Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ĩỉí;ỉ< :ỉíĩíí^ĩỉí;ỉí:íí> fí:íí:íí; ỉí: í:;íc ;ỉí; fí:íí> !í^* ;ỉí/^
NGÔ THANH THƯỶ
NGHIÊN CỨU DỊNH LƯỢNG DỒNG THỜI CLOTRIMAZOL VÀ
METRONIDAZOL TRONG VIÊN ĐẶT APHANETEN
BẰNG PHƯ0NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001 - 2005)
Người hướng dẫn: PGS.TS THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS THÁI DUY THÌN
Nơi thực hiện: PHÒNG HOÁ LÝ I - VIỆN KIỂM n g h iệ m
Thời gian thực hiện: 8/2004 ĐÊN 5/2005
HÀ NÔI 5 - 2005 \ ^
Ị
■ V'.' 1^ ' "■ >
y f l w
Nó''Oc^
LỜI CÁM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý I - Viện
Kiểm nghiệm Bộ Y tế và Bộ môn Hoá dược - Trường đại học Dược - Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp
đỡ tận tình của các thầy, cô hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn Hoá dược
và các cán bộ của phòng Hoá lý I Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế.
Tôi xin chân thành cám ơn sự hưófng dẫn chỉ bảo tận tình của;
- Tiến sĩ: Thái Duy Thìn - Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược - Trường đại
học Dược - Hà Nội
- Phó giáo sư - Tiến sĩ; Thái Phan Quỳnh Như - Trưởng phòng Hoá lý I -
Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế
Đã giúp đỡ tôi những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực
hành khóa luận.
Tôi xin cám ơn sự giũp đỡ của các thầy, các cô, các kỹ thuật viên trong

bộ môn Hoá dược và các cán bộ phòng Hoá lý I Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế.
Đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp của mình.
Tôi xin cám 0fn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo nhà trưòng
và các thầy giáo, cô giáo đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian
tôi học tập tại trường.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn với gia đình, bạn bè và những người luôn sát cánh
bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.
Sinh viên
Ngô Thanh Thuỷ
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1- TỔNG QUAN 3
1.1- Clotrimazol 3
1.1.1- Đại cương 3
1.1.2- Các phương pháp định lượng 3
1.1.3- Tác dụng dược lý 4
1.2- Metronidazol 5
1.2.1- Đại cương 5
1.2.2- Các phương pháp định lượng 5
1.2.3- Tác dụng dược lý 6
1.3- Các phưoìig pháp định lượng clotrimazol, metronidazol trong chê
phẩm hỗn hợp 7
1.3-1- Định lượng Clotrimazol 7
1.3-2- Định lượng Metronidazol
7
1.3-3- Nhận x ét 8
1.4- Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao 8
1.4.1- Khái niệm 8
1.4.2- Các đại lượng đặc trưng 9

1.4.3-Hệ thống HPLC 12
1.4.4- Pha tính trong HPLC 13
1.4.5- Pha động trong HPLC

1.4.6- Cách đánh giá pic 17
1.4.7- Cách tính kết quả
1 ^
PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

.
19
2 .1- Đối tượng nghiên cứu 19
2.2- Thiết bị và hoá chất
19
2.2.1- Hoá chất 19
2.2.2- Thiết bị, dụng c ụ 19
2.3- Nội dung, phương pháp nghiên cứu
20
2 .3 .1- Nội dung 20
2.3.2- Phương pháp nghiên cứu
20
2.3.3- Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tích 20
2.3.4- Cách đánh giá kết quả 21
PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
22
3.1- Xây dựng điều kiện sác ký để định lượng đồng thời clotrimazol và
metronidazol 22
3.1.1- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý
26

3.1.2- Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp

27
3.1.3- Khảo sát độ chính xác của phưofng pháp 30
3.1.4- Khảo sát độ đúng của phương pháp
34
3.1.5- Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

37
3.2- ứng dụng định lượng chê phẩm "Aphaneten" do xí nghiệp dưực phẩm
120 sản xuất đã và đang lưu hành 39
3.3- Bàn luận về kết quả 41
KẾT LUẬN 43
TÀI LIÊU THAM KHẢO
ĐẬT VẤN ĐỀ
Trong xu hướng sản xuất thuốc đa thành phần nhằm phối hợp tác dụng
dược lý của các dược chất người ta đã sản xuất thuốc viên nén đặt trong phụ
khoa gồm clotrimazol phối hợp với metronidazol. Trong đó:
Clotrimazol là một loại thuốe chống nấm phổ rộng, do ức chế các enzym
chuyển hoá màng tế bào nấm [1].
Metronidazol là một loại thuốc có tác dụng rất mạnh trong điều trị nhiễm
động vật nguyên sinh như:
Trichomonas vaginalis, Trichomonas buccalis, Trichomonas intestinalis.
Trichomonas là loại động vật đơn bào, thuộc lớp trùng roi sống ở âm đạo
gây viêm âm đạo, âm hộ. Thuốc có tác dụng chọn lọc trên thể đã gây bệnh,
còn ít có tác dụng trên thể chưa gây bệnh, do đó cần phải phối hợp với các
thuốc kháng khuẩn khác, để đạt được hiệu quả tối ưu trong điều trị [1].
Do đó viên thuốc hỗn hợp clotrimazol và metronidazol vừa có tác dụng
kháng khuẩn, vừa có tác dụng chống nấm nên thuốc được sử dụng rộng rãi
cho các trường hợp viêm nhiễm tạp khuẩn và nấm trong phụ khoa.

Xí nghiệp Dược phẩm 120 có sản xuất viên nén đặt phụ khoa ở dạng phối
hợp với tên “Aphaneten”.
Khi sản phẩm này ra đời thì vấn đề đặt ra ở đây là phải kiểm tra chất
lượng thành phẩm trước khi thuốc đến tay người dùng. Mặt khác trong các
Dược điển hiện hành [5], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21] chỉ có chuyên
luận viên đơn thành phần chứa clotrimazol hoặc metronidazol, vì vậy để kiểm
tra chất lượng sản phẩm cần nghiên cứu phương pháp định tính và định lượng
hai hợp chất này trong cùng một dạng bào chế.
Ngày nay khoa học kỹ thuật đã phát triển vượt bậc, đã có nhiều thành tựu
được đưa vào ứng dụng và đã mang lại cho chúng ta những phương pháp kiểm
nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao. Một trong những phương pháp đó là sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định
lượng có kết quả, các hợp chất trong nhiều loại thuốc đa thành phần [8 ], [13],
[14],
Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu định lượng đồng thời các hoạt
chất trong viên thuốc đặt phụ khoa “Aphaneten” bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với mục tiêu cụ thể sau:
- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời clotrimazol và
metronidazol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành
Dược một phương pháp kiểm nghiệm ngoài Dược điển nhằm mục đích rút
ngắn thời gian tiến hành định lượng, tăng độ chọn lọc và nâng cao hiệu quả
phân tích.
- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn để tiêu chuẩn hoá thuốc mới trước khi
đưa ra thị trường.
- Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để kiểm nghiệm nhanh và chính
xác một số thuốc có thành phần tưcmg tự như trên đang lưu hành trên thị
trường.
PHẦN 1 - TỔNG QUAN
1.1- CLOTRIMAZOL

1.1.1- Đại cương: [1]
* Công thức:
/ \
^C1
c
/ \
-N
C,2Hi7CIN,
Ptl: 344, 8
* khác: Lotrimin; Gyne-lotrimin; Myclo; Canesten; Mycelex.
* Tên khoa học: l-[(2 -chlorophenyl) diphenylmethyl] - IH- imidazol
* Tính chất:
Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, thực tế không tan trong nước, tan trong
methanol và dicloromethan, khó tan trong ether.
Điểm chảy khoảng 141°c - 145°c.
1.1.2- Các phương pháp định ỉượng:
*Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan:
- Hoà tan clotrimazol trong acid acetic khan. Chuẩn độ bằng acid pecloric
0,1N, xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế. Song
song tiến hành làm mẫu trắng [15], [20]. Hoặc dùng chỉ thị tím tinh thể rồi
chuẩn độ bằng acid pecloric 0,1M đến khi xất hiện mầu xanh [19]. Hoặc dùng
chỉ thị naphtolbenzein rồi chuẩn độ cho đến khi mầu chuyển từ nâu vàng sang
xanh[17], [21].
* Phương pháp HPLC: [16]
- Pha động là hỗn hợp:
Methanol - Dung dịch K2HPO4 (3:1)
(Dung dịch K2HPO4: Hoà tan 4,35g K2HPO4 trong lOOOml nước cất).
- Điều kiện sắc ký:
Cột RP8 có kích thước (250 X 4,6mm; lOịim)
Detector UV: 250nm

Tốc độ dòng: l,5ml/phút
Thể tích tiêm: 20|Lil
1.1.3- Tác dụng dược lý: [2]; [6]
* rác dụng:
Clotrimazol là thuốc kháng nấm phổ rộng, tác dụng trên nhiều loại nấm
gây bệnh, gồm các loại nấm trên bề mặt da, niêm mạc và nấm nội tạng. Ngoài
ra thuốc còn có tác dụng trên vi khuẩn gram (+).
* Cơ chế tác dụng:
Clotrimazol có tác dụng ức chế alphademethylase (enzym tham gia vào
quá trình tổng hợp ergosterol) do đó clotrimazol ngăn cản tổng hợp ergosterol
và lipid của màng tế bào nấm. Kết quả là làm thay đổi tính thấm của màng tế
bào, ức chế chức năng màng và ức chế sự phát triển của nấm. Liều thấp thuốc
có tác dùng kìm nấm, liều cao thì diệt nấm.
1. 2- METRONIDAZOL
1.2.1- Đại cưong: Ị 1 ]; [ 5 ]
* Công thức:
O2N'
C6H9N3O:
CH2 -C H 2 -O H
^ N ^ C H 3
— N
Rl: 171,16
* Tên khác: Flagyl; Klion; Protostat; Metro IV; Novomidazol trikacide.
* Tên khoa học: 1 - (P - hydroxyetyl) - 2 - metyl - 5 - nitroimidazol
* Tính chất:
Tinh thể hay bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vững bền ngoài
không khí, song sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng.
Khó tan trong nước, aceton, dicloromethan và ethanol 96%, rất khó tan
trong ether.
1.2.2- Các phương pháp định lượng:

* Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan:
- Hoà tan metronidazol trong acid acetic khan, chuẩn độ bằng dung dịch
acid pecloric 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo
điện thế [1]; [5]; [18]; [21]. Hoặc dùng chỉ thị naphtobenzein, rồi chuẩn độ
đến khi màu chuyển từ vàng da cam đến xanh[15]; [19]; [20]. Hoặc dùng chỉ
thị malachit xanh, rồi chuẩn độ đến khi xuất hiện màu vàng xanh. Song song
tiến hành làm mẫu trắng [15]; [19]; [20].
* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:
- Hoà tan một lượng metronidazol trong acid hydrocloric 0,1M để được
dung dịch có nồng độ 0,002% metronidazol. Đo độ hấp thụ tử ngoại của dung
dịch trên ở bước sóng 230nm -ỉ- 350nm. Qiỉ có một cực đại hấp thụ ở 277nm
với độ hấp thụ riêng 365 4- 395 và một cực tiểu ở 240 nm [1].
- Định lượng thuốc tiêm metronidazol: [19]
Pha chế phẩm với dung dịch acid hydrocloric loãng để được dung dịch có
nồng độ 12,5|Lig/ml. Đo độ hấp thụ của dung dịch đó ở bước sóng 277nm,
dùng dung dịch acid hydrocloriç loãng làm mẫu trắng. Lấy 377 là giá trị
A(l%, Icm) ở bước sóng 277nm.
- Định lượng thuốc viên nén metronidazol: [5]
Lấy 20 viên và xác định khối lượng trung bình của viên, nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 50mg
metronidazol cho vào bình định mức lOOml thêm khoảng 80ml dung dịch acid
hydrocloric 0,1N lắc kỹ cho phân tán đều, thêm acid hydrocloric 0,1N vừa đủ
đến vạch. Lắc đều, lọc, loại bỏ 20ml dịch lọc đầu. Kút chính xác 2,0ml dịch
lọc cho vào bình định mức lOOml. Thêm dung dịch acid hydrocloric 0,1N vừa
đủ đến vạch, lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở 277nm, dùng
dung dịch acid hydrocloric 0,1N làm mẫu trắng. Lấy 377 là giá trị A (1%,
Icm) ở bước sóng 277nm.
1.2.3- Tác dụng dược lý: [2]; [6]
* rác dụng:
Metronidazol có tác dụng tốt với cả amip trong và ngoài ruột, cả thể cấp

và thể mạn. Với lỵ amip mạn ở ruột, thuốc có tác dụng yếu hơn do ít xâm
nhập vào đại tràng.
Ngoài ra thuốc còn có tác dụng tốt đối với trichomonas vaginalis, giardia,
các vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn gram (-), kể cả barteroid, clostridium,
helicobacter, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn ưa khí.
* Cơ chê tác dụng:
Nhóm nitro của metronidazol bị khử bởi protein vận chuyển electron
hoặc bởi ferredoxiri. Metronidazol dạng khử làm mất cấu trúc xoắn của ADN,
tiêu diệt vi khuẩn và sinh vật đơn bào.
1.3- CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLOTRIMAZOL,
METRONIZOL TRONG CHẾ PHẨM HỖN h ợ p
* Định lượng thuốc đạn clotrimazol, metronidazol và chlohexidine
acetat:
1.3.1 - Định lượng clotrimazol: [19]
Cân 10 viên thuốc đạn, hơ nóng cho chảy rồi trộn đều và để nguội. Cân
chính xác một lượng thuốc đạn (đã chảy lỏng và để nguội ở trên) tương đương
với khoảng 400mg clotrimazol. Thêm 20ml cloroform ấm hoà tan lượng thuốc
đạn trên trong một phễu chiết và lắc đều cho tan hoàn toàn sau đó làm lạnh
đến nhiệt độ phòng. Chiết metronidazol và chlohexidine acetat từ dung dịch
trên 3 lần (40, 20, 20ml) bằng dung dịch acid acetic (1,5M), lọc dịch chiết vào
một bình định mức lOOml, rửa giấy lọc bằng dung dịch acid acetic (1,5M),
gộp dịch rửa và dịch chiết rồi thêm acid acetic (1,5M) đến vạch và trộn đều.
Lọc phần cloroform, rửa phễu chiết và giấy lọc bằng cloroform, gộp dịch
rửa và dịch chiết clorform và dồn vào bình định lượng. Thêm lOml dung dịch
acid acetic, 2 ml dung dịch anhydric acetic, 2 giọt tím tinh thể và định lượng
bằng acid pecloric (0,1M) cho đến khi chuyển sang màu xanh sẫm. Song song
tiến hành làm mẫu trắng.
1.3.2 - Định lượng metronidazol:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng lOOmg metronidazol
chuẩn rồi hoà tan bằng methanol trong bình định mức lOOml. Thêm methanol

đến vạch và trộn đều. Lấy chính xác l,Oml dung dịch sang bình định mức
lOOml khác. Thêm l,Oml dung dịch acid acetic (1,5M) sau đó thêm ethanol
đến vạch và trộn đều.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu: Lấy chính xác 10,0ml dung dịch nước thu
được ở phần định lượng clotrimazol vào một bình định mức 50ml. Thêm dung
dịch acid acelic (1,5M) cho đến vạch và trộn đều. Lấy chính xác l,Oml dung
dịch thu được và chuyển vào bình định mức lOOml khác. Thêm ethanol đến
vạch và trộn đều.
- Chuẩn độ: Đo độ hấp thụ tử ngoại của hai dung dịch mẫu và dung dịch
chuẩn ở bước sóng 312nm, dùng hỗn hợp dung dịch acid acetic (1,5M) -
ethanol (1/100) làm mẫu trắng. Tính nồng độ của metronidazol dựa vào độ
hấp thụ tử ngoại.
1.3.3- Nhận xét:
Quy trình định lượng clotrimazol và metronidazol trong chế phẩm hỗn
hợp (đã trình bày ở phần 1.3.1 và phần 1.3.2), phải qua quá trình chiết tách rất
phức tạp nên rất dễ mắc phải sai số. Do đó việc nghiên cứu một phương pháp
định lượng các hoạt chất trong thuốc hỗn hợp được thuận tiện hơn, không phải
chiết tách qua nhiều công đoạn phức tạp, tránh được sai số là việc hết sức
quan trọng và cần thiết.
1.4- PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC): [3];
[4]; [7]; [10]; [11]; [12]
1.4.1- Khái niệm:
Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý dùng để tách và
định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các
chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong
cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải), pha động cùng với mẫu
thử được bơm qua cột dưới áp suất cao và các chất phân tích di chuyển theo
pha động qua cột dưới tốc độ khác nhau tuỳ theo ái lực của chúng với 2 pha
dẫn đến sự tách ra của các chất. Sự lách này đạt được là do quá trình phân bố,
hấp thụ hoặc trao đổi ion của các chất tiêm khác nhau về cấu trúc hoá học và

tính chất. Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột, được nhận biết bởi bộ
phận phát hiện gọi là detector. Tuỳ theo bản chất của các chất phân tích mà sử
dụng detector thích hợp. Detector hay được sử dụng nhất là detector uv. Sau
một qúa trình sắc ký ta thu được một sắc ký đồ, sắc ký đồ phản ánh quá trình
tách sắc ký ở trong cột tốt hay không. Trong quá trình sắc ký chất nào được
lưu giữ mạnh nhất trong pha tĩnh sẽ được pha động rửa giải ra khỏi cột sau
cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên. Thời gian
chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh
cũng như tính chất hoá lý của chất tan.
1.4.2- Các đại lượng đặc trưng:
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và
ghi thành sắc ký đồ.
signal
Component 1
Component 2
Hình 1.1: Các đại lượng đặc trưng trên sắc ký đồ
trong phép định lượng bằng HPLC.
*t* Thời 2Ìan lưu t¡i (phút) (Retention time):
Là thời gian từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh
của pic (thời gian lưu đặc trưng cho một chất). So sánh thời gian lưu của mẫu
thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện sẽ định tính được chất đó.
+ Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động
Ír ~ ^0 (dung dịch) ( 1 + K ) (1)
Trong một phép phân tích nếu ír nhỏ quá thì sự tách kém, còn Ir quá
lớn (Ir > 2 0 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài.
Để thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố

trong các yếu tố phụ thuộc trên đây.
- Diện tích pic: thể hiện lượng chất tan được tiêm vào cột (dùng để xác
định hàm lượng). Khi so sánh diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn làm
trong cùng điều kiện ta sẽ xác định được hàm lượng hoạt chất mẫu thử.
Hê số dune lươnư K' (Capacity factor):
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
= k . 1 (2 )
^0 ^0
Nếu K' nhỏ thì Ir cũng nhỏ và sự tách kém, K' lớn thì pic bị doãng, độ
nhậy kém. Trong thực tế K' từ 1 đến 5 là thích hợp.
♦> Đô chon loe a (Selectivity):
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A,
B có K \ và K'b khác nhau thì mới có khả năng tách, mírc độ tách biểu thị ớ dộ
chọn lọc a ;
a =
E l
(3)
B *^RA '0
a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng.
❖ Hê sô phán bố K:
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi hệ số phân
bố, nó được tính theo công thức:
c.
(4)
Trong đó Cg, C|^ lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
♦> Sô đĩa lý thuết (N) và chiều cao của đĩa (H):
Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: Số đĩa lý thuyêì và

chiều cao đĩa lý thuyết. Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ơ mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới.
Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H. Ta có
thể tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:
(5)
Trong đó: Chiều rộng pic ở đáy pic
W|^2- Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh
2
N= 16
= 5,54
w
_ B _
w
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý ihuyêt
được tính bằng công thức:
L
H =
N
(6)
❖ Đô phân siải (Rs):
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên
một điều kiện sắc ký đã cho:
t„ o - t .
Rs =
-R.B -R.A _ Khoảng cách giữa hai pic
1/ r +\Y 1 Đô rông trung bình của hai pic
/ 0 1 B A J
❖ Hê sô đôi xứns (T):
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức;
T =

2A
(8)
Trong đó : Wx: Độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
A: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic
đến chân đường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic
Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp nliậii
được.
1.4.3- Hệ thống HPLC:
Theo thứ tự từ đầu đến cuối hệ thống, có các bộ phận chính như sau:
+ Bình chứa dung môi
+ Bơm cao áp, đẩy pha động qua cột sắc ký
+ Van bơm mẫu, boìn vào cột một thế tích mẫu nhất định
+ Cột tách
+ Detector
+ Máy ghi sắc ký hoặc máy vi tính
1.4.4- Pha tĩnh trong HPLC:
Cũng như sắc ký cột ở áp xuất thường, pha tĩnh (Stationenary phasc)
trong HPLC chính' là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chát
phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rấl nhỏ đường kính cỡ
hạt từ 3 lOịim, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 -4- 500mVg-
* Phán loại pha tình :
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.
Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong
kỹ thuật tách HPLC .
- Căn cứ vào trạng thái là rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm hai loại;
Nếu pha tĩnh là chất rắn, người ta có sắc ký lỏng rắn LSC (Liquid solid
chromatography), nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ngưòi ta có sắc ký lỏng lỏng
LLC (Liquid liquid chromatography).
- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại; sắc ký

pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Xét về cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có hai kiểu
xốp: Xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).
* Điều kiện đối với một pha tĩnh :
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong diều
kiện sắc ký nhất định
- Tính chất bề mặt phải ổn định
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất
* Chế tạo pha ãnh. Pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
- Pha tĩnh trên nền silicagel
- Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm
- Pha tĩnh trên nền mạch carbon
Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền silicagel là ưu việt hơn và được
sử dụng nhiều nhất.
* Pha tĩnh trên nền silicagel:
- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký pha thuận. Loại này trên bề mặt
của nó có chứa các nhóm -OH. Đó là các nhóm hoạt động có tính chất phân
cực và ái nước. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực
và ít phân cực. Pha động của loại này là những chất không phân cực hoặc ít
phân cực. Với loại pha tĩnh này, nước có ảnh hưởng nhiều đến bề mặt hoạt
động của chúng (tức là các nhóm -OH ái nước). Chính yếu tố này làm ảnh
hưởng đến độ lặp lại của quá trình tách sắc ký.
- Silicagel đã alkyl hoá: Được sử dụng cho sắc ký pha đảo. Nhóm -OH
của silicagel trung tính được alkyl hoá bằng các gốc alkyl của mạch carbon
thẳng hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl.ơiính vì bị thế mất nhóm
-OH nên bề mặt của chất nhồi loại này không phân cực hay ít phân cực. Loại
chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất
phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion. Pha động cho loại này là chất hữu cơ

phân cực như methanol, acetonitril hay nước hoặc là hỗn hợp của các chất
này với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Pha tĩnh loại này kỵ nước, nghĩa là
bề mặt hoạt động của nó không bị ảnh hưởng của các phân tử nước, mà trái lại
nước là một thành phần của dung môi rửa giải có ý nghĩa thực tế lớn. Sự tách
các chất nhồi loại này có độ lặp lại tốt hofn. Do đó loại này được ứng dụng
nhiều hơn loại silicagel trung tính.
- Silicagel đã được sunfonic hoá hay nitro hoá: Được sử dụng cho sắc ký
trao đổi ion (cation). Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitro hoá các
silicagel trung tính để thay các nhóm -OH trên bề mặt silicagel trung tính
bằng các nhóm -SO3H hay -NOjH. Các nhóm chức này có ion có thể trao
đổi được với các cation kim loại khác. Đây là các pha tĩnh trao đổi các cation
mạnh, còn nếu thay thế nhóm -OH bằng nhóm -R-COOH thì ta có loại pha
tĩnh trao đổi cation acid yếu. Pha tĩnh loại này được dùng để tách các chất có
cấu tạo ion như ion các kim loại và hợp chất của chúng, hay các chất khi tan
trong pha động thì phân ly thành ion như các acid, base. Pha động sử dụng
trong loại sắc ký này là các dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm,
chất tạo phức, dung dịch acid hay base, hoặc có thể có các chất hữu cơ tan
trong nước.
- Các silicagel được amin hoá: Được sử dụng cho sắc ký trao đổi anion.
Các silicagel này được chế tạo bằng cách thay thế nhóm -OH bằng các nhóm
-NH2; -NH; -NR2; -NR3; -CH.JOH). Pha tĩnh loại này sử dụng để tách các
anion trong hợp chất có cấu trúc ion hay các chất khi tan trong pha động thì
phân ly thành các ion như các base, acid. Pha động của loại này cũng giống
như trên.
1.4.5- Pha động trong HPLC:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất cần phân tích)
ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố hết sức
linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc có thể là một
hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Nó
cũng có thể là dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức Nói

chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu
quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất tách
sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và
hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến:
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thời gian lưu giữ của chất tan
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh
- Độ rộng của pic sắc ký
• Trong HPLC pha động phải thoả mãn một sô điều kiện sau :
- Trơ đối với pha tĩnh
- Hoà tan được chất cần phân tích
- Bền vững theo thời gian
- Có độ tinh khiết cao
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp với loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân
tích
- Có tính kinh tế, dễ kiếm
• Trong sắc ký pha thuận :
Pha động phải là các dung môi hữu cơ không phân cực hoặc ít phân cực
như n-hexan, n-heptan, cloroform, tetraclorcarbon Trong quá trình chạy sắc
ký, để cho quá trình tách được ổn định độ lặp lại cao, phải bão hoà pha động
trước khi chạy sắc ký bằng nước.
• Trong sắc ký pha đảo :
Pha động là hệ dung môi phân cực, là những dung môi đồng tan với nước,
có khi nước lại là thành phần chính trong pha động ví dụ như methanol,
acetonitril Ta có thể tạo ra những pha động có độ phân cực khác nhau bằng
cách thêm vào đó những tỷ lệ nước nhất định, do đó hệ pha này trở nên linh
động và được ứng dụng nhiều. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, thành phần

pha động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký,
chất tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng trong
sắc ký cặp ion.
• Trong sắc ký trao đổi ỉon:
Pha động là dung dịch nước của các acid hay base, hoặc là dung dịch
nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có chứa chất đệm pH, chất tạo
cặp ion, chất tạo phức. Trong loại sắc ký này thì pH pha động và chất tạo
phức có ý nghĩa rất lớn. Trong sắc ký cặp ion, pha động vẫn sử dụng nước và
methanol là dung môi chính thêm vào đó chất chứa ion tạo cặp, chất đệm pH,
chất tạo phức.
* Có 4 yếu tố quan trọng cần chú ý trong lựa chọn pha động'.
- Bản chất của dung môi để pha chế pha động
- Thành phần các chất tạo ra pha động
- Tốc độ của pha động
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và cặp ion)
1. 4.6- Cách đánh giá pic:
* Đánh giá điện tích pỉc:
Diện tích pic của một chất là tương ứng với tổng lượng chất đó. Để tính
diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với
máy vi tính (sai số khoảng 0,5%) hoặc máy tích phân cơ học (sai số khoảng
1,3%)- Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và
cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và cuối của pic
được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với nồng độ trung bình, vừa và
cao.
* Đánh giá chiều cao pic:
Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền
và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể được
dùng để đánh giá sắc phổ. Một điều kiện để áp dụng cho việc đánh giá bằng
chiều cao pic là các chỉ số K hằng định.
Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều cao

pic sẽ dễ dàng hơn và chính xác hơii việc xác định diện tích pic.
I a /C ' ^ ' \
j Ahĩó^.
1.4.7- Cách tính kết quả:
* Phương pháp ngoại chuẩn :
Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử được phân
tích trong cùng điều kiện. Kếl quả của chất chưa biết được tính toán so với
mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
* Phương pháp nội chuẩn:
Là phươrig pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất
không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần thời gian
lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được tách hoàn toàn và có nồng
độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc hoá học tưoỉng ứng.
* Phương pháp thêm:
Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của
các chất phụ (ví dụ: Tá dược). Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác
định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử
thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký.
1.4.8- Nhận xét:
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được ứng dụng rộng rãi trong
việc định lượng các thuốc đơn thành phần cũng như đa thành phần. Phương
pháp này có độ chính xác và độ nhạy cao, tốn ít mẫu, có tính đặc hiệu, thực
hiện tương đối nhanh và thuận tiện, đặc biệt là định lượng đồng thời được các
thành phần trong hỗn hợp mà không qua quá trình chiết tách, có thể thực hiện
được ở những cơ sở kiểm nghiệm đã được trang bị máy HPLC.
Với những ưu điểm của phương pháp HPLC và những nhược điểm của
các phương pháp khác trong việc định lượng thuốc đa thành phần như đã nêu ở
mục 1.3. Chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời
clotrimazol và metrimazol bằng phương pháp HPLC.
PHẦN 2

NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1- ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN cứ u
Mẫu viên nén Aphaneten do xí nghiệp dược phẩm 120 sản xuất
Mẫu M,: SKS : 050804 - HD : 08-2006
Mẫu SKS : 060804 - HD ; 08-2006
* Công thức:
Clotrimazol 100 mg
Metronidazol 200 mg
Tá dược (gồm lactose, avicel, magnesi stearat, polyvidon, ethanol 96%)
vừa đủ một viên.
2.2- THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT
2.2.1- Hoá chất:
* Các chất chuẩn do viện kiểm nghiệm cung cấp:
- Clotrimazol 99, 59%, độ ẩm 0, 29%
- Metronidazol 99,3%
* Các hoá chất và dung môi khác:
- Methanol loại dùng cho HPLC
- Dikali hydrophosphat loại tinh khiết phân tích
- Nước cất loại dùng cho HPLC
2. 2.2- Thiết bị dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPl 100 với detector u v, cột
Lichrosorb RP 8 (250 X 4mm, 10|a,m).
- Máy lắc siêu âm
- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45|Lim
- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,1 mg
- Máy quang phổ UV-VIS Perkin Enmer và Lambda EZ 210
- Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác: Bình định mức, pipet, ống đong .
2.3- NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.3.1- Nội dung:

* Khảo sát các điều kiện sắc ký:
Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời
clotrimazol và metronidazol trong thuốc hỗn hợp bao gồm;
- Chọn cột sắc ký
- Chọn pha động (thành phần, tỷ lệ)
- Detector UV, chọn bước sóng đo
- Tốc độ dòng
- Thể tích tiêm
- Cách xử lý mẫu
*- Đánh giá phương pháp:
- Tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- Xác định độ tuyên tính giữa nồng độ và diện tích pic
- Xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp
-Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
2.3.2- Phương pháp nghiên cứu:
- Phương pháp thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách 2
chất được tốt nhất, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả
- Phương pháp cụ thể: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
2.3.3- Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tích:
- Giá tri Trung bình: x=^.Vx. (10)
n t t