Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể PGS TS trần thị thanh hương

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM
HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM
MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
PGS. TS. Trần Thị Thanh Hương
ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ
•
DTBS: 2,7% tổng số đẻ
•
Ng/nhân: ĐB gen, ĐB NST
TVDT &
TVDT &
CĐTS
CĐTS
•
Thu thập mẫu:
TB ối
TB ối, tua rau, máu cuống rốn,
sinh thiết thai, TB thai tự do trong máu mẹ
•
KT phát hiện:
–
DT tế bào: phân tích NST  tiêu chuẩn C§RLNST
–
DT phân tử
–
DT tế bào – phân tử
CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN
THU THẬP MẪU:

-

Chọc ối
Chọc ối
-
Sinh thiết rau
-
Máu cuống rốn
-
Soi phôi thai
-
ADN tự do máu mẹ
DTTB
- phân tích NST băng G
DTPT: PCR, Sequencing,
Southerblot, Northerblot
DTTB – PT: FISH
Tiêu chuẩn phát
hiện ĐB NST
phát hiện
BĐ gen
Phát hiện ĐB
NST: SL, RL nhỏ
Các loại ADN dò
ADN dß ph?n
tâm
ADN dß đ?u
mút
ADN dß t?
ch?c h?ch

nhân
ADN dß l?p đ?c
hi?u trên băng R
ADN dß
toànb? NST
ADN dß đ?c hi?u
nhánh NST
ADN dß đ?c hi?u locus
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KT FISH

THẾ GIỚI
•
1969 bắt đầu,
1980 đầu dò huỳnh quang
Thập kỷ 90 ứng dụng rộng rãi
•
Phát hiện trước sinh các RL
NST:HC Down, Edward,
Patau, Turner
•
Mất đoạn nhỏ <3Mb
•
RL đầu mút & gần đầu mút

VIỆT NAM
•
2003 B.V.M.Hoàng-T/p
HCM: áp dụng CĐTS
•
2004 BM YSH – DT

ĐHYHN: hoàn chỉnh,
CĐTS HC Down
•
2007 viện HH-TM: CĐ
leceumia
DTTB khó hoặc
không thể phát hiện
1
Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên
nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y
2
Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trước
sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y
3
Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối
loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST X
Mục tiêu 1
Đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y:
+ 3 mẫu ối: 15-18
w
+ 3 mẫu ối: 28-32
w
Mục tiêu 2 Mục tiêu 3
Đầu dò ADN
TelXp/Yp &
TelXq/Yq:
3 mẫu ối: 15-18
w

73
73
thai
thai
phụ
phụ


Dị dạng chi,
Dị dạng chi,
nội quan
nội quan

Siêu âm (+):
Siêu âm (+):
Nang BH
Nang BH
D
D
ày da gáy
ày da gáy



Triple test (+) hoặc (-)
Triple test (+) hoặc (-)
Cần KQ FISH 
đối chiếu:
+ 2 bệnh nhân:
RLCT NST 21, X

+ 1 mẫu ối RLCT
NST 13
Cần KQ FISH 
chẩn đoán:
+ 2 bệnh nhân:
NST marker
+ 1 trẻ nam 46,XX
Lấy mẫu – làm tiêu bản
Lấy mẫu – làm tiêu bản
nhân TB gian kỳ
nhân TB gian kỳ
Lấy mẫu - Nuôi cấy – Làm
Lấy mẫu - Nuôi cấy – Làm
tiêu bản NST kỳ giữa
tiêu bản NST kỳ giữa
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
Biến tính ADN
Biến tính ADN
Lai ADN dò và ADN đích
Lai ADN dò và ADN đích
Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang
Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang
Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang
Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang
(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)
(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)
1. Làm tiêu bản TB ối ở gian kỳ
hoặc nuụi cấy làm tiêu bản NST
kỳ giữa

2. Biến tính ADN dò và ADN đích
của mẫu XN
3. Lai ADN dò với ADN đích
của thai (20-24h)
5. Phân tích dưới KHV huỳnh
quang tìm tín hiệu lai





Kết quả
Kết quả
sau 2-3 ngày
sau 2-3 ngày
4. Nhuộm mẫu lai bằng thuốc
nhuộm huỳnh quang
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)
Đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y
CÁC
CÁC
Đ
Đ
ẦU DÒ ADN VÀ PHIN LỌC T
ẦU DÒ ADN VÀ PHIN LỌC T
ƯƠ
ƯƠ
NG ỨNG

NG ỨNG
Phin lọc Aqua
Phin lọc orange
Phin lọc orange
Phin lọc green
Phin lọc green
Đầu dò ADN
Tel Xp/Yp
(TTAGGG)n
Telomere
ADN
Đầu dò ADN TelXp
Phin lọc green
1
Không đánh giá vì hai
tế bào chồng lên nhau
2
Đếm là 2 tín hiệu lai,
1 tín hiệu bị khuếch tán
3
Không đánh giá vì
các
tế bào chồng lên
nhau
4
Đếm là 2 tín hiệu
lai,
1 tín hiệu bị chia
nhỏ
5

Đếm là 3 tín hiệu
lai
6
Đếm là 4 tín hiệu
lai
7
Đếm là 3 tín hiệu
lai,
1 tín hiệu bị chia
nhỏ
BẢNG
BẢNG
Đ
Đ
ÁNH GIÁ TÍN HIỆU LAI (VYSIS)
ÁNH GIÁ TÍN HIỆU LAI (VYSIS)
Tư vấn DT – Theo dõi
QT mang thai, sau sinh
XN: DTTB – phân tích NST
KT FISH
TV di truyền – Sản khoa
Chọc ối – CĐ trước sinh
SƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTS
SƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTS
LÀM HỒ SƠ
XĐ thai phụ nguy cơ cao
sinh con bất thường NST
Thai phụ ≥ 35 tuổi
TS sinh con DT
XN triple test

AFP, HCG, uE
3
Siêu âm
1. HOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISH
2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN
ĐOÁN TRƯỚC SINH MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NST
3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN
ĐOÁN MỘT SỐ RỐI LOẠN NST
Bảng 1. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với
đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên nhân gian kỳ
M uẫ
TuÇn thai
KẾT QUẢ FISH (sè tÝn hiÖu lai)
KÕt qu¶
DTTB
NST 13 NST 18 NST 21 NST X NST Y
1
15 2 2 2 2 0 46, XX
2
18 2 2 2 1 1 46,XY
3
18 2 2 2 1 1 46,XY
4
28 2 3 2 2 0 47, XX +18
5
30 2 2 3 1 1 47,XY,+21
6
32 2 2 2 1 1 46, XY
1. HOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISH
HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG

•
Thể tích dịch ối:
–
Thai 15-18
w
: 5ml
–
Thai 28-32
w
: 10ml
•
Xử lý nhân TB
–
Loại trừ máu mẹ (nếu lẫn)
–
Trypsin 0,25% trong 15 – 25’ tuỳ thuộc tuần thai
•
Biến tính ADN: 73
0
C x 3’
•
Lai ADN dò và ADN đích:
–
thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm
–
Thời gian lai 20-22
h
•
Phân tích tín hiệu lai
–

Tín hiệu lai thật: phát sóng ở bước sóng đặc hiệu & kích thước ổn
định
–
Tín hiệu lai giả: phát sáng dưới nhiều phin lọc, kích thước không ổn
định
Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nam bình thường
Đầu dò ADN 13, 21
NST 21
NST 21
NST 13
NST 13
Đầu dò ADN 18, X, Y
NST 18
NST 18
NST X
NST Y
TRƯỚC SINH
Đầu dò ADN 13, 21
NST 21
NST 21
NST 13
NST 13
Đầu dò ADN 18, X, Y
NST X
NST X
NST 18
NST 18
Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nữ bình thường

Bảng 2. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH
với các đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và
Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữa
Ký
hiÖu
mÉu
TuÇn
thai
KÕt quả FISH (sè tÝn hiÖu lai)
KÕt quả
di truyÒn
tÕ bµo
ĐÇu dß 13, 18, 21, X, Y
ĐÇu dß
Tel Xp/Yp
ĐÇu dß
Tel Xq/Yq
NST
13
NST
18
NST
21
NST
X
NST
Y
Xp Yp Xq Yq
1
15 2 2 2 2 0 2 0 2 0 46, XX

2
15 2 2 2 1 1 1 1 1 1 46, XY
3
18 2 2 2 1 1 1 1 1 1 46, XY
HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG
•
Thu hoạch TB kỳ giữa: colcemid, KCl/huyÕt thanh,
carnoy
•
Phun tiêu bản: lam lạnh kèm kéo dài khử nước bằng cồn
70%/2’, 80%/2’, 100%/2’.
•
Biến tính ADN: 73
0
C x 5’
•
Lai ADN dò và ADN đích:
–
thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm
–
Thời gian lai 42
0
C: 20-22
h
(13, 18, 21, X, Y)
22-24h (TelXp/Yp; TelXq/Yq)
•
Phân tích tín hiệu lai: tín hiệu lai nằm trên NST  đánh
giá dễ hơn nhân gian kỳ
Đầu dò Telq/Yq trên NST

kỳ giữa của thai nam
bình thường
TelYq
TelXq
Đầu dò TelXp/Yp trên
NST kỳ giữa của thai
nam bình thường
TelXp
TelYp
2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NST
Kết quả chẩn đoán trước sinh một số bất thường NST
Kt qu chn oỏn trc sinh hi chng Turner
i chiu kt qu siờu õm FISH DTTB trong hi chng Turner
Số l
ợng

mẫu
Kết qu siêu âm
FISH
(số tín hiệu lai trên NST)
Di truyền
tế bào
13 18 21 X Y
4
NBH đơn thuần
2 2 2 1 0 45, X
19
NBH, phù toàn thân, dấu
hiệu bất th ờng khác

2 2 2 1 0 45, X
1
Không có NBH, chân tay
ngắn, TDMP
2 2 2 1 0 45, X
1
NBH, phù toàn TDMP,
TDMB
2 2 2
1 (92%)
2 (8%)
0
45, X (92%)/
46,XX (8%)
Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ
và karyotyp của thai hội chứng Turner
NST X
NST 18



NST 18


Sơ đồ đối chiếu kết quả siêu âm
nang bạch huyết với các bất thường NST