Định lượng đồng thời paracetamol, clorpheniramin maleat và phenylpropanolamin hydroclorid trong viên nén decolgen bằng phương pháp HPLC

,
.




^
Bộ Y Tê
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHAN THỊ NGHĨA
Ẩéióv
U-f4t- ' -
ĐỊNH LƯỢNG ĐÔNG THỜI PARACETAMOL,
CLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ
PHENYLPROPANOLAMIN HYDROCLORID TRONG VIÊN
NÉN DECOLGEN BANG PHƯƠNG PHÁP HPLC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2000-2005)
Người hướng dẫn : TS. Thái Duy Thìn
ThS. Võ Thị Nhị Hà
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá dược
Trường đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : Tháng 8/2004 - tháng 5/2005
vi'' ' y , i
HÀ NỘI, tháng 5/2005 -j
V, ■ -V ,. / r' V
■I-V ffii
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại bộ môn Hoá dược -
Trường đại học Dược Hà Nội. Trong quá trình thực hiện khoá luận, tôi đã
nhận được sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, thầy cô giáo, cán
bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa dược.

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Thái Duy Thìn,
ThS. Võ Thị Nhị Hà đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này.
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, cán bộ kỹ
thuật viên trong bộ môn Hoá dược đã giúp tôi hoàn thành khoá luận.
Tôi cũng xin cảm ơn thư viện trường đại học Dược Hà Nội đã cung cấp
những tài liệu có liên quan.
Cuối cùng tồi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên khích lệ,
giúp đỡ tôi tận tình.
Hà Nội, tháng 5/2005
Phan Thị Nghĩa
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 1
Phần 1: Tổng quan
3
1.1. Paracetamol 3
1.2. Phenylpropanolamin hydroclorid 5
1.3. Cloq^heniramin maleat 7
1.4. Phương pháp HPLC 8
1.4.1. Khái quát phưcmg pháp HPLC
8
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng 9
1.4.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC
12
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC 14
1.4.5. Pha động trong HPLC 15
1.4.6. Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động
16
1.4.7. Cách đánh giá p ic 16
1.4.8. Cách tính kết q uả 17

Phần 2: Thực nghiệm và kết quả
18
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

18
2.1.1. Hoá chất - Dụng c ụ
18
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu
18
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 20
2.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc k ý 20
2.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý 25
2.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 27
2.2.4. Khảo sát độ chính xác của phương pháp 30
2.2.5. Khảo sát độ dúng của phương pháp

33
2 .2 .6 . ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định tính và định lượng
đồng thời PA, PH và CM trong viên nén Decolgen

35
2.3. Bàn luận 37
Phần 3: Kết luận và đề xuất 39
3.1. Kết luận 39
3.2. Đề xuất

.

40
Tài liệu tham khảo

CHỨ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CM
Clorpheniramin maleat
COX
Cyclooxygenase
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
PA
Paracetamol
PH
Phenylpropanolamin hydroclorid
SKS
Số kiểm soát
STT
Số thứ tự
TB
Trung bình
USP Dược điển Mỹ
ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay, nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ của nhân dân ta ngày một
tăng. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là
trong lĩnh vực dược, các thuốc đa thành phần ngày càng phổ biến nhằm kết
hợp tác dụng điều trị và thuận tiện cho người sử dụng. Trong các thuốc đa
thành phần thì thuốc hỗn hợp hạ nhiệt giảm đau là một trong những nhóm
thuốc điển hình, đang được sản xuất, lưu hành và sử dụng ngày càng rộng rãi,
trong đó phần lớn là paracetamol phối hợp với một hoặc nhiều dược chất khác
như: phenylpropanolamin hydroclorid, clorpheniramin maleat,
dextromethorphan hydrobromid, pseudoephedrin, codein, với nhiều biệt dược
khác nhau như viên nén Partamol, viên nén DeAucold, viên nén Rhumenol NF
500, viên nang Coldacmin, viên nén Decolsil, [14]. Trên thị trường hiện nay
có nhiều dạng phối hợp 3 thành phần, trong đó có viên nén Decolgen của

United pharma có tác dụng chữa cảm cúm đã được sản xuất với công thức:
Paracetamol : 500 mg
Phenylpropanolamin hydroclorid : 25 mg
Clorpheniramin maleat : 2 mg
Trong các dược điển thông dụng hiện hành [3, 15, 19, 21 ] chủ yếu chỉ
có các chuyên luận cho thuốc chứa một thành phần. Vì vậy, các phương pháp
định lượng các dạng bào chế đa thành phần nói trên hầu hết phải tiến hành qua
nhiều công đoạn, tốn kém hóa chất và thời gian. Hiện có một chuyên luận
trong ƯSP 27 và tiêu chuẩn cơ sở của viên nén Decolgen [13] sử dụng phương
pháp HPLC để định lượng các hoạt chất trong hỗn hợp trên, nhưng mỗi chất
phân tích sử dụng một chương trình sắc ký khác nhau.
Hiện nay, do nhu cầu sử dụng và sản xuất các thuốc đa thành phần ngày
càng tăng, việc đảm bảo chất lượng và hiệu quả điều trị là một yêu cầu tất yếu.
Với mục đích tìm một phương pháp chung, đơn giản và nhanh, phù hợp với
điều kiện trang thiết bị hiện nay của đa số phòng và trung tâm kiểm nghiệm,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Định lượng đồng thòi paracetamol,
clorpheniramin maleat và phenylpropanolamin hydroclorid trong viên
Decolgen bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu:
- Xây dựng chương trình sắc ký thích hợp để có thể định tính và định
lượng đồng thời paracetamol, phenylpropanolamin hydroclorid và
clorpheniramin maleat.
- Áp dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng các hoạt chất
nói trên trong viên nén Decolgen có trên thị trường.
Phầni: TỔNG QUAN
l.l.PARACETAMOL [1, 3, 4, 6, 15, 16, 18, 19, 21, 22]
1.1.1. Công thức cấu tạo:
HO— — NH—CO—CH3
CgHgNOs (M=151,16)
Tên khoa học: N-acetyl-p-aminophenol
hoặc: p-hydroxy acetanilid

Tên khác: Acetaminophen
1.1.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng, hình lăng trụ đơn lớn, không mùi, vị hơi đắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: 169-170,5®c.
- Độ tan: ít tan trong nước lạnh (1/70), tan nhiều hơn trong nước nóng.
Tan trong methanol, ethanol. Rất ít tan trong cloroíonn, ít tan trong ether. Tan
trong dung dịch hydroxyd kim loại kiềm do tạo muối phenolat.
- Có khả năng hấp thụ quang phổ vùng tử ngoại, cực đại hấp thụ trong môi
trường acid là 245 nm, trong môi trường kiềm là 257 nm.
1.1.3. Tác dụng dược lý [4, 6
- Paracetamol thuộc nhóm thuốc NSAIDs. Có tác dụng hạ nhiệt, giảm đau.
- Cơ chế: Paracetamol ức chế enzym c o x là một enzym xúc tác việc tổng
hợp prostaglandin, nên làm giảm tính cảm thụ của ngọn dây thần kinh cảm
giác với các chất gây đau, có tác dụng giảm đau. Giảm tổng hợp prostaglandin
E| và E2 do đó ức chế quá trình sinh nhiệt, tăng cường quá trình thải nhiệt và
lập lại cân bằng cho trung tâm điều nhiệt, vì vậy có tác dụng hạ sốt.
Paracetamol không có tác dụng chống viêm và chống ngưng kết tiểu cầu.
- Chỉ định: Hạ sốt do mọi nguyên nhân gây sốt. Giảm các cofn đau ngoại vi
từ đau nhẹ đến trung bình.
- Thận trọng: Nói chung thuốc dung nạp tốt, ít tác dụng không mong
muốn. Khi dùng liều cao (lớn hơn lOg/ngày), kéo dài có thể gây tổn thương
gan.
1.1.4. Liều dùng: Người lớn: 500 mg/lần X 2-4 lần/ngày
Trẻ em: 80-325 mg/lần X 3-4 lần/ngày.
1.1.5. Các dạng bào chế: Viên nén, viên bao phim, hỗn dịch uống, dung
dịch uống, viên nén sủi bọt, viên đạn, các dạng bào chế phối hợp
1.1.6. Các phương pháp đã được áp dụng để định lượng paracetamol
- Phương pháp chuẩn độ nitrit [1]
Nguyên tắc: Thuỷ phân paracetamol trong môi trường acid HCl 10% và
nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc một. Chuẩn độ bằng dung dịch natrinitrit

(NaNƠ2) trong môi trường acid tạo ra hợp chất diazoni (phản ứng diazo hoá),
chỉ thị là tropeolin-00 hoặc dùng điện thế kế.
- PhưoTig pháp Kieldahỉ [1]
Nguyên tắc: Dựa trên sự vô cơ hoá các hợp chất có chứa nitơ khi đun với
acid H2SO4 đặc với sự có mặt của kali hay natri sulphat. Khi đó nitơ chuyển
thành NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2S04 Thêm NaOH vào hỗn hợp
phản ứng rồi cất kéo NH3 giải phóng ra bằng hơi nước vào dung dịch chuẩn
H2SO4 0,1N dư. Chuẩn độ acid H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N.
- Phương pháp đo quang [1, 3, 15,19, 21]
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử paracetamol,
cực đại hấp thụ của paracetamol trong dung môi methanol là 245 nm, trong
môi trường kiềm là 257 nm. Tính kết quả dựa vào giá trị độ hấp thụ quang đo
được và độ hấp thụ riêng hoặc so sánh với chuẩn.
- Phương pháp đo ceri [1, 3, 15]
Nguyên tắc: Trong dung dịch acid, paracetamol sau khi thuỷ phân là một
chất khử, ceri IV là một chất oxy hoá sẽ nhận thêm 1 electron để chuyển
thành ceri III, phát hiện điểm kết thúc bằng íeưoin (phức chất sắt của 0-
phenatrolin). sắt ở trong phức này có thể là sắt II hoặc sắt III, phức chất sắt II
có màu đỏ, phức chất sắt III có màu xanh. Tại điểm tương đương, khi bắt đầu
thừa ceri IV, phức sắt II chuyển thành sắt III, làm dung dịch đổi màu từ đỏ
sang xanh.
[(C,2H8N2)jFe]^" - e ^ [(C,2HsN2)3Fe]="
- Phương pháp HPLC [12,22]
Theo USP 27 [22], định lượng paracetamol sử dụng cột L7, 150mm X 4.6
mm, pha động: nước- methanol- acid acetic băng (79:20:1), tốc độ dòng 1
ml/phút, detector u v 280 nm, thể tích tiêm 5 |_il.
1.2. PHENYLPROPANOLAMIN HYDROCLORID [15, 16, 17, 18, 20,
22]
1.2.1. Công thức cấu tạo:
OH

NH, .HCl
CgHigNO.HCL (M= 187,6)
Tên khoa học: (lRS,2SR)-2-amino-l-phenyl-1-propanol hydroclorid
Tên khác: (±)-Norephedrin hydroclorid
1.2.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: 190-194°c.
- pKa = 9,44±0,04
- Độ tan: Dễ tan trong nước và ethanol, thực tế không tan trong ether và
cloroform.
- Có khả năng hấp thụ quang phổ vùng tử ngoại, cực đại hấp thụ trong môi
trường acid là 251 nm, 257 nm, 262nm.
1.2.3. Tác dụng dược lý [17, 20]
- Phenylpropanolamin hydroclorid thuộc nhóm thuốc chống xung huyết.
- Cơ chế: Là thuốc có tác dụng kích thích gián tiếp hệ Adrenergic, làm
giải phóng catecholamin ra khỏi hạt dự trữ. Có tác dụng chống xung huyết.
- Chỉ định: Điều trị các chứng ho, cảm lạnh, xung huyết mũi, viêm mũi
hầu, nghẽn phế quản. Ngoài ra còn dùng để điều trị chứng không kiểm soát
được bài niệu ở người già và trẻ em.
- Thận trọng: Nói chung thuốc ít kích thích trung ương gây bồn chồn, khó
ngủ, không gây ra các xung huyết hồi ứng. Tuy nhiên, thuốc có tác dụng làm
tăng huyết áp mạnh.
1.2.4.Liều dùng: 25 mgAần X 2-4 lần/ngày.
1.2.5. Các dạng bào chế: Viên nén, viên ngậm, dung dịch uống, siro
1.2.6.Các phương pháp đã được áp dụng để định lượng
phenylpropanolamin hydroclorid
- Phưong pháp định lượng trong môi trưòỉng khan [22]
Phenylpropanolamin hydroclorid được hoà tan trong acid acetic, thêm vào
đó một lượng dư thuỷ ngân (II) acetat, chuẩn độ bằng acid perchloric 0,1N với
chỉ thị tím tinh thể.

- Phưoiig pháp định lượng acid-base [15]
Hoà tan phenylpropanolamin hydroclorid trong hỗn hợp dung môi acid
HCl và alcohol, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1M, xác định điểm
tương đương bằng phương pháp đo điện thế và đọc thể tích thêm vào giữa hai
điểm uốn.
- Phưoìig pháp HPLC [12, 22]
Theo USP 27 [22], định lượng phenylpropanolamin hydroclorid sử dụng
cột Lll, 150mm X 4.6 mm, pha động; methanol - dung dịch đệm phosphat
(60:40), tốc độ dòng 2 ml/phút, detector u v 214 nm, thể tích tiêm 20 ỊLil.
1.3.CLORPHENIRAMIN MALEAT [1, 3, 4, 6 , 15, 16, 18, 19, 20, 21, 2 2 ]
1.3.1. Công thức cấu tạo:
_
___
_
H CH,
/ = \ / X
HC - COOH
o
C16H19CLN2.C4H4O4 (M =390,87)
Tên khoa học:3-(4-clorophenyl)-3-(2-pyridyl)propyldimethylamin
hydromaleat.
hoặc: 2 -[p-cloro-a-[2-(dimethylamino)ethyl]benzyl]pyridin maleat.
1.3.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng, không mùi.
- Nhiệt độ nóng chảy: 130-135°c.
- pKa = 9,2.
- Độ tan: Độ tan tính theo mg/ml ở 25°c là: trong nước 160, ethanol 330,
cloroíorm 240, methanol 130, ít tan trong ether, benzen.
- Có khả năng hấp thụ quang phổ vùng tử ngoại, cực đại hấp thụ trong
môi trường acid là 265 nm, trong môi trường kiềm là 262 nm.

1.3.3. Tác dụng dược lý [1, 4, 6, 20]
- Clorpheniramin maleat là thuốc kháng histamin Hj.
- Cơ chế: Clorpheniramin maleat đối kháng cạnh tranh đảo ngược với
histamin tại vị trí RH| của tế bào đích, vì vậy nó ngăn được tác dụng của
histamin lên tế bào đích, ngăn chặn các biểu hiện dị ứng.
- Chỉ định: Chống dị ứng như viêm mũi dị ứng, mày đay, ban da, dị ứng do
thức ăn, thuốc, dị ứng với máu, huyết thanh Ngoài ra, clorpheniramin maleat
còn được dùng rộng rãi trong phối hợp điều trị ho.
-Tác dụng không mong muốn: Tác dụng phụ ít và nhẹ. Không nên dùng
trong các hoạt động cần sự nhanh nhẹn vì thuốc gây buồn ngủ.
1.3.4. Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần X 4-6 lần/ngày
Trẻ em (dưới 11 tuổi); 2mgAần x3-6 lần/ngày.
1.3.5. Các dạng bào chế: Viên nén, viên nhộng chậm, viên bọc chậm,
thuốc tiêm, thuốc nước, siro
1.3.6. Các phương pháp đã được áp dụng để định lượng
clorpheniramin maleat
- Phương pháp định lưọTig trong môi trưòỉng khan [1, 3, 15,19, 21, 22]
Nguyên tắc: Clorpheniramin maleat hoà tan trong acid acetic, định lượng
bằng dung dịch acid percloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể hoặc dùng điện thế
kế.
- Phưoiig pháp đo quang [3, 15, 19, 21, 22]
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của clorpheniramin
maleat, cực đại hấp thụ của clorpheniramin maleat trong môi trường acid là
265 nm. Tính kết quả dựa vào giá trị độ hấp thụ đo được và độ hấp thụ riêng.
- PhưoTig pháp HPLC [12, 22]
Theo USP 27 [22], định lượng clorpheniramin maleat, sử dụng cột Lll,
150mm X 4.6 mm, pha động: methanol - dung dịch đệm phosphat (60:40), tốc
độ dòng 2 ml/phút, detector u v 214 nm, thể tích tiêm 20 \x\.
♦ Nhận xét: Để định tính và định lượng riêng lẻ từng từng hoạt chất nêu
trên có thể sử dụng nhiều phương pháp. Tuy nhiên ở dạng công thức phối hợp,

việc định lượng các thành phần bằng các phương pháp cổ điển sẽ gặp nhiều
khó khăn do phải chiết tách phức tạp. Chính vì vậy phương pháp HPLC được
lựa chọn là giải pháp tốt trong việc phân tích thuốc hỗn hợp nhiều thành phần
bởi nhũng ưu điểm như có thể phân tích đồng thời, không cần chiết tách hoạt
chất, cho kết quả nhanh, tin cậy.
1.4. PHƯƠNG PHÁP HPLC [2, 5, 8, 9, 10, 11]
1.4.1. Khái quát phương pháp HPLC
sac ky long hieu nang cao (HPLC) la mot phuorng phap tach hoa ly dua
vao ai luc khac nhau cua cac cha't khac nhau giua hai pha luon tiep xuc va
khong dong tan v6i nhau. Pha dong la chat long chay qua cot vdi mot tdc do;
nhat dinh du6 i ap suat cao, con pha tlnh la mot chat ran ducfi dang hat min
hoac chat long duac bao tren mot chit mang ran, hoac mot cha't mang ran da
duoc lien ket hoa hoc v6 i cac nhom huu ca. Pha dong cung v6 i mlu thir duac
bom qua cot du6 i ap sua't cao, cac chat phan tich se di chuyen theo pha dong
qua cot v6i toe do khac nhau tuy theo ai luc ciia chung v6 i hai pha va dan den
su tach cac chat. Cac chat sau khi ra khoi cot duoc nhan biet b6 i bo phan phat
hien la detector. Qua trinh sac ky dua tren co che hap phu, phan bo, trao doi
ion hay ray phan tir la tiiy thuoc loai pha tinh sir dung.
1.4.2. Cac dai lirang dac trirng
sign al
C o mp o n en t
C om p o n e n t
H inhl: Sac ky do cua hai chat va cac thong so dac trung
•Thời gian lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột cho
đến khi chất tan ra khỏi cột sắc ký đạt giá trị nồng độ cực đại, tới detector và
cho pic trên sắc ký đồ.
Nếu gọi ĩr là thời gian lưu giữ của một chất thì:
Trong đó: Ir là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực).
to là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (thời gian

chết).
Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định. Các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau phụ thuộc vào bản
chất, cấu tạo và tính chất của chất đó. Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng định
tính các chất.
• Hệ số phân bố K
Trong quá trình sắc ký, khi một chất đang di chuyển trên cột và phân bố
giữa hai pha, nếu ta cho pha động dừng lại để sự phân bố đạt tới cân bằng thì
ta có:
Hệ số phân bố K=
Trong đó Cg, là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh và pha động ở
thời điểm cân bằng. Khi nồng độ chất phân tích không quá cao thì K là một
hằng số phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ.
Với một chất nếu K lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di
chuyển chậm, nếu K nhỏ sẽ di chuyển nhanh.
• Hệ số dung lượng k
Hệ số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng
=Kx
Qm
Trong đó: Q s, Qiyj là lượng chất tan có trong pha tĩnh và pha động
Vg ,Vm là thể tích pha tĩnh và pha động
Có thể tính k theo cách khác: k -1
^0 ^0
k phụ thuộc bản chất các pha, bản chất chất tan, nhiệt độ và đặc điểm của
cột. Với một chất k càng lớn thì tốc độ di chuyển càng thấp, pic bị doãng, độ
nhạy kém, và thời gian lưu kéo dài, nhưng k thấp thì thời gian lưu tjỊ nhỏ do
đó khả năng tách kém. Thường chọn điều kiện phân tích sao cho k nằm trong
khoảng từ 1-5 là tốt nhất.

• Hệ số chọn lọc a:
Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau khi chúng có giá trị k khác nhau, hệ
số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký:
_ ^RB ~ ^ 0 — ^RB
^RA ~ h Ìr A
Theo qui ước, ở đây B là chất lưu giữ mạnh hơn A, vì vậy a luôn lớn hơn
1, a càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Để tách riêng hai chất
thường chọn 1,5 < a < 2,0.
• Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết:
Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột
(N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H).
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:
N=16x
2
=5,54x
ị ]
^Wj
Trong đó; w là chiều rộng đo ở đáy pic
w 1/2 là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao pic.
Nếu cột sắc ký có chiều dài là L thì ta có biểu thức:
h4
N
Cột có N lớn (hay có H nhỏ) là cột có hiệu lực cao.
• Độ phân giải Rgi
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trong cùng
một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính như sau:
_ 2 X ịtiịg —Íra)_ 8X )
' w,+w, K2(a) + K2(.)
CÓ thể xác định Rs theo phương trình khác: Rç X X —
4 a I + kg

Khi: Rg = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều
Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ 4%
Rs = 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%
Như vậy, để tăng độ phân giải Rg có các biện pháp sau:
- Tăng số đĩa lý thuyết N: dùng cột dài hơn hoặc giảm tốc độ dòng pha
động
- Tăng k : thay đổi thành phần pha động
- Tăng a: thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động.
• Hệ số bất đối xứng T:
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức;
2a
Trong đó; Wx; Là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a; Là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic
đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
1.4.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC
Để thực hiện việc tách bằng kỹ thuật HPLC, chúng ta phải có các hệ thống
trang bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang bị HPLC đơn giản và đủ để làm việc
được theo kỹ thuật HPLC bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:
1. Bơm cao áp để bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký.
Bơm này phải điều chỉnh được áp suất để tạo ra được những tốc độ nhất định
của pha động qua cột phù hơp cho quá trình sắc ký.
2. Van bơm mẫu để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng
mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6 chiều có
chứa vòng mẫu thể tích 20, 50 hay 100 ịil.
3. Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh quyết định hiệu quả sự tách một hỗn hợp
mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký. Nói
chung, các cột phân tích thường có kích thước chiều dài từ 10 - 25 cm; đường
kính trong từ 2 - 5 mm.
4.Trang bị phát hiện chất phân tích: Đây thường là các Detector dựa theo
các tính chất của chất phân tích, ví dụ như;

- Detector phát hiện quang phân tử.
- Detector phổ nguyên tử.
- Detector huỳnh quang.
- Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng).
- Detector chiết suất.
- Detector đo độ dẫn nhiệt.
Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector cho phù hợp
để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất. Trong các loại trên, thì
detector hấp thụ quang phân tử hiện nay đang được dùng phổ biến nhất.
5.Trang bị chỉ thị kết quả: ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến
nhất là máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.
Đó là 5 bộ phận cần thiết tối thiểu cần phải có của một hệ thống HPLC.
Hình 2: Sơ đồ khối hệ thống HPLC hoàn chỉnh
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC
• Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất
phân tích. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ,
đường kính cỡ hạt từ 3-10 ịiim, diện tích bề mặt riêng từ 50 — 500 mVg-
• Phân loại pha tĩnh:
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử.
Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong
kỹ thuật HPLC.
- Căn cứ theo trạng thái rắn hoặc lỏng của pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là chất
rắn, người ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC). Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc
ký lỏng-lỏng (LLC).
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó
làm hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp chỉ ở lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).
• Điều kiện đối vói một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những

điều kiện sắc ký nhất định
- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
1.4.5. Pha động trong HPLC
• Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Nó có thể chỉ là một dung
môi hữu cơ hay cũng có thể là hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo
những tỷ lệ phù hợp. Nó cũng có thể là dung dịch của các muối chứa chất
đệm, chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải
riêng cho nó, để có được hiệu quả tách tốt nhất.
• Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn
hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách
sắc ký. Nói chung pha động có thể ảnh hưởng đến:
Độ chọn lọc của hệ pha
Thời gian lưu của chất tan
Hiệu lực của cột tách
Độ phân giải của các chất trong một pha tĩnh
Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký.
• Điều kiện đối với một pha động:
Phải trơ với pha tĩnh
Hòa tan được chất phân tích
Bền vững với thời gian
Có độ tinh khiết cao
Nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
Phù hợp với detector dùng để phát hiện các chất phân tích
Có tính kinh tế, không hiếm, không quá đắt.
• 4 vấn đề cần được xem xét và chọn pha động cho phù hợp:
Bản chất của dung môi để pha chế pha động
Thành phần các chất tạo ra pha động

Tốc độ dòng pha động
pH của pha động.
1.4.6. Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động
Cách chọn pha tĩnh và pha động thích hợp để tách được hỗn hợp chất cần
phân tích là rất quan trọng. Dựa vào tính chất của mỗi pha đã nêu trên người ta
chọn pha tĩnh, pha động phù hợp nhau, chẳng hạn:
- Sắc ký pha thuận: Pha động là các dung môi hữu cơ kị nước, không
phân cực hay ít phân cực. Cột hay sử dụng là cột Lichrosorb Si 60.
- Sắc ký pha đảo: Pha động là hệ dung môi phân cực, các dung môi tan
được trong nước, điển hình là methanol, acetonitril. Nói chung dung môi cho
hệ pha đảo là nước cất, alcol Ngoài các dung môi chính còn có các dung
dịch đệm pH (hay sử dụng dung dịch đệm phosphat) để ổn định cho quá trình
sắc ký. Sắc ký pha đảo thường dùng để tách các chất phân cực. Có nhiều cột
để lựa chọn, loại thường sử dụng là cột alkyl hoá Cg, Cj8 với các tên thương
phẩm khác nhau. Tuỳ theo điều kiện cơ sở và phương pháp tiến hành thí
nghiệm mà người ta chọn loại cột thích hợp
Việc lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp với chất phân tích có tính
chất quyết định đối với quá trình sắc ký, do đó cần lựa chọn, thay đổi sao cho
phù hợp để việc phân tích đạt kết quả cao nhất. Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến
chi phí khi lựa chọn pha tĩnh và pha động.
1.4.7. Cách đánh giá pic
• Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic, người ta có thể dùng tích
phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn trong chương trình.
• Đánh giá chiều cao pic: Phương pháp này áp dụng khi k hằng định. Đo
chiều cao pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
1.4.8. Cách tính kết quả
• Phương pháp ngoại chuẩn: Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử
trong cùng điều kiện. Kết quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã
biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
• Phưcỉng pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và

mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn
nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất
cần phân tích trong mẫu thử.
• Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của
chất chuẩn tương ứng các thành phần cần phân tích trong mẫu thử. Tiến hành
sắc ký cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn trong cùng một
điều kiện sắc ký. Kết quả được tính toán dựa vào sự chênh lệch nồng độ
(lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng diện tích pic hoặc chiều cao pic.
• Phương pháp tính theo phần trăm diện tích pic: Hàm lượng phần trăm
của các chất cần phân tích trong mẫu thử được tính bằng phần trăm diện tích
pic của nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
Phương pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như
nhau, nếu không như nhau có thể được cải thiện bằng sử dụng hệ số đáp ứng
hiệu chỉnh.
Phân2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1.1. Hoá chất - Dụng cụ
a. Hoá chất
- Chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm: chuẩn paracetamol (hàm lượng
100%), chuẩn phenylpropanolamin hydroclorid (hàm lượng 99,66%), chuẩn
clorpheniramin maleat (hàm lượng 99,86%)
- Trimethylamin loại dùng cho HPLC.
- Acetonitril loại dùng cho HPLC.
- Acid phosphoric loại tinh khiết phân tích.
- Nước cất.
b. Dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX-Detector u v diode aưay, gắn
với máy vi tính và máy in.
- Cột Nucleosil C18 (250mm X 4mm, 5|Lim).
- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với đưòfng kính lỗ màng lọc 0,45 |0.m.

- Máy lắc siêu âm-SONOREX
- Máy đo PH Meter 3305-Jenway
- Cân phân tích Mettler AB 204 độ chính xác 0,1 mg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức 1000,0ml; 100,0ml; 50,0ml;
25,0ml; 2 0 ,0 ml; 10,0ml; ống đong, pipet chính xác, pipet thưòỉng, cốc có mỏ
và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu.
a. Đối tượng nghiên cứu
Viên nén Decolgen do công ty United Pharma sản xuất có công thức:
Paracetamol ; 500mg
Phenylpropanolamin.HCL ; 25 mg
Clorpheniramin maleat : 2 mg
(Tá dược: Tinh bột, Povindon, Natri tinh bột Glycolat, Magnesi Stearat,
D&c Yellow #10, D&c Red # 22, D&c Red # 33).
Mẫu 1 có số kiểm soát; 402221
Mẫu 2 có số kiểm soát: 404971
b.Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời PA, PH
và CM trong viên nén Decolgen. Để xây dựng chương trình sắc ký thích hợp,
chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn các điều kiện sau:
Kiểu sắc ký áp dụng
Cột tách sử dụng
Các điều kiện về pha động (thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng) để cho kết
quả tách tốt nhất
Bước sóng thích hợp phát hiện ba chất.
• Để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành:
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất
Khảo sát độ chính xác của phương pháp
Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn.

Thông qua việc xử lý thống kê các kết quả thực nghiệm để đánh giá
chương trình sắc ký đã xây dựng.
ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng, định tính và định lượng đồng
thời PA, PH và CM trong viên nén Decolgen bằng phương pháp ngoại chuẩn.
c. Một sô công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả [7]
n
- p '
- Giá trị trung bình x= ——
- Độ lệch chuẩn s =

-
\ n-\
- Sai số chuẩn Sx =
c ■ A - ' - (97 _ 5'xx c x io o
- Sai sô tương đối s% = _

X
Trong đó: Xj là kết quả của lần xác định thứ i
n là số lần xác định
ta là biến ngẫu nhiên tuân theo phân bố student ứng với
giả thiết số bậc tự do f (f=n-l) và mức ý nghĩa a.
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
Trong viên nén Decolgen, hàm lượng của PA lớn hơn hàm lượng của hai
thành phần còn lại PH và CM rất nhiều. Trong phân tích định lượng PA gây
trở ngại rất lớn đến việc phân tích PH và CM. Dược điển USP 27 và tiêu chuẩn
cơ sở viên nén Decolgen đều sử dụng hai chương trình sắc ký để định lượng
nên tốn kém hoá chất, thời gian. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu để đưa ra được
một chương trình sắc ký có thể định lượng đồng thời 3 thành phần trong viên
nén Decolgen.
2.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

• Qua tham khảo tài liệu và nghiên cứu tính chất hoá lý của các chất phân
tích PH và CM là các muối base hữu cơ, PA có tính acid nên đều là những
chất có tính phân cực, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký pha đảo để phân tích.
Với điều kiện sẵn có của bộ môn, chúng tôi chọn cột Nucleosil C18 trong quá