Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336

m
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỀN THỊ BÍCH DIỆP
GÓP PHẨN NGHIÊN cứu SINH TổNG HỢP KHÁNG
SINH NHỜ STREPTOMYCES 46.336
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dân:
N(ri thực hiện:
PGS. TS Cao Văn Thu
Bộ môn Vì sinh- Sinh học
Thời gian thực hiện: Từ 01/2006 đến 05/2006
&
Oỹ
HÀ NỘI, THÁNG 5/ 2006
m
Lời cảm ơn
Vói lòng kính trong vả biết ơn sâu sẳc, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thồnh
đển thẩy giáo PGỎ.TỔ Cao Văn Thu, ngưòi đỗ trực tiểp hưỏng dẫn, giúp đõ tôi hoồn
thành khoá luận này.
Tỏi cũng xin chân thành cảm ơn cảc thầy cô, các cán bộ kỹ thuật viên bộ
mòn Vi ỏinh-ỏinh Học và các bộ môn khác đã tạo điéu kiện, tận tình giúp đõ tôi trong
thòi gian thực hiện khoá luận.
Do thòi gian nghiên cửu và trình độ bản thân có hạn. khoả luận không tránh
khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ỷ cùa thầy cô, bạtì bè đổng
nghiệp đ ể khoá luận hoàn thiện hơn.
Tối xỉn h'ân írọng cảm ữn./.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2006
Sinh Viên
Qlạuụễn. ^ íú h
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

AND
B.cereus
B.puminus
B.subtiỉis
D(mm)
E.coỉi
Gy
ISP
MT
MTdd
p.mỉrabilis
p.aeruginosa
s
s
s.typhi
s.ỉutea
s.flexneri
S.aureus
SKLM
TS
v sv
w
:Acid deoxyribonucleic.
'.Bacillus cereus ATCC 9946.
.'Bacillus puminus ATCC 10241
Bacillus subtiỉis ATCC 10241.
: Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn.
■.Escherichia coỉi ATCC 25922.
:Grey-xám.
:Intemationnal Streptomyces Project-Chương Trình

(§t^omyceiX)\x6c Tế.
:Môi trường.
:Môi trường dung dịch.
.Proteus mirabiỉis BV 108.
'.Pseudomonas aeruginosa VM 201.
:Độ lệch thực nghiệm chuẩn hiệu chỉnh.
:Spirales-Xoắn.
'.Saỉmoneỉa typhi DT 220. ScJ
:Sarcina lutea ATCC 9341.
:Shigelỉa flexneri DT 112.
:StaphỵỊpccus.aureus ATCC 1228.
:Sắc kỵ lớp mỏng-
:Tham số.
:Vi sinh vật.
;White-Trắng.
M ỤC LỤC
ĐẶT VÂN ĐỂ





1
PHẦN 1, TỔNG QUAN


2
1.1. Đại cương về kháng sinh

2

1.1.2 Phân loại kháng sinh 2
1.1.3 Các ứng dụng của kháng sinh
3
1.1.4 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn


3
1.1.5 Quá trình sản xuất kháng sinh

4
1.2. Xạ khuẩn 5
1.2.1. Đặc điểm chung


5
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces


5
1.2.3. Phân loại Streptomyces
6
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces

6
1.3. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật

7
1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

8

1.3.2. Đột biến nhân tạ o



8
1.3.3. Bảo quản giống vi sinh vật

8
1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9
1.4.1. Phưcíng pháp lên men bề mặt
9
9
11
1,6, Một số nghiên cứu gần đáy về vi sinh, kháng sinh 12
1.6.1. Sự phân lập, hoạt tính kháng nấm và nấm noãn của kháng sinh
Staurosporin từ chủng Streptomyces roseoỷỉavus LS - A24

12
1.4.2. Phương pháp lên men chìm

^ 1.5. Tách chiết và tinh chế sản lẽn nieiLphẩiìi sau khỉ
1.6.2. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp các chất kháng sinh của
hai chủng xạ khuẩn Streptomyces QN - 29 và ĐN “ 110 13
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15
2.1. Nguyên liệu 15
2.1.1. Giống xạ khuẩn

— 15
2.1.2 Chủng vi sinh vật kiểm định 15
2.1.3. Các môi trường nuôi cấy

15
2.1.4. Dụng cụ và hoá chất



18
2.2. Phương pháp thực nghiêm 20
2.2.1 Phưcíng pháp giữ giống
20
2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh

20
2.2.3. Phưcmg pháp cải tạo giống vi sinh vật


21
2.2.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

23
2.2.5. Phưcỉng pháp lựa chọn mồi trường lên men tốt nhất —


23
2.2.6. Phưcỉng pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ

24
2.2.7. Phưcỉng pháp xác địng độ bền của kháng sinh trong dịch lên men — 24
2.2.8. Phương pháp tách kháng sinh bằng SKLM

25
2.2.9. Phương pháp phân loại Streptomyces 46.336 theo ISP

26
2.3. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
27
2.3.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 46.336 trên
môi trường phân lập (M T3)
27
2.3.2. Kết quả phân loại theo ISP


28
2.3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy và các vi sinh vật kiểm định của chủng
Streptomyces 46.336 29
2.3.4 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

30
2.3.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v



31
2.3.6. Kết quả lựa chọn môi trường lẽn men tốt nhất



33
2.3.7. Kết quả lên men chủng gổc, chủng tốt nhất sau sàng lọc ngẫu nhiên và

chủng tốt nhất sau đột biến



34
2.3.8. Lựa chọn dung mồi chiết thích hợp

35
2.3.9. Kết quả SKLM 36
2.3.10. Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 37
PHẨN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
40
3.1. Kết luận 40
3.2. Đề xuất

40
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kể từ khi penicillin được Alexander Fleming phát hiện (1928) và được
chứng minh có tác dụng chữa bệnh (1941), trong hơn nửa thế kỷ qua, kháng
sinh đã trở thành một dược phẩm thẩn kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh
vực thuốc trên thế giới. Nhiều bệnh tật nhất là bệnh nhiễm khuẩn đã được đẩy
lùi, sức khoẻ và tuổi thọ của con người không ngừng được nâng cao rõ rệt,
Song song, tệ sùng bái và lạm dụng kháng sinh cũng phát triển mạnh làm xuất
hiện ngày càng nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh. Vì vậy việc tìm ra các chất
kháng sinh mới luôn là vấn đề thcd sự hấp dẫn các nhà nghiên cứu khoa học
thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau.
ở Việt Nam, hầu hết các thuốc kháng sinh đều được nhập ngoại dưới
dạng nguyên liệu, thành phẩm và bán thành phẩm. Do vậy một vấn đề được
đặt ra và lúc nào cũng bức bách đó là chúng ta cần phải có sự đầu tư và đẩy
mạnh việc nghiên cứu, sản xuất kháng sinh trên qui mô công nghiệp mà trước

hết là qui mô phòng thí nghiêm.
Trong số các v sv sinh tổng hợp kháng sinh, xạ khuẩn là nhóm có tiềm
năng lớn. Chủng Streptomỵces 46.336 được bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường
Đại học Dược Hà Nội phân lập từ trong đất bùn nước ta. Và để góp phần vào
nghiên cứu ban đầu trong việc tìm ra kháng sinh mới, chúng tôi đã chọn đề
làì^^Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Steptomyces
46.336'cho khoá luận tốt nghiệp với các mục tiêu:
> Xác định tên khoa học của Streptomyces 46.336 theo khoá phân loại
ISP.
> Chọn lọc, cải tạo giống để tìm ra những biến chủng có hoạt tính kháng
sinh mạnh hcfn chủng gốc.
> Bước đẩu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh trên qui mô
phòng thí nghiệm.
> Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh và một số tính chất của dịch lọc
kháng sinh thô.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh.
1.1.1. Định nghĩa. [5
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt có nguốn gốc vi sinh vật hay
các nguồn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, ò nồng độ thấp có tác
dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách có chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật
xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật ) hay ^b ào ung thư.
1.1.2. Phân loại kháng sinh. 4 , [5], [14]
Danh sách các kháng sinh được phát minh ngày càng dài thêm mãi.
Việc phân loại các kháng sinh là cần thiết vì nó giúp cho các nhà khoa học tốn
ít thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác
dụng, độc tính
Có thể phân loại kháng sinh theo nhiều cách khác nhau:
- Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc.
- Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh.

- Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh.
- Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học là khoa học nhất. Dựa
vào cấu trúc hoá học chia kháng sinh làm các nhóm sau:
+ Các kháng sinh có chứa đường trong phân tử.
+ Kháng sinh chứa vòng lacton lớn (macrocỵclic lacton).
+ Quinon và các kháng sinh cùng họ.
+ Kháng sinh aminoacid và peptid.
+ Kháng sinh dị vòng chứa nitơ.
+ Kháng sinh dị vòng chứa oxy.
+ Các kháng sinh nhân thơm.
1.1.3. Các ứng dụng của kháng sinh. [5], [8
Đa số các kháng sinh sản xuất được dùng để điều trị các bệnh nhiễm
trùng do vi khuẩn gây ra nhưng một số kháng sinh có những ứng dụng khác:
chống ung thư, chống nấm, dùng trong chàn nuôi, trong trồng trọt và công
nghiệp thực phẩm Bởi những ứng dụng rộng rãi này đã làm cho các nhà
kinh tế và nhà nghiên cứu kết hợp với nhau rất chặt chẽ nhằm phát huy tối đa
tính hiệu quả của kháng sinh.
1.1.4. Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn. [5],
- Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của
nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh và hoá trị liệu.
- Các kiểu kháng thuốc của vi sinh vật:
+ Kháng thuốc nhiễm sắc thể bao gồm :kháng thuốc tự nhiên và kháng
thuốc do đột biến.
+ Kháng thuốc ngoài nhiễm gồm đa kháng thuốc do nhân tố -R
và các cơ chế di truyén như tải nạp, biến nạp, tiếp hợp.
Ngoài ra còn có khái niệm kháng chéo ở các vi khuẩn có cơ chế kháng
như nhau đối với các kháng sinh có cấu trúc h o á Ế ậ gần giống nhau.
- Vi khuẩn kháng thuốc chủ yếu theo 3 cơ chế:
+ Thay đổi vị trí hay đích tác dụng của kháng sinh,
+ Tiết ra những enzym phân huỷ hoặc biến đổi kháng sinh,

+ Thay đổi tính thấm của màng tế bào.
1.1.5 Quá trình sản xuất kháng sinh.
Bã
Hình 1: Giứi thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh.
1.2. Xạ \i\mầnịẠctìnomycetes),
1.2.1. Đặc điểm chung. [2], [6],
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật {Eubacterià) phân bố rộng rãi trong
tự nhiên. Phần lớn các xạ khuẩn là tế bào G(+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu trúc
dạng sợi phân nhánh. Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và
khuẩn ty khí sinh. Xạ khuẩn có khả năng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi
chất quan trọng (kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ).
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi ^teptonĩỹc^. [17
_________
^
Đặc điểm hình thái
- Khuẩn lạc mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thô ráp, được bao
phủ bởi một lớp bột mịn như bụi phấn hoặc bởi các sợi nhỏ bông như lông tơ,
có thể có các lớp toả ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc có chân khá vững chắc,
khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
“ Hệ sợi của khuẩn lạc: khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
+ Khuẩn ty cơ chất : Mọc sâu trong môi trường nuôi cấy. Nó
có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố
tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh : Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra
trong không khí. Sau một thời gian phát triển ưên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ
xuất hiện các chuỗi bào tử.
Màu sắc của khuẩn ty hết sức phong phú : Màu trắng, vàng, đỏ, lục,
xám, đen
- Chuỗi bào tử : Có nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo loài : thẳng, lượn
sóng, móc câu, xoắn

- Bào tử trần :
+ Bề mặt bào tử có nhiều dạng : phẳng nhẵn (sm), xù xì da
cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha).
- Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử.
♦í* Đặc điểm sinh lý
(^eptomyc^Xh. vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hoá cao. Để phát
triển chúng phân giải các hydratcacbon là nguồn cung cấp vật chất và năng
lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột. Chúng
có thể khử nitrat thành nitrit.loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí.
Nhiệt độ tối ưu của chúng thưcíng là 25-30®C, một số loài có thể mọc tốt ở
nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu thường là từ 6,8-7,5.
1.2.3. Phân \0ẠÌ Streptomyces. [l7
Có rất nhiều khoá phân loại Streptomyces khác nhau. Tại hội nghị vi
sinh thế giới lần thứ X (1970) , khoá phân loại của Shirling và Gottlieb được
chọn làm khoá phân loại chính để phân loại chi Streptomyces và đặt tên là ISP
(International Streptomyces Project). Khoá phân loại ISP dựa trên những đặc
điểm :
- Màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất,
- Hình dạng chuỗi bào tử,
- Đặc điểm bề mặt bào tử,
- Khả năng tạo sắc tố hoà tan,
- Khả năng tạo sắc tố melanoid,
“ Khả năng tiêu thụ các nguồn đường.
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces.
Một ưu điểm nổi bật của kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật nói
chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Trong số hcfn 10.000
kháng sinh được biết đến trong y học ngày nay thì khoảng 60% kháng sinh có
nguồn gốc từ xạ khuẩn và trên 50% trong số đó thuộc chi Streptomyces. Một
số được giới thiệu ở bảng 1:
Bảng 1; Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces.

STT Kháng sinh Nguồn gốc Tác dụng
1 Lìncomycin
Streptomyces ỉincolnensis
Kháng khuẩn
2 Oxytetracyclin Steptomyces rimosus Kháng khuẩn
3 (ầteptomyẽ]^
Streptomyces griseus
Kháng khuẩn
4 Vancomycin Streptomyces orientaỉis
Kháng khuẩn
5 Kanamycin Streptomyces kanamyceticus
Kháng khuẩn
6 Tetracyclin Streptomces aureofaciens
Kháng khuẩn
7 Cloramphenicol Streptomyces Venezuela Kháng khuẩn
8 Candicidin
Sreptomỵces griseus
Kháng nấm
9
Nistatin Streptomyces noursei
Kháng nấm
10 Pymaricin Streptomyces nataỉnensỉs Kháng nấm
11 Paromomycin Sĩreptomyces rimosus
Kháng đơn bào
12 Trichomycin Streptomyces hachifaensis Kháng đơn bào và nấm
13 Bleomycin
Streptomyces verticiỉỉum
Kháng ung thư
14 Actinomycin D
Sreptomyces antihioticus

Kháng ung thư
15 Daunombicin
Streptomyces peucetius
Kháng ung thư
16 Mitomorin c
Streptomyces sp Kháng ung thư
1.3, Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật. [5
Đa số các vi sinh vật được phân lập từ cơ chất thiên nhiên cho hoạt tính
thấp đồng thời trong quá ưình nuôi cấy hoạt tính của chúng thường giảm dần.
Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất công nghiệp
đòi hỏi phải áp đụng một cách khéo léo các phương pháp cải tạo chọn giống
và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp.
1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên.
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống
giống thuần khiết tạo ra các cá thể khác nhau. Trong đó có cá thể cho hoạt
tính kháng sinh mạnh hcfn 10-20 % những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá
thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Tuy nhiên trên tìiực tế tần suất xuất hiện những cá thể dưang rất thấp và
việc chọn lọc tự nhiên chỉ giúp cho những nghiên cứu bước đầu, chưa có giá
trị áp dụng vào sản xuất công nghiệp. Để thu được các cá thể có khả năng siêu
tổng hợp kháng sinh người ta áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo.
1.3.2. Đột biến nhân tạo
Là đột biến sinh ra bởi các tác nhân vật lý, hoá học như: tia uv, X hay
những hoá chất : etilenimin, nitrosoguanidin, dimetylsulfat Khi sử dụng các
tác nhân này với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi
sinh vât . Những cá thể nào nếu còn sống sót sẽ có sự biến đổi ở nhiễm sắc
thể, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc là mất (giảm) khả năng tạo ra
kháng sinh (đột biến âm) hoặc là tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên
nhiểu lần (đột biến dưcíng).
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải

tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các tác nhân đột biến.
1.3.3. Bảo quản giống vi sinh vật,
Bảo quản giống vi sinh vật là công việc hết sứ c ^ ^ thiế t không phải
chỉ với các trung tâm giữ giống quốc gia mà ngay cả phòng thí nghiệm công
tác này cũng hết sức quan trọng. Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hoá,
nhầm lẫn và nhiễm nếu không được bảo quản một cách khoa học, đúng kỹ
thuật.
Hiện nay có rất nhiều phưcỉng pháp khác nhau để giữ giống vi sinh vật. Tuỳ
theo các trang thiết bị và loại vi sinh vật cẩn giữ mà chúng ta có thể sử dụng
phưcíng pháp nào. Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm đơn
giản nhất có thể sử dụng phưcỉng pháp giữ giống trên môi trường thạch
nghiêng trong tủ lạnh.
1.4. Lẻn men sinh tổng hơp kháng sinh. [1], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [17]
Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong các điều kiện tối ưu
nhằm tạo ra những sản phẩm trao đổi chất từ chính các vi sinh vật hoặc các
thành phần tế bào của chúng.
Ngày nay công nghệ lên men được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác nhau như: “Dược phẩm, hoá học, năng lượng, thực phẩm ” để sản
xuất ra nhiều sản phẩm hữu ích.
Có 2 phưcmg pháp lên men chính:
1.4.1. Phưomg pháp lên men bề mặt.
Là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay
lỏng. Vi sinh vật hấp thu các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy
không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu của
công nghệ lên men bể mặt là bề mặt lên men phải rộng và lớp dinh dưỡng
khống quá sâu.
* ư u điểm: Đcfn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp.
* Nhược điểm; Đòi hỏi diện tích lổfn, hiệu suất sử dụng trường
thấp, khó cơ giới hoá và tự động hoá.
Chính vì vậy phưcíng pháp này không được sử dụng trong công nghiệp

sản xuất kháng sinh mà chỉ sử dụng trong các phòng thí nghiệm để chọn
giống.
1.4.2. Phương pháp lên men chìm
Là phưcfng pháp lên men mà vi sinh vật được nuôi cấy trong mồi trường
lỏng, phát triển theo cả 3 chiều.
Giống vi sinh vật dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng
đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hoá vật chất cao nhất.
Vì vậy trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống. Giống vi sinh vật được
tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau;
Giống cấp I : Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml).
Giống cấp I I : Nuôi trong bình giống 50L
Giống cấp III: Nuôi trong thiết bị nhân giống 1- 5m^.
Tỷ lệ giống trong môi trường lên men thường từ 1% -10%, có thể phải
cho thêm các chất phá bọt, các chất điều chỉnh pH hay đệm pH nhằm đảm bảo
điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men kháng sinh- Tuỳ thuộc vào sản phẩm
mà thời gian lên men có thể từ 50-120 giờ, tuy nhiên hiệu quả lên men sẽ tàng
khi thời gian lên men được rút ngắn.
* ưu điểm của phương pháp lên men chìm;
Sử dụng được môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh
lý của vi sinh vật.
Hiệu suất sử dụng không gian cao ( 3 chiều), lượng hợp chất được sinh
tổng hợp trong thể tích sử dụng cao dẫn đến hiệu suất lên men cao.
* Nhược điểm:
Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
Với những ưu điểm vượt trội mà đại đa số kháng sinh ngày nay đều được sản
xuất bằng công nghệ lên men chìm.
* Lẻn men chìm chia làm 4 kiểu chính:
Lẽn men gián đoan: Là một quá trinh đóng kín, trong suốt thời gian lên
men không tác động hay bổ sung thêm gì, ngoài cấp oxy ( dưới dạng không
khí nén), chất phá bọt ( nếu cần), chất điều chỉnh pH. Trong quá trình lên men

các th à n h ^ ^ tro n g dịch lên men biến đổi không ngừng.
Lên men có bổ sung: Thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển
của vi sinh vật khi ta bổ sung thêm một số thành phần vào dịch lên men nhằm
tránh các ức chế thay đổi của vi sinh vật và nhằm tăng sinh tổng hợp hoạt
chất.
Lên men liên tuc: Quá trình lên men được xem như một hệ thống mở.
Trong suốt thời gian lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục
vào bình lên men đồng thời lấy bớt ra khỏi hệ thống đồng thể tích dịch lên
men.
Lên men bán liên tuc: Trong quá trình lên men việc rút bớt dịch lên
men và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục mà định
kỳ sau những khoảng thời gian nhất định.
1.5. Tách chiết và tinh chế sản phẩm sau khỉ lên men. [5], [6], [10
Kháng sinh là sản phẩm ừao đổi chất thứ cấp. Tuỳ theo đặc tính của
loài mà sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại
trong tế bào. Sau khi lên men, trong dịch lên men ngoài kháng sinh còn có
nhiều tạp chất khác là các chất vô cơ, hữu cơ, là sản phẩm trao đổi chất hay
thành phần cùa môi trường. Để thu lấy các hoạt chất kháng sinh có độ tinh
thiết cao cần tìm phưcỉng pháp chiết tách thích hợp.
Giai đoạn chiết xuất sản phẩm:
Người ta thường dùng các phương pháp: Qiiết bằng dung môi hữu cơ,
chiết bằng phương pháp kết tủa hoặc bằng nhựa trao đổi ion
Chiết báng dung mối hữu cơ:
- Nguyên tắc; Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hoà
lẫn được vào nhau.
- Dung môi dùng để chiết phải thoả mãn các yêu cầu sau:
+ Dung mồi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, không cháy.
+ Có tính chọn lọc cao: Hoà tan tốt hoạt chất, ít hoà tan tạp
chất.
+ Dễ cất thu hồi.

- Các phưcfng pháp chiết lỏng - lỏng:
+ Qiiết đcfn (chiết 1 lẩn).
+ Chiết lặp c chiết nhiều lần).
+ ơiiết ngược dồng.
Giai đoạn tách sản phẩm;
Thường sử dụng phưoíng pháp sắc ký. sắc ký là một nhóm các phưofng
pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp dựa trên sự phân
chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà
lẫn vào nhau là: Pha động và pha tĩnh.
Một số phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng
hợp kháng sinh:
* Sắc ký lớp mỏng;
Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp
phụ khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn ( chất hấp phụ ), ở đây pha
tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi.
* Sắc ký trao đổi ion:
Nguyên tắc: Dựa trẽn phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit.
Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi
anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối
lượng.
1,6, Một số nghiên cứu gần đây về vi sinh- kháng sinh.
1.6.1. Sự phân lập, hoạt tính kháng nấm và nấm noãn của kháng sinh
staurosporin từ chủng Streptỡmyces rớseo/lavus LS - A24. [15],
Chủng LS - A24 đuợc phân lập từ một mẫu đất trồng ở hồ Sunghwan
Hàn Quốc, ơiủng này có hoạt tính chống lại một số tác nhân gây bệnh là: Cây
nấm và nấm noãn.
Cấu tạo màng tế bào và dạng bào tử của chủng LS -A24 là acid
diaminopimelic và dạng sợi xoắn. Dựa trên cơ sở những đặc điểm sinh lý, sinh
hoá và phép phân tích liên tiếp chuỗi ADN ribosom 16S cho thấy chủng LS -

A24 giống hệt Streptomyces roseoflavus.
Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau để tách ra
một chất kháng sinh có hoạt tính chống nấm và nấm noãn từ LS - A24. Công
thức phân tử của kháng sinh được xác định là C
2gH2gN403 và dựa trên cơ sở dữ
liệu NMR, kháng sinh được chứng minh là staurosporin , 2,3,10,11,12,13 -
hexahydro - lOR - methoxy - 9S - methyl - IIR - methylamino - 9S, 13R -
epoxy - IH, 9H - diindolo [1,23 - gh: 3 \2 \ v - Im] pyrrolo [3,4 - j][l,7]
benzodiazonin - 1.
Staurosporin ức chế hoàn toàn sự phát triển dạng sợi của nấm
Coỉlectotrichum orbiculare, Phytophthora capsici, Rhizoctonia soỉani,
Botrytis cinerea, và Cỉadosporium cucumerinum vởi nồng độ ức chế tối thiểu
tưcíng đưcfng 1-50 mug/ml ( MIQ). Staurosporin cũng có hoạt tính chống lại
Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtiỉis ssp. subtiỉis, và Xanthomonas
vesicatoria. Staurosporin và thuốc diệt nấm metalaxyl đã ức chế được sự phát
triển của Phytophthora gây bệnh tàn lụi trên các cây hạt tiêu. Tuy nhiên, ở
một mức độ nào đó hiệu quả kiểm soát bệnh của staurosporin vẫn thấp hcm so
với metalaxyl. Đây là những nghiên cứu ban đầu để tách kháng sinh
staurosporin từ Streptomyces roseoflavus và chứng minh hoạt tính chống
nấm noãn trên invivo và invitro của nó.
1.6.2. Động học của quá trình lên men sình tổng hợp các chất kháng sinh
của hai chủng xạ khuẩn Streptomyces QN - 29 và ĐN -110. [l6
Hai chủng xạ khuẩn Streptomyces QN - 29 và ĐN - 110 được phân lập
từ đất khu vực Quảng Nam - Đà nẩng có khả năng sinh kháng sinh chống nấm
nhóm polyen qúi hiếm. Qua nghiên cứu động học của quá trình lên men sinh
tổng hợp chất kháng sinh và thử nghiệm khả nãng diệt một số nấm gây bệnh ở
thực vật của hai chủng xạ khuẩn trên, cho thấy có thể sử dụng dịch nuôi cấy
hai chủng xạ khuẩn QN - 29 và ĐN - 110 để xử lý hạt giống cà chua, đậu đỗ,
lạc trước khi gieo.
* về động học quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh: Hai

chủng xạ khuẩn QN - 29 và ĐN - 110 được lên men trong môi trường Gauze
II, sử dụng bình tam giác dung tích 500ml chứa lOOml môi trường pH = 7,
thời gian lên men là 144 giờ, nuôi cấy lắc 220 vòng / phút ở nhiệt độ phồng (
28 - 30°C). Kết quả nghiên cứu cho thấy sinh khối tích luỹ cực đại ờ 96 giờ
lên men, hàm lượng kháng sinh được tạo thành tối đa sau 120 giờ ở nhiệt độ
28 - 30°c, pH = 7.
* Dịch kháng sinh thô của hai chủng xạ khuẩn QN - 29 và ĐN - 110
có khả năng diệt nấm gây bệnh ở thực vật.
- Khả năng diệt nấm gây bệnh thối gốc và lở cổ rễ ở ^ ^ c à chua và cây
đậu đỗ.
Sau khi đã xử lý hạt cà chua và đậu đỗ đã nhiễm Fusarium oxyspomm
bằng dịch nuôi cấy hai chủng QN - 29 và ĐN - 110 cho thấy có hiệu quả rõ
rệt, giảm hẳn tỷ lệ mác bệnh ở cây con, không gây dị ứng ở cây con. Đối với
cây cà chua con chủng QN - 29 đã làm giảm từ 50% xuống còn 30% cây bị
bệnh, chủng ĐN - 110 làm giảm từ 50% xuống 32%. Đối với cây đậu đỗ
chủng QN - 29 làm giảm từ 65% xuống 38%, chủng ĐN - 110 làm giảm từ
65% xuống 40%.
“ Khả năng diệt nấm gây bệnh héo rũ mốc đen ở lạc.
Việc xử lý hạt giống đã nhiễm nấm Aspergillus niger bằng dịch nuôi
cấy hai chủng QN - 29 và ĐN - 110 cho thấy có hiệu quả, giảm tỷ lệ mắc
bệnh ỏ cây con. Đối với chủng QN - 29 làm giảm từ 45% xuống còn 25%,
chủng ĐN - 110 làm giảm từ 45% còn 25%.
Tóm lại, có thể dùng dịch kháng sinh thô của các chủng xạ khuẩn tuyển
chọn để xử lý một số hạt giống, vừa có tác dụng làm giảm tỷ lệ mắc bệnh ở
cây con, vừa không ảnh hưởng đến sự nảy mâm lại làm cho môi trường đồng
ruộng ngày càng sạch hcfn.
PHẦN 2. THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU:
2.1.1. Giống xạ khuẩn.
Giống xạ khuẩn Strepomyces 46.336 do bộ môn Vi sinh - Sinh học

Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật kiểm định
Do bộ môn Vi sinh ~ Sinh học cung cấp.
Vi khuẩn G(-) Vi khuẩn G(+)
Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus cereus ATCC 9946
Proteus mỉrabiỉis BV 108 Bacillus pumilus ATCC 10241
Pseudomonas aeruginosa VM 201 Bacillus subtiỉis ATCC 6633
Salmonella typhi DT 220
Sard na ỉutea ATCC 9341
Shigella flexneri DT 112
Staphylococcus aureus ATCC 1228
2,1,3. Các môi trường nuôi cấy.
* Các mòi trường sử dụng nuòi cấy vi sinh vật kiểm định: Tiệt trùng bằng
hơi niĩứa ò 118”C/ 30 phút.
\ ^ à n h Phần
NaQ CaO Thịt Pepton
Thạch
pH
m t \ .
(%) (%) (%)
(%)
Canh Thang 0,5 0,3 0,5
-
7,0 - 7,4
Thạch thường 0,5 0,3 0,5
1,8
7,0 - 7,4
* Các mòi trường nuôi cấy xạ khuẩn:
Thành phần

MTl MT2
MT3 MT4 MT5
MT6 MT7
Tinh bột
2 2
2,4 2
Lactose
3
Glucose
2 1
Cao ngô 0,5
0,5
Saccarose
3
Bột đậu tưcíng
1,5
Cao thịt
0,3
Pepton
0,3
KNO3
0,1
KCl
0,05
NaNƠ3 0,2
(NH4)2N03 0,2 0,2
CaCOj 0,3 0,4 0,4
0,2
(NH4)2S04 0,2
FeSO^THp 0,001

K2HPO4 0,05
0,1 0,1
0,05
MgS04.7H20 0,05 0,05 0,25 0,15
NaCl
0,05
0,1
0,5
Cao nấm men 0,5
Thạch
1,8
2 2 2 2 2
1,8
Nước 100 100 100 100 100
100 100
pH 6,8 - 7,4
* Chú thích :
+ Đcfn vị tính theo gam.
+ Tiệt trùng MT bằng hơi muởc ò 118°C/30 phút,
* Các môi trường lên men (MTdd); có thành phần tương ứng MT nuôi cấy
xạ khuẩn nhưng bỏ thạch.
* Các môi trường phân loại theo ISP ( ký hiệu từ MT ISPl - ISP9).
> Muối vi lượng: FeSO^. 7H2O o.lg; ZnSO^. 7 H2O 04g; MnCIj. 4H2O,
nước cất vừa đủ lOOml; pH= 7,0 - 7,2.
> ISP 1: Trypton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất lOOOml;
pH = 7,0 - 7,2.
> ISP2; Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,Og; glucose 4,0g; thạch
20,Og; nước cất vừa đủ lOOOml; pH = 7,3-
> ISP3: Bột mì 20,Og; dung dịch muối vi lượng l,Oml; thạch 18,Og; nước
cất vừa đủ lOOOml; pH = 7,2.

> IS P 4: Tinh bột 10,Og; K2HPO4 l,Og; MgS04. 7H2O l,Og; Nacl l,Og;
(NH4)2S04 2,0g; CaCOj 2,0g; dung dịch muối vi lượng l,Oml; thạch 20,Og;
nước cất vừa đủ lOOOml; pH = 7,0 -7,4.
> ISP5: L - asparagin l,Og; Glycerin 10,Og; K2HPO4 l,Og; dung dịch
muối vi lượng l,Oml; thạch 20g; nước cất lOOOml; pH = 7,0 -7,4.
y ISP6 : Dung dịch A 36,0g; cao nấm men l,Og, thạch 15,0g, nước cất
vừa đủ lOOOml; pH = 7,0 - 7,2.
+ Dung địch A: pepton 20g; sắt amonicitrat 0,5g; Na2S203 0,08g;
K2HPO4 l,Og; nước cất vừa đủ lOOOml;
> ISP7: Glycerin 15,Og; L - tyrosin 0,5g; L - asparagin l,Og; K2HPO4
0,5g; MgS04 7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04 0,0Ig; dung dịch muối vi lượng
l,Oml; thạch 20g, nước cất vừa đủ lOOOml; pH = 7,2 - 7,4.
^oỊxoỊo^
> ISP9:
+ Các nguồn đường đã tiệt trùng bằng phương pháp tyndal (A). ^
1. D-Glucose 4. D-Manitol 7. Raffinose
2. Inositol 5. D-Fructose 8 . Rhamnose
3. D-Xylose 6 . L-Arabinose 9. Saccarose
+ Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B):
CUSO4. 5 H2O 0,64g; FeS0 4 , VHjO 0,1 Ig; M nCls^Hp 0,79g;
ZnS0 4 .7 H2 0 0,15g; nước cất lOOOml.
+ Môi trường thạch muối khoáng (C).
(NH4)2SƠ4 2,64g; KH2PO4 2,38g; K2HPO4.3H2O 5,65g; MgS0 4 .
7 H2O l,Og; dung địch muối B l,Og; thạch 18g; nước cất vừa đủ lOOOml;
pH = 6,8-7,0.
+ Khử trùng môi trường (C) để nguội tới 60°c thì cho lần lượt các
nguồn đường (A) đã tiệt trùng vào sao cho nồng độ đường trong môi
trường đạt 1%.
2.1.3 Dụng cụ và hoá chất.
❖ Máy móc thiết bị:

- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng u v (Ji = 254nm) nguồn phát
Toshiba 60w, điện thế 220V.
- Máy lắc Taitec Bio - Shaker BR 300LF.
- Tủ ấm Trung Quốc 30"c, 37"c, tủ ấm Đức.
- Tủ lạnh.
- Cân kỹ thuật SCALTEC, PRECISA.
- Tủ cấy AURA VF 48, BASSAIRE, SANYO CLEANBENCH.
- Tủ sấy SHALLAB MODEL 1350 FX.
- Máy li tâm ROTOFIX 32.
Nồi hấp vô trùng HICLAVE HVE-25, NEWCLAVE MODEL
HL.
- Thước kẹp Paniier độ chính xác 0,02mm.
(^p^ị):ác loại, ống đong, cốc có mỏ các loại, ống nghiệm, đĩa petri,
bình nón các loại, đũa thuỷ tinh
Các dung mồi đã sử dụng:
Dung môi
Khối lượng riêng
Đ (g/mỉ)
Nhiệt độ sôi (T’s)
Methanol 0,791 -0,793 64,5
Ethylacetat 0,902 77
Ethanol
0,789 - 0,791
78,3
Dimethylformamid 0,95 153
Diclomethan 1,32 40
Cloroform 1,470- 1,480 6 0 -6 2
Butylacetat 0,880 - 0,885 117-118
n - Butonol 0,81 116- 118
Aceton 0,79 56

Propanol 0,802 - 0,806 97
Triethylamin 0,727 90
*> Vật liệu dùng trong sác ký:
- Bản mỏng sắc kỷ Silicagel 60 P254-
- Dung môi chạy sắc ký: sử dụng các dung môi trong bảng trên.
- Bình chạy sắc ký.
- Thuốc thử hiện màu: Dung dịch Ninhydrin 1% trong cồn.