ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trước sinh

Bộ Y Tế
TRờng đại học y hà nội




Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ


ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
để phát hiện sớm một số bất thờng nhiễm sắc thể
Trong chẩn đoán trớc sinh

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Trần Thị Thanh Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội
Cơ quan chủ quản: Bộ Y Tế






6990
26/9/2008
Hà Nội - 2008

Bộ Y Tế
TRờng đại học y hà nội

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ



ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
để phát hiện sớm một số bất thờng nhiễm sắc thể
Trong chẩn đoán trớc sinh


Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Trần Thị Thanh Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội
Cơ quan chủ quản: Bộ Y Tế


Thời gian thực hiện từ tháng 9/2005 đến tháng 9/2008
(Quyết định phê duyệt số 3304/QD-BYT ngày 9 tháng 9 năm 2005)
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 350 triệu đồng
Trong đó kinh phí SNKH: 350 triệu đồng


Hà Nội 2008
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ
1. Tên đề tài
ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm
một số bất thờng nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trớc sinh.
2. Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Trần Thị Thanh Hơng
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội
4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế
5. Th ký đề tài: ThS. Hoàng Thu Lan

6. Danh sách những ngời thực hiện chính:
TT Học hàm, học vị, họ và tên Cơ quan công tác
1. PGS.TS.Trần Thị Thanh Hơng Đại học Y Hà Nội
2. ThS. Hoàng Thu Lan Đại học Y Hà Nội
3. TS.Hoàng Thị Ngọc Lan Đại học Y Hà Nội
4. TS. Trần Danh Cờng Bệnh viện Phụ sản Trung ơng
5. ThS. Nguyễn Quỳnh Thơ Đại học Y Hải Phòng
6. TS. Nguyễn Việt Hùng Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội
7. ThS. Bùi Võ Minh Hoàng Đại học Y Dợc T/p Hồ Chí Minh
8. BSCKII. Trần Thị Lan Anh Bệnh viện Phụ sản Trung ơng
9. CN. Nguyễn Ngân Hà Đại học Y Hà Nội
10. KTV Nguyễn Thị Duyên Đại học Y Hà Nội
7. Thời gian thực hiện đề tài tháng 9/2005 đến tháng 9/2008.
Danh sách tác giả
của đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ

1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện
sớm một số bất thờng nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trớc sinh.
2. Thời gian thực hiện: Từ tháng 9/2005 đến tháng 9/2008
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội
4. Bộ chủ quản: Bộ Y Tế
5. Danh sách tác giả:
TT Học hàm, học vị, họ và tên Cơ quan công tác Chữ ký
1. PGS.TS.Trần Thị Thanh Hơng Đại học Y Hà Nội
2. ThS. Hoàng Thu Lan Đại học Y Hà Nội
3. TS.Hoàng Thị Ngọc Lan Đại học Y Hà Nội
4. TS. Trần Danh Cờng Bệnh viện Phụ sản Trung ơng
5. ThS. Nguyễn Quỳnh Thơ Đại học Y Hải Phòng
6. TS. Nguyễn Việt Hùng Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội
7. ThS. Bùi Võ Minh Hoàng Đại học Y Dợc T/p Hồ Chí Minh

8. BSCKII. Trần Thị Lan Anh Bệnh viện Phụ sản Trung ơng
9. CN. Nguyễn Ngân Hà Đại học Y Hà Nội
10. KTV Nguyễn Thị Duyên Đại học Y Hà Nội

Thủ trởng cơ quan chủ trì đề tài
Bản tự đánh giá
tình hình thực hiện và những đóng góp mới
của đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ
1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát
hiện sớm một số bất thờng nhiếm sắc thể trong chẩn đoán trớc
sinh.
2. Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Trần Thị Thanh Hơng
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội
Thời gian thực hiện từ tháng 9/2005 đến tháng 9/2008
(Quyết định phê duyệt số 3304/QD-BYT ngày 9 tháng 9 năm 2005)
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 350 triệu đồng
Trong đó kinh phí SNKH: 350 triệu đồng
7. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cơng
7.1. Mức độ hoàn thành khối lợng công việc
Đã thực hiện đầy đủ nội dung công việc về số lợng, chủng loại
của đề cơng đặt ra. Hoàn thành 3 mục tiêu của đề cơng, cụ thể:
Stt Nội dung công việc
Theo đề cơng
Đã thực hiện Ghi chú
Hoàn chỉnh kỹ thuật
FISH với đầu dò ADN
13, 18, 21, X, Y
- Trên nhân tế bào
gian kỳ

3 mẫu
(15 - 18 tuần)





3 mẫu
(15 - 18 tuần)
3 mẫu
(28-32 tuần)



Do yêu cầu thực tiễn
áp dụng kỹ thuật
FISH ở những tuần
thai muộn (28-32
tuần)
1
- Trên NST ở kỳ giữa 3 mẫu 3 mẫu


Hoàn chỉnh kỹ thuật
FISH với đầu dò ADN

Tel Xp/Yp; Xq/Yq
3 mẫu
Hoàn chỉnh thêm loại
đầu dò này để ứng
dụng
2
ứng dụng kỹ thuật
FISH để phát hiện
trớc sinh một số bất
thờng NST 13, 18,
21, X, Y
65 mẫu tế
bào ối của
các thai phụ
có nguy cơ
cao sinh con
bất thờng
NST 13, 18,
21, X, Y
73 mẫu tế
bào ối của
các thai phụ
có nguy cơ
cao sinh con
bất thờng
NST 13, 18,
21, X, Y
73 thai phụ chẩn đoán
trớc sinh: phát hiện
24 thai Turner; 9 thai

Down; 7 thai Edward;
1 thai Patau. Theo dõi
sau sinh các trờng
hợp kết quả bình
thờng có chỉ định
giữ thai, không có
trờng hợp nào sinh
con bất thờng.
Kết quả kỹ thuật
FISH phù hợp với kết
quả di truyền tế bào
phân tích NST nhuộm
băng G: 73/73 mẫu
(100%).
3
ứng dụng kỹ thuật
FISH để phát hiện
một số rối loạn cấu
trúc NST 21, X
5 mẫu 6 mẫu
Ngoài NST 21, X còn
phát hiện các rối loạn
cấu trúc NST khác
(theo yêu cầu của lâm
sàng)

7.2. Các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm nghiên
cứu khoa học
Đã thực hiện các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản:
- Hoàn chỉnh, áp dụng kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y

trên nhân tế bào gian kỳ phát hiện đúng và sớm trớc sinh một số hội
chứng thờng gặp: Turner, Down, Edward, Patau (liên quan các NST X,
Y, 21, 18, 13).
- Hoàn chỉnh, áp dụng kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và
ADN Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữa để xác định một số rối
loạn NST mà kỹ thuật di truyền tế bào khó hoặc không phát hiện đợc.
Cụ thể các nội dung sau:
7.2.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH
7.2.1.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên
nhân tế bào gian kỳ ở các nội dung sau:
- Thể tích dịch ối cần thiết để làm kỹ thuật FISH tơng ứng với tuần thai
(từ 15 - 18 tuần cần 5 ml dịch ối; 28-32 tuần cần 10 ml dịch ối).
- Xác định thời gian biến tính ADN dò và thời gian lai, nhiệt độ lai phù
hợp của loại đầu dò này (biến tính: 73
0
C/3phút; lai: 42
0
C/20giờ ).
- Giảm diện tích vùng lai xuống 10x10mm để giảm giá thành.
7.2.1.2. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với dầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và
đầu dò ADN Tel Xp/Yp; Xq/Yq ở kỳ giữa:
- Xử lý lam lạnh kết hợp với khử nớc kéo dài bằng alcol 70%/ 2
phút, 80%2 phút, 100%/2 phút để NST phân tán tốt và tín hiệu lai rõ.
- Xác định thời gian biến tính và thời gian lai của đầu dò ADN Tel
Xp/Yp và Tel Xq/Yq: biến tính ở 73
0
C/5 phút, lai ở 42
0
C/24giờ.
7.2.2. áp dụng kỹ thuật FISH chẩn đoán trớc sinh một số bất thờng

NST
ứng dụng kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y ở 73
thai phụ có nguy cơ cao sinh con bất thờng NST, đã phát hiện trớc sinh
24 trờng hợp Turner; 9 trờng hợp Down; 7 trờng hợp Edward; 1
trờng hợp Patau. Theo dõi sau sinh, các trờng hợp kết quả bình thờng
có chỉ định giữ thai, không có trờng hợp nào sinh con bất thờng. Kết
quả FISH phù hợp với di truyền tế bào phân tích NST nhộm băng G:
73/73 (100%).
7.2.3. Đã ứng dụng kỹ thuật FISH để xác định một số rối loạn NST mà kỹ
thuật di truyền tế bào khó hoặc không phát hiện đợc
- Khẳng định kết quả của di truyền tế bào trong những trờng hợp sau:
+ Mất nhánh ngắn, nhân đôi nhánh dài NST X tạo NST bất thờng
gây hội chứng Turner: 46, X, i(Xq).
+ Chuyển đoạn hoà hợp tâm giữa 2 nhánh dài NST 13 gây hội
chứng Patau: 46,XX,t(13q;13q).
+ Chuyển đoạn hoà hợp tâm giữa hai nhánh dài NST 14 và NST 21
ở thai phụ có tiền sử sinh con Down: 45,XX,t(14q;21q).
- Xác định các rối loạn di truyền mà di truyền tế bào khó hoặc không có
khả năng phát hiện.
+ Mất đoạn nhánh dài và vùng đầu mút nhánh ngắn NST X tạo
NST bất thờng gây hội chứng Turner: 46, X, del (Xq), del (Tel Xp).
+ Nhân đoạn đảo ngợc, mất đầu mút nhánh dài tạo NST 21 hai
tâm, dạng soi gơng gây hội chứng Down:
46,XX,idic(21)(pterq22.3::q22.3 pter).
+ Kết quả di truyền tế bào 46,XX, không phát hiện đợc gen biệt
hoá tinh hoàn. Kết quả FISH xác định có gen biệt hoá tinh hoàn TDF
bằng tín hiệu lai trên NST Y (kết quả FISH phù hợp với kỹ thuật PCR).
7.3. Tiến độ thực hiện: Bảo đảm đúng tiến độ.
8. Những đóng góp mới của đề tài
8.1. Giải pháp khoa học công nghệ

- Khẳng định giá trị của kỹ thuật FISH đã phát hiện đúng và sớm một số
rối loạn NST trong chẩn đoán trớc sinh (kết quả FISH phù hợp với kết
quả di truyền tế bào 100%). Theo dõi sau sinh, những trờng hợp có kết
quả bình thờng, có chỉ định giữ thai, không có trờng hợp nào sinh con
bất thờng.
- Đã hợp tác với bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ Sản Hà
Nội, khoa Sản bệnh viện Bạch Mai, ứng dụng kỹ thuật di truyền tế bào và
kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trớc sinh , t vấn di truyền nhằm giảm tỷ
lệ sinh con dị tật.
- áp dụng kỹ thuật FISH phát hiện một số rối loạn vật chất di truyền mà
kỹ thuật di truyền tế bào phân tích NST khó hoặc không phát hiện đợc.
8.2. Những đóng góp khác
- Đã tham gia báo cáo:
+ Hội nghị Quốc tế T vấn di truyền - sàng lọc và chẩn đoán trớc
sinh 8/2007: 3 báo cáo.
+ Hội nghị Nghiên cứu sinh lần XIII, 11-2007: 1 báo cáo.
- Đã đăng 5 bài báo ở tạp chí Nghiên cứu Y học và và Báo cáo toàn văn
Hội nghị Quốc tế T vấn di truyền - sàng lọc và chẩn đoán trớc sinh.
- Đã đào tạo 1 nghiên cứu sinh với đề tài Sàng lọc và chẩn đoán trớc
sinh hội chứng Turner, 1 luận văn tốt nghiệp đại học Góp phần hoàn
chỉnh kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang và bớc đầu ứng dụng để phát hiện
một số bất thờng nhiễm sắc thể (đã bảo vệ loại xuất sắc).
tham gia báo cáo hội nghị khoa học
- Hội nghị Quốc tế T vấn di truyền sàng lọc và chẩn đoán trớc
sinh, 08-2007: 3 báo cáo.
- Hội nghị Nghiên cứu sinh lần XIII, 11-2007: 1 báo cáo.
Các bài báo đ đăng trên tạp chí chuyên ngành
1. Trần Thị Thanh Hơng, Hoàng Thu Lan, Hoàng Thị Ngọc Lan,
Nguyễn Thị Quỳnh Thơ (2007), Chẩn đoán trớc sinh hội chứng
Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp

phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Vol.47
N
0
1, tr. 4-8.
2. Hoàng Thu Lan, Trần Thị Thanh Hơng, Hoàng Thị Ngọc Lan,
Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, Trần Danh Cờng, Bùi Võ Minh Hoàng
(2007), ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang trong chẩn đoán
trớc sinh một số bệnh tật di truyền, Báo cáo toàn văn Hội nghị Quốc
tế T vấn di truyền sàng lọc và chẩn đoán trớc sinh, tr. 129-134.
3. Hoàng Thị Ngọc Lan, Đoàn Kim Phợng, Trần Thị Thanh
Hơng, Hoàng Thu Lan, Nguyễn Quỳnh Thơ, Trần Danh Cờng,
Nguyễn Việt Hùng (2007), Chẩn đoán trớc sinh bằng phân tích nhiễm
sắc thể từ tế bào ối, Báo cáo toàn văn Hội nghị Quốc tế T vấn di
truyền sàng lọc và chẩn đoán trớc sinh, tr.135-146.
4. Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, Trần Thị Thanh Hơng, Hoàng Thị
Ngọc Lan, Hoàng Thu Lan, Trần Danh Cờng (2007), Kết quả phân
tích nhiễm sắc thể và lai tại chỗ huỳnh quang của một số trờng hợp thai
có nang bạch huyết, Báo cáo toàn văn Hội nghị Quốc tế T vấn di
truyền sàng lọc và chẩn đoán trớc sinh, tr.178-186.
5. Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, Hoàng Thu Lan, Hoàng Thị Ngọc Lan,
Trần Thị Thanh Hơng, Phan Thị Hoan, Trần Danh Cờng (2008),
Nghiên cứu chẩn đoán trớc sinh hội chứng Turner, Tạp chí Nghiên
cứu Y học, Vol.53 N
0
1, tr. 38-43.

B¸O C¸O TOµN V¡N
KÕT QU¶ NGHI£N CøU
§Ò TµI CÊP Bé
ch÷ viÕt t¾t

ADN acid dezoxyribonucleic
Arn acid ribonucleoic
Nu Nucleotid
NST NhiÔm s¾c thÓ
PCR Polymerase Chain Reaction (ph¶n øng chuçi polymerase)
AFP Alpha feto protein
HCG Human chorionic gonadotropin
uE
3
Unconjugated estriol (estriol kh«ng liªn hîp)
FISH Fluorescence In Situ Hybridization (lai t¹i chç huúnh
quang)
DTTB Di truyÒn tÕ bµo
Kb Kilo basepairs (10
3
bp)
Mb Mega basepairs (10
6
bp)
Mục lục
Quyết định phê duyệt đề tài KHCN cấp bộ
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ
Danh sách tác giả của đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ
Bản tự đánh giá tình hình thực hiện và những đóng góp mới
Báo cáo HNKH và các bài báo đã đăng trên tạp chí chuyên ngành
Xác nhận chi tiêu tài chính
Báo cáo toàn văn kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ
Chữ viết tắt
Đặt vấn đề 1

Chơng 1: Tổng quan 3
1.1. Các kỹ thuật phát hiện rối loạn vật chất di truyền trớc sinh 3
1.1.1. Thu thập mẫu 3
1.1.2. Kỹ thuật di truyền tế bào 5
1.1.3. Kỹ thuật di truyền phân tử 10
1.1.4. Kỹ thuật di truyền tế bào - phân tử (FISH) 12
1.2. Tình hình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật FISH để phát hiện
rối loạn vật chất di truyền ở thế giới và Việt Nam 15
1.2.1. ứng dụng kỹ thuật FISH trên thế giới 15
1.2.2. Tình hình ứng dụng kỹ thuật FISH ở Việt Nam 17
Chơng 2: Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 18
2.1. Đối tợng nghiên cứu 18
2.2. Phơng pháp nghiên cứu 19
Chơng 3: Kết quả 25
3.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH 25
3.1.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y
trên nhân tế bào gian kỳ 25
3.1.2. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với 2 loại đầu dò ADN
(13,18,21,X,Y và Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq) trên NST ở kỳ giữa 30
3.2. ứng dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trớc sinh một số
bất thờng NST 34
3.2.1. Kết quả chẩn đoán trớc sinh một số bất thờng NST 34
3.2.2. Kết quả chẩn đoán trớc sinh hội chứng Turner 35
3.2.3. Kết quả chẩn đoán trớc sinh hội chứng Down 38
3.2.4. Kết quả chẩn đoán trớc sinh hội chứng Edward 42
3.2.5. Kết quả chẩn đoán trớc sinh những thai có karyotyp
bình thờng (46, XY; 46,XX) 46
3.3. ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối loạn cấu trúc
NST 47
Chơng 4: Bàn luận 53

4.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH 53
4.2. ứng dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trớc sinh một số
bất thờng NST 54
4.3. Giá trị của kỹ thuật FISH trong phát hiện các rối loạn
cấu trúc NST 59
4.3.1. Những trờng hợp di truyền tế bào khó xác định 60
4.3.2. Những trờng hợp di truyền tế bào không xác định đợc 61
Kết luận 63
Những đóng góp mới của đề tài
Đề xuất
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

1
Đặt vấn đề
Sinh con dị tật đã gây những hậu quả nặng nề về sức khoẻ, tâm lý,
ảnh hởng đến chất lợng sức khoẻ sinh sản. Tỷ lệ các gia đình yêu cầu
t vấn di truyền, phát hiện sớm thai dị tật ngày càng nhiều. Đây không
chỉ là yêu cầu của từng gia đình mà còn là yêu cầu chung của xã hội.
Có nhiều nguyên nhân gây bất thờng bẩm sinh, trong đó có
nguyên nhân di truyền, đó là hậu quả của đột biến gen, đột biến nhiễm
sắc thể (NST).
Có nhiều kỹ thuật đợc áp dụng để phát hiện các bất thờng ở mức
độ gen đến mức độ NST.
Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH) là một kỹ thuật di truyền
tế bào phân tử; dùng ADN dò lai với ADN đích cần tìm ở ngay trong tế
bào không cần qua tách chiết ADN ra khỏi tế bào. Vì vậy, có thể thực
hiện kỹ thuật FISH trên các nhân tế bào ở gian kỳ, không cần qua thời
gian nuôi cấy do vậy chỉ sau 24 - 48 giờ hoặc sớm hơn đã có kết quả. Hơn
nữa kỹ thuật FISH là một kỹ thuật di truyền tế bào phân tử có thể phát

hiện các rối loạn vật chất di truyền ở mức mà kỹ thuật di truyền tế bào, kỹ
thuật di truyền phân tử khó hoặc không phát hiện đợc. Kỹ thuật di
truyền tế bào thờng phát hiện các sai khác lớn hơn 5 - 10Mb, với các kỹ
thuật phân tử có thể phát hiện các đột biến từ một, vài cặp Nucleotit (Nu)
đến trăm ngàn cặp Nu. Kỹ thuật FISH thờng đợc ứng dụng để phát hiện
các sai khác lớn hơn 10 Kb. Với những u điểm trên kỹ thuật FISH ngày
càng đợc ứng dụng để phát hiện các rối loạn vật chất di truyền, đặc biệt
trong chẩn đoán trớc sinh.

2
Chẩn đoán trớc sinh phát hiện sớm thai dị tật là một trong những
biện pháp giảm tỷ lệ sinh con dị tật. Trên thế giới đã có nhiều công trình
ứng dụng kỹ thuật FISH để chẩn đoán, phát hiện các bất thờng NST với
nhiều loại đầu dò [18], [26].
ở Việt Nam mới bớc đầu ứng dụng kỹ thuật FISH, do vậy chúng
tôi tiến hành đề tài ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để
phát hiện sớm một số bất thờng nhiễm sắc thể trong chẩn đoán
trớc sinh với 3 mục tiêu sau:

Mục tiêu của đề tài

1. Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên nhân tế bào
gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y.
2. ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trớc sinh một số bất
thờng NST 13, 18, 21, X, Y.
3. ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối loạn cấu trúc NST
liên quan NST 21, NST X.

3
Chơng 1

Tổng quan
1.1. Các kỹ thuật phát hiện rối loạn vật chất di truyền trớc sinh
1.1.1. Thu thập mẫu:
Có 2 phơng pháp lấy tế bào từ nguồn gốc thai nhi, đó là phơng
pháp trực tiếp từ thai nhi và lấy tế bào thai nhi gián tiếp qua máu mẹ.
1.1.1.1. Phơng pháp lấy tế bào trực tiếp từ thai nhi
Phơng pháp lấy tế bào trực tiếp từ thai nhi gồm các phơng pháp
chọc hút dịch ối, sinh thiết tua rau, lấy máu thai nhi, sinh thiết mô thai
* Chọc dò cấy ối (Amniocentesis)
Ngời ta có thể tiến hành chọc dò ối qua thành bụng hoặc qua
đờng âm đạo; thờng kết hợp với siêu âm để xác định vị trí chọc dò.
Chọc dò ối đợc tiến hành vào tuần 15 - 18 vì những lý do:
Trớc tuần 15 dịch ối ít, thờng gây sẩy thai. Sau tuần 15 lợng
dịch ối khoảng 100-180ml, có thể lấy dịch ối. Số tế bào sống bong ra từ
bào thai đủ để làm các xét nghiệm và nuôi cấy tế bào thành công. Sau
tuần 15 tần số sẩy thai tự nhiên cũng bắt đầu giảm.
Các tế bào có trong dịch ối là tế bào có nguồn gốc thai nhi. Dịch ối
là mẫu vật đã đợc sử dụng từ lâu để chẩn đoán trớc sinh, với sự kết hợp
với phơng pháp siêu âm, kỹ thuật chọc dò ối ngày càng phát triển và
đợc sử dụng rộng rãi.
Tuy nhiên hạn chế của phơng pháp này là chọc dò lấy dịch ối
thờng tiến hành từ tuần 15 trở đi, khi thai đã lớn.

4
Tỷ lệ sẩy thai do chọc dò dịch ối 0,5 1%.
Phơng pháp chọc ối phổ biến là qua thành bụng, qua cổ tử cung (ít
dùng).
Lợng dịch ối đối với nuôi cấy tế bào là từ 10-20ml, đối với kỹ
thuật phân tử 2-5 ml. Kỹ thuật phân tử có thể chọc ối sớm từ tuần thứ 12.

* Sinh thiết tua rau thai (chorionic villus sampling):
Thời gian tốt nhất để chọc dò tua rau là tuần thứ 8-10. Các tua rau
thai này đợc sử dụng để phân tích NST theo phơng pháp trực tiếp hoặc
nuôi cấy. Ngoài ra ngời ta thờng dùng tua rau để làm các xét nghiệm
mức phân tử.
Ta có thể sinh thiết tua rau qua cổ tử cung hoặc qua thành bụng kết
hợp siêu âm. Mặc dù các tai biến sẩy thai 2-3% cao hơn chọc ối nhng
với u điểm cơ bản là có thể tiến hành sớm, kỹ thuật này vẫn đợc áp
dụng ở nhiều nớc trên thế giới.
Hình 1.1. Chọc dò dịch ối qua thành bụng dới sự hớng dẫn của siêu âm

5
*Phơng pháp lấy máu cuống rốn: Lấy máu cuống rốn của thai nhi cũng
đã đợc dùng để chẩn đoán bệnh tật di truyền trớc sinh đặc biệt các
bệnh về máu.
* Phơng pháp soi phôi, thai
Ngời ta tiến hành soi thai, phôi, lấy tế bào máu, tế bào mô của
thai để xét nghiệm, phơng pháp này ít dùng hơn.
Việc tách phôi bào từ khối các phôi bào trong kỹ thuật thụ tinh
trong ống nghiệm đã đợc áp dụng để phát hiện các rối loạn vật chất di

truyền của các phôi bào trớc khi chuyển phôi đã nâng cao chất lợng
sinh sản.
1.1.1.2. Phơng pháp lấy tế bào gián tiếp từ thai nhi
Một số tế bào có nguồn gốc thai nhi có thể đi vào máu mẹ; dựa vào
các kỹ thuật phân tử ngời ta có thể tách ADN thai từ huyết thanh mẹ để
chẩn đoán trớc sinh. Tỷ lệ các tế bào thai nhi vào máu mẹ rất ít, hơn nữa
phải tách đợc ADN có nguồn gốc từ thai lần này thì mới có kết quả
chính xác. Hiện nay hiệu quả của phơng pháp này còn rất hạn chế [12].
Trong chẩn đoán trớc sinh sau khi thu thập mẫu, có đợc tế bào
của thai nhi ta tiến hành thực hiện các kỹ thuật di truyền để phát hiện các
đột biến.
1.1.2. Kỹ thuật di truyền tế bào
Bộ NST của ngời 2n = 46 NST, gồm 23 cặp. Trong đó có 22 cặp
NST thờng (1 - 22), 1 cặp NST giới tính. Ngời nữ bình thờng có 22
cặp NST thờng, cặp NST giới là XX; ngời nam bình thờng có 22 cặp
NST thờng, cặp NST giới tính XY.

6

Hội nghị di truyền ngời (1960; 1971; 1995; 2005) đã đa ra các
quy định quốc tế; danh pháp quốc tế để mô tả NST trong trờng hợp bình
thờng và đột biến, đây là tiêu chuẩn để chẩn đoán xác định các rối loạn
NST [7].
NST đợc quan sát rõ nhất ở kỳ giữa, do vậy ngời ta có thể phân
tích NST từ các tế bào đang phân chia mạnh nh tế bào tua rau, hoặc qua
Hình 1.2. Karyotyp của ngời nam bình thờng
Hình 1.3. Karyotyp của ngời nữ bình thờng

7
nuôi cấy (nuôi cấy tế bào dịch ối, nuôi cấy tế bào tua rau, nuôi cấy bạch
cầu lympho từ máu thai nhi).
1.1.2.1. Nuôi cấy tế bào
- Nuôi cấy tế bào ối: môi trờng nuôi cấy thờng dùng Amniomax.
ở nhiệt độ 37
o
C với nồng độ CO
2

5%, thời gian nuôi cấy 15 20 ngày.
- Nuôi cấy tế bào tua rau: Dùng enzym (trypsin, collagenase) tách
tế bào, bổ sung môi trờng nuôi cấy thích hợp (Amniomax, MEM
(Minimum Essential Medium)), thời gian nuôi cấy 12-15 ngày.
- Nuôi cấy bạch cầu lympho từ máu dây rốn:
Môi trờng nuôi cấy: Parker, Hams F10, PB karyomax, cần bổ
sung thêm PHA (phytohemaglutinin) để kích thích bạch cầu lympho phân
bào.
Đối với các loại tế bào trên sau khi nuôi cấy đều qua các bớc tiếp
sau.
1.1.2.2. Thu hoạch tế bào:
Trớc khi thu hoạch tế bào 24h, bổ sung colcemid (đồng đẳng của
colchicine). Colcemid gắn vào các protein tubulin A, B, ức chế các trung
tâm gắn kết của ống vi thể, vì vậy ngăn cản hình thành thoi vô sắc hoặc
phá huỷ thoi vô sắc; colcemid cũng làm cho NST co ngắn hơn giúp cho
chúng ta dễ đánh giá.
1.1.2.3. Sốc nhợc trơng
Thờng sử dụng với dung dịch nhợc trơng KCl 0,075M hoặc
CitratNatri 0,8%. Dung dịch này phá vỡ màng tế bào, màng nhân giúp
phân tán các NST trên tiêu bản.

8
1.1.2.4. Cố định:
Dung dịch Carnoy (3 Methanol : 1 Acid Acetic) có tác dụng làm
ngừng tác động của dung dịch nhợc trơng, cố định hình dáng của NST,
ngoài ra còn ly giải những hồng cầu sót lại trong dung dịch.
1.1.2.5. Phun tiêu bản
Sau thu hoạch, dung dịch tế bào đợc treo trong dung dịch Carnoy
với nồng độ thích hợp, đợc nhỏ lên lam kính (thờng dùng lam kính
lạnh) với yêu cầu các cụm NST ở kỹ giữa phân tán tốt nhng vẫn có nền

bào tơng để đảm bảo các NST không bị bắn ra xa.
1.1.2.6. Nhuộm tiêu bản
- Nhuộm Giemsa thông thờng có ý nghĩa quan trọng trong việc
đánh giá số lợng NST.
- Nhuộm băng: Từ năm 1970 kỹ thuật băng đợc ứng dụng để phân
tích các đột biến NST, với kỹ thuật này ta có thể xác định từng NST
thờng từ số 1 đến số 22 và NST X, NST Y. Một số kỹ thuật băng đợc
ứng dụng phổ biến.
+ Kỹ thuật băng G: Kỹ thuật băng G đợc mô tả bởi Summer và
cộng sự (1971) với kỹ thuật này NST có các băng đậm và băng nhạt đặc
trng cho từng NST. Dựa vào đặc điểm băng ta có thể nhận biết từng NST
và phát hiện các rối loạn cấu trúc trên từng NST. Băng đậm tơng ứng với
vùng giàu A=T (vùng dị nhiễm sắc); băng nhạt tơng ứng với vùng giàu
GX (vùng nhiễm sắc thực). Băng nhạt có ý nghĩa sinh học, đây là vùng
hoạt động nhất của NST. Kỹ thuật băng G đợc sử dụng lập karyotyp ở
các phòng thí nghiệm.

9
+ Kỹ thuật băng R: đợc mô tả đầu tiên bởi Dutrilanx và Lejeune
(1971), kỹ thuật băng R cho hình ảnh ngợc với băng G (băng đậm của
kỹ thuật này lại là băng nhạt của kỹ thuật kia). Kỹ thuật băng R cũng
đợc ứng dụng nhiều ở các phòng thí nghiệm, đặc biệt ở Pháp.
+ Kỹ thuật băng C: Arrighi và HSn (1971) là ngời đầu tiên thực
hiện kỹ thuật này. Với kỹ thuật băng C có thể xác định các vùng dị nhiễm
sắc (heterochromatin), kỹ thuật này thờng đợc ứng dụng để xác định
tâm NST cần xác định NST 2 tâm, 3 tâm, đặc biệt các NST 1, 9, 16, Y,
xác định vùng đa hình của NST.
+ Các kỹ thuật băng Q, T, N thờng đợc sử dụng khi cần thiết.
Băng Q (nhuộm bằng chất màu huỳnh quang Quinacrin mustart
hoặc Quinacrin dihydrochloid).

Băng T (nhuộm phần đầu mút - telomer của NST).
Băng N (nhuộm những phần tham gia tạo thành hạch nhân -
nucleolus).
- Độ phân giải của các băng trên NST
Độ phân giải của băng trên NST đợc đánh giá bằng số lợng băng
đậm, băng nhạt trong bộ NST đơn bội (n).
+ Độ phân giải thấp: 400 băng.
+ Độ phân giải trung bình: 500-550 băng.
+ Độ phân giải cao: 850 băng hoặc hơn. Thờng thực hiện ở giai
đoạn sớm của kỳ giữa (prometaphase).