Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ĐỖ LAN PHƯƠNG
XÂY Dự^ỊG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
AMOXICILLIN VÀ
KALICLAVULANAT TRONG HUYÊT TƯƠNG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC
KHOÁ 2000- 2005
Người hướng dẫn: PGS - TS. TRẦN t ủ a n
Th.s. TRẦN NGUYÊN HÀ
Nơi thực hiện: BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
Thời gian thực hiện: 1/2005 - 5/2005
HÀ NÔI THÁNG 5 - 2005 V'
________^ ^ <■/
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS- TS Trần Tử An,
Th.s . Trần Nguyên Hà, Th.s. Nguyễn Thị Kiều Anh là những người đã trực
tiếp hướng dẫn, đã dành nhiều thời gian và tâm sức, kinh phí giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuậl viên Irong
bộ môn Hoá Phân Tích - Trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ của phòng Vậl lý II, phòng Hoá lý
II- Viện Kiểm Nghiệm đã giúp đỡ về hoá chất cho tôi trong quá trình thực hiện
đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội đã cung
cấp những tài liệu cần thiết cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên
và hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2005

Đỗ Lan Phương
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
Amox
: Amoxicillin
c
: Nồng độ
Clav
: Kali clavulanat
DAD
: Diode array detector
ESI
: Electrospray ionization
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
MeCN
: Acetonitril
MeOH
: Methanol
MSD
: Mass spectrometric detector
NXB
: Nhà xuất bản
PA
: Tinh khiết phân tích
PL
: Phụ lục
s,.
; Diện tích
STT
: Số thứ tự

TB
: Trung bình
THF
: Tetrahydrofuran
UV-VIS : Tử ngoại- khả kiến
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cương về amoxicillin trihydrat 3
1.1.1. Cấu trúc hoá học của amoxicillin trihydrat 3
1.1.2. Tính chất hoá lý 3
1.2. Đại cương về kali clavulanat
3
1.2.1. Cấu trúc hoá học của kali clavulanat
3
1.2.2. Tính chất hoá lý của kali clavulanat 4
1.3. Đại cương về dạng kết hợp amoxicillin và clavulanat 4
1.3.1. Dược lý và cơ chế tác dụng 4
1.3.2. Dược động học 5
1.3.3. Chỉ định 5
1.3.4. Chống chỉ định 6
1.3.5. Liều lượng 6
1.3.6. Dạng bào chế 6
1.4. Các phương pháp đã được áp dụng để định lượng amoxicillin và kali
clavulanat trong huyết tương 7
1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7
1.4.2. Nhận xét và lựa chọn 10
1.5. Phương pháp HPLC

.

10
1.5.1. Nguyên tắc phương pháp HPLC 10
1.5.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký HPLC

11
1.5.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc k ý 12
1.5.4. Pha tĩnh trong HPLC 14
1.5.5. Pha động trong HPLC
15
1.5.6. Cách đánh giá pic 16
1.5.7. Cách tính kết quả
.
17
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

18
2.1. Đối tượng, hoá chất, thiết b ị 18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18
2.1.2. Phương tiện, dụng cụ, hoá chất 18
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1. Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật 19
2.2.2. Thẩm định phương pháp 20
2.2.3. Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả

20
2.3. Kết quả thực nghiệm 20
2.3.1. Chiết amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương

20
2.3.2. Xác định điều kiện sắc ký định lượng amoxicillin và kali

clavulanat trong huyết tương 23
2.3.3.Thẩm định phương pháp 24
2.3.4. Phân tích Amoxicillin và Kali clavulanat trong huyết tương người
tình nguyện 30
2.4. Bàn luận 31
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 33
3.1. Kết luận 33
3.2. Đề xuất 34
ĐẶT VÂN ĐỂ
Song song với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và ngành công nghệ
dược phẩm, lĩnh vực phân tích phục vụ cho công tác đảm bảo chất lượng thuốc
cũng không ngừng lớn mạnh. Phương pháp phân tích định lượng thuốc và các
chất chuyển hoá trong dịch sinh học có vai trò quyết định trong đánh giá
tương đương sinh học của thuốc nhằm đánh giá chất lượng thuốc nghiên cứu
về mặt chất lượng, hiệu quả và an toàn phục vụ cho xét duyệt thuốc và khả
năng thay thế các chế phẩm phát minh.
Hiện nay ở Việt Nam chưa có văn bản chính thức đánh giá tương
đương sinh học đối với các chế phẩm sản xuất trong nước, trong hồ sơ đăng
ký thuốc chưa có yêu cầu cung cấp kết quả nghiên cứu về tương đương sinh
học. Bên cạnh đó để ngành Dược Việt Nam phát triển và hội nhập với các
nước trong khu vực và trên thế giới, thuốc sản xuất ở Việt Nam phải đạt chất
lượng tốt để có thể xuất khẩu ra nước ngoài. Vì vậy triển khai nghiên cứu
tương đương sinh học của thuốc có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế quản
lý thuốc ở nước ta hiện nay.
Chế phẩm thuốc kết hợp hai thành phần (amoxicillin và kali clavulanat)
đã và đang được sử dụng phổ biến ở Việt Nam dưới nhiều dạng chế phẩm như
viên nén, viên phân tán, viên nhai, bột pha tiêm hoặc truyền tĩnh mạch, bột
pha dung dịch treo để uống. Để nghiên cứu chất lượng thuốc có kết hợp hai
thành phần trên sản xuất ở Việt Nam cần phải có đánh giá so sánh với chế
phẩm nhập ngoại, vì lý do đó chúng tôi chọn đề tài:

“Xây dựng phưotig pháp định lượng amoxicillin và kali clavulanat
trong huyết tương”
Đề tài này nhằm mục tiêu:
> Xây dựng qui trình kỹ thuật định lượng hai thành phần
amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương phục vụ đánh giá tương
đương sinh học của chế phẩm Vigentin 625mg do Xí nghiệp Dược phẩm
Trung ương 1 sản xuất so với biệt dược nước ngoài Augmentin
(GlaxoSmithKline) có cùng hoạt chất và dạng bào chế.
Chúng tôi hi vọng rằng kết quả nghiên cứu này sẽ có giá trị thực tiễn
cao, góp phần vào việc thúc đẩy ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để định
lượng các chất trong dịch sinh học nhằm phục vụ cho đánh giá tương đương
sinh học của thuốc cũng như cá thể hoá điều trị.
PH Ầ N l
TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về amoxicillin trihydrat
1.1.1. Cấu trúc hoá học của amoxicillin trihydrat [2], [9], [10], [18]
. 3 H2O
y ✓
/ ✓
Ễ ^
boO H
Công thức phân tử: C16HJ9N3O5S . 3H2O
Phân tử lượng: 419,4.
Tên khoa học : acid (6R) - 6 - (a- D- 4- Hydroxyphenyl glycylamino)
penicilanic trihydrat.
1.1.2. Tính ch ấthoálý
Là kháng sinh nhóm penicilin tồn tại dưới dạng bột kết tinh trắng hoặc
gần như trắng. Khó tan trong nước và trong ethanol 96%, thực tế không tan
trong chloroform, ether và các dầu béo. Tan được trong các dung dịch acid
loãng và dung dịch hydroxyd kiềm loãng.

Bảo quản trong lọ kín ở nhiệt độ không quá 30°c.
1.2. Đại cương về kali clavulanat
1.2.1. Cấu trúc hoá học của kali clavulanat [2], [9], [10], [18]
H H
o
'(X JDH2OH
-N _ ^ ^
H COOK
Công thức phân tử: CgHgNOgK. Phân tử lượng: 237.3
Tên khoa học: Muối mono kali của 3-(2- hydroethyliden)-7-oxo-[2R(2a,
3z, 5a) - 4-oxa-]-aza bicyclo [3, 2 ,0 ] heptan - 2 - Carboxylic.
1.2.2. Tính chất hoá lý của kali clavulanat [10], [16], [17]
Tồn tại dưới dạng tinh thể trắng, tan tốt trong nước, hơi tan trong alcohol,
rất ít tan trong aceton.
Kali clavulanat phản ứng với Imidazol theo phản ứng sau;
.CH2OH
J \ l

C-CHFCH-N—CH2- C -C H 2CH2OH
% , ỵ \ ỳ "
0 H 0
l-(8- hydroxy-6-oxo-4-azaoct-2-enoyl)- imidazol
Bảo quản trong lọ kín ở nhiệt độ không quá 30°c.
1.3. Đại cương vê dạng kết hợp amoxicillin và clavulanat [3], [6], [8 ]
1.3.1. Dược lý và cơ chế tác dụng
Amoxicillin là kháng sinh bán tổng hợp thuộc họ beta-lactamin có phổ
diệt khuẩn rộng đối với nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm do ức chế
tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Nhưng vì amoxicillin rất dễ bị phá huỷ bởi
beta-lactamase, do đó không có tác dụng với chủng vi khuẩn sản sinh ra các
enzym này (nhiều chủng Entetobacterỉaceae Haemophilus influenzae).

Acid clavulanic do sự lên men của Streptomyces clavulỉgerus, có cấu trúc
beta-lactam gần giống với penicillin, có khả năng ức chế beta-lactamase do
phần lớn các vi khuẩn Gram âm \à Staphylococcus sinh ra. Đặc biệt nó còn có
tác dụng ức chế mạnh các beta-lactamase truyền qua plasmid gây kháng các
penicillin và các cephalosporin. Pseudomonas aeruginosa, Proteus morganii
và rettgeri, một số chủng Enterobacter và Providentia kháng thuốc, và cả tụ
cầu methicilỉn cũng kháng thuốc nàj. Bản thân acid clavulanic cũng có tác
dụng kháng khuẩn rất yếu.
Acid clavulanic giúp cho amoxicillin không bị beta-lactamase phá huỷ,
đồng thời mở rộng thêm phổ kháng khuẩn của amoxicillin một cách hiệu quả
đối với nhiều vi khuẩn thông thường đã kháng lại amoxicillin, kháng các
penicillin khác và cephalosporin. Có thể coi amoxicillin và clavulanat là thuốc
diệt khuẩn đối với các Pneumococcus, cắc Streptococcus beta tan máu,
Staphylococcus (chủng nhạy cảm với penicillin không bị ảnh hưởng của
penicillinase), Haemophilus influenza, Branhamella catarrhalis kể cả những
chủng sinh mạnh beta-lactamase.
1.3.2. Dược động học
Amoxicillin và kali clavulanat đều hấp thụ dễ dàng qua đường uống.
Nồng độ của hai chất này trong huyết thanh đạt tối đa sau 1-2 giờ uống thuốc.
Với liều 500mg amoxicillin và 125mg kali clavulanat thì nồng độ thuốc tối đa
trong huyết tương của amoxicillin là 8-9|ig/ ml và của kali clavulanat là
khoảng 3|j,g/ ml. Thời gian bán thải của amoxicillin trong huyết thanh là 1-2
giờ và của kali clavulanat là khoảng 1 giờ.
13.3. Chỉ định
Các chế phẩm amoxicillin + clavulanat được dùng để điều trị trong thời
gian ngắn các trường hợp nhiễm khuẩn sau:
+Nhiễm khuẩn nặng đường hô hấp trên: Viêm amidan, viêm xoang,
viêm tai giữa đã được điều trị bằng các kháng sinh thông thường nhưng không
đỡ.
+Nhiễm đường hô hấp dưới bởi các chủng H.influenzae và Branhamella

catarrbalis sản sinh beta-lactamase: Viêm phế quản cấp và mạn, viêm phổi-
phế quản.
+Nhiễm khuẩn nặng đường tiết niệu sinh dục bởi các chủng E.coli,
Klebsiella và Enterobacter sản sinh; Viêm bàng quang, viêm niệu đạo, viêm
bể thận.
+Nhiễm khuẩn da và mô mềm; Mụn nhọt, áp xe, nhiễm khuẩn vết
thương.
+Nhiễm khuẩn xương và khớp: Viêm tuỷ xương.
+Nhiễm khuẩn nha khoa : Áp xe ổ răng.
+Nhiễm khuẩn khác: Nhiễm khuẩn do nạo thai, nhiễm khuẩn máu sản
khoa, nhiễm khuẩn trong ổ bụng (tiêm tĩnh mạch trong nhiễm khuẩn máu,
viêm phúc mạc, nhiễm khuẩn sau mổ, đề phòng nhiễm khuẩn trong khi mổ dạ
dày-ruột, tử cung, đầu và cổ, tim, thận, thay khớp và đường mật).
13.4. Chống chỉ định
+DỊ ứng với nhóm beta-lactam.
+Cần chú ý đến khả năng dị ứng chéo với các beta-lactam khác như họ
cephalosporin. Chú ý đến người bệnh có tiền sử vàng da/rối loạn chức năng
gan do dùng amoxicillin và clavulanat hay các penicillin vì clavulanat gây
tăng nguy cơ ứ mật trong gan.
1.3.5. Liều lượng
Người lớn và trẻ em từ 40 kg trở lên: Iviên (500mg amoxicillin +125 mg
kali clavulanat) cách 8 giờ/lần trong 5 ngày.
Trẻ em dưới 40 kg cân nặng; Liều thông thường 20mg/kg amoxicillin/
ngày, chia làm nhiều lần cách nhau 8 giờ.
1.3.6. Dạng bào chế
Các thuốc uống thường dùng amoxicillin trihydrat và kali clavulanat.
Dạng thuốc tiêm dùng amoxicillin natri và kali clavulanat.
+Viên nén chứa 250 mg Amox và 125 mg Clav hoặc 500mg Amox và
125mg Clav hoặc 875mg Amox và 125mg Clav.
+Viên phân tán; Chứa 250mg Amox và 125mg Clav; 250mg Amox và

125mg Clav.
+Viên nhai được: Chứa 125mg Amox và31,25mg Clav, chứa 200mg
Amox và 28,5mg Clav, chứa 250mg Amox và 62,5mg Clav, hoặc chứa 400mg
Amox và 57mg Clav.
+Bột pha dịch treo để uống (chai): Hoà vào nước để có các dịch treo,
trong 5ml chứa 125mg Amox và 31,25mg Clav, chứa 200mg Amox và
28,5mg Clav hoặc chứa 250mg Amox và 62,5mg Clav.
+Bột pha tiêm hoặc truyền tĩnh mạch: Lọ chứa 500mg Amox và 100 mg
Clav (dùng cho trẻ em) và lọ chứa 1000 mg Amox và 200mg Clav.
Như vậy trong các dạng bào chế Amox và Clav thường được kết hợp
theo tỉ lệ 2:1, 4:1, 5:1. Theo [19 ] khảo sát tỉ lệ Amox/Clav từ2-10:l cho thấy
tỉ lệ 4:1 là phù hợp hơn cả.
1.4. Các phương pháp đã được áp dụng để định lượng amoxicillin và
kali clavulanat trong huyết tưofng
Để đánh giá sinh khả dụng của thuốc phải xác định được nồng độ của
thuốc trong máu sau khi uống. Do đó phương pháp lựa chọn phải có độ nhạy
cao, đồng thời đáp ứng được độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp định
lượng và đặc biệt lý tưỏíng là phương pháp đó phải có khả năng tách tốt, xác
định được đồng thời nồng độ của amoxicillin và kali clavulanat trong huyết
tương.
1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tham khảo phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng
amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương (bảng 1) và trang thiết bị hiện
có, chúng tôi lựa chọn một chương trình HPLC phù hợp để phân tích định
lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương.
Tài
liệu
tham
khảo
Pha động

íi.iìiiì| ịi||Ị|;b»
lưựiig
(ml/phút)
Detector
Thể
tích
tiêm
(1^1)
Thời
gian
lưu
(phút)
(1)
(2)
(3) (4)
(5) (6)
(7)
15
Zorbax Cg
5|Lim, 150mm X 2.1mm
(Agilent)
HCOOH : MeCN iH p -
2:100:1000
0.4
MSD (ESI)
2|l i 1
14
Lichrospher RP8
5|im, 250nm X 4mm
(Merck)

Dung môi A:NaH2P04 0.0IM
chứa tétraméthylammonium
chlorid 0.02M điều chỉnh tới
pH 2.5 bằng acid phosphoric.
Dung môi B: MeCN
Chương trình sắc ký;
1.0 uv
x=220nm
20ịi\
ÍAmox^ 9.5
tciav- 5-5
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6 )
(7)
0-3 :93%A&7%B
4-6 :88%A&12%B
7-10:93%A&7%B
13
Bondapack Cjg
(30 cm X 3.9mm)
NaH2P0 4 O.IM : MeOH điều
chỉnh tới pH 4.0 bằng H3PO4
UV
A,=230nm
ÍAmox= 7.1
tciav = 8 . 6

11
Bondapack Cjg
MeOH: đệm phosphat 0.2 M
= 15:1 chỉnh tới pH 6
0.8
2 0 |il
17
Bondapack Cjg
K H 2 P O 4 O.IM chỉnh tới pH3.2
bằng H3PO4 sau đó phối hợp
KH2PO4: MeOH= 96 : 4.
Dẫn chất hoá kali clavulanat
bằng Imidazol.
2.5 UV
^ A m o x = 2 2 0 n r n
1 Irim
25|_il
hoặc
50|il
1.4.2. Nhận xét và lựa chọn
Phương pháp dùng acid formic kết hợp với acetonitril làm pha động và
thử trên cả 3 loại cột Cg, Ci8, phenyl, chúng tôi nhận thấy đường nền bị nhiễu,
pH của pha động xuống quá thấp: 2.0 là giới hạn an toàn của cột sắc ký, mặt
khác kali clavulanat không tách được hoàn toàn khỏi tạp trong huyết tương.
Khi thay acid formic bởi acid acetic tuy pH pha động tăng lên đạt 3.0 nhưng
đường nền vẫn nhiễu.
Phương pháp thứ hai dùng pha động là NaH2P0 4 kết hợp acetonitril
chạy pha động theo gradient dung môi ở cả 3 loại cột Cg, Cj8, phenyl kali
clavulanat vẫn khổng tách được khỏi tạp trong huyết tương.
Phương pháp dùng đệm phosphat kết hợp với MeOH (1:15) kali

clavulanat cũng không tách khỏi tạp của huyết tương.
Bên cạnh đó khi tiến hành thử theo một số tài liệu như Dược điển Mỹ,
[12] dùng để định lượng Amox và Clav trong chế phẩm nhưng cả hai chất này
đều bị lẫn với tạp trong huyết tương. Ngoài ra khi tiến hành thử nghiệm chiết
pha rắn thì sau khi chiết không tìm lại được cả hai chất trên.
Tóm lại trong tất cả các phương pháp kể trên chúng tôi đều gặp phải
khó khăn đó là không tách được kali clavulanat ra khỏi tạp trong huyết tương.
Do đó chúng tôi chọn giải pháp dẫn chất hoá kali clavulanat sau đó tiến hành
sắc ký đồng thời ở hai bước sóng khác nhau.
1.5. Phương pháp HPLC [2], [5], [7]
1.5.1. Nguyên tắc phương pháp HPLC
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau. Dung dịch các chất phân tích
khi vào cột sẽ được hấp phụ hay liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất
của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ
nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột.
Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi
mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột sắc ký. Các chất sau khi ra
khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả.
Kết quả cuối cùng được đưa ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi
quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm
nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có
bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ.
1.5.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký HPLC
Một máy sắc ký HPLC đầy đủ gồm 5 phần chính sau:
Bơm cao áp : để bơm pha động vào cột và thực hiện quá trình sắc ký.
Bơm này phải được điều chỉnh áp suất (0-400 bar) để tạo ra được những tốc độ
nhất định qua cột phù hợp với quá trình sắc ký.
Van tiêm mẫu: để tiêm mẫu phân tích vào cột tách với những lượng mẫu
nhất định trong quá trình sắc ký.

Cột sắc ký : Thường được làm bằng thép không rỉ, có nhiều kích thước
khác nhau, song nói chung cột thường có chiều dài từ 10-25 cm, đường kính
trong từ 2-5 mm.
Detector; Là thiết bị phát hiện các chất phân tích sau khi đi qua cột.
Nguyên lý hoạt động của detector UV-VIS dựa trên nguyên lý của phương
pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra các phương pháp: đo khúc xạ vi sai,
huỳnh quang, điện hoá cũng được ứng dụng để phát hiện.
Máy ghi: Để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.
Hình 1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.5.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
corr^oomm 2
Hình 2: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
> Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng
đại và ghi thành sắc ký đồ với các thông số.
■ tp (Thời gian lưu) Là thời gian kể từ khi chất phân tích được bơm
vào cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
■ tọ (Thời gian chết) : là thời gian cần thiết để pha động chảy qua
hệ thống sắc ký.
■ tR’(Thời gian lưu thực)= ÍR-to
■ Wq 5 : Độ rộng của pic ở nửa chiều cao.
■ W(,: Độ rộng ở đáy pic.
Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số
đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
> Hệ sô dung lượng k’
~ Kì _Ịj__ị
(q Íq /q
Nếu k’ nhỏ thì Ír cũng nhỏ và sự tách kém, k ’ lớn thì pic bị doãng độ
nhạy kém. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng từ 2 đến 5 là tốt nhất. Hai chất
được tách khỏi nhau nếu chúng có giá trị k ’ khác nhau.
> Độ chọn lọc a

K ì„ - ĩ.
Với điều kiện k2’> kj’
a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2.
> Độ phân giải
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của chất ra khỏi nhau trong
một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính
theo một trong ba công thức sau:
R s= hoặc hoặc
a 1 + *', 4
> Hệ số đối xứng(T)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:
2A
Trong đó là độ rộng của đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
A là khoảng cách từ đưòỉng vuông góc hạ từ cực đại của pic đến
chân đường cong phía trước ở tại 1/20 chiều cao của pic.
> Sô đĩa lý thuyết: Để đặc trưng cho hiệu lực của cột người ta dùng số
đĩa lý thuyết (N) và chiều cao của đĩa (H)
iV = 16 hoặc N = 5.54
Trong đó:
+ Wß là chiều rộng ở đáy pic
+ W ,/2 là chiều rộng ở nửa chiều cao của pic.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết
được tính bằng công thức: H=—
1.5.4. Pha tĩnh trong HPLC
> Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp
có nhiều thành phần. Nó là một chất rắn xốp có kích thước hạt rất nhỏ, đường
kính cỡ hạt từ 3- 10 |j,m, diện tích bề mặt riêng từ 50-500mVg.
> Phân loại
■ Căn cứ vào bản chất của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiéu loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.

Tương ứng với các loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng
trong kỹ thuật HPLC.
■ Căn cứ vào trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó
làm hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh
là chất lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LLC).
■ Căn cứ vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động, ta có các loại; sắc
ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi
ion.
■ Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia
nó làm hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt.
> Điều kiện đối với một pha tĩnh
■ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
■ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong
điều kiện sắc ký nhất định.
■ Tính chất bề mặt phải ổn định đặc biệt là đặc trưng xốp của nó.
■ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
■ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
1.5.5. Pha động trong HPLC
> Pha động là dung môi để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh
động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều
dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỉ lệ nhất định. Nó cũng có thể là muối
chứa các chất đệm, chất tạo phức .Đối với mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung
môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
> Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký
của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu
quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến:
■ Độ chọn lọc của hệ pha.
■ Thời gian lưu giữ của chất tan.
■ Hiệu lực của cột tách.

■ Độ phân giải của các chất trong một pha tĩnh.
■ Độ rộng và cân đối của pic sắc ký.
> Điều kiện đối với một pha động
■ Phải trơ đối với pha tĩnh.
■ Hoà tan được chất cần phân tích.
■ Bền vững theo thời gian.
■ Có độ tinh khiết cao.
■ Phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký.
■ Phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
■ Có tính kinh tế và không quá hiếm.
> Các yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động
■ Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động.
■ Thành phần các chất tạo ra pha động.
■ Tốc độ dòng pha động.
■ pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp
ion)
1.5.6. Cách đánh giá pic
> Đánh giá diện tích pỉc. Diện tích pic của một chất tương ứng với
tổng lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy
tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0.5%) hoặc máy phân tích
cơ học (sai số 1.3%). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi
đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu
và điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ
vừa, trung bình và cao.
> Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỉ lệ với diện tích
pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá sắc phổ. Phương pháp này chỉ áp dụng
khi các chỉ số k ’ là hằng định.
> Với pic cố đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều
cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.

1.5.7. Cách tính kết quả
> Phương pháp ngoại chuẩn: Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh
mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện. Kết quả của chất chưa biết được
tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
> Phương pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào cả mẫu thử
và mẫu chuẩn một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó
có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
Nó được tách hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất cần phân
tích và có cấu trúc hoá học tương tự.
> Phương pháp thêm chuẩn: Chủ yếu được sử dụng trong kĩ thuật
HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của chất phụ như tá dược. Dung dịch mẫu thử
được thêm một lượng xác định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung
dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được tiến hành trong cùng một
điều kiện sắc ký. Kết quả được tính toán dựa vào sự chênh lệch nồng độ
(lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích hoặc chiều cao của pic.
> Phương pháp tính theo phẩn trăm diện tích pic\ Nồng độ của mẫu
thử được tính toán dựa trên diện tích pic tính theo tỉ lệ phần trăm diện tích pic
chất thử trên tổng diện tích toàn bộ pic có trong sắc đồ. Trong HPLC, phương
pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên tất cả các chất là như
nhau, nếu không như nhau khi đó với mỗi chất cần có hệ số hiệu chỉnh.
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tượng, hoá chất, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
■ Nguyên liệu amoxicillin trihydrat (Viện kiểm nghiệm-Bộ Y tế)
■ Nguyên liệu kali clavulanat (Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế)
2.1.2. Phương tiện, dụng cụ, hoá chất
> Dụng cụ máy móc
■ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent HP 1100- Detector UV- VIS
diode array.

■ Máy li tâm điện Jouan (Pháp).
■ Máy lọc nước sạch Elga (Anh).
■ Tủ lạnh sâu (T°=-50°) Prigor (Đan Mạch).
■ Máy lắc Labinco (Hà Lan).
■ Máy khuấy từ Labinco(Hà Lan).
■ Máy lọc chân không Satorius.
■ Máy đo pH Meter - Jenway.
■ Cân phân tích Metller AB 204 Toledo (Thụy Sĩ).
■ Auto pipet 0.1-10jxl, 10- lOOịLil, 100-1000|Lil.
■ Bình định mức 5, 10, 25, 50, 100 ml.
■ Cốc đong 100, 500, 1000 m l.
■ Đầu lọc đường kính lỗ lọc 0.2|Lim, màng lọc đường kính lỗ lọc
0.45|j,m.
■ Pipet các loại, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm.
■ Tủ sấy và các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết khác.
>
Hoá chất
■ Amoxicillin trihidrat; Chất chuẩn hàm lượng 99.46%, độ ẩm 13.12%
( Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế).
■ Kali clavulanat : Chất chuẩn hàm lượng 99.26%, độ ẩm 0.47%
(Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế).
■ Imidazol: PA (Merck).
■ Muối NaỉỈ2P0 4 PA (Merck).
■ Methanol HPLC (Baker).
■ Acetonitril HPLC (Prolabor).
■ Dichloromethan HPLC (Prolabor)
■ H3PO4 98%.
■ Nước cất siêu sạch dùng cho HPLC.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu, xáy dựng qui trình kỹ thuật

> Tham khảo các phương pháp định lượng amoxicillin và
kaliclavulanat đã được công bố.
> Tham khảo các phương pháp định lượng đồng thời amoxicillin và
kali clavulanat trong huyết tương bằng phương pháp HPLC.
> Dựa vào cấu tạo nguyên tử, tính chất lý hoá học của amoxicillin và
kali clavulanat cũng như các điều kiện thực nghiệm ở nước ta để tiến hành xây
dựng qui trình kĩ thuật định lượng đồng thời amoxicillin và kali clavulanat
trong huyết tương bằng phương pháp HPLC.
> Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng
phưcíng pháp.
■ Khảo sát các qui trình chiết amoxicillin và kali clavulanat trong
huyết tương để tìm ra phưoỉng pháp chiết tốt nhất: chiết được đồng thời cả hai
chất trên với hiệu suất cao, loại được các tạp chất trong huyết tương cản trở
việc phân tích mẫu.
■ Khảo sát điều kiện sắc ký: Chọn cột, pha động, bước sóng xác định
và tốc độ dòng thích hợp để tách tốt nhất hai chất amoxicillin và kali
clavulanat, pic cân xứng nhất, đường nền không bị nhiễu và hiệu suất tách đạt
cao nhất.
2.2.2. Thẩm định phương pháp
> Đánh giá tính chọn lọc của phương pháp.
> Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cả hai chất.
> Đánh giá khoảng tuyến tính của phương pháp.
> Đánh giá độ đúng của phương pháp.
> Đánh giá độ chính xác của phương pháp.
2.2.3. Một sô công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả
> Giá trị trung bình: x=~Yx,
n ,=|
> Độ lệch chuẩn : SD= ]j
n
/ = l

-x Ỵ
n~\
> Độ lệch chuẩn tương đối : RSD = ^ X100%
Trong đó: XI là kết quả xác định lần thứ i
n là số lần xác định
2.3. Kết quả thực nghiệm
2.3.1. Chiết amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương
Do tính chất hoà tan trong nước và trong dung môi hữu cơ của
amoxicillin và kali clavulanat khác nhau nhiều nên quá trình chiết tương đôi
phức tạp. Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm nhiều chương trình khác nhau
như:
- MeOH.
- Acid trichloracetic 0.5% và hỗn hợp MeOH : CH2 CI2 (1:9).
- Acid trichloracetic 1%, 1.5%, 2%.