gắn kết fibrinogen và fibrinetin làm kích thích sự kết dính các khối
máu và mô bị chấn thương. Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp ở
những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp.
- Các nhân tố xâm nhiễm

S. aureus tạo ra nhiều protein giúp vi khuẩn xâm nhập và lan nhiễm trong vật
chủ, được gọi tên chung là invasins, là bộ phận đóng vai trò quan trọng trong độc
lực của vi khuẩn này. Sau đây là các invasins chính của S. aureus.
+ Hemolysin: là độc tố tế bào có hoạt tính làm tan màng hồng cầu. Ở S.
aureus độc tố này gồm 3 loại: (i) α-Hemolysin: là độc tố tan màng mạnh nhất tác
dụng lên tiểu cầu và bạch cầu ở người; (ii) β-Hemolysin có tác dụng phân hủy màng

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 17

giàu lipid, thường được dùng làm thử nghiệm tan hồng cầu cừu; (iii) δ-hemolysin có
hoạt tính làm tan màng một số tế bào khác nhau.
+ Hyaluronidase: phân huỷ chất gian bào ở tế bào chủ giúp S. aureus lan
nhiễm các vùng xung quanh.
+ Catalase: thủy phân hydrogen peroxide và ức chế sự hình thành các gốc tự
do bởi hệ thống myeloperoxidase trong tế bào chủ.
+ Coagulase: được tiết ra khỏi tế bào S. aureus gắn được với prothrombin
hình thành phức hợp staphylothrombin làm đông fibrinogen trong máu, giúp vi
khuẩn tránh được sự tấn công của đại thực bào.
+ Staphylokinase: có hoạt tính phân giải fibrin giúp cho S. aureus lan nhiễm
trong vật chủ.
+ Các enzyme ngoại bào khác: Tnase là enzyme kháng nhiệt, xúc tác sự
hydrogen hóa DNA và RNA của tế bào chủ; DNase, protease, lipase thủy phân các
cơ chất đại phân tử để cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn; FAME (fatty acid
modifying enzyme) xúc tác phản ứng biến đổi giúp kéo dài sự sống của S. aureus.
- Các nhân tố chống lại sự phòng vệ của vật chủ

Ngoài các protein có vai trò tăng cường sự xâm nhiễm trong vật chủ
S. aureus còn tạo ra các protein giúp vi khuẩn chống lại hệ thống phòng vệ của vật
chủ làm tăng độc lực của vi khuẩn, bao gồm:
+ Microcapsule: giúp vi khuẩn chống lại sự thực bào của vật chủ.
+ Protein A: protein bề mặt có thể gắn phân tử IgG qua vùng Fc, cản trở
phản ứng opsonin hóa và sự thực bào của hệ thống phòng vệ ở vật chủ.
+ Leukocidin: có hoạt tính phân hủy màng tế bào bạch cầu yếu hơn
α-hemolysin, chỉ có ở 2% các chủng S. aureus được phân lập nhưng có đến gần

90% các chủng phân lập từ vết xước trên da.
+ Siêu kháng nguyên (superantigen): S. aureus tiết ra hai độc tố có hoạt tính
siêu kháng nguyên là TSST-1 (Toxic shock syndrom toxin) gây hội chứng sốc
nhiễm độc tụ cầu (TSS) và Enterotoxin gây nôn mửa, tiêu chảy, thường xảy ra ở các
vụ ngộ độc thực phẩm. Hai siêu kháng nguyên này sẽ kích hoạt 1/5 tế bào T không
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 18

chuyên biệt vốn không nhận được những kháng nguyên thông thường gây ra hội
chứng sốc do S. aureus [62].
1.1.3. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus
a. Triệu chứng ngộ độc thường gặp
S. aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực
phẩm ở nhiều nước sau Salmonella và Clostridium perfringens [31] [46]. Triệu
chứng thường gặp ở các vụ ngộ độc do S. aureus là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng,
có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết
áp. Các triệu chứng này xuất hiện khoảng 3 - 6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm,
tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm, độ nhạy với
độc tố và sức khỏe của từng người. Thông thường, các triệu chứng ngộ độc chỉ kéo
dài khoảng 6 - 8 giờ và hết bệnh sau 1 - 2 ngày [4].
b. Ngộ độc do S. aureus trên thế giới
Trên thế giới, vụ ngộ độc lớn đầu tiên do S.aureus xảy ra vào năm 1884 ở
Michigan (Mỹ) do phô mai. Các vụ ngộ độc lớn sau này được ghi nhận do thịt bò,
khô bò bị nhiễm, sữa, bánh kem,… [12].
Tại Mỹ, S. aureus gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm, gây
thiệt hại khoảng 1,5 tỷ đô la hằng năm; trong đó độc tố ruột A (SEA) chiếm 77,8%,
độc tố D (SED) 37,5% và độc tố B (SEB) 10% [46].
Ở Nhật Bản, năm 2000, ngộ độc sữa do độc tố A (SEA) của S. aureus đã gây

ngộ độc cho 14.780 người lớn [42]. Số liệu thống kê cho thấy trong các năm 1994-
1998 số trường hợp ngộ độc do S. aureus chiếm 3,1 - 11,9% các vụ ngộ độc thực
phẩm do vi khuẩn tại Nhật Bản.
Ở Tây Ban Nha, năm 2002, đã xảy ra ba vụ ngộ độc do dùng thực phẩm bị
nhiễm độc tố A (SEA) hoặc độc tố C (SEC) của S. aureus.
Ở Đài Loan, S. aureus là nguyên nhân gây 30% các trường hợp ngộ độc
trong thời gian từ 1986 đến năm 1995.
Hầu hết các vụ ngộ độc liên quan đến S. aureus là do quá trình chế biến hoặc
bảo quản thực phẩm không tốt. S. aureus thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 19

tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm không
phù hợp sẽ giúp vi khuẩn tăng nhanh số lượng và tạo ra độc tố (vi khuẩn tăng
trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 7 - 48
o
C). Sự hiện diện độc tố ruột của S.
aureus không gây ảnh hưởng đến đặc tính cảm quan của thực phẩm nên khó được
phát hiện [53].
c. Tình hình ô nhiễm và gây ngộ độc thực phẩm do S. aureus tại Việt Nam
Tại Việt Nam ngộ độc thực phẩm đang rất được xã hội quan tâm vì sự bùng nổ
của việc tiêu thụ thức ăn nhanh, thức ăn đông lạnh và tình trạng các hàng quán
không hợp vệ sinh. Trong số những vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn thì
S. aureus, Salmonella và E. coli là những tác nhân chiếm đa số. Kết quả khảo sát
tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại các chợ tại
TP.HCM trong vài năm gần đây cho thấy tỷ lệ nhiễm S. aureus là rất cao 53% ở các
mẫu bánh mì thịt nguội, 90% các mẫu thịt quay đã khảo sát [2] [3]. Năm 2006, đã
ghi nhận được vụ ngộ độc thực phẩm của 105 người tại Nha Trang do thức ăn

nhiễm độc tố ruột của S. aureus. Cùng năm này đã ghi nhận vụ ngộ độc ở nhà trẻ tại
Huyện Phú Quốc, Kiên Giang do yaourt bị nhiễm độc tố A (SEA) của S. aureus.
Tháng 12/2007 đã ghi nhận được 2 vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus tại
một số trường tiểu học, mầm non với trên 100 trẻ em bị ngộ độc. Hiện nay
S. aureus đã được xem là một chỉ tiêu vi sinh vật cần được kiểm soát trong thực
phẩm bởi các cơ quan chức năng tại Việt Nam. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực
phẩm của nước ta qui định mật độ S. aureus được phép hiện diện trong thực phẩm
thay đổi tùy theo loại thực phẩm (0, 3, 10, 10
2
CFU/g hoặc ml thực phẩm) và được
trình bày ở Bảng 1.2. Tuy nhiên, hiện nay chưa có tiêu chuẩn kiểm soát độc tố ruột
SE trong thực phẩm tại Việt Nam. Các công trình khác nghiên cứu về độc tố ruột
và sản xuất bộ ELISA để xác định độc tố ruột cũng chỉ giới hạn phát hiện SEA,
trong đó các thành phần bộ kít ELISA đều nhập ngoại do nhóm tác giả
Lê Quang Hà
và CS (2009) của Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nghiên cứu.
Bảng 1.2. Qui định về mức cho phép hiện diện của S. aureus trong thực phẩm tại
Việt Nam
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 20

Nhóm thực phẩm Loại thực phẩm TCVN
QĐ-BYT-
46/2007
Sản phẩm từ ngũ cốc,
khoai củ, đậu đỗ
Phở, Bún khô Hủ tiếu ăn
liền

TCVN6346 – 98
TCVN6347 – 98
TCVN6345 – 98
0CFU/g
0CFU/g
0CFU/g
/
Sản phẩm chế biến từ ngũ
cốc, khoai củ - có xử lý
nhiệt trước sử dụng
/
/ 10
2
CFU/g
Sản phẩm chế biến từ ngũ
cốc, khoai củ - không qua
xử lý nhiệt trước sử dụng
/ / 10 CFU/g
Thịt và các sản phẩm
từ thịt
Thịt tươi, Thịt đông lạnh TCVN
7046:2002
TCVN
7047:2002
10
2
CFU/g 10
2
CFU/g
Thịt chế biến không qua xử

lý nhiệt, có xử lý nhiệt
TCVN 7050:2002
TCVN
7049:2002
10CFU/g 10
2
CFU/g
Thịt hộp TCVN 7048:2002 0CFU/g Không có
Thịt tươi, đông lạnh, xay
nhỏ, nghiền, (phải qua xử
lý nhiệt trước khi xử dụng
/ / 10
2
CFU/g
Cá và thủy sản
Cá và thuỷ sản tươi
/
/
10
2
CFU/g
Sản phẩm chế biến từ cá và
thủy sản không qua xử lý
nhiệt
/ / 10CFU/g

Thủy sản khô sơ chế / /
10
2CFU/g
Rau quả muối - rau

quả khô

/ / /
Dầu mỡ

/ / 0CFU/g
Kem – nước đá

/ / 10CFU/g
Nước chấm nguồn
gốc động, thực vật

/ / 3CFU/g

Sữa bột TCVN 5538:2002 10CFU/g 10CFU/g

Sữa đặc có đường TCVN 5539:2002 0CFU/g /
Sữa - các sản phẩm
từ sữa
Sữa chua TCVN 7030:2002 0CFU/g Không có
Sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002 0CFU/g Không có

Pho mát / / 10
2
CFU/g
Trứng
Trứng tươi, dịch trứng tươi
hoặc đông lạnh
/ / 10CFU/g

Sản phẩm chế biến từ trứng / / 3CFU/g
Nước giải khát và
nước uống
Nước giải khát không cồn
Nước giải khát có cồn .
Nước khoáng đóng chai
/ /
Không có/ml
Thức ăn dinh dưỡng
đặc biệt
Thức ăn khô,thức ăn thay
thế đặc biệt, phải xử lý
nhiệt
/ / 10
2
CFU/g
Thức ăn khô, dùng trực tiếp / / 3CFU/g
Gia vị

/ /
10
2
CFU/g
TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam; QĐ-BYT: Quyết định của Bộ Y tế
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 21

1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S. AUREUS

1.2.1. Đặc điểm chung và phân loại
Độc tố ruột của S. aureus hay Staphylococcal enterotoxin (SE) là những
protein có trọng lượng phân tử 25 - 29 kDa, chứa vòng cystein bên trong phân tử
giúp ổn định cấu trúc phân tử và có thể có vai trò trong sự kháng protease của các
độc tố này. Các SE dễ tan trong nước và nước muối, có điểm đẳng điện pI là 7 - 8,6,
(SEG, SEH có pI là 5,6 và 5,7) [54].
SE chứa nhiều lysine, axít aspartic, axít glutamic và tyrosine, khá bền với hầu
hết protease nên không bị thủy phân bởi các protease trong đường tiêu hóa. Chúng
còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain [41]. Mặt khác, SE có tính bền
nhiệt không bị mất hoạt tính ở 100
o
C trong 30 phút [4], thậm chí ở 121
o
C trong 28
phút. Tuy nhiên tính bền nhiệt này của SE phụ thuộc vào môi trường, loại thực
phẩm, độ pH, nồng độ muối và nhiều yếu tố khác. Ở nồng độ thấp trong thực phẩm
thì SE có thể bị bất hoạt trong điều kiện đóng hộp và xử lý nhiệt để khử trùng đồ
hộp [41].
Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp chúng.
Năm 1962, việc dựa vào tính kháng nguyên các độc tố SE được chia thành 5 loại
theo mẫu tự la tinh là độc tố A (SEA), B (SEB), C (SEC), D (SED) và E (SEE)
[53]. Trong đó, SEC lại được chia thành SEC
1
, SEC
2
, SEC
3
. Sau này, nhiều SE mới
cùng với các gen tương ứng đã được công bố và được đặt tên từ SEG đến SER và
SEU [38]. Tuy nhiên, sự liên quan giữa các SE mới này trong ngộ độc thực phẩm

thì chưa rõ. Do vậy, hiện nay hầu hết các bộ bộ kít thương mại chỉ được phát triển
đối với 5 độc tố SE là SEA, SEB, SEC, SED và SEE, chính là các độc tố thường
gặp nhất trong ngộ độc thực phẩm do S. aureus [21] [38]. Mặt khác, có khoảng 5%
các vụ ngộ độc do S.aureus được cho là có nguyên nhân bởi các độc tố chưa được
xác định [52].
- Độc tố A (SEA)
Độc tố SEA được mã hóa bởi gen entA được mang bởi một bacteriophage
ôn hoà trong vi khuẩn [14]. Gen entA mã hóa cho pre-SEA chứa 257 acid amin. Khi
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 22

- Độc tố B (SEB)
Độc tố SEB chứa 267 acid amin, trọng lượng phân tử 31,4 kDa được mã hóa
bởi gen entB trên DNA của vi khuẩn hoặc được mang bởi plasmid [55] [56].
- Độc tố C (SEC)
Độc tố SEC gồm 3 loại SEC1, SEC2 và SEC3 có trình tự acid amin rất giống
nhau. SEC1 chỉ khác SEC3 bởi 9 acid amin và SEC2 khác SEC3 4 acid amin. Gen
entC3 có chiều dài 801bp mã hóa pre-SEC3 chứa 267 acid amin với một peptid tín
hiệu 27 acid amin ở đầu N. Sự cắt loại bỏ peptid tín hiệu này khi được tiết ra khỏi tế
bào tạo thành SEC3 với 240 acid amin có hoạt tính [32].
- Độc tố D (SED)
Độc tố SED gồm 288 acid amin, là độc tố được mã hóa bởi gen entD nằm
trên plasmid. Gen entD mã hóa cho pre-SED gồm 258 acid amin chứa một peptid
tín hiệu 30 acid amin.
- Độc tố E (SEE)
Độc tố SEE là một protein 239 acid amin được mã hóa bởi gen entE có 81%
tương đồng entA. Gen entE mã hóa cho một pre SEE chứa 257 acid amin.
- Các độc tố khác:

+ Độc tố SEG: chứa 233 acid amin được tạo thành từ pre SEG chứa 258 acid
amin có tính tương đồng cao với SEB, SEC và SSA [44].
+ Độc tố SEH: mới được phát hiện gần đây có trọng lượng phân tử 27 kDa
không có phản ứng chéo miễn dịch với các SE xác định trước đây [60].
+ Độc tố SEI: là loại độc tố gồm 218 acid amin được hình thành từ preSEI,
chứa 242 acid amin, có tính tương đồng thấp với các SE khác [44].
+ Độc tố SEJ: có 245 acid amin có trình tự tương đồng đáng kể với SEA, SEE
và SED (64 - 66%). Bảng 1.3 tổng hợp các đặc tính sinh hóa chính của các độc tố
SE.
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 23

Bảng 1.3. Một số đặc điểm sinh hóa chính của các độc tố ruột.
Loại
độc tố
Khung
đọc mở
(bp)
Chiều dài
tiền độc tố
(acid amin)
Chiều dài độc
tố (acid amin)
Trọng lượng
phân tử
(Da)
Điểm
đẳng điện

Tài liệu
tham khảo
A 774 257 233 27100 7,3
[13]
B 801 266 239 28336 8,6
[17]
C1 801 266 239 27531 8,6
[17]
C2 801 266 239 27531 7,8
[17]
C3 801 266 239 27563 8,1
[32]
D 777 258 222 26360 7,4
[23]
E 774 257 230 26425 7,0
[26]
G 777 258 233 27043 5,7
[44]
H 726 241 218 25210 ND
[60]
I 729 242 218 24928 ND
[44]
J 806 268 245 28565 8,65
[44]

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo độc tố SE
Mặc dù SE có thể được tạo ra ở khoảng điều kiện rất rộng nhưng cũng bị ảnh
hưởng bởi một số yếu tố môi trường. Thông thường, khi S. aureus tăng trưởng đến
mức 10
6

CFU/g thực phẩm thì có thể tạo SE [58]. Các chủng S. aureus khác nhau
có nhu cầu khác nhau về acid amin cho sự tăng trưởng và tạo độc tố. Valine cần cho
sự tăng trưởng của S. aureus; arginine và cystine cần cho sự tăng trưởng và sinh độc
tố; các acid amin khác thì có nhu cầu khác nhau tùy từng chủng [41]. Điều kiện
thích hợp nhất để tạo độc tố SE là pH trung tính. Khi trị số pH giảm và độ ẩm thấp
(dưới 0,86) thì sự tạo SE bị giảm hay bị ức chế [51]. Tương tự, pH kiềm cũng làm
giảm khả năng tạo độc tố SEB, SEC và SED. Sự tạo SE cũng bị ức chế bởi dịch
chiết từ lựu [18]. Glucose cũng có tác dụng ức chế sự tạo độc tố SEB và SEC do sự
biến dưỡng glucose làm giảm pH [41]. Nồng độ muối cao (trên 12%) trong thực
phẩm cũng làm ức chế sự tạo độc tố.

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 24

1.2.3. Hoạt tính của độc tố ruột SE
a. Hoạt tính siêu kháng nguyên

Phân tử SE có thể tác động trực tiếp lên chuỗi β của thụ thể tế bào T và phức
hợp tương hợp mô MHC-2 không thông qua sự trình diện kháng nguyên APC và
hoạt hóa tế bào này. Ở người, tỷ lệ tế bào T được hoạt hóa khi bị nhiễm SE có thể
lên đến 2 – 20% của các tế bào T. Các tế bào T được hoạt hóa này tiết ra một lượng
lớn bất thường các cytokine và thường gây sốt. Các protein có đặc tính tương tự
như SE được gọi là siêu kháng nguyên (superantigen) hay độc tố siêu kháng nguyên
gây sốt (pyrogenic toxin superantigen, PTSA) [41].
b. Hoạt tính gây nôn

Hoạt tính gây nôn chưa được hiểu rõ, người ta cho rằng độc tố SE có lẽ tác
động trực tiếp lên biểu mô của đường tiêu hoá và lên thần kinh phế vị gây kích thích

trung tâm nôn gây nôn mửa là một trong các triệu chứng ngộ độc của SE. Liều gây
ngộ độc do SE khoảng 0,1µg, thay đổi tùy độ mẫn cảm của từng người. Họat tính
gây nôn được cho là có liên quan đến vòng cystine trong phân tử các SE [41].
1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS TRONG
THỰC PHẨM
1.3.1. Định lượng S. aureus trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy
a. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô
trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Nếu mẫu giữ đông phải làm tan băng trước
khi xét nghiệm. Mẫu thực phẩm nếu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản ở
-20
O
C và không quá 4 ngày. Thực phẩm khô không cần bảo quản lạnh.
Cân chính xác 25g mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị hoặc hút chính xác
25ml mẫu thực phẩm lỏng cho vào chai dural chứa sẵn 225ml nước đệm phosphat
(hay 90ml nước đệm phosphat). Lắc đều 2-3 phút thì thu được dung dịch mẫu thử
có độ pha loãng 10
-1
. Mẫu được pha loãng tiếp tục 10
-2
, 10
-3
, …tùy theo mức nhiễm
của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích mẫu xác định lên đĩa thạch Baird
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc


Trang 25

Parker, thạch Chapman hoặc thạch máu sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc/
đĩa.
Sau 48 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường Baid-Parker có đường kính
khoảng 0,5 - 1mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng
khoảng 1 - 2mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc của một số dòng có thể không tạo các
vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên [54].
Trên môi trường Chapman khuẩn lạc lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm (do
sử dụng đường manitol màu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng), đường kính
khuẩn lạc 0,1 - 1mm; sau 48 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có màu vàng đậm.
Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ, S. aureus cho khuẩn lạc bóng
loáng, đục lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 - 2mm. Hầu hết
S.aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.
Chọn những khuẩn lạc đặc trưng để thử phản ứng coagulase, và dựa vào tỷ lệ các
khuẩn lạc cho kết qua coagulase (+), tính kết quả.
b. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ
S. aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với 3 độ
pha loãng liên tiếp. Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể
sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần
lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở
mỗi độ pha loãng).
Trên cơ sở các ống cho kết quả dương tính trong ống môi trường canh cấy
chọn lọc và khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker hoặc Chapman có
phản ứng coagulase (+) và tính kết quả dựa vào bảng MPN 9 ống hoặc 15 ống để
suy ra mật độ S. aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml) [54].
1.3.2. Phát hiện và định lượng S. aureus trong thực phẩm bằng phản ứng PCR
Các tiến bộ về khoa học và công nghệ ngày nay đã giúp cho việc xét nghiệm
vi sinh vật trở nên nhanh, tiện, nhạy và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc

Trang 26

pháp nuôi cấy. Tại Việt Nam, việc phát hiện S. aureus trong thực phẩm được thực
hiện chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của
phương pháp này là thời gian phân tích kéo dài, phải mất 3 - 4 ngày mới cho kết
quả chính thức. Năm 2006, phương pháp PCR để phát hiện S. aureus trong thực
phẩm đã được thiết lập tại Việt Nam trong báo cáo nghiệm thu đề tài Khoa học và
Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học
phân tử vào việc kiểm tra, giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, KC.04-30, Bộ Khoa
học và Công nghệ, 2006 của tác giả Trần Linh Thước [5] dựa trên việc nhân bản sao
đoạn gen nuc mã hóa cho protein nuclease chịu nhiệt đặc trưng cho S. aureus với
cặp mồi chuyên biệt cho sản phẩm PCR có kích thước là 276bp. Do S. aureus
thường hiện diện với mật độ thấp trong thực phẩm, vì vậy để làm tăng độ nhạy phát
hiện, trước khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR cần phải qua bước tăng sinh trong
môi trường không chọn lọc. Qui trình phát hiện S.aureus trong thực phẩm bằng
phản ứng PCR được tiến hành qua các bước sau:
- Đồng nhất và tăng sinh 25g mẫu 225ml môi trường Saline Peptone Water
(SPW) hoặc Trytone Soya Broth (TSB) bằng máy dập mẫu Stomacher trong 30
giây, ủ 37
o
C trong 24 giờ.
- 1ml dịch canh khuẩn sau tăng sinh được ly tâm ở để thu sinh khối, rửa
bằng nước cất vô trùng, huyền phù hóa với 1ml nước cất và đun sôi cách thủy trong
10 phút. Dịch đun sôi được ly tâm để thu dịch nổi chứa DNA mẫu.
- Phản ứng PCR được thực hiện trong dung tích 25μl gồm các thành phần là
2,5μl đệm dùng cho phản ứng PCR (10X); 2,5μl dNTP 100μM; 1,0μl Taq
polymerase 1U; 1,0μl mồi 1 (5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’) 6pM,
1,0μl mồi 2 (5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’) 6pM; 3,0μl DNA

khuôn; 14,0μl nước cất. Mẫu được ủ trong máy điều nhiệt theo chu kỳ ở 95
o
C trong
5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi DNA có trong mẫu. Phản ứng PCR gồm
35 chu kỳ gồm các bước như sau: (i) Biến tính ban đầu ở 95
o
C trong 5 phút; 35 chu
kỳ gồm ba bước: biến tính ở 94
o
C trong 30 giây, bắt cặp ở 55
o
C trong 40 giây, kéo
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ Phúc