Phân tích các biến đổi hình thái học và sinh lý học trong các quá trình phát sinh cơ quan và phôi thể hệ ở một số giống chuối (Musa sp.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TRẦN THANH HƯƠNG





PHÂN TÍCH CÁC BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH LÝ HỌC
TRONG CÁC QUÁ TRÌNH PHÁT SINH CƠ QUAN VÀ PHÔI THỂ HỆ
Ở MỘT SỐ GIỐNG CHUỐI (Musa sp.)

Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật
Mã số: 62 42 30 05




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. BÙI TRANG VIỆT
2. GS.TS. FENG TENG-YUNG



Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

i
MỤC LỤC

Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH x
MỞ ĐẦU. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây chuối 3
1.2. Các nghiên cứu nhằm cải tiến giống chuối trên thế giới và ở Việt Nam 5
1.2.1. Sự nuôi cấy chồi và mô phân sinh ngọn chồi 5
1.2.2. Sự thu nhận phôi soma 6
1.3. Phát sinh hình thái thực vật, phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử 8
1.3.1. Phát sinh hình thái thực vật 8
1.3.2. Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi 8
1.3.3. Mô phân sinh ngọn rễ và sự phát triển rễ 11
1.3.4. Sự phát triển phôi hợp tử 13
1.4. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong phát sinh cơ
quan và phát triển phôi hợp tử 14
1.4.1. Auxin 15
1.4.2. Cytokinin 18
1.4.3. Gibberellin và acid abscisic 19
1.5. Cơ sở phân tử của sự phát sinh hình thái 20
1.6. Sự phát sinh hình thái in vitro và các ứng dụng của vi nhân giống 23
1.6.1. Sự phát sinh cơ quan 23
1.6.2. Sự phát sinh phôi soma 24

ii
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU 31
2.1.1. Vật liệu nuôi cấy 31

2.1.2. Vật liệu được dùng trong các sinh trắc nghiệm 31
2.2. PHƯƠNG PHÁP 34
2.2.1. Quan sát các biến đổi hình thái học, giải phẫu học 34
2.2.2. Đo cường độ hô hấp 35
2.2.3. Đo hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 35
2.2.4. Nuôi cấy khúc cắt chồi và khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi 39
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự
phát triển chồi 40
2.2.6. Áp dụng phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và sự hủy mô phân
sinh ngọn chồi 40
2.2.7. Áp dụng phương pháp nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi trong
vi nhân giống 41
2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát
triển rễ bất định từ khúc cắt chồi 41
2.2.9. Tạo mô sẹo và dịch treo tế bào 42
2.2.10. Tạo phôi soma từ dịch treo tế bào 44
2.2.11. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển phôi 47
2.2.12. Sự chuyển cây ra vườn ươm 48
2.2.13. Thử dùng dịch treo tế bào để cô lập, dung hợp và nuôi cấy tế bào trần 48
2.2.14. Xử lý thống kê kết quả thu được 50

iii
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ 51
3.1. Sự hình thành và phát triển chồi 51
3.1.1. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển chồi 51
3.1.2. Mối liên hệ giữa kiểu gen, kích thước mô phân sinh ngọn chồi và sự phát
triển chồi 62
3.1.3. Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát triển chồi 65
3.1.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp của chồi 68

3.1.5. Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh
trong quá trình phát triển chồi 70
3.1.6. Áp dụng phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và sự hủy mô
phân sinh ngọn trong sự phát triển chồi 73
3.1.7. Áp dụng phương pháp nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi trong
vi nhân giống 77
3.2. Sự hình thành rễ bất định từ các khúc cắt chồi 79
3.2.1. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển rễ bất định 79
3.2.2. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát
triển rễ bất định 86
3.3. Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào 86
3.3.1. Sự hình thành mô sẹo từ hoa đực non 86
3.3.2. Sự hình thành dịch treo tế bào từ mô sẹo có nguồn gốc hoa đực non 86
3.3.3. Sự hình thành dịch treo tế bào từ cụm chồi tăng sinh cao 86
3.3.4. Ảnh hưởng của pH và sự loại 2,4-D trên sự hình thành tế bào có khả
năng sinh phôi 93
3.4. Sự sinh phôi soma ở chuối 96
3.4.1. Các thay đổi hình thái trong quá trình phát triển phôi 96

iv
3.4.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu trên sự phát sinh phôi 104
3.4.3. Ảnh hưởng của pH và sự loại các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
trong các môi trường Ma
2
, Ma
3
trong sự phát sinh phôi 105
3.4.4. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trên sự sinh phôi 105
3.4.5. Số lần cấy chuyền dịch treo tế bào và khả năng phát sinh phôi 109
3.4.6. Ảnh hưởng của acid abscisic trong sự trưởng thành của phôi 109

3.4.7. Ảnh hưởng của TIBA trong sự hình thành và phát triển phôi 111
3.4.8. Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh
trong quá trình phát triển phôi 115
3.4.9. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển phôi 116
3.5. Sự chuyển cây ra vườn ươm 123
3.6. Sự cô lập, dung hợp và nuôi cấy tế bào trần 126
THẢO LUẬN 131
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 152
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 154
TÀI LIỆU THAM KHẢO 156
PHỤ LỤC

v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHP : Cultures Hautement Proliférante
TLT : Trọng lượng tươi

IAA : indol acetic acid
IBA : indol butyric acid
NAA : 1-naphtalene acetic acid
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
TIBA : 2,3,5-triiodobenzoic acid
TDZ : Thiadiazuron
BA : 6-Benzylaminopurine
KIN : kinetin
2-iP : 6-dimethylallylaminopurin
ABA : abscisic acid
GA

3
: gibberellic acid

Fe-EDTA : Ferric Ethylen Diamintetraacetat
PEG : Polyethylene glycol
TTC : 2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride
SCV : Settled cell volume
SAM : Shoot apical meristem


vi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Kích thước của mô phân sinh ngọn chồi cây trong vườn thuộc một số
giống trồng có kiểu gene khác nhau, ở giai đoạn 1 tháng tuổi 62
Bảng 2. Kích thước của mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro 6 tuần tuổi, thuộc
một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, tăng trưởng từ khúc cắt chồi
trên môi trường MS 63
Bảng 3. Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây trong vườn,
thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy
trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l. 64
Bảng 4. Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro,
thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy
trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l. 64
Bảng 5. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự hình thành
và phát triển chồi từ khúc cắt chồi cây in vitro chuối Cau Mẵn sau 4
tuần nuôi cấy 66
Bảng 6. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin trong sự tăng sinh chồi
từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro, thuộc một số giống
trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy 67

Bảng 7. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin trên sự phát triển chiều
cao chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro, thuộc một
số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau 6 tuần nuôi cấy 67
Bảng 8. Cường độ hô hấp của khúc cắt chồi từ cây trong vườn một tháng tuổi,
thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau. 68
Bảng 9. Cường độ hô hấp của khúc cắt chồi từ cây in vitro 6 tuần tuổi tăng trưởng
trên môi trường MS, thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau. 68

vii
Bảng 10. Cường độ hô hấp của mẫu cấy phát triển từ khúc cắt mô phân sinh ngọn
chồi cây in vitro, thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau, sau
4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA
2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l 69
Bảng 11. Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do (đo bằng
phương pháp sinh trắc nghiệm) trong khúc cắt chồi cây trong vườn một
tháng tuổi, thuộc một số giống trồng có kiểu gene khác nhau. 71
Bảng 12. Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do (đo
bằng phương pháp sinh trắc nghiệm) trong khúc cắt chồi cây in vitro 6
tuần tuổi tăng trưởng trên môi trường MS, thuộc một số giống trồng
có kiểu gene khác nhau. 71
Bảng 13. Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do trong
mẫu cấy phát triển từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi
cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17mg/l, BA 2,5 mg/l và
zeatin 1 mg/l (đo bằng phương pháp sinh trắc nghiệm) 72
Bảng 14. Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng liên kết trong
mẫu cấy phát triển từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi
cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và
zeatin 1 mg/l (đo bằng phương pháp sinh trắc nghiệm). 72
Bảng 15. Hàm lượng IAA và zeatin tổng cộng trong mẫu cấy phát triển từ khúc
cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP*

với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l (đo bằng phương
pháp HPLC). 73
Bảng 16. Sự phát sinh chồi từ các mẫu cấy chịu các kiểu tác động lên mô phân
sinh ngọn chồi khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP*
có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l. 74

viii
Bảng 17. Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi của một số
giống chuối sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung
IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1mg/l 77
Bảng 18: Ảnh hưởng của auxin trong sự hình thành sơ khởi rễ (quan sát dưới
kính hiển vi) từ khúc cắt chồi sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường
MSK với IAA, NAA hay 2,4-D ở các nồng độ khác nhau. 83
Bảng 19. Vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái rễ từ khúc cắt chồi
chuối Cau Mẵn sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MSK với IAA,
NAA hay 2,4-D ở các nồng độ khác nhau 85
Bảng 20. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu trên sự phát sinh phôi của dịch
treo tế bào có nguồn gốc mô sẹo chuối Cau Mẵn sau 21 ngày nuôi cấy
trên môi trường đặc Ma
*
3
với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05
mg/l và NAA 0,2 mg/l, ở pH 5,3 104
Bảng 21. Số phôi được tạo từ dịch treo tế bào có nguồn gốc mô sẹo chuối Cau
Mẵn trên các môi trường có pH khác nhau, trong mỗi hộp Petri với 0,5
ml dịch treo tế bào ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy. 105
Bảng 22. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trong sự phát sinh phôi
(giai đoạn hình cầu) từ dịch treo tế bào có nguồn gốc cụm chồi tăng
sinh cao chuối Cau Mẵn sau 28 ngày nuôi cấy 106
Bảng 23. Mối liên hệ giữa số lần cấy chuyền dịch treo tế bào và khả năng phát

sinh phôi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma
*
3
có bổ sung kinetin
0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 109
Bảng 24. Vai trò của TIBA trong sự phát sinh phôi sau 21 ngày nuôi cấy tế bào
dịch treo chuối Cau Mẵn ở các thời điểm phát triển phôi khác nhau trên
môi trường Ma
*
3
có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05
mg/l và TIBA ở các nồng độ thay đổi. 111

ix
Bảng 25. Tác động của TIBA trên phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát
triển khác nhau sau 42 ngày nuôi cấy trên môi trường MS½ với BA
0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l 113
Bảng 26. Sự thay đổi hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật tổng cộng
trong quá trình hình thành và phát triển phôi soma từ tế bào dịch treo
chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao (đo bằng
phương pháp HPLC). 116
Bảng 27. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trên sự phát triển phôi
sau 42 ngày nuôi cấy các phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát
triển khác nhau 118.

x

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ một cây chuối trưởng thành 4

Hình 1.2. Sự phân vùng chức năng của mô phân sinh ngọn chồi 10
Hình 1.3. Mối liên hệ giữa sự di chuyển của auxin và sự phát triển phôi 17
Hình 1.4. Mối liên hệ tương tác giữa WUS và CLV trong sự duy trì các tế bào gốc 23
Hình 2.1. Cây chuối Sứ 1 tháng tuổi được trồng trong vườn tại Tiền Giang. 32
Hình 2.2. Các cây chuối in vitro 6 tuần tuổi tăng trưởng trên môi trường MS 32
Hình 2.3. Chồi đực (bắp chuối) của chuối Cau mẵn và chuối Hột. 33
Hình 2.4. Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 38
Hình 3.1. Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn qua lát cắt dọc sau
6 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên
môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l. 53
Hình 3.2. Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Hột qua lát cắt dọc sau 6
tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên
môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l. 53
Hình 3.3. Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn qua lát cắt dọc
sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in
vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5
mg/l và zeatin 1 mg/l 54
Hình 3.4. Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Hột qua lát cắt dọc sau 4
tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in vitro trên
môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và
zeatin 1 mg/l. 54
Hình 3.5. Chi tiết vùng trung tâm của mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau
Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây
in vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5
mg/l và zeatin 1 mg/l 55

xi
Hình 3.6. Chi tiết vùng ngoại vi của mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn
sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi từ cây in
vitro trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5

mg/l và zeatin 1 mg/l 55
Hình 3.7. Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro
sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* với IAA 0,17 mg/l, BA
2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l. 56
Hình 3.8. Vùng trung tâm mô phân sinh ngọn chồi hình thành ở nách lá. 57
Hình 3.9. Vùng trung tâm mô phân sinh ngọn chồi hình thành từ trục thân 57
Hình 3.10. Sơ khởi chồi hình thành từ trục thân chuối Hột sau 6 tuần nuôi cấy
khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi trường
CHP* có bổ sung với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l. 57
Hình 3.11. Cấu trúc mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn qua lát cắt dọc sau
4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi
trường CHP* (quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt). 58
Hình 3.12. Chi tiết tế bào lớp L1 và L2 của mô phân sinh ngọn chồi chuối
Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây
in vitro trên môi trường CHP* có hay không bổ sung chất điều hòa
tăng trưởng thực vật. 59
Hình 3.13. Sự phân chia ngẫu nhiên của các tế bào lớp L2 ở vùng ngoại vi của
mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy khúc
cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi trường CHP*. 60
Hình 3.14. Sự phân chia theo hướng song song của các tế bào lớp L2 ở vùng
ngoại vi của mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi
cấy khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi cây in vitro trên môi trường
CHP* có bổ sung IAA 0,17mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1mg/l 60
Hình 3.15. Hoa đực non với cụm chồi hình thành ở phần gốc sau 6 tuần nuôi cấy. 61
Hình 3.16. Chi tiết một chồi cụm từ hoa đực non sau 6 tuần nuôi cấy. 61

xii
Hình 3.17. Lát cắt dọc qua phần gốc cuống hoa với sự hình thành trung tâm
mô phân sinh ngọn chồi sau 3 tuần nuôi cấy. 61
Hình 3.18. Lát cắt dọc qua phần gốc cuống hoa với sự hiện diện của nhiều

trung tâm mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần nuôi cấy. 61
Hình 3.19. Lát cắt dọc qua các chồi hình thành từ mẫu cấy hoa đực non sau 5
tuần nuôi cấy. 61
Hình 3.20. Chi tiết các chồi hình thành từ mẫu cấy hoa đực non sau 5 tuần
nuôi cấy. 61
Hình 3.21. Sự phát sinh chồi từ các mẫu cấy chịu ảnh hưởng bởi các kiểu tác
động khác nhau lên mô phân sinh ngọn chồi sau 3 tuần nuôi cấy
trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và
zeatin 1 mg/l. 75
Hình 3.22. Sự hình thành chồi mới ở mẫu cấy cắt bỏ một phần mô phân sinh
ngọn chồi sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung
IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l. 74
Hình 3.23. Sự phát sinh chồi ở lát cắt dọc ở giữa chồi sau 10 ngày nuôi cấy
trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và
zeatin 1 mg/l 76
Hình 3.24. Sự phát triển chồi từ khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi sau 4 tuần
nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5
mg/l và zeatin 1mg/l (hình chụp ở lần cấy chuyền thứ ba). (A), La
Ba; (B), Chà Bột; (C), Lửa; (D), Tá Quạ; (E), W1; (F) W2. 78
Hình 3.25. Cấu trúc tổng quát của thân cây chuối Già Hương in vitro 4 tuần
tuổi có nguồn gốc từ sự nuôi cấy mô phân sinh ngọn trên môi
trường CHP* với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1mg/l qua
lát cắt ngang 80
Hình 3.26. Nguồn gốc nội sinh của rễ bất định từ thân cây chuối Già Hương
sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường MSK qua lát cắt ngang. 80

xiii
Hình 3.27. Các giai đoạn của sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt chồi chuối
Già Hương tăng trưởng trên môi trường MSK 81
Hình 3.28. Rễ kéo dài trên môi trường đối chứng (MSK) 84

Hình 3.29. Sơ khởi rễ hình thành với mật độ cao trên cùng một lát cắt ở mẫu
cấy phát triển trên môi trường với NAA 0,4 mg/l 84
Hình 3.30. Sơ khởi rễ hình thành với mật độ cao trên cùng một lát cắt và có
sự gia tăng bề rộng ở vài sơ khởi rễ ở mẫu cấy phát triển trên môi
trường với 2,4-D 0,05 mg/l 84
Hình 3.31. Nhiều trung tâm mô phân sinh rễ hiện diện cùng với các tế bào
mô sẹo ở mẫu cấy phát triển trên môi trường với 2,4-D 0,2 mg/l 84
Hình 3.32. Mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau Mẵn sau 4 tháng nuôi cấy trên
môi trường MS với 2,4-D 4 mg/l, NAA 1 mg/l và IAA 1 mg/l 87
Hình 3.33. Mô sẹo từ hoa đực non chuối Hột sau 4 tháng nuôi cấy trên môi
trường MS với 2,4-D 4mg/l, NAA 1mg/l và IAA 1mg/l. 87
Hình 3.34. Lát cắt dọc qua vùng chồi đực với sự hiện diện của các hoa đực
non (mẫu cấy ngày 0). 88
Hình 3.35. Lát cắt dọc qua phần gốc của một hoa đực non sau 15 ngày nuôi cấy
trên môi trường MS với 2,4-D 4 mg/l, NAA 1 mg/l và IAA 1 mg/l 85
Hình 3.36. Dịch treo tế bào 14 ngày tuổi, hình thành từ mô sẹo chuối Cau
Mẵn sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma
*
2
có bổ sung 2,4-D 1
mg/l và zeatin 0,5 mg/l. 89
Hình 3.37. Dịch treo tế bào 14 ngày tuổi, hình thành từ mô sẹo chuối Hột sau
2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma
*
2
có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và
zeatin 0,5 mg/l 89
Hình 3.38. Đặc tính của tế bào có khả năng sinh phôi trong dịch treo tế bào
14 ngày tuổi có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau Mẵn
sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma

*
2
với 2,4-D 1 mg/l và
zeatin 0,5 mg/l. 90

xiv

Hình 3.39. Tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình thành từ mô sẹo chuối Hột sau 2
tháng nuôi cấy trên môi trường Ma với 2,4-D 1mg/l và zeatin 0,5 mg/l. 90
Hình 3.40. Dịch treo tế bào 14 ngày tuổi hình thành từ cụm chồi tăng sinh
cao chuối Cau Mẵn sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường Ma
*
2
với
2,4-D 1,2 mg/l và zeatin 0,5 mg/l. 91
Hình 3.41. Sự phân chia cân xứng của tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình
thành từ cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn sau 2 tháng nuôi
cấy trên môi trường Ma
*
2
với 2,4-D 1,2 mg/l và zeatin 0,5 mg/l 91
Hình 3.42. Lát cắt qua các tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình thành từ cụm
chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn trên môi trường Ma
*
2
với 2,4-D
1,2 mg/l và zeatin 0,5 mg/l (nhân to, tế bào chất đậm đặc). 92
Hình 3.43. Lát cắt qua các tế bào dịch treo 14 ngày tuổi, hình thành từ cụm
chồi tăng sinh cao chuối Hột trên môi trường Ma
*

2
với 2,4-D 1,2
mg/l và zeatin 0,5 mg/l (nhân nhỏ hơn, không bào lớn). 92
Hình 3.44. Các tế bào có khả năng sinh phôi bên cạnh các tế bào không có
khả năng sinh phôi. 94
Hình 3.45. Chi tiết tế bào không có khả năng sinh phôi với nhân nhỏ nhưng
hạt tinh bột và không bào lớn. 94
Hình 3.46. Chi tiết tế bào có khả năng sinh phôi với nhân to, hạt tinh bột và
không bào nhỏ hơn. 94
Hình 3.47. Chi tiết tế bào có khả năng sinh phôi đang trong giai đoạn phân
bào với hạt tinh bột rất nhỏ 94
Hình 3.48. Tế bào dịch treo có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non chuối Cau
Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma
*
2
có bổ sung 2,4-D
1 mg/l, pH 3 và mật độ tế bào ban đầu 7,5 m/l 95
Hình 3.49. Các nhóm tế bào dịch treo có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non
chuối Cau Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma
*
2
có bổ

xv

sung 2,4-D 1 mg/l, pH 5,3 và mật độ tế bào ban đầu 7,5 m/l tế
bào lắng/ml dịch treo tế bào 95
Hình 3.50. Các nhóm tế bào dịch treo có nguồn gốc mô sẹo từ hoa đực non
chuối Cau Mẵn sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma
*

2
lỏng
không có 2,4-D, pH 5,3 và mật độ tế bào ban đầu 7,5 m/l tế bào
lắng/ml dịch treo tế bào 95
Hình 3.51. Sự phân chia không cân xứng của tế bào dịch treo sau 4 ngày nuôi cấy. 98
Hình 3.52. Phôi hình cầu hình thành sau 8 ngày nuôi cấy 98
Hình 3.53. Phôi hình cầu với dây treo hình thành sau 14 ngày nuôi cấy 98
Hình 3.54. Phôi ở các trạng thái khác nhau hình thành sau 42 ngày nuôi cấy 98
Hình 3.55. Sự thành lập phôi thứ cấp xung quanh phôi xuất hiện trước (ở trạng
thái núi lửa) sau 42 ngày nuôi cấy 98
Hình 3.56. Chi tiết tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng
sinh cao sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma
*
3
99
Hình 3.57. Tế bào với nhân to và tròn, tế bào chất đậm đặc, và mật độ ti thể
hình cầu cao. 99
Hình 3.58. Vùng tế bào với sự hiện diện của ti thể và mạng nội chất. 99
Hình 3.59. Vùng tế bào với sự hiện diện của hệ thống Golgi. 99
Hình 3.60. Sự phân bào (A) và phân chia không cân xứng (B) của tế bào dịch
treo chuối Cau Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma
*
3
có bổ
sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 100
Hình 3.61. Phôi hình cầu sớm hình thành từ tế bào dịch treo có nguồn gốc cụm
chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường
Ma
*
3

có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l. 100
Hình 3.62. Phôi hình cầu sớm hình thành từ tế bào dịch treo có nguồn gốc cụm
chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn 21 ngày trên môi trường Ma
*
3
100
Hình 3.63. Các phôi hình cầu với biểu bì hóa 101
Hình 3.64. Chi tiết một phôi hình cầu với biểu bì hóa 101

xvi

Hình 3.65. Phôi hợp tử chuối Hột 30 ngày tuổi 101
Hình 3.66. Quá trình hình thành mô phân sinh ngọn chồi của phôi phát triển từ
tế bào dịch treo có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn
trên môi trường Ma
*
3
có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,02 mg/l và
zeatin 0,05 mg/l. 102
Hình 3.67. Phôi ở trạng thái tử diệp phát triển từ phôi hình núi lửa chuối Cau
Mẵn sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường MS½. 103
Hình 3.68. Sự phát sinh phôi sau 49 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau
Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh phôi trên môi trường Ma
*
3
. 107
Hình 3.69. Sự phát sinh phôi sau 49 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau
Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao trên môi trường Ma
*
3

có
bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 107
Hình 3.70. Phôi hình núi lửa (quan sát dưới kính hiển vi quang học). 108
Hình 3.71. Phôi hình núi lửa (quan sát dưới kính hiển vi confocal). 108
Hình 3.72. Phôi hình chùy (quan sát dưới kính hiển vi confocal). 108
Hình 3.73. Phôi hình cầu muộn với lớp tế bào biểu bì phân chia quá mức
(quan sát dưới kính hiển vi confocal). 108
Hình 3.74. Sự phát triển phôi từ các phôi hình cầu chuối Cau Mẵn sau 1 tuần
nuôi cấy trên môi trường Ma
*
3
có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP
0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l 110
Hình 3.75. Sự phát triển phôi từ các phôi hình cầu chuối Cau Mẵn sau 1 tuần
nuôi cấy trên môi trường MS với ABA 0,5 mg/l. 110
Hình 3.76. Các nhóm tế bào ở thời điểm ngày 0. 112
Hình 3.77. Các nhóm tế bào ở ngày 14 của quá trình phát sinh phôi 112
Hình 3.78. Các nhóm tế bào ở ngày 28 của quá trình phát sinh phôi 112
Hình 3.79. Sự phát triển phôi từ các phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát
triển khác nhau trên môi trường MS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5
mg/l và TIBA 1 mg/l. 114

xvii

Hình 3.80. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokin trên sự phát triển
phôi từ phôi hình kim tự tháp chuối Cau Mẵn 119
Hình 3.81. Sự phát triển của cây mầm chuối Cau Mẵn từ phôi hình kim tự tháp
trên môi trường MS½ có bổ sung zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l 120
Hình 3.82. Cây mầm phát triển từ phôi hình núi lửa sau 4 tuần nuôi cấy 121
Hình 3.83. Cây mầm với sự hình thành cụm chồi phát triển từ phôi hình núi

lửa sau 8 tuần nuôi cấy. 121
Hình 3.84. Cây mầm với phần gốc bị phù phát triển từ phôi hình cầu sau 5
tuần nuôi cấy. 121
Hình 3.85. Cây mầm với tử diệp bất thường phát triển từ phôi hình cầu sau 5
tuần nuôi cấy 121
Hình 3.86. Phôi với sự hiện diện của mô phân sinh ngọn chồi và rễ sau 3 tuần
nuôi cấy. 122
Hình 3.87. Phôi trưởng thành với sự hiện diện của các sơ khởi cơ quan (chồi,
rễ và hệ thống mạch) sau 4 tuần nuôi cấy 122
Hình 3.88. Cụm chồi phát triển từ phôi chuối Cau Mẵn bị cắt bỏ một phần
mô phân sinh ngọn chồi, sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½
có bổ sung BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l. 124
Hình 3.89. Cụm chồi phát triển từ lát cắt dọc qua mô phân sinh ngọn chồi của
phôi chuối Cau Mẵn (phôi tế bào dịch treo), sau 3 tuần nuôi cấy
trên môi trường MS½ có bổ sung BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l. 124
Hình 3.90. Các cây chuối Cau mẵn sau 6 tuần chuyển ra bầu đất và tăng
trưởng trong nhà lưới tại Bộ môn Sinh lý thực vật, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 125
Hình 3.91. Các cây chuối La Ba sau 14 tuần chuyển ra bầu đất tăng trưởng
trong nhà lưới tại Bộ môn Sinh lý thực vật, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh 125
Hình 3.92. Sự phóng thích tế bào trần từ các nhóm tế bào dịch treo 127
Hình 3.93. Sự phóng thích tế bào trần từ lá cây in vitro. 127

xviii

Hình 3.94. Tập hợp tế bào trần được cô lập từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn 127
Hình 3.95. Chi tiết một nhóm tế bào trần được cô lập từ dịch treo tế bào
chuối Cau Mẵn. 127
Hình 3.96. Khả năng sống của tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi

trường PCM 127
Hình 3.97. Tế bào trần từ tế bào dịch treo sau 10 ngày nuôi cấy trên môi
trường PCM 127
Hình 3.98. Sự tăng trưởng của tế bào trần được cô lập từ dịch treo tế bào
chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy 128
Hình 3.99. Sự thành lập vách của tế bào trần sau 5 ngày nuôi cấy trên môi
trường N
6
PKM với 2,4-D 0,2 mg/l, NAA 1 mg/l và zeatin 0,5 mg/l 129
Hình 3.100. Tập hợp các tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường
PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn 129
Hình 3.101. Sự phân chia của tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi
trường PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn. 129
Hình 3.102. Cụm tế bào hình thành từ tế bào trần sau 28 ngày nuôi cấy trên
môi trường PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn 129
Hình 3.103. Sự dung hợp của các tế bào trần dưới ảnh hưởng của PEG 130
Hình 3.104. Mô hình giải thích sự phát triển chồi từ mô phân sinh ngọn chồi
và sự phát triển rễ bất định từ chồi (SAM, mô phân sinh ngọn chồi;
PZ, vùng ngoại vi; RZ, vùng lõi). 139
Hình 3.105. Mô hình giải thích sự hình thành và phát triển phôi 151






1

MỞ ĐẦU
Chuối là cây ăn trái rất được ưa chuộng ở hầu hết các nước trên thế giới. Ở

một số vùng nhiệt đới ẩm (Châu Phi, Đông Á và một số vùng thuộc khu vực Đông
Nam Á), chuối còn là nguồn cung cấp năng lượng chính. Ngoài lượng carbohydrat
phong phú, trái chuối giàu potassium, một chất dinh dưỡng khoáng cần cho hoạt
động nhịp nhàng của tim, và chứa nhiều vitamin C, B
6
, đặc biệt là vitamin A, loại
vitamin thường thiếu hụt trong bữa ăn của người dân vùng nhiệt đới [65], [116].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy trong trái chuối (Musa acuminata) có sự hiện diện
của Banlec, một protein đặc biệt thuộc nhóm lectin có khả năng làm chậm sự lây lan
HIV (human immunodeficiency virus) bằng cách ngăn cản sự xâm nhập của virus
này vào cơ thể [87], [126].
Với giá trị cao về mặt dinh dưỡng, cảm quan và dược liệu, chuối là thứ trái
nhiệt đới quan trọng trên thị trường thế giới. Tuy nhiên, việc sản xuất chuối bị đe
dọa nghiêm trọng bởi các vấn đề về bệnh nhiễm như bệnh đốm lá do nấm
Mycosphaerella fijiensis, bệnh héo (héo Panama hay héo rũ) do Fusarium
oxysporum, các bệnh do virus (banana bunchy top virus, banana streak virus) và
bệnh do giun tròn [53], [105], [150]. Do đó, việc nghiên cứu vi nhân giống nhằm
sản xuất cây giống ở qui mô công nghiệp với chất lượng cao (cây đồng nhất, sạch
bệnh, năng suất cao và ổn định…) rất được quan tâm.
Sự phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phôi soma (phát sinh phôi thể
hệ, somatic embryogenesis) là hai quá trình phát sinh hình thái thực vật (plant
morphogenesis) có ý nghĩa quan trọng trong sinh học thực vật. Các quá trình này chịu
sự tác động của nhiều yếu tố khác nhau, trong đó vai trò của các chất điều hòa tăng
trưởng thực vật là đặc biệt quan trọng. Vì vậy, ngày nay sự sinh cơ quan và đặc biệt là
sự sinh phôi soma được các nhà sinh học thực vật hết sức quan tâm và nghiên cứu dưới
các khía cạnh phát sinh hình thái và sinh lý học cũng như ở mức độ tế bào và phân tử,
nhằm ứng dụng có hiệu quả trong sự vi nhân giống thực vật ở quy mô lớn.
2

Đề tài “Phân tích các biến đổi hình thái học và sinh lý học trong các quá trình

phát sinh cơ quan và phôi soma ở một số giống chuối (Musa sp.)” được thực hiện
nhằm tìm hiểu cơ sở sinh lý học và phát sinh hình thái cho việc vi nhân giống một
số giống chuối trồng hay hoang dại ở các tỉnh phía nam Việt Nam, tập trung vào các
vấn đề sau:
- Tạo các hệ thống tế bào để dùng trong vi nhân giống thực vật;
- Phân tích các quá trình phát sinh hình thái in vitro (chồi, rễ và phôi soma), đặc
biệt dưới khía cạnh hình thái học và sinh lý học;
- Tìm hiểu vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong các quá trình
phát sinh cơ quan và phôi soma;
- Thu nhận cây in vitro của một số giống chuối trồng và hoang dại.
Về mặt khoa học, luận án giải đáp một số vấn đề liên quan tới sự phát sinh
hình thái ở cây chuối: các biến đổi hình thái học và sinh lý học của quá trình phát
sinh cơ quan (chồi và rễ) và phôi soma ở chuối xảy ra như thế nào? ở vùng tế bào
nào? chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố nào? Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có
vai trò gì trong từng giai đoạn của các quá trình phát sinh hình thái này?
Về mặt thực tiễn, sự nuôi cấy khúc cắt chứa mô phân sinh ngọn chồi và thu
nhận phôi soma giúp sự vi nhân giống chuối đạt hiệu quả cao, đặc biệt nhờ áp dụng
phối hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật vào các bước phát sinh hình thái và sự
hủy mô phân sinh ngọn chồi bằng cách cắt cho phép thu nhận cây in vitro đồng nhất
với số lượng cao.
Phần lớn đề tài được thực hiện tại Bộ môn Sinh lý thực vật, các quan sát dưới
kính hiển vi huỳnh quang được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học
phân tử, các phân tích hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhờ HPLC
được thực hiện tại trung tâm phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Thành
phố Hồ Chí Minh; các quan sát dưới kính hiển vi confocal và kính hiển vi điện tử
truyền suốt được thực hiện tại Viện Sinh học thực vật và vi sinh Sinica, Đài Loan,
Trung Quốc.
3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về cây chuối
Cây chuối có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới đông nam Châu Á, thuộc lớp Đơn
tử diệp (một lá mầm), bộ Zingiberales, họ Musaceae, giống Musa L., giống phụ
Eumusa. Đa số các giống trồng hiện nay do sự kết hợp giữa hai loài hoang dại Musa
acuminata (AA) và Musa balbisiana (BB) hay giữa các thứ trong cùng một loài với
nhau. Hai loài khởi thủy này là nhị bội, thụ tinh được, có cùng số lượng nhiễm sắc
thể cơ bản (n=11) nhưng mang các đặc điểm hình thái khác nhau [24], [105], [113].
Cây có chiều cao hai đến sáu mét, có thể phân biệt hai phần chính: phần dinh
dưỡng và phần mang phát hoa. Phần dinh dưỡng gồm một thân ngầm (thường được
gọi là củ) nằm dưới mặt đất, là thân thật, mang hệ thống rễ bất định và một thân giả
khí sinh với các bẹ lá lồng vào nhau. Ở mỗi nách lá đều có chồi mầm. Trong thời kỳ
dinh dưỡng, nhiều chồi dinh dưỡng cùng phát triển trên thân ngầm. Tuy nhiên, chỉ
các chồi từ phần giữa đến ngọn thân ngầm có thể phát triển thành thân hay chồi nảy
đảm bảo cho sự nhân giống dinh dưỡng [1], [105].
Khi cây trưởng thành, đỉnh sinh trưởng của thân thật vươn dài ra khỏi thân giả
cùng với một phát hoa. Lúc này gọi là trổ buồng. Mô phân sinh hoa phân hóa theo
chiều dài trục phát hoa theo thứ tự hoa cái, hoa lưỡng tính và cuối cùng là hoa đực.
Phát hoa đã thành thục thường mang ở đầu tận cùng các “chồi đực” hay còn gọi là
“bắp chuối” gồm mô phân sinh phát hoa được bao bọc trong các lá bắc không mở
ra, che giấu các hoa đực bên trong (hình 1.1) [1], [150].
Hoa cái có noãn sào và vòi nhụy lớn, cánh hoa thường có màu trắng chia
thành năm khía ở đỉnh, năm nhị đực không có túi phấn. Đầu nuốm nhụy cái có mật
để thu hút ong, bướm… Hoa lưỡng tính có noãn sào nhỏ nhưng không thụ tinh
được. Ở hoa đực, noãn sào bị thoái hóa, vòi nhụy nhỏ và nhị đực có bao phấn,
nhưng ở các giống trồng thì ít khi bao phấn chứa phấn hoa. Một ngày sau khi nở,
hoa đực rụng. Hoa cái do không có tầng tế bào vùng rụng ở đáy noãn sào nên không
rụng. Cách thức “bắp chuối” mọc chỉ thẳng lên trời, mọc ngang hay mọc thòng
xuống đất được dùng để phân loại các giống chuối trồng [1].
4

Hình 1.1. Sơ đồ một cây chuối trưởng thành [113], [150].


5

Sự phân loại có thể được thực hiện nhờ dựa vào các đặc tính như: màu sắc
thân cây, hình dạng cuống lá, sự phân bố của noãn, chồi đực hay hình dạng trái
[24], [150].
1.2. Các nghiên cứu nhằm cải tiến giống chuối trên thế giới và ở Việt Nam
Các phương pháp cổ điển để cải thiện giống chuối bằng cách sử dụng các kỹ
thuật lai giống thường khó thực hiện vì chuối có tỉ lệ vô sinh cao và vì tính đa bội
của chúng [80].
Trên thế giới, việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ở chuối bắt đầu vào
năm 1919 bởi sự nhân giống sinh dưỡng tái sinh chồi, và đến năm 1960 bởi sự nuôi
cấy phôi hợp tử của loài lưỡng bội. Năm 1987, Cronauer và Krikorian mô tả sự hình
thành các khối mô sẹo và sự tái sinh chồi qua quá trình phát sinh cơ quan. Hiện nay,
sự thu nhận phôi soma ở chuối được tiến hành từ các mô cấy có nguồn gốc khác
nhau như: chồi, phôi hợp tử non, cuống lá non, hoa đực non, mô phân sinh ngọn
qua con đường tạo mô sẹo, dịch treo tế bào (huyền phù tế bào, suspension cell) hay
tế bào trần [26], [28], [35], [40], [43], [59], [92], [95], [111].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chuối đã được thực hiện liên quan tới sự nuôi
cấy chồi đỉnh [10]; tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo [5]; tạo mô sẹo và dịch treo
tế bào từ phôi hợp tử non hay hoa đực non [2], [3], [4], [8], [20], [31]; phân tích tính
đa dạng di truyền giữa các giống chuối nhóm AAA-Cavendish Việt Nam [6], [11].
1.2.1. Sự nuôi cấy chồi và mô phân sinh ngọn chồi
Các khúc cắt chồi ngọn (dài vài mm, mang chồi với nhiều phát thể lá và chồi
nách) hay khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi (dài 0,5 - 1,0 mm, mang mô phân sinh

ngọn chồi và một hay hai phát thể lá) được nuôi cấy trên môi trường MS với IAA
(0,175 mg/l) và BA (2,25 mg/l) [67], [125]. Sự phát triển chồi chịu ảnh hưởng bởi
kích thước mẫu cấy và nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy [121], [133].
Tùy mục đích nghiên cứu, vật liệu ban đầu có thể lớn hay nhỏ. Sự dùng các
mảnh cấy lớn mang nhiều chồi nách cho khả năng thu nhận số chồi cao hơn (so với
6

các mảnh cấy nhỏ), nhưng các mẫu cấy chuối thường bị hóa nâu do sự oxy hóa các
hợp chất phenol tại vị trí vết thương [123]. Sự tiết các các sản phẩm oxy hóa ức chế
hoạt động của nhiều enzyme, làm đen mô và ngăn cản sự hấp thu các chất dinh
dưỡng từ môi trường dẫn đến sự cản tăng trưởng của mẫu cấy [45]. Để khắc phục
tình trạng này, sự cấy chuyền mỗi hai tuần trong 4 - 6 tuần đầu kết hợp với sự đặt
mô cấy trong tối, bổ sung các chất chống oxy hóa (acid ascorbic hay acid citric) vào
môi trường, hay dùng khúc cắt có kích thước nhỏ. Đặc biệt, mảnh cấy nhỏ (khúc cắt
mô phân sinh ngọn chồi) là vật liệu lý tưởng để thu nhận cây sạch bệnh [51], [67].
Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy chồi, BA 2,25 mg/l thường được
bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Trong giai đoạn tăng sinh chồi, mẫu cấy tiếp tục
được cấy chuyền trên môi trường có BA ở nồng độ 2,25 mg/l hay cao hơn (có thể
đến 22,5 mg/l, tùy giống chuối) nhằm thu nhận cụm chồi tăng sinh cao (dùng trong
sự tạo dịch treo tế bào). Các nồng độ BA cao hơn thường ức chế sự tăng sinh chồi
và sự phát sinh hình thái nên ít được sử dụng [123]. Ở một vài giống chuối, TDZ
cho tỉ lệ tăng sinh chồi cao hơn so với BA [112].
Các chồi hay cụm chồi sau đó được cấy chuyền sang môi trường giảm
cytokinin và tăng auxin nhằm thu nhận cây in vitro hoàn chỉnh. Để tạo rễ ở chuối,
các auxin như IAA, NAA và IBA thường được sử dụng ở nồng độ 0,1- 2,0 mg/l.
Trong vài trường hợp, sự bổ sung than hoạt tính (0,1 - 0,25 mg/l) được thực hiện
[123]. Sau sự tạo rễ, các cây in vitro được chuyển ra trồng trong bầu đất, trước khi
được trồng trong các vườn thực nghiệm hay vườn sản xuất.
1.2.2. Sự thu nhận phôi soma
 Kỹ thuật nuôi cấy phôi hợp tử

Các phôi hợp tử chưa trưởng thành được đặt nuôi trên môi trường đặc có
picloram 2 mg/l. Sau một đến hai tháng, các mô sẹo có khả năng sinh phôi được thu
nhận cho sự tái sinh cây qua con đường sinh phôi soma [43]. Kỹ thuật này chỉ áp
dụng được ở các cây chuối có khả năng tạo hột (loài nhị bội, thụ tinh được).